Giáo trình Ký sinh trùng nâng cao

Ứng dụng của các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán ký sinh trùng Trong lĩnh vực bệnh lý do ký sinh trùng, sinh học phân tử góp phần không nhỏ vào công tác phát hiện, chẩn đoán,

KỸ THUẬT MIỄN DỊCH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ

TRONG CHẨN ĐOÁN KÝ SINH TRÙNG MỤC TIÊU

1 Trình bày được nguyên nguyên lý và các kỹ thuật miễn dịch học trong chẩn đoán ký sinh trùng

2 Trình bày được nguyên lý và các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán ky sinh trùng

* Năng lực tự chủ và trách nhiệm:

3 Nghiêm túc, cẩn thận, sáng tạo trong việc vận dụng kiến thức được học để giải quyết vấn đề trong học tập

4 Chứng minh được khả năng làm việc độc lập, làm việc nhóm để giải quyết vấn đề trong quá trình học tập

- Ký sinh trùng sau khi xâm nhập vào cơ thể bệnh nhân có khả năng kích thích cơ thể sản xuất ra kháng thể đặc hiệu Vì vậy, các nguyên lý chung về miễn dịch học đều có thể áp dụng được đối với các bệnh ký sinh trùng

- Kỹ thuật miễn dịch được sử dụng trong các trường hợp mà phương pháp trực tiếp không thể làm được như:

+ Giai đoạn mới nhiễm: KST còn non, chưa đẻ trứng (sán lá gan, sán máng) + Trong giai đoạn mãn tính, KST đóng kén như Toxoplasma

+ Mật độ ký sinh thấp như Trypanosoma

+ KST nằm trong nội tạng sâu như bệnh amíp ở gan, gạo heo (lợn) ở cơ, não + Ngõ cụt ký sinh như hội chứng ấu trùng di chuyển, KST ở dạng ấu trùng, không bao giờ tiến đến giai đoạn trưởng thành và không bao giờ hoàn tất chu trình phát triển như Toxocara sp

- Trong nhiều trường hợp, huyết thanh miễn dịch học tỏ ra thực tế hơn, nhất là trong các trường hợp mà cần lấy bệnh phẩm bằng kỹ thuật xâm lấn

1 Kỹ thuật miễn dịch trong chẩn đoán ký sinh trùng

1.1 Nguyên lý của kỹ thuật miễn dịch học

Phương pháp miễn dịch học áp dụng trong chẩn đoán bệnh KST bao gồm nhiều kỹ thuật như kết tủa, điện di, gắn bổ thể, ngưng kết, miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch men

Trước đây, kỹ thuật miễn dịch chỉ dựa vào kháng nguyên để phát hiện và đo lượng kháng thể luân lưu trong máu và các dịch sinh học ðộ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm này tùy thuộc chủ yếu vào chất lượng của kháng nguyên, nếu kháng nguyên thô thì cho nhiều phản ứng chéo, dương giả, kết quả dương tính không cho biết được bệnh đang mắc hay đã qua, vì kháng thể giảm rất chậm, từ vài tháng đến cả năm Vì vậy, việc biện luận kết quả gặp nhiều khó khăn và cần thận trọng

Vài năm gần đây, chúng ta có những bộ thử nghiệm phát hiện kháng nguyên để chẩn đoán một số bệnh đơn bào như bệnh do Entamoeba histolytica, Giardia lamblia,

Cryptosporidium parvum, Trichomonas vaginalis và bệnh giun chỉ Wuchereria, sán máng Schistosoma sp

So với nhóm trên, các kỹ thuật phát hiện kháng nguyên có giá trị chẩn đoán, kết quả dương tính xác định bệnh đang có

1.2 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang

- Nguyên lý: Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thể kết hợp với kháng thể mà không phá hủy tính chất đặc hiệu của kháng thể Kháng thể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp kháng nguyên - kháng thể có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang

- Phương pháp trực tiếp: Kháng thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tác dụng với kháng nguyên Ví dụ trong chẩn đoán vi khuẩn tả sau 6 - 8 giờ nuôi cấy ở nước pepton kiềm, làm một phiến phết rồi nhuộm với kháng huyết thanh liên hợp với Fluorescein Quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang, ta phát hiện thấy khuẩn tả phát huỳnh quang xanh lục nếu mầu phân dương tính

- Phương pháp gián tiếp: Kháng thể được cho tác dụng trực tiếp với kháng nguyên rồi cho kết hợp với kháng globulin người liên hợp với Fluorescein Trước hết cho kháng nguyên cố định lên tiêu bản rồi cho tác dụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau đó nhỏ một giọt globulin người gắn Fluorescein rồi quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang Phương pháp này được sử dụng để chẩn đoán bệnh giang mai (phản ứng FTA - Abs), bệnh tự miễn Phương pháp gián tiếp có nhiều ưu điểm như: Sự phát huỳnh quang mạnh hơn, tiết kiệm được thời gian nếu nhiều huyết thanh được thử nghiệm cùng một lúc

1.3 Phản ứng miễn dịch enzym (ELISA)

ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay) là một phương pháp sinh hoá sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu

Hình 1: Nguyên lý ELISA Nguyên lý của kỹ thuật ELISA là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và được thực hiện bằng những bước cơ bản sau: Kháng nguyên - antigen (KN) hoặc Kháng thể - antibody (KT) đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thể - antibody (KT) hoặc kháng nguyên (KN) cần tìm vào giếng Bổ sung thêm kháng thể có gắn với ezyme Bước cuối cùng thêm cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh quang

1.3.1 ELISA trực tiếp (direct ELISA)

Phương pháp này thường sử dụng trong ELISA định tính, ít dùng trong định lượng Phương pháp này có ưu điểm là chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian và tối thiểu được việc kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính thời gian…) Tuy nhiên, nhược điểm của nó là nhuộm màu nền (background staining) cao do sự liên kết không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn và các protein cố định trên bề mặt rắn Việc đánh dấu từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng khá tốn kém, nhất là khi phải chẩn đoán một số lượng lớn các loại kháng nguyên khác nhau

1.3.2 ELISA gián tiếp (indirect ELISA) Ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy cao chỉ cần tạo một loại kháng kháng thể mang enzyme để nhận biết cho nhiều kháng nguyên khác nhau Tuy nhiên nhược điểm của nó là tăng số bước thực hiện do đó làm tăng việc kiểm soát các điều kiện, quá trình thực hiện xét nghiệm và kéo dài thời gian chẩn đoán

Phương pháp này có khá nhiều ưu điểm vượt trội, thứ nhất là độ nhạy cao giảm được nhuộm màu nền và các phản ứng không đặc hiệu do đã loại bỏ được hầu hết các thành phần tạp, phản ứng được thực hiện dễ dàng hơn

1.3.4 ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)

ELISA cạnh tranh là phương pháp ELISA rất hiệu quả cho định lượng các yếu tố hiện diện trong mẫu với lượng nhỏ ELISA cạnh tranh sử dụng một lượng kháng nguyên cùng loại với kháng nguyên mà ta muốn định lượng trong mẫu (kháng nguyên cạnh tranh) cho phản ứng miễn dịch với cùng một loại kháng thể đặc hiệu cố định trên mặt rắn, sau đó đo lượng kháng nguyên cạnh tranh này thông qua hoạt tính enzyme được liên kết với nó Kháng nguyên cạnh tranh càng hiện diện nhiều cho biết loại kháng nguyên đó trong mẫu càng ít và ngược lại

Hình 2: Các phương pháp kỹ thuật ELISA

1.4 Phản ứng miễn dịch phóng xạ (RIA)

Nguyên lý: Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H3 Cacbon 14, I125 đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể

KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT KHÁNG THUỐC

1 Trình bày được đặc điểm, nguyên nhân, sự lan truyền, các phương pháp đánh giá ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

2 Giải thích được cơ chế kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét

* Năng lực tự chủ và trách nhiệm

3 Tổng hợp kiến thức đã được học về ký sinh trùng sốt rét, tham khảo thêm các tài liệu liên quan nhằm phát triển năng lực bản thân

4 Thể hiện khả năng làm việc độc lập và làm việc nhóm, tổng hợp, đánh giá kết quả công việc của các thành viên trong nhóm để hoàn thành các bài tập được giao

1 Lịch sử và đặc điểm của ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

Cho đến nay, nói đến kí sinh trùng sốt rét (KSTSR) kháng thuốc là nói đến P.falciparum kháng thuốc sốt rét Kí sinh trùng sốt rét kháng thuốc đã xảy ra ở mọi vùng sốt rét trên thế giới và là một trong những khó khăn kĩ thuật lớn nhất ảnh hưởng đến các chương trình phòng chống sốt rét toàn cầu Tuy nhiên tình hình kí sinh trùng sốt rét kháng thuốc có sự biến đổi theo thời gian và không gian do sự phân bố của các loài kí sinh trùng sốt rét và khả năng phòng chống ở mỗi thời điểm, khu vực khác nhau Tác giả Gilles cho rằng: ở các vùng nhiệt đới tỉ lệ P.falciparum chiếm ưu thế, còn các vùng ôn đới thì P.vivax chiếm ưu thế Ở Việt Nam P.falciparum chiếm khoảng 80% P.vivax chiếm khoảng 15 - 20% P.malariae chiếm khoảng 1% Tuy nhiên mỗi vùng tùy theo đặc điểm sinh cảnh, khí hậu và biện pháp PCSR sẽ có tỉ lệ khác nhau Theo báo cáo của Viện Sốt rét -KST -

CT Trung ương (2000), trong giai đoạn hiện nay ở khu vực miền Trung - Tây Nguyên tỉ lệ P.falciparum và tỉ lệ KSTSR/lam xét nghiệm cao nhất cả nước và cũng là nơi tình hình KSTSR kháng thuốc diễn ra phức tạp nhất

1.1 Lịch sử của ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

Sự xuất hiện KSTSR kháng thuốc có mối liên quan chặt chẽ với quá trình phát triển thuốc điều trị sốt rét Tác giả Peters đã tóm tắt lịch sử phát triển thuốc sốt rét cùng với sự xuất hiện KSTSR kháng thuốc và nhận thấy hoặc nhanh hay chậm kí sinh trùng cũng tự thay đổi để thích nghi rồi kháng lại các thuốc tác dụng lên nó

Lịch sử phát triển thuốc sốt rét với sự xuất hiện KSTSR kháng thuốc (dua theo Peters)

Tên thuốc Năm sử dụng Năm xuất hiện kháng thuốc invitro invivo Quốc gia

Tình hình P.falciparum kháng chloroquine trở nên vô cùng nghiêm trọng cả về phạm vi và mức độ, đòi hỏi phải đề ra đối sách chống kháng cho phù hợp với từng quốc gia và khu vực Đã có thông báo về P.vivax kháng hoặc giảm hiệu lực điều trị với primaquine ở một số khu vực trên thế giới từ một vài dòng (strains) thể phân liệt trong gan đã có kháng một phần và được nhận định ở Đông Nam Á: 17% ở Thái Lan, 30% ở Papua New Guinea; ở Amazon Basine, Trung Mĩ, Somalia (43% trong quân đội Mĩ) Nhưng đến nay chưa có thông báo chính thức về P.vivax kháng chloroquine, một loại thuốc vẫn được coi là số một trong điều trị P.vivax

Việt Nam là một trong những nước được ghi nhận có sự kháng thuốc sớm trên thế giới Năm 1963, P.falciparum kháng chloroquine lần đầu tiên được phát hiện ở Nha Trang Cho đến nay tình hình P.falciparum kháng chloroquine và hầu hết các thuốc sốt rét khác (trừ artemisinine và các dẫn chất) diễn biến hết sức phức tạp về phạm vi và mức độ ngày một tăng theo thời gian

1.2 Đặc điểm của ký sinh trùng kháng thuốc sốt rét

- Khi thuốc kháng 1 giai đoạn của ký sinh trùng, thường kháng các giai đoạn khác (như Pyrimethamin)

- Ký sinh trùng kháng Chloroquin có thể:

+ Duy trì suốt vòng đời

+ Truyền sang đời sau + Dễ có kháng chéo trong nhóm 4 aminoquinolein

+ Có khả năng gây cho muỗi tăng nhiễm ký sinh trùng kháng

- Ký sinh trùng kháng 4 aminoquinolein và Amino-alcool (Chloroquin và Mefloquin): Duy trì trong quá trình lan truyền mặc dù không có áp lực của thuốc

- Kháng Sulfonamid, Pyrimethamin và Chloroquin: tính kháng di truyền qua chu kỳ hữu tính ở muỗi sang đời sau

2 Các phương pháp đánh giá ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

2.1 Kỹ thuật đánh giá mật độ ký sinh trùng sốt rét

Mật độ ký sinh trùng sốt rét là số lượng ký sinh trùng sốt rét đếm được trong một vi trường hoặc một thể tích máu nhất định Trong nghiên cứu, chẩn đoán, điều trị và đánh giá tính nhạy cảm (nhạy-kháng) trong các thử nghiệm in vivo và in vitro với thuốc sốt rét, vai trò của xác định loài và đếm mật độ ký sinh trùng sốt rét (KST SR) là khâu quan trọng, đồng thời cũng góp phần vào lộ trình phòng chống và loại trừ sốt rét trên thế giới và Việt Nam Có 2 phương pháp dùng để tính mật độ KST SR:

- Đếm số lượng KST SR trong 1 àl (1ml) mỏu

- Kỹ thuật đếm được chính xác, cần lưu ý các điều kiện sau:

+ Lam máu nhuộm đẹp, không có/ít cặn, đạt chuẩn khoảng 10-20 bạch cầu/vi trường ở giọt đặc và khoảng 250 hồng cầu/một vi trường ở giọt mỏng, nơi chỉ có một lớp hồng cầu

+ Chọn vùng đếm: tế bào máu (hồng cầu/bạch cầu) rải đều, KST SR bắt màu đẹp rõ

+ Nên đếm 2 – 3 lần để lấy số trung bình

+ Nên sử dụng 2 máy đếm (1 máy đếm số lượng bạch cầu và 1 máy đếm ký sinh trùng sốt rét

+ Đếm tất cả ký sinh trùng có mặt trong vi trường, chuyển sang vi trường tiếp theo, theo hình zíc zắc và lặp lại như vậy đến khi số lượng bạch cầu/hồng cầu đạt quy định thì dừng lại Cẩn thận không chồng chéo lập lại đường (vi trường) đã đi qua;

2.1.1 Tính mật độ ký sinh trùng sốt rét theo hệ thống dấu cộng Đánh giá mật độ nhiễm bằng dấu cộng (+) là một cách đếm ký sinh trùng sốt rét trên giọt dày (giọt đặc), ước lượng được số lượng ký sinh trùng sốt rét tương đối trong

1 khoảng giá trị Kết quả đếm ký sinh trùng sốt rét trên tiêu bản giọt dày xác định như sau:

2.1.2 Tớnh số lượng ký sinh trựng sốt rột trong 1àl mỏu

* Một số lưu ý khi đếm ký sinh trùng sốt rét trên lam máu

- Chỉ đếm số lượng KSTSR ở giai đoạn vô tính (trophozoite, schizont) được thực hiện ở tất cả loài Plasmodium falciparum, Plassmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale và Plasmodium knowlesi nếu có, trong đó chú trọng loài

Plasmodium falciparum thường gây sốt rét ác tính (SRAT), một số loài khác cũng có thể dẫn đến SRAT nhưng hiếm hơn (P vivax, P knowlesi)

- Đối với thể hữu tính hay thể giao bào (gametocytes) không đếm, trừ trường hợp có yêu cầu trong nghiên cứu kháng thuốc đối với P vivax chẳng hạn, nhưng sự hiện diện của chúng phải ghi vào kết quả xét nghiệm (sổ xét nghiệm hay phiếu ghi kết quả của các nghiên cứu tại thực địa và bệnh viện)

- Trong trường hợp nhiễm phối hợp nhiều loài Plasmodium spp (thường gặp là

P falciparum và P vivax), tất cả KSTSR thể vô tính phải đếm chung với nhau;

- Phần lớn, đếm số lượng KSTSR được thực hiện trên lam giọt dày, vì mật độ KSTSR tập trung cao và ít tốn thời gian soi cho xét nghiệm viên/ kỹ thuật viên Tuy vậy, giọt mỏng cũng có thể được dùng để đếm số lượng KSTSR trong những trường hợp sau:

+ Không làm giọt dày hoặc có nhưng giọt dày bị hư hỏng, không soi được;

+ Khi số KSTSR > 100 ở mỗi vi trường trên giọt dày tương ứng với > 80.000 KSTSR/μL (vì ở mật độ này trên giọt dày rất khó đếm);

+ Xác định tỷ lệ phần trăm HC nhiễm KSTSR Plasmodium spp

+ Hoặc do yêu cầu khác hoặc trong nghiên cứu…

* Đếm số lượng ký sinh trùng sốt rét trên tiêu bản giọt dày và tính mật độ KST SR/ μL

- Trước khi đếm phải xét nghiệm ít nhất 100 vi trường ở giọt dày (một số trường hợp cần phải đếm số vi trường lớn hơn 200-300 với mục đích nghiên cứu,

29 chẳng hạn đánh giá nhiễm trùng trên người không triệu chứng trong cộng đồng) để phát hiện sự hiện diện của KSTSR về các thông số cơ bản về loài, thể KSTSR và đánh giá mật độ KSTSR theo hệ thống dấu cộng và ghi lại kết quả

- Quy định về số lượng BC phải đếm phụ thuộc vào số lượng KSTSR đếm được và dừng đếm khi đếm được 200 hoặc 500 BC

+ Nếu đếm thấy số lượng KSTSR ≥ 100 thì đếm đến 200 BC, dừng đếm và ghi kết quả số lượng KSTSR/200 BC;

+ Nếu đếm thấy số lượng KSTSR ≤ 99 thì đếm đến 500 BC, dừng đếm và ghi kết quả số lượng KSTSR/500 BC;

+ Trường hợp được xác định là âm tính (-) khi đếm 0/1000 BC;

+ Đếm tất cả KSTSR và BC ở vi trường cuối cùng, ngay cả khi số lượng

+ Ghi số lượng thực tế KSTSR và BC đếm được;

+ Tổ chức Y tế thế giới đó lấy số bạch cầu = 8000/àL mỏu làm chuẩn

Số lượng KSTSR/ àL = Số lượng KSTSR đếm được x 8000 BC/àL

Số lượng BC đếm được

- Ở cơ sở điều trị có xét nghiệm số lượng BC hãy lấy số lượng BC thực tế đếm được để thay thế cho số lượng bạch cầu trung bỡnh quy ước là 8.000 BC/àL, sẽ cho kết quả số lượng KSTSR/àL chớnh xỏc hơn

* Xác định tỷ lệ phần trăm hồng cầu (HC) bị nhiễm KSTSR trên lam giọt mỏng

MỘT SỐ KỸ THUẬT NHUỘM VÀ NUÔI CẤY CHẨN ĐOÁN VI NẤM

1 Trình bày được nguyên tắc, các bước tiến hành của một số kỹ thuật nhuộm và nuôi cấy vi nấm

2 Mô tả được đặc khuẩn lạc và hình thể một số vi nấm hoại sinh

3 Nhận định được kết quả nhuộm và nuôi cấy vi nấm trên một số hình ảnh mẫu

4 Xác định được hình ảnh một số vi nấm hoại sinh trên hình ảnh mẫu

* Năng lực tự chủ và trách nhiệm

5 Tổng hợp kiến thức đã được học về vi nấn gây bệnh, tham khảo thêm các tài liệu liên quan nhằm phát triển năng lực bản thân

6 Thể hiện khả năng làm việc độc lập và làm việc nhóm, tổng hợp, đánh giá kết quả công việc của các thành viên trong nhóm để hoàn thành các bài tập được giao

1 Hình thẻ một số vi nấm hoại sinh

- Khuẩn lạc: phẳng, mượt và có màu xanh ô liu đến đen Có kích thước từ vài mm đến vài cm đường kính Khi thuộc địa trưởng thành, nó có thể phát triển một vòng đồng tâm sẫm màu xung quanh mép

- Hình thể quan sát dưới kính hiển vi

+ Sợi tơ nấm phân vách, màu nâu đen + Bào đài không phân nhanh

+ Bào tử màu đen, có nhiều vách ngăn

Hình 3.1 Hình thể cấu tạo nấm Alternaria

- Khuẩn lạc: Mọc nhanh, mặt khóm hơi nhăn, có lông tơ Màu trắng xám hoặc hồng Không có sắc tố

- Hình thể quan sát dưới kính hiển vi

+ Sợi tơ nấm phân vách + Bào đài phân nhánh hoặc không phân nhánh + Bào tử hình bầu dục, dài, đôi khi phân vách 2-3 tế bào + Bào tử thường đứng thành chùm đầu bào đài

Hình 3.2 Hình thể nấm Cephalosporium sp

- Khuẩn lạc: Mọc nhanh Mặt khóm phẳng như nhung, bột Màu xám xanh đến xanh lá cây sẫm Có sắc tố phía sau đen

- Hình thể quan sát dưới kính hiển vi:

+ Sợi tơ nấm phân vách, phân nhánh + Bào đài dài, đầuu bào đài phình to thành bầu + Phủ đầy 1 hay 2 hàng tiểu bào đài

+ Từ tiểu bào đài sinh ra các bào tử xếp thành chuỗi dài

Hình 3.3 Hình thể nấm A.fumigatus

- Khuẩn lạc: Mọc nhanh Mặt khóm phẳng như len Màu trắng đến vàng, khi già có màu nâu sẫm hoặc đen

+ Sợi tơ nấm phân vách, phân nhánh + Bào đài dài, đầu bào đài phình to thành bầu + Phủ đầy 1 hay 2 hàng tiểu bào đài

+ Từ tiểu bào đài sinh ra các bào tử xếp thành chuỗi dài

Hình 3.4 Hình thể nấm Aspergillus niger

- Khuẩn lạc: Mọc nhanh Mặt khóm lúc đầu có màu vàng sau đổi sang màu xanh lá cây

Hình 3.5 Hình thể nấm A.flavus

+ Sợi tơ nấm phân vách, phân nhánh

+ Bào đài dài, đầu bào đài phình to thành bầu

+ Phủ đầy 1 hay 2 hàng tiểu bào đài

+ Từ tiểu bào đài sinh ra các bào tử xếp thành chuỗi

- Khuẩn lạc: Mọc nhanh Mặt khóm phẳng như bột Màu trắng xanh đến xanh da trời hoặc có các màu khác

+ Sợi tơ nấm phân vách, phân nhánh

+ Bào đài phân nhánh, tiểu bào đài xếp như hình bàn tay hay chồi

+ Từ tiểu bào đài sinh ra bào tử tròn xếp thành chuỗi

Hình 3.6 Hình thể nấm Penicillium sp

2 Một số kỹ thuật nhuộm vi nấm

2.1 Kỹ thuật nhuộm mực tàu

- Nguyên lý: Thường dùng để khảo sát vi nấm có nang, nhất là vi nấm Cryptococcus neoformans, mực tàu không thấm vào nang tạo một khoảng trống, trắng chung quanh tế bào vi nấm

+ Kính hiển vi + Tủ an toàn sinh học cấp 2 + Mực tàu

+ Lam kính + Lá kính + Bút viết kính + Đèn cồn

+ Que lấy bệnh phẩm + Khay nhuộm

1 Trên tấm lam kính sạch, khô, nhỏ 1 giọt mực tàu

2 Nhỏ 1 giọt bệnh phẩm, hay lứa cấy lên giọt mực tàu

3 Đốt kim cấy để nguội, trộn mực tàu và bệnh phẩm

4 Đậy lá kính lên giọt mực tàu đã hòa với bệnh phẩm

5 Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi

- Nhận định kết quả: Nếu trong bệnh phẩm có Cryptococcus neoformans: tế bào nấm tròn hay bầu dục, bên ngoài được bao bởi 1 nang lớn, nang không thấm màu, do đó sáng lên trên nền đen của mực tàu

- Lưu ý: Nếu nền mục tàu quá đậm có thể làm loãng bớt bằng 1 giọt nước cất

2.2 Kỹ thuật nhuộm PAS (periodic acid schiff)

- Nguyên lý: Dùng một tác nhân oxy hoá là acid periodic để phá vỡ mối liên kết của 2 nguyên tử C trong một số nhóm hoá học (các nhóm glycol 1 - 2, hydro 1 amino

- 2, hydroxy - 1, alkylamino - 2 và hydrõyl - 1, ceto - 2) làm xuất hiện các nhóm aldehyt

Các nhóm aldehyt này nhìn thấy được nhờ phản ứng của thuốc thử Schiff (fuschin basic không màu bởi axit sulfureux) tạo thành chất có màu đỏ

+ Các bể hóa chất Xylen I, Xylen II, Xylen III, Cồn 100o I, Cồn 100o II, Cồn 90o, Hematoxyline (đã lọc), Lithium, Periodic 1%, thuốc thử Schiff

+ Keo gắn Baume, Lamen, bút dạ, nhãn lam

1 Ngâm tiêu bản trong cồn ethylic 95˚ trong 1 phút

2 Ngâm tiêu bản trong PAS trong 5 phút

3 Ngâm tiêu bản trong Basic fuchsin 2 phút

5 Lấy tiêu bản ra nhỏ vài giọt Light green

6 Rửa ngay bằng nước thường

10 Phủ lá kính, dán bằng Baumme Canada hay Permount

11 Khảo sát dưới kính hiển vi

+ Vi nấm bắt màu đỏ tím

+ Hiện nay, người ta dùng chất huỳnh quang để phát hiện nấm như thuốc nhuộm Calciflour trắng phát hiện nấm nhanh, kể cả Pneumocystis carinii, xanh Toluidine nhuộm đàm để tìm P.carinii

- Lưu ý: Ngay sau khi nhỏ Light green rửa ngya tiêu bản bằng nước

2.3 Kỹ thuật kháng acid (phương pháp Kinyoun cải tiến)

- Nguyên lý: là nhuộm tiêu bản bằng carbon fuschin, sau đó tẩy màu và nhuộm nền tiêu bản bằng màu xanh Nhuộm kháng acid khi muốn tìm Norcardia

1 Phết bệnh phẩm mỏng trên lam kính, cố định bằng cách hơ nóng Phủ Carbon fuchsin, để trong 3 phút

2 Rửa lam kính với nước

3 Tẩy màu bằng cồn acid

4 Phủ xanh Methylen, để trong 1 phút

5 Rửa lam kính với nước

7 Quan sát dưới kính hiển vi

- Nhận định kết quả: Nocardia sp bắt màu ủỏ của Carbon fuchsin

- Lưu ý: Tẩy kỹ màu bằng cồn acid

3 Một số kỹ thuật cấy vi nấm

3.1 Kỹ thuật cấy nấm trên kính

- Nguyên lý: Với phương pháp cấy nấm trên kính: sự liên hệ giữa bào tử, cơ cấu sinh bào tử, nhánh nấm không bị xáo trộn

- Dụng cụ: a Môi trường: Thạch Sabouraud hoặc thạch khoai đường: 15-20ml (cho 1 đĩa thạch) b Dụng cụ và thuốc thử:

+ Hộp petri, đường kính 90mm

+ Que thủy tinh hình chữ U, V

+ Lá kính (tốt nhất cỡ 18 x 18mm)

+ Gốc vi nấm cần cấy

1 Đặt lam kính lên que thủy tinh uốn cong hình chữ U hay V

2 Tất cả cho vào hộp Petri, đem hấp vô trùng

3 Đổ thạch Sabouraud vào một Petri khác để nguội Dùng dao vô trùng cắt thạch thành khối 1 x 1mm, đặt thạch lên lam kính

4 Cấy nấm ở điểm giữa mỗi cạnh của khối thạch

5 Hơ nhẹ lá kính lên ngọn đèn - đậy lá kính lên khối thạch

6 Cho vào hộp 1 - 3ml nước cất vô trùng

7 Đậy nắp hộp Petri, ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm

8 Theo dõi lứa cấy: khi thấy nấm mọc, gỡ lá kính đặt lên tấm lam kính có sẵn

9 Dùng kim cấy lấy khối thạch trên lam cấy bỏ vào bình nước sát trùng

10 Làm thêm một tiêu bản thứ 2: nhỏ 1 giọt LPCB lên nấm nơi miếng thạch vừa được lấy ra Đậy lá kính lên

11 Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi

+ Nấm hoại sinh mọc: 3 - 7 ngày

+ Nấm gây bệnh mọc: 2 - 3 tuần

+ Không nên cấy trên kính các loại nấm nguy hiểm Ví dụ: Histoplasma capsulatum

+ Đảm bảo các kỹ thuật vô khuẩn trong quá trình nuôi cấy

+ Lưu giữ tiêu bản bằng cách dán kín xung quanh lá kính bằng keo sơn móng tay

- Nguyên tắc: Thạch bột bắp (ngô) là môi trường thuận lợi cho sự hình thành bào tử bao dày của các loại nấm men đặc biệt là nấm Candida spp

+ Gốc nấm cần định danh

+ Ống nghiệm chứa NaCl 0,85% vô trùng

+ Môi trường: thạch bột bắp

1 Đổ môi trường ra hộp Petri

2 Lấy gốc nấm cần cấy hòa tan vào ống nghiệm có chứa NaCl 0,85% vô trùng (có thể lấy nấm từ lứa cấy lỏng)

3 Đốt kim cấy để nguội - lấy nấm

4 Dùng kim cấy có nấm vạch sâu vào trong thạch 2 đường song song cách nhau khoảng 1cm

5 Đốt khuyên cấy để nguội, vạch đường chữ Z trên 2 đường cấy

6 Hơ lá kính trên ngọn đèn để sát trùng rồi phủ lên 2 đường cấy

8 Khi thấy nấm mọc trên 2 đường cấy, khảo sát trực tiếp nấm trong hộp cấy dưới kính hiển vi

- Nhận định kết quả: Quan sát đặc điểm hình thể của nấm dưới kinh hiển vi

+ Đảm bảo các kỹ thuật vô khuẩn trong quá trình cấy nấm

+ Có thể đổ thạch trên lam kính và cấy giống như cấy trên đĩa petri

1 Trỡnh bày hỡnh thể một số vi nấm hoại sinh: Alternaria, Cephalosporiumá

Aspergilus fumigatus, Aspergilus niger, Aspergilus flavus, Penicillium sp?

2 Trình bày nguyên lý, các bước tiến hành, nhận định kết quả của các kỹ thuật nhuộm vi nấm: kỹ thuật nhuộm mực tàu, nhuộm PAS, kỹ thuật nhuộm kháng acid?

3 Trình bày nguyên tắc, các bước tiến hành và nhận định kết quả của một số kỹ thuật nuôi cấy vi nấm?

KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN BẢO QUẢN TRỨNG GIUN SÁN

1 Thực hiện được quy trình làm tiêu bản bảo quán trứng giun, sán vỏ mỏng

2 Thực hiện được quy trình làm tiêu bản bảo quản trứng giun, sán vỏ dày

3 Thể hiện sự cẩn thận, chính xác trong khi thực hành

4 Thực hiện đúng các quy định về an toàn sinh học trong quá trình thực hành

5 Xây dựng được kỹ năng làm việc độc lập và làm việc nhóm

1.1 Chuẩn bị nhân viên y tế

- Trang phục gọn gàng đúng quy định

- Đội mũ, đeo khẩu trang

- SV chuẩn bị bài trước khi lên lớp

1.2 Chuẩn bị phòng thực hành

- Phòng thực tập ký sinh trùng

- Đầy đủ máy móc trang thiết bị

1.3 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

1.4 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

- Kính hiển vi có vật kính X10

- Lam kính, lamen, giá lam, bút kính, pipet, bàn gắn tiêu bản, giá tiêu bản, hộp tiêu bản, đền cồn

- Quy trình làm tiêu bản bảo quản trứng giun, sán vỏ dày

QUY TRÌNH KỸ THUẬT BẢO QUẢN TRỨNG GIUN SÁN VỎ DÀY

TT Các bước tiến hành

1 Chuẩn bị nhân viên y tế

2 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, bệnh phẩm

3 Ly tâm lấy cặn mẫu trứng giun, sán

4 Trộn cặn ly tâm với dung dịch gắn tiêu bản

6 Nhỏ 1 giọt hỗn hợp cặn trứng giun, sán và dung dịch gắn lên lam kính

7 Đậy lamen lên giọt hỗn hợp cặn trứng giun, sán và dung dịch

10 Thu dọn dụng cụ, hóa chất, rác thải

12 Ghi kết quả vào sổ lưu

- Quy trình làm tiêu bản bảo quản trứng giun, sán vỏ mỏng

QUY TRÌNH KỸ THUẬT BẢO QUẢN TRỨNG GIUN SÁN VỎ MỎNG

4 Nhỏ 1 giọt mẫu trứng giun sán lên lam kính

5 Đậy lamen lên giọt trứng giun sán

6 Hơ nóng bàn gắn tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn

7 Nhúng cạnh bàn gắn đã được hơ nóng vào khay gôm gắn

8 Gắn cạnh lamen bằng gôm gắn

- Gắn tiêu bản trứng vỏ mỏng: hơ bàn gắn tiêu bản nóng vừa đủ, không được để cháy gôm gắn

- Gắn tiêu bản trứng vỏ dày: trộn đều mẫu trứng giun sán trong hỗn hợp không tạo ra bọt khí

- Dạy học trực tiếp tại phòng thực hành

- Giảng viên hướng dẫn thực hành dựa trên quy trình kỹ thuật và bảng kiểm

- Sinh viên thực hành theo nhóm, lần lượt thực hiện quy trình kỹ thuật

- Theo mục tiêu bằng thang điểm

QUY TRÌNH KỸ THUẬT BẢO QUẢN TRỨNG GIUN SÁN VỎ DÀY

TT Các bước tiến hành Ý nghĩa Tiêu chuẩn phải đạt

- Thể hiện sự nghiêm túc khi làm việc

- Đảm bảo an toàn cho người làm xét nghiệm

- Trang phục đúng quy định, gọn gàng

- Tóc gọn gàng, móng tay cắt ngắn

- Đội mũ, đeo khẩu trang, đi găng đúng kỹ thuật

Thuận tiện cho quá trình thực hiện kỹ thuật xét nghiệm

- Đầy đủ dụng cụ: lam kính, bút kính, pipet nhỏ giọt…

- Hóa chất đảm bảo chất lượng: dung dịch gắn tiêu bản

+ Còn hạn sử dụng + Có nắp đậy kín + Để ở nhiệt độ phòng (25 0 C)

- Mẫu trứng giun sán: giun đũa, giun tóc, sán dây đã được bảo quản trong các dung dịch bảo quản, lưu giữ và cố định ký sinh trùng

3 Ly tâm lấy cặn mẫu trứng giun,

- Loại bỏ bớt phần dịch lỏng có trong mẫu trứng

- Mẫu trứng giun sán được ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút x

- Phần dịch nổi được loại bỏ hết

- Chuẩn bị mẫu trứng giun sán để làm tiêu bản

- Cặn trứng giun sán được trộn với dung dịch gắn với tỷ lệ 1:3

- Hỗn hợp không có bọt khí

5 Chuẩn bị lam kính - Chuẩn bị lam làm kỹ thuật

- Lam kính khô sạch, không xước

- Thông tin trên lam đúng với mẫu trứng giun, sán đã chuẩn bị

- Lấy bệnh phẩm thực hiện kỹ thuật xét nghiệm

- Giọt dung dịch nằm chính giữa lam kính, không có bọt khí

- Dàn mỏng và đểu mẫu trứng giun sán

- Lamen nằm ngay ngắn, cân đối chính giữa lam kính

- Dung dịch trong lamen tràn đều, không có bọt khí, không tràn ra khỏi lamen

8 Phơi khô tiêu bản - Hoàn thiện tiêu bản bảo quản và lưu trữ trứng giun sán vỏ dày

- Tiêu bản được xếp lên giá, khay thẳng hàng, giữa các tiêu bản phải có khoảng cách

- Phơi đến khi dung dịch trong lamen khô hoàn toàn

9 Bảo quản tiêu bản - Lưu giữ tiêu bản được lâu dài phục vụ công tác học tập và nghiên cứu

- Tiêu bản được xếp vào hộp/giá tiêu bản có nhãn phân loại

- Bảo quản ở nhiệt độ 22-25 0 C, ở nơi khô thoáng tránh ánh sáng trực tiếp, bụi bẩn

- Dụng cụ, hóa chất được bảo quản đúng quy định,

- Dụng cụ và hóa chất để đúng vị trí với điều kiện về nhiệt độ,

53 đảm bảo chất lượng cho lần xét nghệm tiếp theo

- Đảm bảo an toàn cho nhân viên y tế và cho cộng đồng độ ẩm và ánh sáng phù hợp

- Lau bề mặt bàn xét nghiệm bằng dung dịch khử trùng

- Thu gom và phân loại rác thải đúng quy định:

+ Bệnh phẩm để vào nơi quy định

+ Lam kính, găng ta bỏ vào thùng rác thải y tế

11 Rửa tay Tránh lây nhiễm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh

Thực hiện đúng 6 bước rửa tay bằng chất khử trùng

Lưu trữ, quản lý, theo dõi Ghi kết quả đầy đủ, chính xác theo quy định:

+ Loại trứng giun sán + Ngày làm tiêu bản + Số lượng tiêu bản QUY TRÌNH KỸ THUẬT BẢO QUẢN TRỨNG GIUN SÁN VỎ MỎNG

- Đầy đủ dụng cụ: lam kính, bút kính, pipet nhỏ giọt, bàn gắn tiêu bản

- Hóa chất đảm bảo chất lượng: gôm gắn tiêu bản

+ Có nắp đậy kín + Để ở nhiệt độ phòng (25 0 C)

- Mẫu trứng giun sán: giun móc/mỏ, giun kim, sán lá đã được bảo quản trong các dung dịch bảo quản, lưu giữ và cố định ký sinh trùng

3 Chuẩn bị lam kính - Chuẩn bị lam làm kỹ thuật

- Lam kính khô sạch, không xước

- Thông tin trên lam đúng với mẫu trứng giun, sán đã chuẩn bị

- Lấy bệnh phẩm thực hiện kỹ thuật xét nghiệm

- Dàn mỏng và đểu mẫu trứng giun sán

- Làm nóng bàn gắn giúp lấy được gôm gắn tiêu bản

- Chọn cạnh bàn gắn có chiều dài phù hợp với lamen

- Cạnh bàn gắn tiêu bản được làm nóng đều

- Lấy gôm gắn lên bàn gắn

- Cạnh bàn gắn bám đều gôm gắn

8 - Gắn cạnh lamen bằng gôm gắn

- Tạo thành bờ bao quanh lamen, gắn lamen chặt vào lam kính, bảo quản trứng giun sán ở phía

- Gôm gắn từ bàn gắn nhỏ từ từ và đều xuống cạnh lamen

- Bờ gụm gắn khoảng 2mm, ẵ phủ trờn lamen, ẵ phủ trờn lam

- Bờ gắn đều, mịn, khép kín 4 góc, không nứt vỡ

9 Phơi khô tiêu bản - Hoàn thiện tiêu bản bảo quản và lưu trữ trứng giun sán

- Phơi đến khi phần gôm gắn khô hoàn toàn

10 Bảo quản tiêu bản - Lưu giữ tiêu bản được lâu dài phục vụ công tác học tập và nghiên cứu

- Bảo quản ở nhiệt độ 22-25 0 C, ở nơi khô thoáng tránh ánh sáng trực tiếp, bụi bẩn

- Dụng cụ, hóa chất được bảo quản đúng quy định, đảm bảo chất lượng cho lần xét nghệm tiếp theo

- Đảm bảo an toàn cho nhân viên y tế và cho cộng đồng

- Dụng cụ và hóa chất để đúng vị trí với điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng phù hợp

+ Loại trứng giun sán + Ngày làm tiêu bản + Số lượng tiêu bản

BẢNG KIỂM KỸ THUẬT BẢO QUẢN TRỨNG GIUN SÁN VỎ DÀY

TT Các bước tiến hành Đạt Không đạt Chuẩn bị

BẢNG KIỂM KỸ THUẬT BẢO QUẢN TRỨNG GIUN SÁN VỎ MỎNG

THANG ĐIỂM KỸ THUẬT BẢO QUẢN TRỨNG GIUN SÁN VỎ DÀY

2 Đội mũ, đeo khẩu trang, đi găng

THANG ĐIỂM KỸ THUẬT BẢO QUẢN TRỨNG GIUN SÁN VỎ MỎNG

TT Các bước tiến hành Thang điểm Hệ số

STT Chỉ tiêu Yêu cầu đạt

Xác nhận của người đánh giá

1 Số lần quan sát GV/SV khác thực hiện kỹ thuật

2 Số lần thực hiện có hướng dẫn của GV 1

KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN BỌ GẬY VÀ MUỖI ANOPHELES

1 Thực hiện được quy trình làm tiêu bản bọ gậy Anopheles

2 Thực hiện được quy trình làm tiêu bản muỗi Anopheles

3 Thận trọng, tỉ mỉ, chính xác, thực hiện đúng các quy định về an toàn phòng xét nghiệm trong khi tiến hành kỹ thuật xét nghiệm

4 Thể hiện khả năng làm việc độc lập và làm việc nhóm, tổng hợp, đánh giá kết quả công việc của các thành viên trong nhóm để hoàn thành các chỉ tiêu được giao

- Mẫu muỗi và bọ gậy

- Kính hiển vi có vật kính X10, X4, kính lúp

- Lam kính, lamen, giá lam, bút kính, pipet, kim thủy tinh, tuýp thủy tinh làm tiêu bản muỗi, nút lie, bông không thấm nước

- Dung dich gắn tiêu bản, băng phiến bột

- Quy trình làm tiêu bản bọ gậy Anopheles

QUY TRÌNH KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN BỌ GẬY ANOPHELES

4 Dùng pipet nhỏ giọt hút bọ gậy đặt lên lam

5 Chỉnh sửa tư thế bọ gậy trên tiêu bản dưới kính hiển vi vật kính X4

6 Thấm hút hết nước thừa quanh bọ gậy

7 Nhỏ 1 giọt keo gắn lên bọ gậy

8 Đặt lamen lên bọ gậy

- Quy trình làm tiêu bản muỗi Anopheles

QUY TRÌNH KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN MUỖI ANOPHELES

3 Chuẩn bị ống nghiệm làm tiêu bản

4 Gây mê muỗi bằng ete

5 Cắm kim thủy tinh vào ngực muỗi

6 Chỉnh sửa tư thế muỗi trên tiêu bản dưới kính lúp

7 Cắm tim thủy tinh lên nút lie

8 Đưa tiêu bản muỗi vào tuýp thủy tinh

9 Nhúng phần nút lie vào paraphin đã được làm nóng chảy

- Làm tiêu bản bọ gậy: thấm hút nước thừa từ từ xung quanh bọ gậy không làm xô lệch hay đứt gãy các bộ phận định danh

- Làm tiêu bản muỗi: cắm kim thẳng đứng vào ngực giữa ở muỗi, chân cánh muỗi duỗi tự nhiên, không làm đứt gãy bộ phận định danh

QUY TRÌNH KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN BỌ GẬY ANOPHELES

- Đầy đủ dụng cụ: lam kính, bút kính, pipet nhỏ giọt, đĩa petri, kim có đầu nhọn, kính hiển vi, giấy thấm

- Hóa chất đảm bảo chất lượng: gôm gắn tiêu bản

- Bọ gậy muỗi Anopheles đã xử lý trong nước nóng 50-60 0

- Chuẩn bị lam làm kỹ thuật - Lam kính khô sạch, không xước

- Lấy mẫu bọ gậy thực hiện kỹ thuật làm tiêu bản

- Chỉnh sửa tư thế bộ gậy ngay ngắn đúng chiều, các bộ phận định danh được bộc lộ rõ ràng

- Chỉnh sửa tư thế bọ gậy bằng kim nhọn

- Bộ gậy nằm úp lưng trên lam kính

- Các bộ phận định danh được bộ lộc rõ ràng không đứt gẫy hoặc bị che phủ

- Loại bỏ hết nước quanh bọ gậy, không làm loãng keo gắn

- Nước quanh bộ gậy được thấm hút hết

- Các bộ phận định danh nằm ngay ngắn, không bị đứt gãy hay bị che lấp

- Làm tiêu bản bọ gậy - Keo gắn phủ đều trên bọ gậy, không có bọt khí

- Dàn mỏng và đểu keo gắn quanh bọ gậy

- Hoàn thiện tiêu bản bảo quản và lưu trữ bọ gậy

- Phơi đến khi phần gôm gắn khô hoàn toàn

- Lưu giữ tiêu bản được lâu dài phục vụ công tác học tập và nghiên cứu

63 ánh sáng trực tiếp, bụi bẩn

+ Địa điểm thu thập + Loài bọ gậy + Ngày làm tiêu bản + Số lượng tiêu bản

QUY TRÌNH KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN MUỖI ANOPHELES

2 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất,

- Đầy đủ dụng cụ: kim có đầu nhọn, kính hiển vi, kim thủy

64 bệnh phẩm tinh, túp làm tiêu bản, bông…

- Hóa chất đảm bảo chất lượng: băng phiến, paraphin, ete

- Muỗi Anopheles đã thu thập

- Chuẩn bị tuýp làm kỹ thuật lưu trữ muỗi

- Đáy ống ngiệm có nhồi bông cuốn băng phiến, độ dày 1,5-2 cm

- Làm muỗi bất động dễ làm tiêu bản

- Muỗi được gây mê bất động hoàn toàn

- Làm tiêu bản muỗi - Kim được cắm vào chính giữa ngực muỗi, chắc chắn

- Chân, cánh muỗi xòe rõ, không bị che khuất, không bị gãy rụng

- Chỉnh sửa tư thế muỗi ngay ngắn đúng chiều, các bộ phận định danh được bộc lộ rõ ràng

- Chỉnh sửa tư thế muỗi bằng kim nhọn

- Các bộ phận định danh được bộ lộc rõ ràng không đứt gẫy hoặc bị che phủ

- Gắn tiêu bản muỗi cố định trước khi đưa vào tuýp

- Kim thủy tinh đứng thẳng cân đối giữa nút lie

- Làm tiêu bản lưu trữ, bảo quản muỗi

- Tiêu bản muỗi nằm chính giữa tuýp thủy tinh, vị trớ ẵ ống nghiệm không chạm vào bông ở đáy ống nghiệm

- Tiêu bản muỗi không chmaj

- Hoàn thiện tiêu bản bảo quản và lưu trữ muỗi

- Tránh ẩm mốc làm hỏng tiêu bản

- Paraphin sau khi khô bám đều trên bề mặt nút lie, một phần bao trùm lên ống ngiệm thủy tinh, kín đều, không nứt vỡ

- Lưu giữ tiêu bản được lâu dài phục vụ công tác học tập và nghiên cứu

25 0 C, ở nơi khô thoáng tránh ánh sáng trực tiếp, bụi bẩn

+ Địa điểm thu thập + Loài muỗi

+ Ngày làm tiêu bản + Số lượng tiêu bản

BẢNG KIỂM KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN BỌ GẬY ANOPHELES

TT Các bước tiến hành Đạt Không đạt

BẢNG KIỂM KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN MUỖI ANOPHELES

THANG ĐIỂM KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN BỌ GẬY ANOPHELES

TT Các bước tiến hành Thang điểm Hệ số

THANG ĐIỂM KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN MUỖI ANOPHELES

TT Các bước tiến hành Thang điểm

KỸ THUẬT ĐỊNH DANH BỌ GẬY VÀ MUỖI ANOPHELES

1 Định danh được bọ gậy Anopheles

2 Định danh được muỗi Anopheles

3 Thận trọng, tỉ mỉ, chính xác, thực hiện đúng các quy định về an toàn phòng xét nghiệm trong khi tiến hành kỹ thuật xét nghiệm

4 Thể hiện khả năng làm việc độc lập và làm việc nhóm, tổng hợp, đánh giá kết quả công việc của các thành viên trong nhóm để hoàn thành các chỉ tiêu được giao

- Mẫu muỗi và bọ gậy

- Kính hiển vi có vật kính X10, X4, kính lúp

- Quy trình định danh muỗi Anopheles

QUY TRÌNH ĐỊNH DANH MUỖI ANOPHELES

3 Quan sát tiêu bản muỗi bằng kính lúp

- Quy trình định danh bọ gậy Anopheles

QUY TRÌNH ĐỊNH DANH BỌ GẬY ANOPHELES

3 Quan sát tiêu bản bọ gậy bằng kính hiển vi

+ Xác định đúng các bộ phận cơ thể của muỗi và bọ gậy

+ Xác định đúng các đặc điểm định danh muỗi và bộ gậy

QUY TRÌNH ĐỊNH DANH MUỖI ANOPHELES

- Đội mũ, đeo khẩu trang, đi

Anopheles, giấy bút, kính lúp

- Định danh muỗi - Nơi quan sát đủ ánh sáng

- Quan sát đúng và đủ các đặc điểm định danh muỗi

4 Định danh muỗi - Định danh muỗi - Các đặc điểm định danh được đối chiếu đúng với bảng đinh danh

- Định danh đúng loài muỗi trên tiêu bản

+ Địa điểm thu thập + Loài muỗi

QUY TRÌNH ĐỊNH DANH BỌ GẬY ANOPHELES

- Tiêu bản bọ gậy Anopheles

- Bảng định danh bọ gậyi

Anopheles, giấy bút, kính hiển vi

- Định danh bọ gậy - Quan sát bọ gậy dưới kính hiển vi vật kinh 4x và 10x

- Quan sát đúng và đủ các đặc điểm định bọ gậy

- Định danh bọ gậy - Các đặc điểm định danh được đối chiếu đúng với bảng định danh

- Định danh đúng loài bọ gậy trên tiêu bản

- Thu gom và phân loại rác

+ Địa điểm thu thập + Loài bọ gậy + Ngày làm tiêu bản + Số lượng tiêu bản

BẢNG KIỂM ĐỊNH DANH MUỖI ANOPHELES

BẢNG KIỂM ĐỊNH DANH BỌ GẬY ANOPHELES

THANG ĐIỂM ĐỊNH DANH MUỖI ANOPHELES

3 Quan sát tiêu bản muỗi bằng lúp 2

THANG ĐIỂM ĐỊNH DANH BỌ GẬY ANOPHELES

KỸ THUẬT ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

1 Xác định được mật độ ký sinh trùng sốt rét bằng phương pháp dấu (+) trên tiêu bản mẫu

2 Xác định được mật độ ký sinh trùng sốt rét trong 1mm 3 máu trên tiêu bản mẫu

3 Nghiêm túc, cẩn thận, chính xác trong khi tiến hành kỹ thuật, đảm bảo các quy định về an toàn phòng xét nghiệm

4 Chứng minh được năng lực làm việc độc lập và phối hợp nhóm để giải quyết các vấn đề học tập

- Tiêu bản máu chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét

- Kính hiển vi có vật kính vật kính dầu

- Dầu soi kính, cồn tuyệt đối, giấy thấm dầu

- Đánh giá mật độ ký sinh trùng sốt rét bằng phương pháp dấu (+)

QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

3 Quan sát tiêu bản giọt máu đặc dưới kính hiển vi

4 Đếm số lượng ký sinh trùng sốt rét trên tiêu bản máu đặc

5 Xác định mật độ ký sinh trùng SR

- Xỏc định số lượng ký sinh trựng sốt rột trong 1àL mỏu

QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

5 Xác định số lượng ký sinh trùng SR

3 Các bước cần lưu ý Đếm tất cả ký sinh trùng sốt rét và bạch cầu trong vi trường cuối cùng cả trong trường hợp đã vượt qua số lượng KST và BC cần thiết

QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

- Đầy đủ dụng cụ: kính hiển vi vật kính dầu, 2 máy đếm, giấy thấm

- Hóa chất đảm bảo chất lượng: dầu soi kính, cồn tuyệt đối

- Tiêu bản giọt máu đặc chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét

- Tìm ký sinh trùng sốt rét trên tiêu bản

- Lựa chọn vùng đếm ký sinh trùng sốt rét

- Vùng đếm sạch, ít/không có cặn

- Bạch cầu rải đều, ký sinh trùng bắt màu rõ

- Đếm số lượng ký sinh trùng sốt rét

- KST SR được đếm toàn bộ trên 100 vi trường

- Đếm 2-3 lần lấy giá trị trung bình

5 Xác định mật độ - Xách định mật độ ký sinh - Mật độ KST SR trên tiêu

79 ký sinh trùng SR trùng SR trên tiêu bản giọt đặc bản:

+: 1-10 KST/100 vi trường ++: 11-100 KST/100 vi trường +++: 1-10 KST/1 vi trường ++++: trên 10 KST/1 vi trường

6 Trả lời kết quả Trả lời kết quả xét nghiệm xác định mật độ KST SR

- Kết quả xác định mật độ ký sinh trùng:

+ Loài + Thể + Mật độ theo dấu cộng

QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

- Đảm bảo an toàn cho

- Tóc gọn gàng, móng tay cắt

80 người làm xét nghiệm ngắn

- Đầy đủ dụng cụ: kính hiển vi vật kính dầu, 2 máy đếm, giấy thấm

- Hóa chất đảm bảo chất lượng: dầu soi kính, cồn tuyệt đối

- Tiêu bản giọt máu đặc chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét

- Tìm ký sinh trùng sốt rét trên tiêu bản

- Lựa chọn vùng đếm ký sinh trùng sốt rét

- Vùng đếm sạch, ít/không có cặn

- Bạch cầu rải đều, ký sinh trùng bắt màu rõ

- Đếm số lượng ký sinh trùng sốt rét

- KST SR được đếm toàn bộ trên vi trường:

+ Nếu đếm thấy số lượng KSTSR ≥ 100 thì đếm đến

200 BC, dừng đếm và ghi kết quả số lượng KSTSR/200 BC; + Nếu đếm thấy số lượng KSTSR ≤ 99 thì đếm đến 500

BC, dừng đếm và ghi kết quả số lượng KSTSR/500 BC; + Trường hợp được xác định là âm tính (-) khi đếm 0/1000 BC;

+ Đếm tất cả KSTSR và BC ở vi trường cuối cùng, ngay cả khi số lượng BC vượt quá

- Đếm 2-3 lần lấy giá trị trung bình

- Xách định số lượng ký sinh trựng SR/1àL

- Số lượng KST SR được tính toán theo công thức

6 Trả lời kết quả Trả lời kết quả xét nghiệm xác định mật độ KST SR

- Kết quả xác định số lượng ký sinh trùng:

BẢNG KIỂM KỸ THUẬT ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

5 Xác định mật độ ký sinh trùng SR

BẢNG KIỂM KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG KÝ SINH TRÙNG SỐT

THANG ĐIỂM KỸ THUẬT ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

3 Quan sát tiêu bản giọt máu đặc dưới kính hiển vi 2

5 Xác định mật độ ký sinh trùng SR 2

THANG ĐIỂM KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG KÝ SINH TRÙNG SỐT

3 Quan sát tiêu bản giọt máu đặc dưới kính hiển vi 2

5 Xác định số lượng ký sinh trùng SR 2

KỸ THUẬT NUÔI CẤY CHẨN ĐOÁN VI NẤM

1 Thực hiện được quy trình và nhận định được kết quả của một số kỹ thuật nuôi cấy chẩn đoán vi nấm

2 Nghiêm túc, cẩn thận, chính xác trong khi tiến hành kỹ thuật, đảm bảo các quy định về an toàn phòng xét nghiệm

3 Chứng minh được năng lực làm việc độc lập và phối hợp nhóm để giải quyết các vấn đề học tập

- Tủ an toàn sinh học cấp 2, đèn cồn, que cấy/kim cấy nấm, lam kính, lamen, đĩa petri…

- Hóa chất: thạch Sabouraud/ thạch khoai đường, thạch bột bắp, thuốc nhuộm xanh Lacto-phenol…

- Quy trình kỹ thuật cấy nấm trên kính

QUY TRÌNH KỸ THUẬT CẤY NẤM TRÊN KÍNH

3 Đặt lam kính lên que thủy tinh chữ U hoặc V đặt trong đãi petri, đã được hấp vô trùng

4 Cắt thạch Sabouraud thành khối 1x1mm, đặt lên lam kính trong đĩa petri

5 Cấy nấm ở điểm giữa mỗi cạnh của khối thạch Sabouraud

6 Hơ nóng nhẹ lamen đặt lên trên khối thạch

7 Cho vào trong đĩa petri 1-3ml nước cất vô khuẩn

8 Đậy nắp đĩa petri , ủ ở nhiệt độ phòng 22-25 0 C

10 Khi thấy nấm mọc, gỡ lamen đặt lên lam kính có sẵn 1 giọt LPCB (tiêu bản 1)

11 Loại bỏ khối thạch trên lam cấy, giữ lại lam cấy

12 Nhỏ 1 giọt LPCB lên vị trí khối thạch trên lam cấy, đậy lamen (tiêu bản 2)

13 Khảo sát 2 tiêu bản dưới kính hiển vi

- Quy trình kỹ thuật cấy nấm Dalmau

QUY TRÌNH KỸ THUẬT CẤY NẤM DALMAU

3 Chuẩn bị đĩa môi trường cấy nấm

4 Hòa tan mẫu nấm cần cấy trong nước muối sinh lý vô khuẩn

5 Dùng que cấy lấy huyền dịch nấm vạch sâu vào thạch 2 đường song song

6 Khử trùng que cấy, để nguội, vạch những đường chữ Z trên 2 đường cấy

7 Hơ nóng nhẹ lamen đặt lên 2 đường cấy

8 Đậy nắp đĩa petri , ủ ở nhiệt độ phòng 22-25 0 C, trong 3-5 ngày

Không nên cấy trên kính các loại nấm nguy hiểm, ví dụ: Histoplasma cpsulatum

QUY TRÌNH KỸ THUẬT CẤY NẤM TRÊN KÍNH

TT Các bước tiến hành Ý nghĩa Tiêu chuẩn phải đạt Chuẩn bị

- Đầy đủ dụng cụ: kính hiển vi, hộp petri, que cấy nấm, lá kính, lamen, que thủy tinh chữ U hoặc V…

- Hóa chất đảm bảo chất lượng: Thạch Sabouraud hoặc thạch khoai đường, thuốc nhuộm xanh lacto- phenol…

3 Đặt lam kính lên que thủy tinh chữ U hoặc

V đặt trong đãi petri, đã được hấp vô trùng

- Chuẩn bị đĩa petri cấy nấm - Ghi thông tin mẫu nấm cần cấy đầy đủ trên đĩa cấy nấm

- Lam kính, que thủy tinh trong đĩa petri đã được hấp sấy vô khuẩn

- Lam kính nằm cân đối trên que thủy tinh

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm

- Khối thạch vuông đều, kích thước 1x1mm

- Khối thạch đặt chính giữa lam kính trong đĩa petri

- Cấy nấm trên thạch - Nấm được cấy ở chính giữa mỗi cạnh của khối thạch, không làm vỡ thạch

- Đảm bảo các kỹ thuật vô trùng

- Tạo môi trường cho nấm dễ dàng phát triển

- Lamen được đặt che phủ hoàn toàn bề mặt khối thạch

- Đảm bảo kỹ thuật vô trùng

- Mực nước phủ kín đáy hộp petri, không chạm đến lam kính

8 Đậy nắp đĩa petri , ủ ở nhiệt độ phòng 22-

- Đĩa cấy nấm được đặt trên mặt phẳng, nắp đĩa

9 Theo dõi lứa cấy - Quan sát theo dõi sự phát triển của nấm

- Đĩa cấy được theo dõi hàng ngày

10 Khi thấy nấm mọc, gỡ lamen đặt lên lam kính có sẵn 1 giọt

- Làm tiêu bản soi tươi nấm với LPCB

- Gỡ và đặt nhẹ nhàng lamen lên lam kính

- Dung dịch LPCB tràn đều trong lamen cấy nấm, không có bọt

- Làm tiêu bản thứ 2 để soi phát hiện nấm

- Khối thạch được bỏ vào dung dịch sát khuẩn

- Nấm không bị rơi vãi ra xung quanh

- Làm tiêu bản thứ 2 để soi phát hiện nấm

Phát hiện sợi tơ nấm và bào tử nếu có trong tiêu bản

- Phát hiện đúng các loại nấm có trong tiêu bản: + Nấm hoại sinh mọc: 3-7 ngày

+ Nấm gây bệnh mọc: 2-3 tuần

- Thu gom và phân loại rác thải đúng quy định: + Bệnh phẩm để vào nơi

89 quy định + Lam kính, găng ta bỏ vào thùng rác thải y tế

+ Nấm gây bệnh/nấm hoại sinh

QUY TRÌNH KỸ THUẬT CẤY NẤM DALMAU

TT Các bước tiến hành Ý nghĩa Tiêu chuẩn phải đạt Chuẩn bị

- Đầy đủ dụng cụ: kính hiển vi, hộp petri, que cấy nấm, lá kính, lamen

- Hóa chất đảm bảo chất lượng: Thạch bột bắp, nước muối sinh lý vô khuẩn

- Chuẩn bị đĩa petri cấy nấm - Ghi thông tin mẫu nấm cần cấy đầy đủ trên đĩa cấy nấm

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm

Nấm tan đều trong nước muối sinh lý

- Cấy nấm trên thạch - Thạch không bị vỡ, đường vạch thẳng đều, song song cách nhau 1 cm

- Cấy nấm trên thạch - Que cấy nguội hoàn toàn trước khi cấy

- Thạch không bị vỡ, đường vạch thẳng đều

- Lamen được đặt ngay ngắn trên 2 đường cấy

8 Đậy nắp đĩa petri , ủ ở nhiệt độ phòng 22-

- Đĩa cấy được theo dõi hàng ngày

- Làm tiêu bản soi tươi nấm với LPCB

- Gỡ và đặt nhẹ nhàng lamen lên lam kính

Phát hiện nấm trong tiêu bản - Phát hiện đúng các loại nấm có trong tiêu bản

- Thu gom và phân loại rác thải đúng quy định: + Bệnh phẩm để vào nơi quy định

+ Nấm gây bệnh/nấm hoại sinh

BẢNG KIỂM QUY TRÌNH KỸ THUẬT CẤY NẤM TRÊN KÍNH

3 Đặt lam kính lên que thủy tinh chữ U hoặc V đặt trong đãi

92 petri, đã được hấp vô trùng

5 Cấy nấm ở điểm giữa mỗi cạnh của khối thạch Sabouraud

BẢNG KIỂM QUY TRÌNH KỸ THUẬT CẤY NẤM DALMAU

6 Khử trùng que cấy, để nguội, vạch những đường chữ Z trên

8 Đậy nắp đĩa petri , ủ ở nhiệt độ phòng 22-25 0 C, trong 3-5

THANG ĐIỂM KỸ THUẬT CẤY NẤM TRÊN KÍNH

3 Đặt lam kính lên que thủy tinh chữ U hoặc V đặt trong đãi petri, đã được hấp vô trùng

THANG ĐIỂM KỸ THUẬT CẤY NẤM CẤY NẤM DALMAU

8 Đậy nắp đĩa petri , ủ ở nhiệt độ phòng 22-25 0 C, trong 3-

HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG GIÁO TRÌNH

Tiêu đề	Ký sinh trùng nâng cao
Tác giả	Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Hà Thị Nguyệt Minh, Bùi Huy Tùng
Trường học	Trường Cao đẳng Y tế Hà Nội
Chuyên ngành	Kỹ thuật xét nghiệm y học
Thể loại	Giáo trình
Năm xuất bản	2021
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	97
Dung lượng	1,39 MB