NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:- Xây dựng quy trình chiết cao ngải cứu giàu sesquiterpen lactones.- Đánh giá hoạt tính ức chế xanthine oxidase từ cao tổng và các cao phân đoạn.- Phân lập và xác đị
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây ngải cứu
Ngải cứu thuộc chi Artemisia, thuộc họ thực vật Compositae (Asteraceae) khoảng gồm 300 loài cây cỏ, bụi, hằng niên, lưỡng niên hay lưu niên, mọc ở một số vùng của khu Bắc Bán Cầu, tại Nam Mỹ chỉ có vài loài, còn ở Nam Phi chỉ có một loài duy nhất Trung Quốc có hai tên gọi là Quinnhao và Quinggao, trên thế giới có rất nhiều loài cây, gồm từ nhiều loài cây bụi đến những cây cao khoảng 4m [22,24] Thành phần hóa học của chi này rất đa dạng và phong phú Ở Việt Nam có 15 loài thuộc chiArtemisia, trong đó có 4 loài rất giống nhau về ngoại hình, cụ thể: [1,2] :
Artemisia campestrist (thanh cao biển)
Danh pháp cây ngải cứu [1-5] :
Tên khoa học:Artemisia VulgarisL.
Tên thường gọi: Ngải cứu, ngải diệp (miền Nam), nhả ngải (tiếng Tày), quá sú (tiếng H’mông), cỏ linh li (tiếng Thái),…
Tên khác: Motherwort, Maidenwort, Mugwort (Anh), Cordon de S Jose (Tây Ban Nha), Armoise commune (Pháp),…
Ngải cứu thuộc họ thân thảo, là loại cây sống lâu năm và thường cao từ 0,4 - 1m.Ngọn thân dài không quá 30cm, có khía dọc, màu vàng nâu hay xám, có lông tơ Lá mọc so le, có cuốn hoặc không, thường nhăn nheo, cuộn vào nhau Chúng có nhiều hình dạng như hình mác, lá phía dưới xẻ một hoặc hai lần có hình lông chim Mặt trên lá màu xám đến màu xanh đen, nhẵn và có rất ít lông tơ Vi phẩu các bộ phận cây ngaỉ cứu được mô tả cụ thể [17] :
Thân cây ngải cứu thường thẳng đứng và có một phần đỏ tím, thân cành mọc sum suê, có rãnh và lông nhỏ Các lá dài 5-20 cm, màu xanh lá cây thẫm, hình mũi giáo, xẻ thùy lông chim, với các sợi lông trắng dày đặc hai mặt trên, dưới[1-5,16,17]. Hoa mọc thành chùm kép gồm nhiều cụm hoa đầu; mang hoa cái hoặc hoa lưỡng tính, thường là hoa cái; hoa cái tràng hình ống, cụt hoặc có răng cưa ở đầu, hoa lưỡng tính trên cùng một cụm hoặc ở nhiều cụm khác nhau, thường thì hoa cái chiếm nhiều hơn, tràng hoa cái có cái ống mảnh, cụt hoặc có răng ở hai đầu, tràng hoa lưỡng tính có dạng hình hình phễu, có 5 thùy uốn cong ra phía ngoài Những bông hoa nhỏ (dài ~ 5 mm) đối xứng với nhiều cánh hoa màu vàng hoặc màu hồng. Cụm hoa hẹp và rất nhiều, sinh thành chùm Hoa trổ từ tháng 7-tháng 10 Ngải cứu là cây ưa ẩm, dễ trồng bằng cách giâm cành những đoạn gốc thân già[1-5,16,17].
Quảbé thuôn nhỏ Mùa hoa quả vào tháng 10-12 [16,17]
Lángải thường có mùi thơm nồng và có vị hơi đắng hoặc rất đắng tùy theo mùa. Tuy nhiên thông thường chúng được thu hoạch giai đoạn từ thâng 5 đến tháng 6 tại Việt Nam.
Hình 2.1 Hình cây ngải cứu khi chưa hình thành hoa [22.23]
Hình 2.2 Cây ngãi cứu [22] , (A) Hình cây ngải cứu, (B) Hình hoa cây ngải cứ, (C) hình lá cây ngải cứu, (D) chi tiết hình hoa ngải cứu [24] Đặc tính phân bố và thu hái chế biến:
Ngải cứu phân bố rộng khắp thế giới, phát triển nhất ở vùng nhiệt đới Nam Á, các nước Đông Nam Á, Ấn Độ, Pakistan, Srilanca, Banglades và Trung Quốc [23,24] Ở nước ta, ngải cứu được trồng từ lâu đời trên khắp các vùng miền từ Nam tới Bắc và mọc hoang nhiều nơi chẳng hạn như vườn cây, lề đường Ngải cứu có ưu điểm thích hợp với các vùng đất nghèo dinh dưỡng như các khu vực đồng cỏ và hoang hóa [1] Hiện nay phần lớn cây ngải cứu được trồng theo xung quanh nhà và vườn của người dân với quy mô nhỏ, chưa thấy trồng với quy mô lớn, tập trung phục vụ cho sản xuất công nghiệp.
Thu hái lá vào hai mùa xuân, hạ (thường hái vào dịp Tết Đoan ngọ, mồng 5 tháng 5 âm lịch Khi hoa chưa nở, lá đang tươi tốt, cắt lấy lá đem phơi khô trong râm thì được ngải diệp [1-5] Loại lá ngải cứu khô, mặt dưới màu vàng trắng tro, lá có nhiều lông nhung, mùi thơm đậm, không lấy cành già và loại bỏ tạp phẩm, ngải cứu hong khô vừa phải đảm bảo không nát vụn không bị ẩm mốc Lá ngải cứu phải là toàn lá hoặc chỉ lẫn ít cành non, nhỏ, đường kính dưới 2mm [1,5,17] Theo kinh nghiệm dân gian lá ngải cứu càng để lâu càng tốt.
Lá ngải cứu sau khi thu hoạch, phơi khô và bảo quản trong túi kính đảm bảo lượng ẩm phù hợp tránh ẩm mốc, tránh côn trùng xâm hại.
Hình 2.3 Sản phẩm ngải cứu khô [1]
2.1.3 Một số bài thuốc chữa bệnh trong dân gian từ cây ngải cứu [1-5] Tại Việt Nam có rất nhiều cách sử dụng cây ngải cứu trong điều trị một số bệnh và được tác giả Đỗ Tất Lợi cũng như một số tài liệu lưu hành các bài thuốc Đông y khác nhau về cách sử đụng Dưới đây là một số bài thuốc được sử dụng phổ biến.
Một tuần trước ngày kinh dự kiến, mỗi ngày lấy 6-12gr (tối đa 20gr) sắc với nước hoặc hãm với nước sôi như trà, chia làm 3 lần uống trong ngày Có thể uống dưới dạng bột (5-10gr) hay dạng cáo đặc (1-4gr) Nếu kinh nguyệt không đều thì hàng ngày bắt đầu kỳ kinh và cả những ngày đang có kinh, lấy ngải cứu khô 10gr, thêm 200ml nước, sắc còn 100ml, thêm chút đường để uống, chia 2 lần/ngày Có thể uống liều gấp đôi, cũng 2 lần/ngày Sau 1-2 ngày sẽ thấy hiệu quả, người đỡ mệt, máu kinh đỏ, ít hơn.
Những người đang mang thai, nếu thấy có hiện tượng đau bụng, ra máu, dùng 16gr lá ngải cứu, 16gr lá tía tô, sắc cùng với 600ml nước, sắc còn 100ml, chia làm 3-4 lần uống/ngày Ngải cứu không có tác dụng kích thích với tử cung có thai nên không gây sảy thai.
Lấy lá ngải cứu tươi giã nát, thêm 1/3 muỗng cà phê muối đắp lên vết thương, cầm máu nhanh, giảm đau nhức.
Lá ngải cứu tươi giã nát, đắp lên mặt, để khoảng 20 phút, rồi rửa lại mặt, làm liên tục như vậy sẽ có làn da trắng sáng hồng Với trẻ em thường hay bị rôm sảy thì lấy lá ngải cứu xay nát rồi lọc lấy nước cho trẻ tắm.
Đau thần kinh tọa, nhức buốt khớp xương, đau đầu hoa mắt
Lấy 300gr ngải cứu rửa sạch, giã nát, thêm 2 muỗng mật ong (ruồi, nghệ), vắt lấy nước uống trưa, chiều Uống liên tục trong 1-2 tuần.
Tăng lưu lượng máu lên não
Lấy một nắm lá ngải cứu, xắt nhỏ, đánh tan đều với một quả trứng gà, nêm hạt nêm vừa miệng, đổ vào chảo chiên chín rồi ăn.
Suy nhược cơ thể kém ăn
Lấy 250gr ngải cứu, 2 quả lê, 20gr câu kỷ tử , 10gr đinh quy, 1 con gà ri (gà ác) 150gr, hầm trong 0,5 lít nước ( thêm gia vị, bột nêm) còn 250ml Chia làm 5 phần, ăn cả ngày và liên tục 1-2 tuần cơ thể sẽ phục hồi.
Cảm cúm, ho, đau cổ họng, đau đầu, đau dây thần kinh
Nấu lá thuốc ngải cứu với 100gr lá tía tô, 100gr tần dầy lá, 50gr lá xả trong
1 lít nước còn 0,5 lít Uống lúc khát, uống liên tục trong 3-5 ngày.
Một số công trình nghiên cứu về cây ngãi cứu
Ngải cứu là một trong những loài được biết đến nhiều nhất của chiArtemisia, có sự phân bố rộng rãi trong các môi trường sống tự nhiên trên toàn thế giới trãi rộng từ Châu Âu, Châu Á, Bắc và Nam Mỹ và Châu Phi [23,24] Trong nhiều thế kỷ, ngải cứu được sử dụng chủ để điều trị các bệnh phụ khoa và các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa đã được nghiên cứu và sử dụng bao gồm tại Việt Nam và nhiều nước trên thế giới[1,2,25,26,27].
Một số hoạt tính được ghi nhận trong một số công trình nghiên cứu từ năm
2008 đến nay cũng đã được chứng minh rằng ngải cứu có nhiều tác dụng mới khác nhau như chống oxy hóa, hạ lipid máu, bảo vệ gan, chống co thắt, giảm đau, estrogen, gây độc tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm, hạ huyết áp và tiêu phế quản thông qua các thành phần hóa học phong phú được tìm thấy trong cây ngải cứu gồm tinh dầu, flavonoid, sesquiterpene lacton, axit phenolic, coumarin và các nhóm chất chuyển hóa khác đã minh chứng cho các tác dụng khác nhau của nó [28-32]
Năm 2008, Temraz, A cùng cộng sự đã thực hiện nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết nước từ cây ngải cứu Kết quả cho thấy cả lần thí nghiệm thứ nhất và thứ hai đều cho thấy dịch chiết nước của ngải cứu có khả năng loại bỏ cỏc gốc 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) ở IC50 = 11,4 àg/mL và cỏc gốc oxit nitric (NO) ở IC50 = 125 mg/mL Do đó dịch chiết ngải cứu có thể hữu ích để điều trị các bệnh liên quan đến stress [34] Ngoài ra trong ngải cứu chứa nhiều loại chất chống oxy hóa như glutathione (chất chống oxy hóa mạnh), vitamin C, superoxide dismutase, các chất này ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa các chất khác bằng cách khử đi các gốc tự do, kiềm hãm quá trình oxy hóa Từ đó cho thấy ngải cứu là một nguồn tiềm năng của chất chống oxy hóa tự nhiên.
Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết từ rễ cây ngải cứu tác động đến việc hạ lipid và hạ đường huyết đã được K.Abedulla Khan khảo sát đánh giá Kết quả cho thấy dịch chiết rễ cây ngải cứu có tác dụng hạ lipid máu rõ rệt ở chế độ ăn kiêng và liều tác dụng là 100 mg/kg mỗi ngày trong 4 tuần; Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết rễ cây ngải cứu cũng giúp hạ đường huyết đáng kể tương tự như nhóm thuốc rosuvastatin được dùng làm thí nghiệm đối chứng trong nghiên cứu [18,35] Tuy nhiên kết quả nghiên cứu cần nghiên cứu sâu hơn nữa để có kết luận chính xác cơ chế tác động của dịch chiết rễ cây ngải cứu đến tác động hạ lipid máu và đường huyết.
Dịch chiết xuất ngải cứu cũng được chứng minh có tác dụng chống co thắt hiệu quả đối với khí quản và ruột non thông qua các hợp chất chính gồm chloroform—yomogin và 1,2,3,4-diepoxy-11(13)-eudesmen-12,8-olide đã được phân lập và đánh giá với liều lượng có tác dụng từ 500mg/kg và 1000mg/kg Kết quả ức chế đến 48% và 59% các cơn co thắt [36] Nó còn được chứng minh có hiệu quả tốt đối với việc điều trị rối loạn đường hô hấp, ho và hen suyễn, giãn phế quản, giản khí quản và chống tiêu chảy thông qua dịch chiết thô của cây ngải cứu Bên cạnh đó dịch chiết từ lá và thân ngải cứu với nước cho thấy các chất chiết xuất này giúp trì hoãn việc khởi phát các cơn động kinh và giảm tỷ lệ tử vong Các tác giả cho rằng các alkaloid, coumarin, flavonoid, saponin, sterol, tannin và terpen là những hợp chất có tác dụng chính trong việc tiêu phế quản phụ thuộc nồng độ (0,03–10 mg/mL) của chiết xuất ngải cứu [32,35] Các công trình cũng chỉ ra rằng yomogin (sesquiterpenoid lactone) là hợp chất chịu trách nhiệm cho hoạt động này.
Một thí nghiệm khác về tác dụng giảm đau do dịch chiết ngải cứu với nhiều nồng độ khác nhau và đối chứng dương là morphin 20 mg/kg Kết quả thí nghiệm được báo cáo là nồng độ dịch chiết thấp không thể hiện giảm các đợt đau tại các nồng độ thấp 250mg/kg Tuy nhiên tại nồng độ 500 mg/kg và 1000 mg/kg cho thấy số lần đau đã có giảm [36] Từ đó các tác giả khẳng định dịch chiết ngải cứu có tác dụng chống nhiểm trùng ngoại biên vừa phải nhưng không phải là tác dụng chính của dịch chiết ngải cứu.
Các flavonoid có trong cây ngải cứu đã được đánh giá về tác động đến nội tiết tố Tác dụng ảnh hưởng đến nội tiết tố được quan sát thấy thí nghiệm bằng 5% so với 17-β-estradiol ở dịch chiết ngải cứu ethyl acetate, trong khi chiết xuất ethanol ít phân cực hơn cho thấy không có tác dụng Sau khi thử nghiệm các flavonoid riêng lẻ của cây, người ta quan sát thấy rằng tác dụng ảnh hưởng lên nội tiết tố được gây ra đáng kể bởi eriodictyol và apigenin [37,38] Các tác dụng này này cũng được đánh giá là phụ thuộc vào nồng độ của chúng có trong dịch chiết.
Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của ngải cứu cũng đã được các nhà khoa học thực hiện thông qua cao chiết methanol đối với cây ngải cứu để thí nghiệm phân tích tác dụng gây độc tế bào của nó đối với các dòng tế bào ung thư ở người gồm MCF7- dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú phụ thuộc estrogen, A549
- dòng tế bào ung thư phổi, HeLa - dòng tế bào ung thư cổ tử cung và các dòng tế bào bình thường, A7R5 - dòng tế bào cơ trơn mạch máu, 293T- dòng tế bào thận phôi người Tác dụng ức chế có ý nghĩa thống kê đã được quan sát thấy đối với
MCF7 (IC50 = 190 ng/mL), HeLa (IC50 = 284 ng/mL), A7R5 (IC50 = 382 ng/mL) và 293T (IC50 = 317 ng/mL), trong khi đó ảnh hưởng yếu được đối với các tế bào A549 (IC50 = 778 ng/mL) [39] Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng những hoạt động này được gây ra bởi các flavonoid và các hợp chất phenolic khác có trong cây ngải cứu [38] Bên cạnh đó tinh dầu ngải cứu trong quá trình nghiên cứu cho thấy có hiệu quả hơn trong việc gây ra apoptosis ở các dòng tế bào ung thư khác nhau so với các tế bào không ung thư Dựa trên những quan sát này, các tác giả cho rằng ngải cứu có thể là nguồn cung cấp các chất chống ung thư mới đầy hứa hẹn [41]
Ngoài các tác dụng trên ngải cứu còn có tác dụng kháng viêm, chống viêm khớp, chống dị ứng, bảo vệ gan và một số công dụng đã được ứng dụng từ lâu như tẩy giun sáng, tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn, chống sốt rét, xua đuổi côn trùng [40-44] Bên cạnh các tác dụng được minh chứng thông qua các thành phần hóa học có trong cây ngải cứu thì tinh dầu có trong ngải cứu cũng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như là gia vị trong ngành công nghiệp thực phẩm. Ngày nay tinh dầu ngãi cứu ngày càng được sử dụng nhiều trong sản xuất mỹ phẩm ở Châu Âu, Châu Á và một số vùng ở Bắc Mỹ Tinh dầu có trong cây ngải cứu góp phần nâng cao tầm quan trọng của loài này ở nhiều lĩnh vực khác nhau [39,44]
Tại Việt Nam ngải cứu cũng được sử dụng phổ biến từ lâu trong y học dân gian để chữa nhiều bệnh như đau đầu, thuốc điều hòa kinh nguyệt, rong kinh, sẩy thai, bồi bổ sức khỏe [1-5] Bên cạnh đó cũng đã có một số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và dược tính một số hợp chất được phân lập từ cảy ngải cứu tại Việt Nam, cụ thể:
Theo Võ Thị Thu Hà, Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành (Tạp chí Khoa Học & Công Nghệ Số 1) “Khảo sát tác động kháng viêm của một số hợp chất flavonoid phân lập từ cây ngải cứu (Artemisia vulgaris asteraceae) trên chuột nhắt trắng”, với 2 đối tượng nghiên cứu NC1 (5,7-Dihydroxy-6,3’,4’-trimethoxy flavone) và NC2 (5,7,3-Trihydroxy-6,4’,5’-trimethoxy flavone) thuộc nhóm flavonoid được chọn để tiến hành khảo sát tác động kháng viêm của chúng với đối chứng là diclofenac 5mg/kg Kết quả thí nghiệm cho thấy NC2 thể hiện tác động kháng viêm sớm, nhanh, mạnh và duy trì ổn định trong suốt quá trình thử nghiệm, còn hợp chất
NC1 thể hiện tác động kháng viêm chậm và yếu hơn Hiệu quả kháng viêm của NC2 (5 mg/kg) tương đối mạnh hơn tác động kháng viêm của diclofenac (5 mg/kg), khả năng ức chế viêm của NC2 bằng 117% so với diclofenac Dựa trên cấu trúc của hai chất chiếc từ ngải cứu NC1 và NC2 nhóm tác giả đã nhận định rằng sự gia tăng số lượng nhóm hydroxyl (- OH) trong cấu trúc hợp chất đã làm gia tăng đáng kể tác động kháng viêm.
Cấu trúc hợp chất NC1 (5,7-Dihydroxy-6,3’,4’-trimethoxy flavone) và NC2 (5,7,3-Trihydroxy-6,4’,5’-trimethoxy flavone) chiết suất từ cây ngải cứu được sử dụng trong thí nghiệm
Hình 2.4 Cấu trúc chất NC1
Hình 2.5 Cấu trúc chất NC2 (5,7,3-Trihydroxy-6,4’,5’-trimethoxy flavone) [47]
Tiếp đó 2019 Võ Thị Thu Hà tiếp tục thực hiện nghiên cứu khảo sát tác động kháng viêm của một số hợp chất terpenoid được phân lập từ cây ngải cứu. Trong công trình nghiên cứu này của nhóm tác giả các hợp chất được phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm gồm NC11 (Dehydromatricarin), NC12 (Moxartenolid), NC16 (Santamarin) là các hợp chất terpenoid được phân lập từ cây ngải cứu (Artemisia vulgaris L– Asteraceae) với đối chứng là diclofenac5mg/kg Kết quả cho thấy tác động kháng viêm ở cùng liều 5mg/kg của NC16 vàNC12 gần tương đương nhau và mạnh hơn NC11 Tuy nhiên tác động kháng viêm của các hợp chất chiết từ cây ngải cứu có tác động chậm hơn so với đối chứng và xuất hiện hầu hết vào ngày thứ 4 đến ngày thứ 6 sau uống Điều này cho thấy hợp chất phân lập và xác định được cấu trúc chưa phù hợp với các tác dụng kháng viêm mà ứng dụng thực tế có được từ cây ngãi cứu Cấu trúc các chất phân lập được từ cây ngải cứu và đánh giá khả năng kháng viêm của chúng trong thí nghiệm ở công trình nghiên cứu này.
Sesquiterpene lactones
Sesquiterpene lactones (SLs) là một loại sesquiterpenoid có chứa vòng lactone Chúng thường được tìm thấy nhiều trong các loại thực vật thuộc họ Arteraceae (cúc, cúc tây) Bên cạnh đó SLs còn được tìm thấy ở một số họ cây khác như họ Umbelliferae (cần tây, rau mùi tây, cà rốt) và Magnoliaceae (mộc lan).
Về tính chất hóa lý thì SLs là một tập hợp các chất rắn không màu, kém phân cực, về dược liệu SLs là nguồn dược liệu phong phú được tìm thấy trong tự nhiên Trong một số nghiên cứu còn cho thấy SLs là một trong những nhóm chất chuyển hóa thứ cấp phổ biến và có ý nghĩa quan trọng về mặt sinh học, có thể đóng một vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe con người Một số nghiên cứu đã chứng minh sesquiterpene lacton ngoài ứng dụng trong điều trị các bệnh khác như tiêu chảy, bỏng, cúm, thoái hóa thần kinh, chống ung thư và khả năng chống viêm thì chúng còn có các tác dụng khác được ứng dụng trong y học và nông nghiệp [61-64] Đặc biệt sesquiterpen lactone là một hợp chất cũng được tìm thấy trong cậy ngải củu và hầu hết họ Artemisia Tuy nhiên việc phân lập, xác định chính xác cấu trúc và hoạt tính sinh học của các chất cụ thể vẫn còn chưa được đánh giá đầy đủ.
Ngải cứu là cây trồng được phân bố trải dài trên cả nước ta, việc nghiên cứu xác định hàm lượng sesquiterpene lactones và xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thuộc họ sesquiterpene lactones có trong cây ngải cứu tại Việt Nam sẽ góp phần ý nghĩa vào việc đánh giá tiềm năng dược liệu cũng như khả năng ứng dụng của cây ngải cứu tại Việt Nam trong điều trị bệnh.
Cấu trúc của một chất hữu cơ thuộc họ sesquiterpen lactone được phân lập từ cây thuộc chiArtemisia [65.66]
Hình 2.15 Cấu trúc một số sesquiterpen lactone từ chiArtemisia [65]
Trong các chất hữu cơ thuộc nhóm sesquiterpen lactone chiết suất từ họArtemisiacó arteminisin là chất có hàm lượng thể hiện tính đặc trưng nhất và có cả trong 7 loài củaArteraceae Hàm lượng của nó chiếm từ 0,05 - 8% [76,77] hàm lượng khô của mẫu thí nghiệm Ngoài ra cấu trúc hóa học của arteminisin còn là nền tảng cho việc tổng hợp một số loại thuốc chống sốt rét như pyronaridine, lumefantrine (benflumetol), naphthoquine, v.v
Artemisinin và các dẫn xuất của nó ngoài các hoạt tính sinh học đặc trưng nó còn có tác dụng thứ hai là thuốc chống ung thư [67] Một số công trình nghiên cứu đã chứng minh Artemisinin có hiệu quả cao trong việc chống lại nhiều loại tế bào ung thư, với một số tác dụng phụ nhỏ đối với tế bào bình thường ở bệnh nhân ung thư [68,69] Cơ chế chống ung thư của artemisinin dựa trên sự phân cắt cầu endoperoxide của nó bằng sắt trong tế bào ung thư và sự hình thành các gốc tự do. Các gốc tự do sẽ tạo ra những thay đổi của tế bào như apoptosis, tổn thương axit deoxyribonucleic (DNA), điều chỉnh phản ứng của thụ thể trung tâm, ngừng tăng trưởng, ức chế hình thành mạch, ức chế sự xâm lấn của khối u, di cư và di căn. Những tác dụng đa hướng này có thể giải thích cho hiệu quả của các hợp chất artemisinin trong các loại ung thư đa kháng thuốc.
Trên cơ sở đó cho thấy việc điều tra hoạt động sinh học của các loài Artemisia và các thành phần của chúng là cần thiết Nhằm khám phá toàn bộ tiềm năng đa dạng của các loài Artemisia và các thành phần hóa học của chúng nhằm chống lại ung thư, sốt rét, chống nhiễm trùng cũng như các tác dụng chống bệnh gout [70] Thuốc artemisinin cũng có thể phát huy tác dụng có lợi trong điều trị các bệnh phổ rộng như béo phì, tiểu đường và các rối loạn liên quan đến lão hóa Vì vậy tìm hiểu về dẫn xuất của Artemisinin đối với cảy ngải cứu tại Việt Nam là rất cần thiết nói riêng và đối với nhóm sesquiterpen lactones nói chung.
Trong quá trình nghiên cứu thực hiện các bước đánh giá sơ bộ rất quan trọng trong nghiên cứu thành phần các chất hữu cơ thiên nhiên Đối với những hợp chất chiết có nhiều thành phần thông thường phải trải qua nhiều công đoạn mới đánh giá được phân đoạn cần tìm Đặc biệt SLs là tập hợp những chất có trong thực vật nên việc đánh giá nhanh, đơn giản, rẻ tiền và tiện dụng được sử dụng trong phòng thí nghiệm là rất cần thiết Do thực tế là hầu hết các lacton sesquiterpene là các hợp chất kém bền nhiệt, ít bay hơi nên chúng không có các nhóm chức đặc trưng cụ thể trong phân tử hay nhạy cảm với môi trường axit và bazơ nên việc xác định và định lượng chúng là một nhiệm vụ khó khăn đối với người phân tích Một khía cạnh khác vấn đề sự phức tạp của các mẫu thực vật, có thể chứa các hợp chất gây cản trở quá trình phân tích Tuy nhiên việc xác định gián tiếp hàm lượng SLs thông artemisinin bởi phương pháp phân tích phổ IR có thể được thực hiện dễ dàng hơn Sự hiện diện của nhóm carbonyl có mặt trong trong hầu hết các hợp chất sesquiterpen và được xác định ở các vị trí cụ thể như tai vị trí bước sóng 1766 cm -1 ,
1726 cm −1 /1783, 1733 cm−1 /1773, 1734 cm−1 /1778 và 1734 cm−1 Bên cạnh FTIR thì UV-vis cũng là một trong những phương pháp giúp xác định một số chất hữu cơ được đề cặp trong việc đánh giá nhanh, rẻ phục vụ cho nghiên cứu sơ bộ hoặc các phương pháp phân tích hiện đại khác như HPLC, GC GC-FID, TLC [65,66] dùng xác định định lượng các hợp chất hữu cơ một cách chính xác.
Trên cơ sở đó artemisinin được sử dụng làm chất chuẩn nhằm đánh giá sơ bộ hàm lượng sesquiterpene lactones có trong cao chiết tổng của cây ngải cứu cũng như các cao phân đoạn của cây ngải cứu nhằm chọn ra quy trình chiết cao ngải cứu với hàm mục tiêu là sesquiterpene lactones cao nhất để thực hiện phân lập và xác định cấu trúc các chất có hoạt tính sinh học có trong cây ngải cứu.
Kỹ thuật chiết và tách các hợp chất tự nhiên
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Theo Nguyễn Kim Phi Phụng, Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng Trong thực nghiệm, việc chiếc rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, gồm sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với máy Soxhlex, … Sự chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra, còn có sự chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước và phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn để thực hiện tách các chất hữu cơ ra khỏi nguyên liệu Dù có nhiều tên gọi và cách chiết cao khác nhau nhưng thực tế được phân thành 2 phương pháp chính trong kỹ thuật chiết hợp chất thiên nhiên. a Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng là quá trình chiết bằng các dung dung môi với nguyên liệu ban đầu là một hổn hợp chất lỏng Do từ cao alcohol ban đầu hoặc dịch chiết ban đầu thường chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực được tách ra từ nguyên liệu nên khó phân lập được những hợp chất tinh khiết phục vụ cho các bước nghiên cứu tiếp theo cũng như đánh giá chính xác được tính chất của hoạt chất có trong mẫu Kỹ thuật chiết lỏng–lỏng được áp dụng để phân chia cao alcohol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung trình hòa tan tốt các chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh. b Kỹ thuật chiết ngâm dầm (rắn – lỏng)
Kỹ thuật chiết rắn - lỏng là kỹ thuật khuếch tác các chất tan trong nguyên liệu ra một dung môi bằng cách ngâm ngập toàn bột nguyên liệu trong một thiết bị, dụng cụ có chất liệu bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ nhằm tránh ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm dịch chiết và có nắp đậy kín hoặc bộ phận làm kín phù hợp. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến ngập bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dịch chiết được lọc qua một giấy lọc; loại dung môi bằng cách cô dịch chiết sẽ có được cao chiết Tiếp theo rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Ngoài kỹ thuật chiết ngâm dầm, kỹ thuật chiết ngấm kiệt và kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet cũng thuộc kỹ thuật chiết rắn–lỏng Tuy nhiên 2 kỹ thuật này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn và quá trình được kiểm soát chặt chẽ Hiện nay phương pháp chiết rắn- lỏng được ứng dụng nhiều tại một số nhà máy sản xuất cao dược liệu tại Việt Nam như công ty BV Pharma Việt Nam, nhà máy chiết xuất cao Dược liệu Công nghệ cao IMC Quang Minh,
Trong thực tế nghiên cứu cho thấy các phương pháp chiết các hợp chất thiên nhiên đều có giới hạn và tác động bởi các yếu tố khác nhau Đề tài chọn phương pháp chiết cao ngãi cứu bằng phương pháp chiết rắn-lỏng và đánh giá các yếu tố tác động gồm ảnh hưởng của nồng độ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu chiết-dung môi, nhiệt độ, thời gian đến quá trình chiết cao ngải cứu bằng ethanol Phương pháp phù hợp với điều kiện thực tế hiện có cũng như khả năng phát triển với điều kiện thực tế sản xuất tại Việt Nam hiện nay.
Xanthine oxidase - phương pháp đánh giá khả năng ức chế xanthine oxidase 20 1 Enzyme xanthine oxidase
2.5.1 Enzyme xanthine oxidase a Cấu trúc enzyme xanthine oxidase:
Enzyme xanthine oxidase (XO) là một enzyme nhị phân đồng thể có khối lượng phân tử 283 kDa [50] Phân tử enzyme này có hình dạng phức tạp, với kích thước trung bình 155Å×90Å×70Å Trong đó, mỗi tiểu đơn vị của enzyme XO có kích thước 100 Å × 90 Å × 70 Å Mỗi tiểu đơn vị của enzyme XO mang một cofactor molybden ở trung tâm, hai cụm sắt–lưu huỳnh (2Fe–2S) và một coenzyme flavin (FAD) Ở trung Enzyme tâm chứa molybden, nguyên tố này liên kết với pterin thông qua nhóm dithiolene sulfur để hình thành một cofactor được gọi là molybdopterin Khoảng cách từ trung tâm cofactor molybden đến cụm [2Fe-2S]I là 14,8 Å, từ [2Fe-2S]I đến [2Fe-2S]II là 12,5 Å và từ [2Fe-2S]II đến FAD là 8,3 Å [51] Cấu trúc enzyme xanthine oxidase được mô tả mô phỏng như sau:
Hình 2.16 Cấu trúc tổng thể của enzyme XO được phân lập [51]
Xanthine oxidase (XO) và xanthine dehydrogenase (XDH) là các dạng có thể chuyển đổi lẫn nhau của cùng một enzyme XO và XDH tham gia vào nhiều phản ứng sinh hóa với vai trò chính là phân hủy purine và chuyển hypoxanthine thành xanthine và chuyển hóa xanthine thành axit uric Axit uric là sản phẩm phụ trong quá trình phân hủy purine và là nguyên nhân của của nhiều bệnh lý khác nhau. b Cơ chế hoạt động enzyme xanthine oxidase
Cơ chế xúc tác của enzyme XO chuyển xanthine thành acid uric cụ thể: Ở trạng thái oxy hóa, trung tâm molybden của enzyme được xây dựng theo mô hình LMo VI OS(OH) với L là đại diện cho đồng yếu tố pyranopterin chung cho các enzyme molybden và vonfram đơn nhân Đầu tiên, proton từ nhóm Mo-OH tấn công vào trung tâm ái nhân của xanthin tại vị trí C-8, đồng thời vận chuyển hydro giải phóng từ vị trí C-8 tới nhóm Mo-S tạo ra LMo IV O(SH)(OR) Sản phẩm tao thành tiếp tục phản ứng bới tác động của sự dịch chuyển của các electron ở giữa các trung tâm oxy hóa khử khác trong enzyme, Từ đó chúng giải phóng H + , tạo ra LMo V OS(OR) Sau đó, hydro thay thế nhóm R, quay về trạng thái ban đầu LMoVIOS(OH) của enzyme [52] c Ảnh hưởng của xanthine oxidase đến một số bệnh lý
Tăng acid uric trong máu là một bệnh lý thường gặp nhất liên quan đến enzyme XO [10] Ngoài ra tăng acid uric trong máu có liên quan đến nhiều bệnh như: gout, tim mạch, thận, kháng insulin và béo phì.
- Tăng acid uric máu là nguyên nhân chính của sự hình thành bệnh gout và là biểu hiện đặc trưng của bệnh gout [53] Khi lượng acid uric trong máu với mức trên 10 mg/dL có nguy cơ mắc bệnh gout là 30,5%, và khi hàm lượng acid uric trong máu dưới 7 mg/dL tỷ lệ người mắc bệnh gout chỉ có khoảng 0,6% [54] Hay trong công trình nghiên cứu của Roddy and Doherty, 2010 cũng cho thấy tỷ lệ người mắc bệnh gout là 10,8% khi acid uric trong máu trong khoảng 7,0-7,9 mg/dL, nó tăng lên đến 27,7% và 61,1% khi nồng độ acid uric trong máu tăng đến khoảng 8,0-8,9 mg/dL và trên 9,0 mg/dL tương ứng.
- Bệnh tim mạch cũng có mối tương quan khá chặt chẽ với việc tăng acid uric trong máu [56] Khi nồng độ acid uric trong máu tăng đủ cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của các mạch máu nhỏ, từ đó làm rối loạn chức năng nội mô từ đó dẫn đến bệnh động mạch vành và bệnh tăng huyết áp.
- Tăng acid uric máu còn là nguyên nhân dẫn đến các nguy cơ mắc bệnh thận. Acid uric máu cao không những làm tổn hại tới động mạch vành mà còn ảnh hưởng tới mạch máu ở thận Một số nghiên cứu đã cho thấy khi sử dụng allopurinol (AP) làm giảm nồng độ acid uric máu đồng thời làm chậm sự tiến triển của bệnh suy thận mạn tính [57]
- Ngoài ra, tăng acid uric máu còn là nguyên nhân làm tăng nguy cơ kháng insulin và tăng nguy cơ béo phì [58]
Từ đó cho thấy việc ức chế hoạt động emzyme xanthine oxidase giúp hạn chế việc tăng acid uric sẽ giúp hạn chế các bệnh liên quan đến việc tăng acid uric trong máu như huyết áp, tim mạch, thận, đái tháo đường… Xanthine oxidase bị tác động ức chế, giảm hoạt động bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH, các ion kim loại, các hoạt chất khác Một số flavonoid có hoạt tính ức chế enzyme XO như chrysin, luteolin (thuộc nhóm flavone); kaempferol, quercetin, myricetin, isorhamnetin (thuộc nhóm flavonol); hesperetin (thuộc nhóm flavanone); phloretin (thuộc nhóm dihydrochalcone) Ngoài ra một số hợp chất khác cũng có hoạt tính ức chế enzyme
XO như: caffeic acid, cinnamaldehyde, hydroxychavicol, riparsaponin, urea, purine 6-aldehyde, 2-amino-4-hydroxypteridine 6-aldehyde Trong đó, nhiều hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO đã được tìm thấy trong các cây thuộc họ cúc Các hợp chất chiết xuất từ thiên nhiên khả năng ức chế enzyme XO mạnh mẽ và hiện đang có hướng phát triển thành thuốc phòng trị tăng acid uric trong máu.
2.5.2 Các dạng ức chế hoạt động enzyme
Chất ức chế hoạt động enzyme là chất có tác dụng làm giảm hoạt tính hay làm enzyme không còn khả năng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm Nó có thể là chất ức chế thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch. Ức chế thuận nghịch có thể là ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh hoặc ức chế hỗn hợp Tùy thuộc vào điều kiện tham gia vào quá trình phản ứng, tâm hoạt động enzyme, cấu trúc của enzyme hay cơ chất tham gia vào quá trình phản ứng chúng sẽ có tên gọi khác nhau Cụ thể: a Ức chế cạnh tranh:
Chất ức chế cạnh tranh trực tiếp vào tâm hoạt động của enzyme được gọi là chất ức chế cạnh tranh Những chất ức chế này thường có cấu trúc giống với cơ chất và làm giảm lượng enzyme tự do Quá trình ức chế cạnh tranh tác động bởi cơ chất được mô tả như sau:
Hình 2.17 Sơ đồ biểu diễn quá trình ức chế cạnh tranh [79]
Phần lớn các chất ức chế cạnh tranh và cơ chất có sự tương đồng về mặt hóa học Trường hợp đặc biệt của ức chế cạnh tranh là ức chế bằng sản phẩm, trường hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và choán vị trí hoạt động của phân tử enzyme. b Ức chế không cạnh tranh: Ức chế không cạnh tranh là kiểu ức chế mà chất ức chế bám trực tiếp vào phức hợp enzyme-cơ chất nhưng không bám vào enzyme tự do Quá trình ức chế tác động bởi cơ chất trong phản ứng ức chế không cạnh tranh được mô tả như sau:
Hình 2.18 Sơ đồ biểu diễn quá trình ức chế không cạnh tranh [79]
Quá trình ức chế không cạnh tranh có đặc điểm khi enzyme kết hợp với tác chất làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme đồng thời tạo trung tâm kết hợp với chất ức chế, do đó không thể loại bỏ tác dụng ức chế bằng cách tăng nồng độ cơ chất. c Ức chế hỗn hợp Ức chế hỗn hợp là kiểu ức chế mà trong đó chất ức chế đồng thời tham gia liên kết với enzyme và phức hợp của enzyme với tác chất Từ đó tạo thành một phức hợp mới mà sản phẩm của phản ứng không tạo thành Quá trình phản ứng được mô tả như sau
Hình 2.19 Sơ đồ biểu diễn quá trình ức chế không cạnh tranh [79]
Hiện tượng ức chế hỗn hợp chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế Vận tốc cực đại đo được trong một số thí nghiệm cho thấy khi không có mặt chất ức chế vận tốc phản ứng cao hơn so với khi có mặt chất ức chế Kiểu ức chế này cho thấy các nồng độ chất ức chế càng cao thì tốc độ phản ứng tạo thành sản phẩm càng giảm. Trường hợp đặc biệt của ức chế hỗn hợp khi enzyme có thể kết hợp với chất ức chế hoặc cơ chất hoặc cả hai khi cơ chất và chất ức chế có cùng hệ số tương tác với enzyme được gọi là ức chế kháng cạnh tranh.
2.5.3 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế xanthine oxidase
Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase in vitro
Nguyên tắc chung trong việc đánh giá khả năng ức chế enzyme XO là so sánh dựa trên các sản phẩm trung gian, sản phẩm tạo thành của enzyme XO trong điều kiện môi trường phản ứng với mẫu thử Các tác nhân oxy hóa thường dùng trong xác định hoạt tính enzyme XO như oxy, xanh methylene, cytochrome khi phản ứng với enzyme hoặc dựa vào sự giảm của cơ chất hay hàm lượng sản phẩm chất mục tiêu tạo thành như acid uric thông qua các phương pháp như đo quang phổ, huỳnh quang và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang.
Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase in vitro bằng phương pháp quang phổ:
Nguyên tắc chung: Hoạt tính của enzyme XO được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành theo phản ứng:
Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 290 nm ở 25°C hoặc 37°C, pH=7,5 hoặc 8,0.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ thiết bị
3.1.1 Nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm:
Nguyên liệu: Cây ngải cứu tươi (Artemisinia Vulgaris L) được thu mua từ tỉnh Tiền Giang tại thời điểm khoảng tháng 6 - 8 năm 2023 Nguyên liệu được xử lý hong khô tại điều kiện nhiệt độ phòng, thoáng khí, phân loại và loại bỏ tạp chất, bảo quản tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng trước khi thực hiện thí nghiệm.
Bảng 3.1: Danh mục hóa chất sử dụng thí nghiệm
STT Tên hóa chất Kí hiệu Xuất sứ
2 Ethanol 96% Et Chemsol, Việt Nam
3 Methanol 99% Me Chemsol, Việt Nam
4 Ethylacetate EA Chemsol, Việt Nam
6 Xanthine oxydase XO Sigma-Aldrich, Mỹ
9 Acid hydrochloride HCl Trung Quốc
10 Artemenisin tinh khiết Sigma-Aldrich, Mỹ
11 Potassium Bromide KBr Himedia - Ấn Độ
12 Bản mỏng silicagel F254 F254 Merck, Đức
14 Tấm silica thông thường Merck, Đức
15 Dung dịch đệm PBS Việt Nam
Các thiết bị, dụng cụ cơ bản dùng xử lý mẫu chứa mẫu và các dụng cụ thiết bị cơ bản dùng thực hiện các thí nghiệm xây dựng qui trình chiết cao ngải cứu ở điều kiện tốt nhất nhằm thu hàm lượng sesquiterpene lactone gồm: Bình cầu thủy tinh 500 mL, 2 L, bếp đun bình cầu và ống sinh hàn hồi lưu, phễu lọc sứ 500 mL, bình lọc chân không (500mL, 2L), bình tam giác, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, nhiệt kế, cồn kế, Các giếng thí nghiệm, micropipett đơn và đa đầu, cân phân tích, thiết bị cô quay chân không, tủ ủ ấm nhằm thực hiện phản ứng đánh giá khả năng ức chế xanthine oxidase, các cột tách chiết, sắc ký nhằm phân lập các cao phân đoạn, làm sạch chất trước khi đánh giá giá cấu trúc của hợp chất Các thiết bị phân tích gồm thiết bị phân tích phổ hồng ngoại FTIR (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) tạiViện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng.
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Xử lý cây ngải cứu (Artemisia Vulgaris.L) tươi
Cây ngải cứu được thu mua tại tỉnh Tiền Giang, tại thời điểm tháng 6 đến tháng 8 Nguyên liệu sau khi thu nhận được loại bỏ tạp chất; Rễ, thân, cành rửa sạch bằng nước, hông khô nguyên liệu cho đến khi khối lượng không đổi, có hàm lượng ẩm được đánh giá