Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu chuyển hóa Sulfamethoxazole trong nước do chiếu xạ

- 4 - Hình 1-7 Sơ đồ các sản phẩm hình thành trong phản ứng quang phân trực tiếp Sulfonamide- 5 - Hình 1-8 Sơ đồ cơ chế hình thành sản phẩm quang phân hủy do bị khử nhóm sulfonate của c

TỔNG QUAN

Khái quát về Sulfamethoxazole

Sulfamethoxazole (SMX) – công thức phân tử C10H11O3N3S – có tên theo IUPAC 4-Amino-N-(5-methylisoxazol -3-yl) benzenesulfonamide, các tên thương mại Gantanol, Urobak, Sinomin, Sulfisomezole, Metoxal, Radonil SMX là kháng sinh tổng hợp họ sulfonamide, có số đăng ký CAS 723-46-6, được sử dụng phổ biến trong điều trị các bệnh liên quan đến truyền nhiễm gây ra bởi các vi khuẩn Speptococci, Gonococci, Pneumococci và Staphylococci hay khuẩn que colon

I.1.2 Tính chất vật lý Ở điều kiện thông thường, SMX tinh khiết có dạng tinh thể rắn màu trắng hay trắng ngả vàng, nóng chảy ở nhiệt độ 167 o C, hằng số Henry 9,56.10 -13 atm.m 3 /mol, ít tan trong nước (610 mg/L ở nhiệt độ 37 o C) và dung môi hữu cơ không phân cực (hệ số phân bổ SMX giữa octanol và nước Kow = 0,9) SMX không tan trong diethyleter và chloroform, tan nhiều trong rượu etylic (1 g / 50 ml) và trong axeton (1 g / 3 ml)

Với công thức cấu tạo như trên Hình 1-1, SMX có hai giá trị hằng số phân ly (ở 25

0C) là pKa1 = 1,85 và pKa2 = 5,6 Do đó mặc dù ít tan trong nước nhưng SMX dễ tan trong dung dịch kiềm và axit loãng Dạng tồn tại của SMX trong 2 môi trường này khác nhau nên phổ hấp thu UV của chúng cũng khác nhau, thể hiện trên Hình 1-2

Hình 1-3 thể hiện phổ hấp thu hồng ngoại của mẫu SMX rắn, với 6 peak chính, ứng với các số sóng: 1145, 1160, 1599, 1621, 685, 1306 cm -1 Phổ khối của mẫu SMX thu được với kỹ thuật ion hóa bằng bắn phá điện tử thể hiện trên Hình 1-4 với các phân mảnh chủ yếu ứng với m/z = 156, 92, 108, 65, 140, 253, 157, 43

SMX được điều chế từ phản ứng Sulfonyl hóa 3-amino-5-methyl-isoxazole với 4- acetylaminobenzenesulfonyl clorua, sau đó axit hóa để khử nhóm Axetyl (Hình 1-5)

- 3 - Hình 1-1 Công thức cấu tạo của Sulfamethoxazole

Hình 1-2 Phổ hấp thu UV của dung dịch SMX trong môi trường axit (đường liền, λmax ~ 265 nm) và kiềm (đường rời, λmax ~ 255 nm).

Hình 1-3 Phổ hồng ngoại của SMX Hình 1-4 Phổ khối của SMX

Hình 1-5 Sơ đồ phản ứng tổng hợp SMX

I.1.5 Chuyển hóa SMX trong cơ thể người [5]

Sau khi SMX được đưa vào cơ thể người theo đường miệng, SMX sẽ bị chuyển hóa một phần với thời gian bán hủy trong huyết tương ~ 9 ÷ 12 giờ Khoảng 45 ÷ 70 % liều dùng được bài tiết qua đường nước tiểu trong 24 giờ, trong đó ~ 15 ÷ 25 % ở dạng SMX (chưa chuyển hóa), ~ 43% dạng N4-acetyl-sulfamethoxazole (Ac-SMX), ~

9 ÷ 15% dạng SMX-N1-glucuronide (SMX-Glu), và một số sản phẩm khác Hình 1-6 thể hiện sơ đồ đường chuyển hóa của SMX

Hình 1-6 Sơ đồ chuyển hóa của SMX trong cơ thể

Sulfamethoxazole trong môi trường nước và khả năng phân hủy

Trong nước mặt, các hợp chất kháng sinh họ Sulfonamide được xem là bền vững với các quá trình phân hủy sinh học tự nhiên Kết quả khảo sát của dịch vụ địa lý Mỹ (US Geological Service) cho thấy dư lượng SMX xuất hiện nhiều trong các sông suối với tần suất lên tới 27% số mẫu khảo sát [8]

Annel L Boreen và cộng sự khảo sát quang phân của 5 hợp chất Sulfonamide:

Sulfamethoxazole, Sulfisoxazole, Sulfamethizole, Sulfathiazole và Sulfamozole [19]

Kết quả cho thấy tốc độ quang phân của các chất này phụ thuộc vào nhóm dị vòng R (5 cạnh) cũng như pH của dung dịch khảo sát Trong đó SMX quang phân kém nhất

Các sản phẩm quang phân cũng đã được khảo sát, trong các sản phẩm chính của cả 5 chất khảo sát đều có Sulfanilic acid Sơ đồ quang phân thể hiện trên Hình 1-7

- 5 - Hình 1-7 Sơ đồ các sản phẩm có thể hình thành trong phản ứng quang phân trực tiếp các Sulfonamide

Martina Periša thực hiện phản ứng quang phân hủy các hợp chất Sulfonamide:

Sulfamethazine (SMT), sulfadiazine (SDZ), sulfamethoxazole (SMX) và các chất chuyển hóa dạng N4-acetylate của chúng là: N4-acetylsulfadiazine, N4 - acetylsulfamethazine, N4-acetylsulfamethoxazole bởi ánh sáng mặt trời mô phỏng sử dụng đèn Xenon [20] Qua đó đã xác định được hiệu suất và nhận dạng được các sản phẩm quang phân bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

Các hợp chất khảo sát phân hủy với hiệu suất ~ 88 ÷ 98% trong 24 giờ chiếu đèn, ngoại trừ sulfamethazine (52%) Tốc độ quang phân tuân theo qui luật động học của phản ứng bậc một biểu kiến pH của dung dịch đóng vai trò quan trọng đối với tốc độ quang phân, trong đó SDZ, SMT và các sản phẩm chuyển hóa của chúng có tốc độ quang phân chậm hơn trong môi trường axit, nhưng tốc độ quang phân SMX và sản phẩm chuyển hóa của nó lại giảm khi pH tăng Điều này cho thấy tốc độ quang phân chịu ảnh hưởng rất lớn bởi trạng thái tồn tại của từng chất trong dung dịch, tùy theo giá trị pH Tổng cộng chín sản phẩm quang phân đã được giải phổ, trong số đó đồng phân Tautomers của SMX và các sản phẩm khử sulfonate của SDZ và SMT lần đầu đã được nhận dạng Kết quả quang phân các Sulfonamide và chất chuyển hóa cho thấy các sản phẩm được hình thành thông qua 2 con đường: Một là đứt gãy liên kết sulfonamide S – N và hai là khử Sulfonate Những kết quả đạt được này góp phần quan trọng vào việc đánh giá khả năng phân hủy cũng như tác động môi trường của các sản phẩm quang phân

- 6 - Hình 1-8 Sơ đồ cơ chế hình thành sản phẩm quang phân hủy do bị khử nhóm sulfonate của các Sulfonamide và chất chuyển hóa

Alam G Trovo thực nghiệm phản ứng quang Fenton sử dụng đèn Xenon có kính lọc để loại bỏ bước sóng < 290nm, đánh giá khả năng phân hủy của SMX cũng như mức độ độc của dung dịch trước và sau thí nghiệm sử dụng vi khuẩn Vibrio fischeri [21] Khảo sát được thực hiện trong mô hình thử nghiệm sử dụng nước cất và nước biển, kết quả là khả năng phân hủy của phản ứng chịu ảnh hưởng rất lớn của dung dịch nền thí nghiệm giữa nước biển và nước cất, thật vậy trong nước biển, sự phân hủy của phản ứng được cho là do gốc Cl  và Cl 2  gây nên, không phải do gốc

Hydroxyl OH  Hiệu suất phân hủy tăng lên không nhiều khi tăng nồng độ ion Fe 3  trong dung dịch, trong khi đó khi tăng nồng độ H O 2 2 đến 120mg/L trong thí nghiệm sử dụng nước cất cho thấy độ độc của dung dịch giảm trong suốt quá trình phản ứng Các sản phẩm của phản ứng đã được nhận dạng sử dụng phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ kỹ thuật thời gian bay (LC-ESI-TOF-MS), sản phẩm được hình thành qua 2 con đường: một là gốc tự do OH  tấn công vào vòng thơm benzene và hai là sẽ phản ứng vào vòng Isoxazole, tuy nhiên dựa trên các sản phẩn được nhận dạng, cho thấy gốc OH  sẽ ưu tiên phản ứng vào vòng Isoxazole hơn so với vòng thơm

Angela Rodayan [22] khảo sát phân hủy SMX trong nước tinh khiết và nước thải sử dụng Ozone, hiệu suất phân hủy và các sản phẩm oxi hóa đã được khảo sát trong hai môi trường nêu trên sử phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ Không có sự khác biệt nào về lượng Ozone cần thiết để phân hủy hết lượng SMX đến dưới ngưỡng phát hiện ở cả 2 môi trường Khi nồng độ đầu của SMX là 60 mg/L, SMX bị phân hủy hết với lượng Ozone cần thiết là 83 mg/L Ở nồng độ đầu 100 àg/L SMX đũi hỏi 14 mg/L Ozone Các sản phẩm đã được nhận dạng gồm: 4-aminobenzene sulfonamide, N-(3-phenylpropyl)-acetamide, 2-methyl-benzoxazole và phenol

Các phương pháp phân tích Sulfamethoxazole

Để phân tích xác định hàm lượng SMX hay các kháng sinh họ Sulfonamide có thể dùng phương pháp sắc kí khí với các loại đầu dò khác nhau như đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID), sắc kí ghép khối phổ (MS) một lần hay 2 lần MS/MS, ngoài ra ta cũng có thể dùng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tích với các đầu dò phù hợp

Alida A M Stolker [34] xác định dư lượng của các dược phẩm trong nước mặt, nước ngầm, nước sinh hoạt Các dược phẩm đã được khảo sát là thuốc giảm đau Acetylsalicylic acid, diclofenac, ibuprofen, và paracetamol; các kháng sinh SMX, erythromycin và cloramphenicol; các thuốc kiểm soát mỡ máu fenofibrate, bezafibrate, clofibric acid, bisoprolol, metoprolol; thuốc điều trị động kinh co giật Carbamazepine

Phương pháp sử dụng là sắc kí lỏng ghép hai lần tứ cực (LC-QqQ) và sắc kí lỏng ghép tứ cực kết hợp thời gian bay (LC-Q-TOF) Các phương pháp trình bày cho giới hạn phát hiện tốt, trong đó phương pháp LC-Q-TOF có nhiều ưu điểm hơn

Weiwei Ben [35] sử dụng trích ly pha rắn (SPE) và sắc kí lỏng ghép khối phổ để xác định 5 hợp chất Sulfonamide (SMX, Sulfathiazole, Sulfamethizole, Sulfamethazine, Sulfadimethoxine); Tetracycline, Oxytetracycline, Chlortetracycline và Tiamulin trong nước thải Kết quả cho thấy ngoại trừ Sulfamethizole, các hợp chất còn lại đều có mặt trong mẫu nước thải khảo sát.

Phương pháp và thiết bị sử dụng phân tích SMX

I.4.1 Máy đo phổ hấp thu tử ngoại – khả kiến (UV-Vis)

Hình 1-9 Sơ đồ máy quang phổ UV-VIS 1-Nguồn bức xạ; 2-Bộ tạo đơn sắc; 3-Bộ chia chùm sáng; 4-Cuvét chứa mẫu; 5-Cuvet chứa dung môi; 6-Detector; 7-Bộ tự ghi

Sóng điện từ do nguồn cung cấp được bộ tạo đơn sắc tách riêng thành từng dải đơn sắc, được bộ phận chia chùm sáng hướng lần lượt qua cuvet chứa dung môi và cuvet chứa mẫu Đầu dò sẽ so sánh cường độ bức xạ đi qua mẫu và đi qua dung môi, chuyển tín hiệu quang thành tín hiệu điện và tính toán dựa vào định luật Lambert – Beer Bộ ghi thường được nối với máy tính

I.4.2 Sắc kí lỏng ghép đầu dò hai lần khối phổ (LC - MS/MS) Đây là một thiết bị phân tích gồm có hai phần chính: Bộ phận sắc kí lỏng (LC) có nhiệm vụ là rửa giải, phân tách mẫu khảo sát ban đầu Mẫu sau khi được phân tách sẽ đi vào bộ phận khối phổ, ở đây nó được ion hóa và ghi nhận dựa theo giá trị tỉ lệ khối lượng trên điện tích m/z của ion

I.4.2.1 Bộ phận sắc kí lỏng (LC) Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp sắc ký lỏng có hiệu quả tách cao hơn nhiều so với phương pháp sắc ký lỏng cổ điển nhờ sử dụng các chất nhồi có kích thước hạt rất nhỏ (5-10 àm), ngày nay với cụng nghệ ngày càng hiện đại, người ta cú thể tạo được vật liệu nhồi cột cú kớch thước dưới 2 àm sử dụng trong siờu sắc kớ lỏng hiệu năng cao UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) Các ưu điểm của thiết bị này bao gồm: Tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách được sử dụng nhiều lần, khả năng thu hồi mẫu cao, lượng mẫu cho phép bơm vào cột tách lớn hơn so với sắc ký khí, nhiệt độ phân tích mẫu phần lớn là nhiệt độ phòng, rất thích hợp cho các hợp chất hữu cơ khó bay hơi và không bền nhiệt (ưu điểm rõ rệt so với sắc ký khí)

+ Các bộ phận trong thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao:

Hình 1-10 Sơ đồ thiết bị LC

1- Hệ thống pha động 2 - Bơm cao áp

3 - Bộ nạp mẫu 4 - Bộ lọc tạp chất 5 - Cột tách

Bơm cao áp dùng để đẩy pha động đi qua cột tách Loại bơm tốt nhất thường được dùng hiện nay là bơm syringe lượng lớn Công suất của bơm dùng cho sắc ký phân tích với lưu lượng dòng pha động 0,1-10 ml/phút (đường kính trong của cột tách là 5 mm) ở áp suất 300-400 bar

Bộ nạp mẫu trong HPLC thường được thiết kế phù hợp với hai kiểu bơm mẫu: bơm cùng với dòng dung môi (giống trong sắc ký khí) hoặc bơm mẫu vào cột tách trong điều kiện dòng dung môi ngưng lại không chịu áp suất, thường sử dụng khi thiết bị phải làm việc với áp suất rất cao

Cột HPLC dùng cho mục đích phân tích thường dài 12,5 ÷ 25 cm, đường kính trong từ 2 ữ 4 mm Với cột cú đường kớnh trong 2 mm, hạt nhồi cú kớch thước 30 àm là phù hợp Như vậy, kích thước hạt dùng trong HPLC bé hơn nhiều so với GC

Hệ thống pha động bao gồm các bình thủy tinh chứa dung môi rửa giải Nếu chạy theo chương trình dung môi (còn gọi là rửa giải gradient, sẽ giúp rút ngắn đáng kể thời gian phân tích, độ phân giải của phương pháp tăng lên, peak nhọn hơn, độ nhạy tăng, có thể so sánh với chương trình nhiệt độ của GC) thì phải chứa các dung môi trong các bình khác nhau và dùng bơm điều khiển 4 dòng, tuy nhiên là đường nền của phương pháp này cũng thay đổi theo Nếu không cần thay đổi tỉ lệ thành phần pha động thì chỉ cần pha theo tỉ lệ đã định trước và chứa trong một bình

Pha động phải được lọc tạp chất bằng màng lọc 0,45 àm (nếu dựng hoỏ chất độ tinh khiết HPLC thì không cần lọc), loại bỏ khí hòa tan bằng cách đánh siêu âm Pha động được bơm liên tục qua cột tách bằng hệ thống bơm cao áp Mẫu phân tích được

- 10 - đưa vào cột tách bằng bộ phận tiêm mẫu, sau đó được pha động đẩy qua cột tách, quá trình tách xảy ra ở đây Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào đầu dò (detector), các tín hiệu được thu nhận và chuyển đến bộ phận tự ghi và xử lí kết quả

I.4.2.2 Máy đo phổ khối (Mass spectrometer) Nguyên tắc cơ bản của phương pháp đo khối phổ là tạo ra các ion từ hợp chất vô cơ hay hữu cơ bằng các phương pháp thích hợp, sau đó tách các ion này dưạ theo giá trị tỉ lệ khối lượng trên điện tích m/z của chúng (mass-to-charge ratio value) và có thể xác định định tính hay định lượng

Hình 1-11 Sơ đồ các bộ phận máy khối phổ A Các bộ phận chính trong máy đo phổ khối bao gồm:

+ Bộ phận nạp mẫu vào máy: Tùy vào trạng thái tập hợp (rắn, lỏng, khí), thành phần và đặc tính của mẫu đo, đặc biệt là độ bền nhiệt của mẫu mà sử dụng các bộ phận nạp mẫu khác nhau Ví dụ máy đo phổ khối sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng bắn phá điện tử EI (electron impact), mẫu cần phải đạt được các tiêu chuẩn: Hoàn toàn ở thể khí trước khi đi vào buồng ion hóa, Mẫu phân tích phải bền nhiệt độ Đặc biệt quan trọng là áp suất chân không của máy phải được đảm bảo

+ Nguồn Ion hóa (Ionization source): Kỹ thuật biến đổi các phân tử pha khí thành ion

Thành phần trong mẫu phân tích có thể bị ion hóa bằng cách sử dụng nhiệt, điện trường, các electron năng lượng cao, các ion / photon hay nguyên tử trung hòa mang năng lượng, nguyên tử bị kích thích Ion được tạo ra có thể là các nguyên tử, phân tử bị ion hóa, mảnh khối lượng… Các ion hình thành có thể được tách thông qua sử dụng điện trường, từ trường, kỹ thuật thời gian bay, …

+ Bộ phận phân tích khối lượng (Mass analyzer): Các ion hình thành trong buồng ion hóa (ion source) sẽ đi vào bộ phận này và được tách biệt khỏi nhau dựa vào giá trị tỉ lệ khối lượng trên điện tích m/z (mass-to-charge ratio) ion Máy có thể sử dụng điện trường tĩnh hay động, từ trường hoặc là kết hợp cả điện trường và từ trường, …

Bảng 1-1 Các thiết bị phân tích khối lượng thường gặp

Loại thiết bị Kí hiệu Nguyên tắc tách

Sử dụng điện trường E Dựa vào động năng (kinetic energy)

Sử dụng từ trường B Động lượng (Momentum)

Tứ cực (Quadrupole) Q m/z (độ bền quỹ đạo)

Bẫy ion (Ion trap) IT m/z (tần số cộng hưởng)

Thời gian bay (Time of flight) TOF Thời gian bay

Cộng hưởng cyclotron-ion sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)

FTICR m/z (tần số cộng hưởng)

Orbitrap FT-OT m/z (tần số cộng hưởng)

+ Đầu dò / Bộ ghi nhận tín hiệu (Detector): Ghi nhận, đếm ion thoát ra từ bộ phận phân tích khối lượng

+ Bộ phận xử lý dữ liệu: Xuất ra kết quả phổ khối lượng của mẫu phân tích

B Kỹ thuật ion hóa bằng phun ion ESI (Electrospray):

Hình 1-12 Sơ đồ kĩ thuật phun ion ESI [39]

Vào thời điểm ban đầu, ESI được xem như là một kỹ thuật ion hóa sử dụng trong phân tích protein, nhưng sau đó kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi hơn trong phân tích các polymer, polymer sinh học, phân tích các hợp chất phân cực nhỏ Kỹ thuật ESI có độ nhạy cao và dễ dàng lắp ghép với hệ thống sắc ký lỏng HPLC

Chiếu xạ sử dụng tia Gamma và các phản ứng trong nước do chiếu xạ

Hóa học chiếu xạ bao gồm sự nghiên cứu các quá trình bắn phá mẫu sử dụng bức xạ năng lượng cao làm ion hóa mẫu hay làm cho mẫu từ trạng thái cơ bản chuyển lên trạng thái kích thích Chiếu xạ có thể được thực hiện sử dụng tia bức xạ điện từ như: Tia X-ray, tia Gamma hay các hạt mang điện tích và năng lượng cao bao gồm hạt electron (beta-ray), hạt nhân Helium (alpha-ray),

Năng lượng bức xạ gamma bị hấp thu bởi vật chất thông qua ba hiệu ứng: Hiệu ứng điện quang, hiệu ứng Compton và hiệu ứng tạo cặp Vai trò, tương quan của 3 hiệu ứng này tùy thuộc vào năng lượng photons của bức xạ điện từ và vào cấu trúc điện tử của vật chất bị chiếu xạ

Bức xạ điện từ được sử dụng phổ biến nhất trong hóa học chiếu xạ là tia Gamma, tạo ra bởi đồng vị 60 Co, có năng lượng photon trung bình khoảng 1,2 MeV, bước sóng rất ngắn, λ ≤ 10 -3 nm Trong đó hiệu ứng Compton ảnh hưởng chính đến sự hấp thu năng lượng, năng lượng photon được hấp thu sẽ làm thoát ra các electron ở lớp ngoài cùng và bức xạ điện từ có năng lượng photon yếu hơn

Các thông số quan trọng đặc trưng cho nguồn đồng vị phóng xạ nói chung và nguồn 60 Co nói riêng bao gồm hoạt độ A, chu kỳ bán hủy T1/2, công suất liều D* Đối với các hệ phản ứng do tác động của tia Gamma, đại lượng quan trọng là liều năng lượng bị hấp thu, gọi tắt là liều hấp thu D

Hoạt độ A của một nguồn đồng vị phóng xạ được định nghĩa là số hạt nhân đồng vị đó của nguồn dN bị phân rã trong một đơn vị thời gian dt A  dN ; Đơn vị của hoạt độ A là Bq = s -1 và Ci = 3,7.10 7 Bq

Chu kỳ bán hủy T1/2 của một nguồn đồng vị phóng xạ là thời gian cần thiết để hoạt độ A của nguồn giảm còn một nửa Đơn vị trong hệ SI là giây (s)

Liều hấp thu D là năng lượng tia gamma đã bị hấp thu bởi hệ phản ứng qui về một đơn vị khối lượng của hệ

- 20 - m D  E Đơn vị của liều hấp thu là Gy, 1Gy là sự hấp thu của 1J/kg, thường dùng 1kGy = 1kJ/kg

Công suất liều hay còn gọi là suất liều D* là tốc độ tăng liều hấp thu năng lượng tia gamma bởi hệ phản ứng qui về một đơn vị khối lượng của hệ dt D*  dD Đơn vị của công suất liều là G/s = J/(kg.s), thường dùng kGy/h

Trong hóa học chiếu xạ, đối với chất A bị biến đổi hóa học do chiếu xạ gây nên, thì hiệu suất hình thành các gốc X do chiếu xạ thường được mô tả sử dụng giá trị G (G-value), là số gốc tự do hay phân tử hình thành trên 100 eV năng lượng được hấp thu

Ngoài ra theo hệ đo lường SI, giá trị G của gốc tự do X còn được mô tả là số àmol gốc X hỡnh thành trờn một J, ở đõy ta cú: 1mol X/100 eV = 0,1036 àmol/J

I.5.2 Các sản phẩm hình thành do xạ phân nước

Khi thực hiện phản ứng xạ phân nước sử dụng tia gamma, ngày nay người ta cho rằng các sản phẩm được hình thành theo phương trình:

Trong đó các hệ số của phương trình là các giá trị G của gốc tự do và phân tử hình thành do xạ phân nước (đơn vị phân tử/100 eV)

Hình 1.24 Sơ đồ quá trình xạ phân nước

Hình 1-19 Sơ đồ quá trình xạ phân nước Ở giai đoạn đầu, thời gian ngắn hơn 10  16 s, khi bị xạ phân, một phân tử nước có thể sẽ bị ion hóa tạo thành H O 2  và thoát ra electron hoặc bị kích thích điện từ tạo thành phân tử H O 2 elec * , được gọi là giai đoạn vật lý Electron thoát ra sẽ tiếp tục ion hóa hoặc gây kích thích các phân tử nước tiếp theo, cho đến khi năng lượng của nó không còn đủ lớn để gây ra phản ứng, và electron này được gọi là e  se (subexcitation electron) Kết thúc giai đoạn vật lý, dung dịch nước sẽ hình thành nên ion phân tử

H O 2  , e  se , và H O 2 elec * trong các vùng rất nhỏ được gọi là “vệt” (“spurs”) Ở giai đoạn tiếp theo, trong khoảng thời gian 10  16 s đến 10  12 s được gọi là giai đoạn hóa lý, có các phản ứng phân rã tạo thành các gốc tự do

Bảng 1-3 Các phản ứng trong giai đoạn hóa học quá trình xạ phân nước (298 K; low LET Radiation)

Thứ tự Phản ứng k/10 10 dm3.mol -1 s -1 ΔG/phân tử (100 eV) -1

, , HO , , , e  aq H   H H O H O  Sự hình thành các sản phẩm phân tử trong

“spurs” và khuyết tán ra khỏi “spurs” 10  7 s

I.5.3 Tính chất của các gốc tự do cơ bản trong phản ứng xạ phân nước

Mặc dù cấu trúc hoàn chỉnh của e  aq chưa được biết hết, nhưng người ta cho rằng e  aq là một electron quá độ, bao quanh bên ngoài là các phân tử nước có định hướng và giống như một anion mang điện tích âm có kích thước gần giống với ion I  Bảng 1-4 Đặc tính cơ bản các phần tử e  aq , H  , HO  , O  trong dung dịch nước e  aq H  HO  O 

Hệ số hấp thu mol (m mol 2  1 ) 200

(240 nm) Hệ số khuếch tán, 10 s  9 m 2  1 4,9 7 2,2 Độ dẫn điện, s cm mol 2  1 190 Độ linh động, 10  3 cm V s 2  1  1 1,9 Thế khử chuẩn, V -2,9 a -2,3 b 2,7 c , 1,9 d 1,7 e pKa 9,6 f 11,9 g a(H O e 2   e  aq ) b(H O e 2    H  H  aq ) c(  OH e    H   H O 2 ) d(  OH e  OH  ) e(O   e  H  OH  ) f(H  H O 2 H O 3  e  aq ) g(  OH H O  2  H O 3   O 

Electron hydrat e  aq có thế khử tiêu chuẩn -2,9 V, do đó nó phản ứng nhanh chóng với nhiều hợp chất có thể khử dương hơn Trong phản ứng với các phân tử chất hữu cơ, e  aq thể hiện như một tác nhân ái nhân (nucleophile), có ái lực lớn đối với hạt nhân, có xu hướng tấn công vào trung tâm điện tích dương hay nghèo điện tử hơn Do đó khả năng phản ứng sẽ được nâng lên khi vòng thơm hay liên kết đôi có nối với nhóm thế hút điện tử mạnh

Bảng 1-5 Hằng số tốc độ phản ứng của e  aq với các chất hữu cơ ở nhiệt độ phòng

Hydrogen nguyên tử H  là acid liên hợp của e  aq và là một acid yếu có pKa 9,7

Khi xạ phân trong các dung dịch trung tính và bazơ, hydrogen nguyên tử là một gốc ít quan trọng hơn, tuy nhiên trong dung dịch acid nó là một gốc khử chính của dung dịch, có thế khử tiêu chuẩn -2,3 V, nhưng vẫn bé hơn so với electron hydrat có thế khử tiêu chuẩn -2,9 V Trong một số trường hợp H  cũng thể hiện tính oxi hóa như phản ứng với ion Fe 2+ hay I  trong dung dịch acid mạnh

H  Fe  Fe H   Error! Reference source not found Fe 3   H 2

H  I  HI  Error! Reference source not found HI 2 2  Error! Reference source not found I  2  H 2

THỰC NGHIỆM

Hóa chất - dụng cụ

Methanol – HPLC grade, J Baker, USA

Nước cất 2 lần sử dụng thiết bị chưng cất - Hamilton laboratory glass limited, UK, model Wsc/4D

H2O2 30%, Merk HNO3 65 %, Merk H2SO4 98 %, Merk NaOHr  99 %, Merk Na2CO3  99,9 %, Merk Acid Formic, Merk

Giấy đo pH: pH indicator paper (Germany)

Cân phân tích 4 số lẻ, Precisa XT 120A, Switzerland Đầu lọc mẫu dựng cho phõn tớch MS 0,22 àm, USA

Micro pipet 10 - 100àl Nichipet EX, Japan; và 100 - 1000 àl Labsystems 4500

Bình định mức 10ml, 50ml, 100ml, 250ml - Isolab, Germany

Beacher 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml (Germany)

Pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml (Germany)

Xylanh lấy mẫu Ống thủy tinh 12 ml, Hach, USA.

Thực nghiệm phân tích SMX

II.2.1 Đo phổ hấp thu UV-Vis

+ Máy quang phổ UV – VIS DR 5000

+ Nguồn sáng : Tungsen (khả kiến, 2000h), Deuterium (cực tím, 1100h) + Độ phân giải bước sóng: 0,1nm

II.2.1.2 Vận hành thiết bị

Việc sử dụng thiết bị UV-Vis tương đối đơn giản Đầu tiên mở công tắc nguồn của thiết bị UV –Vis khoảng 30 phút trước khi phân tích để ổn định nguồn sáng Sau đó cài đặt các thông số đo, có thể đo độ hấp thu tại các bước sóng λ xác định, ở đây ta đo bước sóng từ 190 nm → 700 nm

Dùng mẫu trắng (nước cất 2 lần) để trừ nền Sau đó lấy dung dịch SMX có nồng độ xác định, đã chuẩn bị sẵn cho vào cuvet để thực hiện phép đo, lưu ý phải tráng rửa cuvet trước và sau mỗi lần thay đổi dung dịch, sau đó ghi nhận kết quả

II.2.1.3 Các bước chuẩn bị mẫu

+ Dung dịch gốc SMX 1000 àmol/L:

Cân chính xác 0,0639 gam SMX (99%) sử dụng đĩa nhựa đã được rửa sạch và sấy khô (sử dụng nước cất và dung môi), sau đó đem hòa tan trong beacher và định mức thành 250 ml dung dịch trong bình định mức 250 ml, sử dụng nước cất hai lần, đánh siêu âm trong 5 phút Mẫu được bảo quản trong bao đen để tránh ánh sáng mặt trời và giữ lạnh ở 3 0 C

+ Đo phổ phổ hấp thu UV-Vis của dung dịch chuẩn SMX ở các nồng độ

Từ dung dịch gốc của SMX 1000 àmol/L đó chuẩn bị, ta sử dụng micropipet hỳt V àl dung dịch này cho vào bỡnh định mức 10 ml, sau đú thờm nước cất hai lần và định mức thành dung dịch cú cỏc nồng độ C ; àmol/L như sau

+ Đo phổ UV-Vis của dung dịch SMX 100 àM ở cỏc giỏ trị pH khỏc nhau:

- Chuẩn bị dung dịch acid HNO3 1M và 0,1M

- Chuẩn bị dung dịch NaOH 1M và 0,1 M

- Từ dung dịch gốc SMX 1000 àmol/L, ta dựng micropipet hỳt 1000 àl dung dịch này cho vào bình định mức 10 ml, sau đó thêm nước cất hai lần để định mức, sử dụng các dung dịch HNO3 hay NaOH đã pha ở trên để điều chỉnh pH của dung dịch thành 5 giá trị khác nhau là: 2, 4, 6, 8, và 12 nhờ giấy chỉ thị pH

Dung dịch SMX nồng độ 100 àmol/L , thể tớch 10 ml ở cỏc giỏ trị pH khỏc nhau

Riêng mẫu dung dịch có pH ~ 6 ở trên, ta không điều chỉnh pH sử dụng dung dịch HNO3, và NaOH, mà giá trị này là pH tự nhiên của nước cất hai lần sử dụng để chuẩn bị mẫu

II.2.2 Đo bằng phương pháp HPLC-UV

Máy HPLC: Agilent 1290 infinity series Cột bảo vệ: Agilent Eclipse Plus C18 2,1x5 mm; 1,8àm

Cột phõn tớch: Agilent Poroshell 120 EC – C18 2,7 àm; 4,6x100 mm Đầu dò: UV (diot array detector – DAD)

II.2.2.2 Vận hành thiết bị

- Bật công tắc nguồn thiết bị HPLC - Khởi động máy tính, phần mềm chemstation

- Vào mục instrument bật “on” để mở bơm - Vào mục Method → chọn “load” phương pháp

- Để máy ổn định, kiểm tra các thông số như áp suất đầu cột, nếu áp suất thấp bất thường, điều này có thể do hở cột, cần phải siết lại

- Tắt máy: Được thực hiện ngược với quy trình mở máy Lưu ý trước khi tắt máy, cột phân tích phải được rửa với pha động, sau đó tăng tỉ lệ dung môi lên đến 100 % để đảm bảo các chất trong cột được rửa giải hết

II.2.2.3 Thông số phân tích

Tốc độ dòng: 1 ml/phút Bước sóng: 270 nm Thể tớch tiờm: 20 àl Thời gian rửa giải - tR: 7,2 phút (a) ; 4,6 phút (b)

Hình 2-1 Thiết bị sắc kí lỏng HPLC – DAD 1290 infinity series và cột sử dụng

II.2.2.4 Các bước chuẩn bị mẫu để xây dựng đường chuẩn Tiến hành pha các dung dịch chuẩn SMX ở 7 nồng độ khác nhau gồm: 2, 5, 10, 30, 50, 70 và 100 àmol/L như trong phần chuẩn bị mẫu đo phổ UV của SMX (mục

Thờm vào đú, từ dung dịch SMX cú nồng độ 2 àmol/L được chuẩn bị, ta dựng micropipet, tiếp tục pha loãng thêm sử dụng nước cất hai lần, để thu được các dung dịch cú nồng độ 1 àmol/L, và 0,5 àmol/L hay dung dịch SMX cú nồng độ thấp hơn để xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của SMX, với thiết bị HPLC - UV sử dụng

Nồng độ SMX 1 àmol/L 0,5 àmol/L 0,2 àmol/L

Vdd (2 àmol/L) 500 àL 250 àL 100 àL

Thể tớch nước 500 àL 750 àL 900 àL

Thể tích dung dịch thu được 1 ml 1 ml 1 ml

II.2.3 Đo bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ (LC-Q-TOF MS) II.2.3.1 Thiết bị

+ Máy LC - MS: 1290 infinity series Q – TOF – MS/MS G6530A

+ Các cột phân tích được sử dụng:

Cột bảo vệ: Agilent narrow bore guard column 2,1x12,5 mm 5àm Cột phõn tớch: Agilent Eclipse plus C18, RRHD 2,1x100 mm 1,8 àm

 Cột B Cột bảo vệ: Agilent narrow bore guard column 2,1x12,5 mm 5àm Cột phõn tớch: Phenomenex 00G-4454-Eo Gemini-NX C18 110A 4,6x250 mm; 5 àm

 Cột C Cột bảo vệ: Agilent poroshell 120 EC – C18 4,6x5 mm 2,7 àm Cột phõn tớch: Agilent poroshell 120 C18 150x4,6 mm 2,7 àm

- 31 - Hình 2-2 Thiết bị LC – Q TOF – MS/MS

II.2.3.2 Vận hành thiết bị

+ Kiểm tra máy sinh khí Nitơ, bơm Edwards và bình chứa khí Nitơ, nhằm đảm bảo máy ở chế độ On, có đủ dầu để vận hành và bình chứa đủ áp

+ Khởi động máy tính + Khởi động phần phần mềm → “double click” - Acq System Launcher → Start →

“double click” vào Data Acquisition

- Instrument status pane: Cửa sổ này hiển thị trạng thái của các module (Pump, Column, DAD, MS, h-ALS); cài đặt thông số cho LC và MS; đồng thời theo dõi khi hoạt đông

→ Chọn On cho toàn hệ thống

→ Chọn tốc độ dòng thấp 0,01 ml/phút, dung môi 100% ACN → Purge để đuổi bọt khí ra khỏi hệ thống

Sau đó nâng từ từ tốc độ dòng, pha động lên cho đến tỉ lệ chạy pha động

 Tiến hành hiệu chỉnh máy calibration: ở mục “ Context” chọn tune → thiết lập các thông số (ESI hay APCI; Positive hoặc Negative,…) → sau khi tune xong Click Acquisition để về màn hình chính

- Real time plot pane: Theo dõi sắc kí đồ chạy mẫu theo thời gian - Method editor pane: Chon, cài đặt thông số phân tích cho phương pháp (Sample, Properties, h-ALS, Binpump, Column, DAD, MS Q-TOF)

- Worklist pane: Điền thông tin mẫu (số mẫu đo, phương pháp) khi chạy sequences - Sau khi cài đặt xong, máy ổn định - nhiệt độ, áp suất → tiến hành đo mẫu

II.2.3.3 Thông số phân tích