Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu tác dụng của chiếu xạ đến biến đổi của dư lượng Erythromycin trong tôm, cá nuôi

Đề tài “Nghiên cứu tác dụng của chiếu xạ đến biến đổi của Erythromycin trong tôm, cá nuôi” nhằm xem xét có hay không sự biến đổi của dư lượng Erythromycin khi thủy sản được bảo quản bằng

TỔNG QUAN

Kỹ thuật chiếu xạ

Chiếu xạ là một kỹ thuật vật lý ứng dụng tia bức xạ điện từ hay dòng electron lên mẫu vật chất Mục đích của chiếu xạ là đạt được những yêu cầu cụ thể, như làm vô trùng sản phẩm, cải thiện chất lượng vật liệu, hoặc sửa đổi tính chất của vật chất.

Chiếu xạ thực phẩm là công nghệ sử dụng năng lượng bức xạ ion hoá để xử lý thực phẩm nhằm nâng cao chất lượng vệ sinh và an toàn thực phẩm [14]

1.2.1.2 Chi ế u x ạ trong công ngh ệ th ự c ph ẩ m

Năm 1980, chiếu xạ bắt đầu được sử dụng trong Công nghiệp thực phẩm

Kỹ thuật chiếu xạ đang được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm tại hơn 40 quốc gia, bao gồm cả Việt Nam Đây là phương pháp hiệu quả giúp bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa nhiễm khuẩn, được áp dụng cho hơn 40 loại thực phẩm khác nhau.

Ph m Th Ki u H nh Trang 6

Một số ứng dụng của chiếu xạ trong công nghệ thực phẩm [14]:

Bảng 1-1.Ứng dụng của chiếu xạ trong công nghệ thực phẩm

MỤC ĐÍCH LIỀU LƯỢNG CHIẾU

Liều lượng thấp (không lớn hơn 1kGy) Ức chế nảy mầm 0.05 – 0.15kGy Khoai tây, hành, tỏi, gừng

Diệt sâu bọ, côn trùng, ký sinh trùng 0.15 – 0.5kGy Ngũ cốc, rau quả (tươi hoặc khô), cá, thịt

Làm chậm quá trình chín sau thu hoạch

Liều lượng trung bình (1-10KGy)

Kéo dài thời gian bảo quản 1.0 – 3.0 KGy Cá tươi

Diệt vi sinh vật gây bệnh 1.0 – 7.0 KGy Thủy sản, thịt, gia cầm (tươi và lạnh đông) Cải thiện kỹ thuật chế biến 2.0 – 7.0 KGy Nước ép nho, rau khô

Tiệt trùng công nghiệp 30 – 50 KGy Thịt, gia cầm, thủy sản, một số thực phẩm ăn liền Giảm mức độ nhiễm VSV 10 – 50KGy Phụ gia, enzyme

1.2.2 Bức xạ tia gamma và cơ chế tác động

Bức xạ là từ thông dụng chỉ sự lan truyền sóng điện từ hoặc chùm hạt với năng lượng trải trong một phổ rộng Ở mức thấp là các dạng truyền năng lượng có thể nhìn thấy được bằng mắt thường Mức cao hơn của phổ là các loại sóng radio và sóng lò vi ba

Mức cao hơn nữa là tia X và tia Gamma

Khi bức xạ với mức năng lượng cao tương tác với vật liệu nó có thể truyền một phần hoặc toàn bộ năng lượng của nó cho vật liệu Khi năng lượng truyền cho vật liệu có thể gây ra hiện tượng ion hóa các phần tử của vật liệu, bức xạ được gọi là bức xạ ion hóa

Các ion hình thành có hoạt tính hoạt động hóa học rất mạnh và dễ dàng tham gia các phản ứng với các chất xung quanh Vì vậy, bức xạ ion hóa có thể thay đổi cấu trúc hóa học của vật liệu, có thể gây ra các tác động sinh học lên các sinh vật đang sống

Sơ đồ phân rã khi sử dụng máy phát tia gamma Co - 60

Nguồn đồng vị Co – 60 phát ra hai tia gamma với mức năng lượng là 1,333MeV và 1,172MeV Chu kỳ bán rã: T 1/2 = 5.27 năm [14]

Tia X, γ tương tác với vật chất, năng lượng bức xạ mất do ba quá trình chính:

- Hiệu ứng quang điện: sự hấp thụ photon bởi đám mây điện tử của nguyên tử, kèm theo bắn electron ra ngoài

- Tán xạ Compton: một photon do va chạm đàn hồi với electron của môi trường và như vậy photon chuyển một phần năng lượng cho electron

- Quá trình tạo cặp photon bị hủy tạo thành electron và positron: Năng lượng của photon một phần chuyển thành khối lượng tĩnh của 2 hạt cơ bản và một phần chuyển thành năng lượng động học của positron Ep và electron Ee [13]

Cơ chế: Bức xạ ion hóa gây ra các ảnh hưởng trực tiếp và ảnh hưởng gián tiếp lên vật bị chiếu xạ Ảnh hưởng trực tiếp: Các DNA trong sinh vật sống bị phá hủy trực tiếp bởi các hạt, photon của bức xạ Ảnh hưởng gián tiếp: tế bào bị tác động bởi các sản phẩm xạ phân khác Trong thực phẩm, chất trực tiếp nhận ảnh hưởng của bức xạ là nước [13, 14, 30]

N ướ c b ị ion hóa sinh ra các g ố c t ự do nh ư H • hay • OH, theo c ơ ch ế nh ư sau:

-Kích hoạt và ion hóa (10 -16 s) H 2 O -> H 2 O* (1)

-Phản ứng ion phân tử (10 -14 s) H 2 O + + H 2 O -> H 3 O + + • OH (3) -Phân tử kích hoạt phân ly (10 -13 s) H 2 O* -> H • + • OH (4)

H 3 O + -> H + aq (7) -Các phản ứng tái kết hợp (10 -11 - 10 -5 s)

H • + • OH -> H 2 O (10) -Phản ứng giữa sản phẩm PLBX nước với chất tan (10 -10 s)

Hình 1-1.Cơ chế phân ly nước của tia gamma [13]

1.2.2.3 S ả n ph ẩ m phân ly b ứ c x ạ n ướ c và tính ch ấ t

•H, •OH, HO• 2 là sản phẩm gốc tự do còn H 2 , H 2 O 2 là các sản phẩm phân tử

•H thể hiện tính chất khử, phản ứng khử của nó phụ thuộc vào tính chất của chất tan và pH của môi trường Khi pH tăng hoạt tính khử của nó tăng lên Trong dung dịch axit, hydro nguyên tử có thể biểu hiện tính oxi hóa H 2+ được tạo thành trong môi trường axit theo phản ứng như sau:

Các ion này có khả năng oxi hóa sắt (II), iodua và một số hợp chất hữu cơ Gía trị pKa của phản ứng ≤2,7

•OH có tính chất oxy hóa, đôi khi gốc •OH cũng tác dụng như là tác nhân khử, ví dụ như trong trường hợp có mặt KMnO 4 Khi pH > 9 gốc •OH phân li :

Hydro phân tử không phản ứng trực tiếp với chất tan, nhưng nó có thể phản ứng với gốc •OH

Khi xét về sự chuyển hóa phân li phóng xạ trong dung dịch nước, thì khả năng phản ứng này xảy ra cũng cần phải được tính đến Hydroperoxit và gốc hydroperoxi HO• 2 có thể là tác nhân oxi hóa hoặc là khử phụ thuộc vào điều kiện và tính chất của chất tan Gốc HO• 2 có thể phân li thành ion:

Giá trị pK của phản ứng này nằm trong khoảng 2 - 3 Trong môi trường có tính axit mạnh, gốc tự do hydroxyl (HO•2) tồn tại ở trạng thái không phân ly Ngược lại, trong môi trường có tính kiềm, gốc tự do hydroxyl sẽ tồn tại ở dạng ion oxit.

Gốc HO• 2 là tác nhân oxi hóa mạnh, dễ dàng oxi hóa Fe(II) và là tác nhân khử yếu, khử ion Fe(III) một cách khó khăn Ngược lại, ion O 2 - là tác nhân khử hữu hiệu đối với nhiều ion, bao gồm cả ion Fe(III)

Ph m Th Ki u H nh Trang 10 H 2 O 2 phân li theo phương trình:

H2O2 ặ HO 2 - + H + (16) Giá trị pKa của phản ứng này là 11,75

Các sản phẩm phân tử trong dung dịch chiếu xạ có thể được đo bằng nhiều phương pháp phân tích khác nhau Sự có mặt của các gốc tự do được xác nhận bằng phản ứng của nó với chất tan

Các gốc tự do H• hay •OH có hoạt tính hóa học rất mạnh mẽ sẽ tương tác với các chất khác để quay lại trạng thái bền vững Quá trình tương tác này diễn ra làm biến đổi các chất khác như: protein, carbonhydrat, lipid, enzyme, DNA, RNA… Các phản ứng chính thường là rối loạn cấu trúc không gian, cắt mạch, oxy hóa… Vì vậy, các sản phẩm có độ khô cao như trái cây sấy, trái cây ngâm đường ít nhạy với bức xạ và nên cần được xử lý liều cao hơn

Sử dụng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh phân tích erythromycin

Để nghiên cứu sự biến đổi của kháng sinh Erythromycin sau chiếu xạ, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp cực phổ sóng vuông do một số nghiên cứu gần đây đã thành công trong việc xây dựng phương pháp phân tích Erythromycin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

Kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trên giọt cực chậm là một kỹ thuật phân tích đơn giản và nhanh, không cần hóa chất tinh khiết hay thiết bị đắt tiền, đã được dùng để phân tích hàm lượng nhiều chất kháng sinh [7, 22]

Kỹ thuật cực phổ sóng vuông là kỹ thuật vi phân biên độ lớn sử dụng điện áp xung hình vuông chồng lên điện áp bậc thang Các điều kiện tối ưu bao gồm chiều dài xung và chu kỳ xung đồng nhất (5 ms), bước thế bậc thang 10 mV và cường độ xung 10-60 mV, tương ứng với tần số xung 200 Hz và tốc độ quét thế 200 mV/s Trong phản ứng thuận nghịch, xung đủ lớn để xảy ra quá trình oxy hóa sản phẩm trong xung đầu, tạo ra dòng I1 Xung ngược sau đó tạo ra dòng I2 Dòng Faraday được ghi hai lần: lần đầu vào cuối xung đầu và lần thứ hai vào cuối xung ngược Sự khác biệt giữa hai dòng này (Δi) được vẽ theo bước thế, tạo thành cực phổ sóng vuông, trong đó chiều cao và diện tích sóng tương ứng với thế bán sóng trong cực phổ DC.

1.3.2 Ưu điểm Ưu điểm nổi trội của phương pháp này là tốc độ quét cực nhanh.Tần số khoảng 1- 100 vòng/s dùng cho tốc độ quét sóng nhanh.Giới hạn phát hiện của phương pháp cực phổ sóng vuông trong khoảng 10 -7 -10 -8 M

1.3.3 Nguyên lý hoạt động của phương pháp cực phổ quét nhanh trên cực giọt chậm:

ANALYZER SQF-505 là thiết bị phân tích điện hóa hiện đại hoạt động theo nguyên lý sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm, cực tĩnh, cực rắn Nguyên lý hoạt động có thể tóm tắt: Ta nhúng vào dung dịch nền có chứa chất cần phân tích 3 điện cực:

Cực làm việc trong phép đo phân tích vôn tĩnh là cực giọt thủy ngân Tốc độ chảy của giọt thủy ngân đóng vai trò quan trọng, thông thường là khoảng 7 giây một giọt Trong trường hợp áp dụng kỹ thuật stripping nhanh thì tốc độ chảy tăng lên, khoảng trên 10 giây một giọt.

• Cực so sánh (Reference Electrode): dùng cực Ag/AgCl/KCl bão hòa có thể không đổi

• Cực hỗ trợ (Auxiliary Electrode): dùng cực Platin

Hình 1-4.Hệ thống thiết bị ANALYZER SQF-505

Ph m Th Ki u H nh Trang 26 Đặt lên cực làm việc 2 thành phần:

• Thế một chiều tăng dần theo thời gian hình bậc thang với bước thế 2, 4, 6, 8, 10mV

• Thế xoay chiều là các xung vuông góc có giá trị biên độ xung: 10, 20, 30, 40 mV và tần số vài trăm Hz Để triệt tiêu dòng tụ điện gây nhiễu cho tín hiệu cần đo, ta tiến hành ghi cường độ dòng Faraday xoay chiều ở đầu xung và cuối xung Phần mềm SQF-505 cho phép hiển thị sự biến đổi của cường độ dòng Faraday xoay chiều theo thế một chiều Đường thu được gọi là phổ sóng vuông quét nhanh Phổ thường chứa nhiều đỉnh Mỗi đỉnh ứng với một chất hay một giai đoạn phản ứng điện hóa của một chất Thế bán sóng (E 1/2 ) với một dung dịch nền nào đó là một giá trị đặc trưng cho mỗi chất và thường dùng cho mục đích phân tích định tính Chiều cao của đỉnh (cường độ dòng Faraday xoay chiều) hay diện tích đỉnh (công suất tạo sóng) tỷ lệ với nồng độ chất tham gia phản ứng điện hóa trên cực làm việc nên được dùng cho mục đích định lượng

Stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

Dùng một cực giọt thủy ngân chạy rất chậm, khoảng 10 giây một giọt, làm cực làm việc Phần mềm PSA – F cho phép đặt lên một giá trị thế một chiều tùy ý để tích góp chất cần phân tích lên bề mặt của một giọt thủy ngân đang lớn dần lên Sau quá trình này, máy sẽ tự động tiến hành quét phổ theo chế độ sóng vuông quét nhanh.

Định lượng Erythromycin bằng phương pháp LC – MS/MS

Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC – MS/MS) đã được sử dụng khá rộng rãi để định danh các chất chuyển hóa và định lượng dư lượng thuốc trừ sâu và kháng sinh trong thực phẩm [23]

1.4.1 Nguyên lý chung của phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ:

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hay từ trường nhất định Tỉ số khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó

Trong nghiên cứu khối phổ, chất mẫu được chuyển sang trạng thái bay hơi và ion hóa bằng các phương pháp thích hợp Các ion tạo thành được phân tích trong bộ phận phân tích khối của máy khối phổ Tùy thuộc vào loại điện tích của ion nghiên cứu, có thể chọn chế độ quét ion dương (+) hoặc âm (-) Chế độ quét ion dương thường cung cấp nhiều thông tin hơn về ion được nghiên cứu và do đó được sử dụng phổ biến hơn.

Tuy nhiên, với sự phát triển của công nghệ, hiện nay đã có thể tích hợp cả hai phương pháp quét (CT và MRI) thành một, giúp ích cho các nhà nghiên cứu Tuy vậy, độ nhạy của phương pháp kết hợp này thường không cao bằng khi sử dụng từng phương pháp riêng lẻ.

Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với nhiều khó khăn trong việc tìm các giải quyết được sự tương tích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dò khối phổ đòi hỏi mức độ không cao, trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao, với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng Để khắc phục những khó khăn trên, cần có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện

Kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB) bắn phá nguyên tử thành

Ph m Th Ki u H nh Trang 28 dòng liên tục (CF – FAB…) đã được nghiên cứu và ứng dụng nhưng cho đến cuối thập niên 80 mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (atmospheric Pressure Ionization – API)

Có 3 kiểu hình thành ion ứng dụng trong nguồn API trong LC/MS:

• Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI)

• Ion hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical ionization – ACPI)

• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure photonionization – APPI)

1.4.2 Các loại máy khối phổ

Hiện nay có 4 kiểu máy phân tích khối phổ chính đang được sử dụng, bao gồm:

• Máy khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT)

• Máy khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry FTICR hay FT – MS)

• Máy khối phổ thời gian bay (Time of flight, TOF)

• Máy khối phổ tứ cực (Quadrupole).

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT

Erythromycine base chuẩn của Viện kiểm nghiệm Dược – Bộ Y tế Cá rô phi, tôm sú tươi sống mua tại chợ Nguyễn Tri Phương, Q.10, TPHCM

Tôm càng xanh, cá rô phi được nuôi thử nghiệm có sử dụng Erythromycin tiến hành tại Sóc Trăng

• Thiết bị chiếu xạ gamma Co – 60 Issledavachel đặt tại phòng Công nghệ Bức xạ, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt

• Thiết bị Analyzer SQF – 505 tại Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga chi nhánh phía Nam

• Các thiết bị phân tích khác

Hình 2-1.Thiết bị chiếu xạ gamma Co – 60 Issledavachel

• Các dụng cụ và hóa chất phân tích khác.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Khảo sát phương pháp phân tích Erythromycin chưa chiếu xạ

Khảo sát thông số phân tích Erythromycin trên dung dịch chuẩn không chiếu xạ

Dựng đường chuẩn trên dung dịch nền xác định giới hạn phát hiện của phương pháp

Khảo sát thông số phân tích Erythromycin trong mẫu thủy sản chưa chiếu xạ

Dựng đường chuẩn trên nền mẫu thủy sản xác định giới hạn phát hiện Erythromycin trong mẫu nguyên liệu

2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ đến dung dịch chuẩn Erythromycin

Khảo sát ảnh hưởng của chiếu xạ đến dung dịch Erythromycin ở suất liều 1kGy

Khảo sát ảnh hưởng của các liều chiếu đến dung dịch Erythromycin

Hình 2-2.Thiết bị Analyzer SQF – 505

2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ đến dư lượng Erythromycin trongthủy sản

2.2.4 Bằng phương pháp thêm chuẩn, tạo các mẫu có hàm lượng Erythromycin khác nhau, chiếu xạ ở các suất liều khác nhau, phân tích Erythromycin có trong mẫu sau khi chiếu xạ

2.2.5 Sử dụng mẫu thủy sản nuôi thử nghiệm cho ăn có bổ sung Erythromycin, chiếu xạ và phân tích Erythromycin có trong mẫu sau khi chiếu xạ

Phân tích mẫu có đối chứng với phương pháp LC-MS/MS

SƠ ĐỒ TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu ảnh hưởng của suất liều chiếu xạ lên dung dịch chuẩn Ery Khảo sát thông số phân tích Ery chuẩn không chiếu xạ

Xây dựng đường chuẩn Erythromycin

Nghiên cứu ảnh hưởng chiếu xạ lên dung dịch chuẩn Ery

Khảo sát thông số phân tích Ery trên thủy sản

Kết luận khả năng biến đổi của Ery qua chiếu xạ Đối chứng phương pháp LC-MS/MS

Thí nghiệm trên tôm bổ sung

Erythromycin Thí nghiệm trên cá bổ sung

Khảo sát thông số phân tích Ery trên thủy sản chiếu xạ Đối chứng phương pháp LC – MS/MS

2.3.1 Phương pháp phân tích Erythromycin trên máy Analyzer SQF – 505

- Sử dụng dung dịch đệm Amoniacetate 0.1M, pH 8.0

- Dung môi hòa tan Erythromycin: Acetonitril

- Các thông số tối ưu chạy máy Analyzer SQF – 505 cho Erythromycin:

Vstart: -400mV, Vstop: -1700mV, Vstep: 6mV, Vpulse: 40mV, Tdrops: 5000ms, Velectrolise: -1100mV, Telectrolise: 5s

2.3.2.1 Xây d ự ng đườ ng chu ẩ n

Lấy 25mL dung dịch nền amoniacetate 0.1M, pH 8.0 chuyển vào cốc đo và thêm 5, 10, 20, 30, 40àL dung dịch Erythromycin gốc 250ppm được chuẩn bị bằng acetonitril

Nồng độ Erythromycin trong cốc đo lúc này là 50, 100, 200, 300, 400ppb

Tiến hành xây dựng đường chuẩn theo các thông số chạy máy Analyzer SQF – 505 cho dung dịch Erythromycin

2.3.2.2 Kh ả o sát ả nh h ưở ng c ủ a chi ế u x ạ đế n dung d ị ch Erythromycin chu ẩ n t ạ i các su ấ t li ề u khác nhau và đ o trên máy Analyzer SQF – 505

Dung dịch đệm Amoniacetate 0.1M, pH: 8.0

Cho 25mL dung dịch đệm amoni acetate 0.1M, pH 8.0 vào ống nghiệm Dùng micropipette hỳt chớnh xỏc 5àL, 10àL, 20àL, 30àL, 40àL dung dịch chuẩn Erythromycin gốc 250ppm cho vào ống nghiệm Như vậy, nồng độ dung dịch Erythromycin có trong ống nghiệm là 50ppb, 100ppb, 200ppb, 300ppb, 400ppb

Dung dịch mẫu được đưa đi chiếu xạ ở các suất liều: 1kGy, 2kGy, 3kGy, 4kGy, 4.5kGy, 5kGy, 7kGy

Sau khi chiếu xạ ở các liều chiếu khác nhau, tiến hành phân tích trên thiết bị phân tích Analyzer SQF – 505

2.3.2.3 Phân tích Erythromycin trên m ẫ u th ủ y s ả n 2.3.2.3.1 Quy trình phân tích Erythromycin

Hút 5 ml phần dịch trong phía trên Để bay hơi dung môi

Hòa tan phần cặn với 3 ml n-Hexan

Thêm 5 mL dung dịch đệm

Dùng pipet Pasteur hút phần dịch trong bên dưới Đo trên thiết bị Analyzer SQF 505

Quy trình trên được nghiên cứu bởi Đinh Thị Thu Hằng (2010) [7] và Nguyễn Phước Minh [21] Trường Đại học Bách khoa TPHCM

Mẫu tôm sú và cá rô phi được mua từ chợ Nguyễn Tri Phương, Quận 10, Thành phố Hồ Chí Minh, đã được phân tích bằng kỹ thuật LC - MS/MS tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh Kết quả phân tích cho thấy mẫu nguyên liệu ban đầu có chứa kháng sinh Erythromycin.

Dung dịch gốc chuẩn Erythromycin 500ppm: cân chính xác 0.05g Erythromycin chuẩn pha trong bình định mức 100mL, định mức bằng Acetonitril

Dựng micropipette hỳt 400àL Erythromycin 500 ppm cho vào bỡnh định mức 50mL rồi định mức bằng dung môi Acetonitril đến vạch Lúc này ta được 50mL Erythromycin 4 ppm Dùng 50mL Erythromycin 4 ppm này trộn đều với 1000g nguyên liệu đã xay nhuyễn Lúc này hàm lượng Erythromycin được bổ sung trong 1g mẫu là 200ppb

Chia nguyên liệu có Erythromycin thành 7 phần bằng nhau và đem đi chiếu xạ lần lượt ở các suất liều: 1kGy, 2kGy, 3kGy, 4kGy, 4.5kGy, 5kGy, 7kGy Sau đó, tiến hành phân tích mẫu như sau:

Cân 5 g nguyên liệu (đã nghiền mịn) cho vào ống nhựa ly tâm 50mL Thêm chuẩn Erythromycin vào, trộn đều Thêm 10 mL dung môi Đậy nắp ống nhựa ly tâm rồi lắc đều, sau đó đem ly tâm 3000 g / 10 phút Dùng pipet hút 5mL dung dịch trong phía trên cho vào ống nhựa ly tâm 15mL Để mẫu bay hơi dung môi Hòa tan phần cặn bằng 3mL n-Hexan Thêm tiếp 1mL dung dịch đệm Lắc đều rồi ly tâm 3000 g / 10 phút Dùng pipet Pasteur hút phần dịch trong phía dưới rồi đem đo bằng máy Analyzer SQF-505

Tiến hành: chuẩn bị mẫu chuẩn ở nồng độ 50ppb, 100ppb, 200 ppb, 300 ppb, 400 ppb Phần dịch sau chiết được đem đo bằng máy Analyzer SQF-505 ở chế độ PSA-F

Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp thêm chuẩn để tìm ra nồng độ thật của mẫu cần xác định sau khi chiếu xạ

2.3.2.4 Quy trình phân tích Erythromycin trên m ẫ u nguyên li ệ u tôm, cá đượ c nuôi và ki ể m soát quá trình x ử lý kháng sinh

Mẫu tôm, cá được nuôi tại ấp An Phú, Thị Trấn Kế Sách, Tỉnh Sóc Trăng Kiểm soát từ giai đoạn thả giống đến khi đạt kích cỡ thương phẩm

Xử lý kháng sinh: 100mg/kg thể trọng/ngày trong thời gian là 7 ngày

Số lần cho ăn thức ăn trong ngày: 4 lần

Sau khi ngưng thuốc 23 ngày tiến hành lấy mẫu và sơ chế, bảo quản đem đi chiếu xạ ở các suất liều: 1kGy, 2kGy, 3kGy, 4kGy, 4.5kGy, 5kGy, 7kGy

Tiến hành phân tích mẫu tương tự như trên bằng phương pháp thêm chuẩn để xây dựng đường chuẩn và tìm ra nồng độ thật của mẫu sau khi chiếu xạ.

XỬ LÝ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ

Xử lý các kết quả thực nghiệm theo phương pháp thống kê

• Giá trị nồng độ trung bình cộng

• Giá trị tín hiệu trung bình cộng

• Độ lệch chuẩn đối với 1 trị đo được

• Độ lệch chuẩn đối với giá trị trung bình

• Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (biên giới tin cậy hoặc độ tín nhiệm giới hạn)

• Độ biến động của phép đo

Kết quả chấp nhận được khi: RSD≤5%, nhưng với phân tích nồng độ vết (nồng độ t 0.99, f

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Phân tích Erythromycin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông

Theo kết quả nghiên cứu của Đinh Thị Thu Hằng (2010) [7] và Nguyễn Phước Minh [21, 22], khi nghiên cứu phương pháp phân tích Erythromycin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông trên thiết bị Analyzer – 505 đã chọn được các điều kiện sau:

• Dung dịch đệm Amoniacetate 0.1M, pH 8.0

• Dung môi hòa tan Erythromycin: Acetonitrile

• Các thông số đo của máy Analyzer SQF – 505 là: Mode PSA – F, Vstart= - 400mV; V stop = -1700mV; V step =6mV; V pulse = 40mV; T drop = 5000ms;

Cường độ dòng của Erythromycin bị ảnh hưởng mạnh bởi loại dung dịch nền

Nồng độ dung dịch nền (lực ion của dung dịch nền) có vai trò tạo ra môi trường điện ly, tạo nên dòng dịch chuyển các điện tích khi đặt trong điện trường, hỗ trợ quá trình truyền khối các phân tử Erythromycin đến bề mặt điện cực tốt hơn [21] Như đã nghiên cứu thì dung dịch nền được chọn là amoni acetate 0.1M, pH 8.0

Sử dụng thông số đo của máy Analyzer SQF – 505 cho dung dịch Erythromycin, phổ sóng vuông của dung dịch nền amoni acetate 0.1M, pH 8.0 được xác định lại, thu được hai đỉnh phổ có thế bán sóng lần lượt là -996mV và -1616mV (Hình 3-1).

Hình 3-1 Sóng phổ dung dịch nền amoni acetate 0.1M, pH 8.0 Để nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ đến sự biến đổi của dư lượng Erythromycin trong thủy sản trước hết cần xác định các thông số đặc trưng của Erythromycin khi phân tích bằng phương pháp cực phổ sóng vuông Các thông số đặc trưng được chọn là thế bán sóng và cường độ dòng Trong cùng 1 điều kiện phân tích, các thông số này không đổi và đặc trưng cho chất phân tích Vậy, trước hết cần xác định lại các thông số đặc trưng này

Bảng 3-1.Phổ sóng vuông của dung dịch Erythromycin A chuẩn

Nồng độ (ppb) I (nA) RSD (%) E ẵ (mV)

• Mỗi giá trị là trung bình của 3 lần đo (n=3)

Từ kết quả trên, ta nhận thấy thế bán sóng đặc trưng của Erythromycin A là -1390 mV Khi thay đổi nồng độ thì chỉ cường độ dòng thay đổi, thế bán sóng đặc trưng cho Erythromycin A là -1390mV

Kết luận: Thế bán sóng đặc trưng của Erythromycin A là -1390mV trong điều kiện phân tích như trên Khi thay đổi nồng độ Erythromycin trong dung dịch từ 50 – 400ppb, cường độ dòng tăng tuyến tính như trên hình 3.2 Ta thiết lập đường chuẩn cho Erythromycin trong khoảng nồng độ 50 – 400ppb, cho ta biết độ nhạy và giới hạn phát hiện của phương pháp

Hình 3-2 Sóng phổ đặc trưng của Erythromycin và mối quan hệ giữa cường độ dòng và nồng độ Erythromycin trong khoảng 50 – 400ppb

Trên hình 3-2, ta thấy hình dạng sóng phổ Erythromycin cong đều, ổn định và tỷ lệ thuận với chiều tăng nồng độ Erythromycin Đường chuẩn Erythromycin tuyến tính trong khoảng nồng độ 50 – 400ppb:

• Phương trình đường chuẩn: I (nA)= 0.95 x C (ppb) + 175

• Hệ số tương quan của đường chuẩn: R= 0.99581

• Độ lệch chuẩn %RSD trong khoảng 0.75 ÷ 2.85

• Giới hạn phát hiện: LoD = 22.737ppb

Nghiên cứu của Đinh Thị Thu Hằng [7] và Nguyễn Phước Minh[21, 22] đã chứng minh kỹ thuật stripping nhanh có thể được sử dụng để xác định hàm lượng kháng sinh trong thủy sản Vấn đề đặt ra là khi trong thực phẩm (thủy sản) còn tồn dư một lượng chất kháng sinh Erythromycin và thủy sản này được đem đi chiếu xạ thì liệu Erythromycin bị biến đổi hay không? Sự biến đổi này sẽ làm hàm lượng Erythromycin biến đổi như thế nào? Thí nghiệm tiếp theo sẽ nhằm tìm hiểu rõ vấn đề này

Thí nghiệm được tiến hành trước hết lên các dung dịch Ery pha từ chất chuẩn.

Khảo sát ảnh hưởng của chiếu xạ đến dung dịch Erythromycin chuẩn

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của liều hấp thu đến nồng độ dung dịch Erythromycin chuẩn

Các dung dịch Erythromycin chuẩn có nồng độ khác nhau gồm: 50ppb, 100ppb, 200ppb, 300ppb, 400ppb được chiếu xạ ở 1kGy, 2kGy, 3kGy, 4kGy, 4.5kGy, 5kGy, 7kGy Tiến hành phân tích Erythromycin trong cùng điều kiện đã thực hiện với các dung dịch Erythromycin chuẩn không chiếu xạ Khảo sát sóng phổ thu được bằng phương pháp sóng vuông quét nhanh theo các thông số: cường độ dòng và thế bán sóng

Bảng 3-2 Cường độ dòng và hiệu suất phân hủy của dung dịch Ery chuẩn sau khi chiếu xạ tại các suất liều khác nhau

Hình 3-3 Phổ sóng vuông dung dịch chuẩn nồng độ 50ppb sau khi chiếu xạ

Hình 3-4 Phổ sóng vuông của dung dịch Ery chuẩn nồng độ 100ppb sau khi chiếu xạ

Máy phân tích Analyzer SQF – 505 khi xây dựng đường chuẩn của một chất cho phép thế bán sóng dao động trong khoảng ±40mV [35] Thế bán sóng đặc trưng của Erythromycin chuẩn chưa chiếu xạ là -1390mV Thế bán sóng của dung dịch sau khi chiếu xạ thu được peak (trừ điểm peak (-996mV và -1616mV) của dung dịch nền) là khoảng từ -1350 -> -1380mV Vì vậy, tại sóng phổ có thế bán sóng trong khoảng này ta nhận định đó là dấu hiệu nhận biết sóng phổ của Erythromycin A

Thế bán sóng của dung dịch Erythromycin chuẩn sau khi chiếu xạ không ổn định như khi chưa chiếu xạ Nguyên nhân là trong quá trình chiếu xạ, các gốc tự do H• hay

•OH sinh ra do xạ phân nước làm thay đổi lực ion của dung dịch do thay đổi tỷ lệ nồng độ H + , CH 3 COO - và NH 4 + khi có mặt các gốc tự do Do đó, thế bán sóng của Erythromycin có xu hướng dịch chuyển về phía bên trái, tức là thế bán sóng kém âm hơn,

Chiếu xạ với liều càng cao thì cường độ dòng của Erythromycin càng giảm, có nghĩa là mức độ phân hủy của Erythromycin càng lớn

Hình 3-8 Ảnh hưởng của nồng độ Erythromycin đến hiệu suất phân hủy Erythromycin trong dung dịch chuẩn sau khi chiếu xạ

Theo hình 3-8, ta nhận thấy: Trong khoảng nồng độ 50 – 400ppb, Erythromycin gần như bị phân hủy bởi năng lượng của bức xạ với liều hấp thu từ 5kGy Tại 5 và 7kGy, mức năng lượng cao được chiếu vào mẫu lỏng hình thành nhiều các gốc tự do từ quá trình xạ phân nước, tác động vào các ion trong dung dịch cũng như nhóm chức trong Erythromycin làm Erythromycin bị oxy hóa và biến đổi Mặt khác, do chiếu xạ ở mức năng lượng cao, photon có thể tác động trực tiếp đến Erythromycin, làm phân hủy hoàn toàn Erythromycin

400ppb 300ppb 200ppb 100ppb 50ppb

Như vậy, trong dung dịch nền Amoniacetate 0.1M, pH 8.0 dung dịch Erythromycin A khi được chiếu với liều từ 1 đến 7kGy thì Erythromycin A bị phân hủy theo liều hấp thu và tại 7kGy thì Erythromycin bị phân hủy hoàn toàn.

Khảo sát thông số phân tích Erythromycin trong thủy sản chưa chiếu xạ

3.3.1 Khảo sát thông số phân tích Erythromycin trong tôm sú chưa chiếu xạ

Tiến hành ghi phổ cho Erythromycin ở những giá trị nồng độ 50ppb, 100ppb, 200ppb, 300ppb, 400ppb

Hình 3-9 Đường chuẩn Erythromycin trong mẫu tôm sú

• Phương trình đường chuẩn: I (nA) = 0.88 x C + 15

• Giới hạn phát hiện: LoD = 30.611

• Giới hạn định lượng: LOQ = 3x LoD = 91.83ppb

3.3.2 Khảo sát thông số phân tích Erythromycin trong cá rô phi chưa chiếu xạ

Tiến hành ghi phổ cho Erythromycin ở những giá trị nồng độ 50ppb, 100ppb, 200ppb, 300ppb, 400ppb

Hình 3-10 Đường chuẩn Erythromycin trong mẫu cá rô phi

• Phương trình đường chuẩn: I (nA) = 0.88 x C + 15

• Giới hạn phát hiện: LoD = 30.611

• Giới hạn định lượng: LOQ = 3x LoD = 91.83ppb

Phân tích Erythromycin trong mẫu thủy sản chiếu xạ

3.4.1.1 M ẫ u tôm càng xanh nuôi có s ử d ụ ng Erythromycin

Mẫu tôm được nuôi và xử lý kháng sinh, sau đó đem chiếu xạ ở các liều khác nhau từ 1kGy đến 7kGy Các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 50 đến 400ppb, sau đó tiến hành đo bằng thiết bị Analyzer SQF – 505, thu được kết quả để đánh giá hiệu quả của quá trình chiếu xạ trong việc loại bỏ kháng sinh trong tôm.

Hình 3-11 Phổ sóng vuông của Erythromycin trong mẫu tôm càng xanh chiếu xạ ở 1kGy

Từ kết quả thu được ta nhận thấy:

Hình ảnh sóng phổ cong đều tại các suất liều 3, 5, 7kGy nhưng có sự chênh lệch thế bán sóng khá rõ trong cùng 1 mẫu phân tích nên đỉnh các sóng phổ có sự chênh lệch nhau Sóng phổ tại 1kGy ổn định và vị trí đỉnh phổ tăng đều theo hàm lượng chất phân tích

Mặc dù đã thêm chuẩn trong tiến trình thí nghiệm nhưng khi phân tích trên máy cực phổ sóng vuông không thấy xuất hiện thế bán sóng của Erythromycin (-1390 ± 40mV) Thế bán sóng của dung dịch trong mẫu tôm càng xanh phân tích được dao động trong khoảng -1148 → -1234mV Giả sử, khoảng thế bán sóng trên là của Erythromycin thì độ lệch chuẩn của thế bán sóng dung dịch phân tích được so với thế bán sóng của Erythromycin chuẩn là 11% đến 16% do đó không thể kết luận phổ phân tích được là của Erythromycin Điều này chứng tỏ, Erythromycin có trong tôm càng xanh đã biến đổi sau khi chiếu xạ, có thể thành những dẫn xuất khác của Erythromycin Nhưng biến đổi cụ thể thành chất gì thì cần có những nghiên cứu sâu thêm

Thí nghiệm tiếp theo được tiến hành ở mẫu tôm sú bằng cách thêm chuẩn Erythromycin và nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ đến hàm lượng Erythromycin

3.4.1.2 M ẫ u tôm sú thêm chu ẩ n Erythromycin

Mẫu tôm nguyên liệu ban đầu được làm sạch, bảo quản lạnh đông và đưa kiểm tra tại Trung Tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TPHCM Kết quả cho thấy nguyên liệu tôm ban đầu có chứa 49.4ppb Erythromycin theo chứng thư số MM11061274 Lấy nguyên liệu này khảo sát hàm lượng Erythromycin sau khi chiếu xạ

Mẫu tôm xay nhuyễn được bổ sung 200ppb Erythromycin rồi chiếu xạ với các liều khác nhau (1kGy, 2kGy, 3kGy, 4kGy, 4,5kGy, 5kGy, 7kGy) Hàm lượng Erythromycin ban đầu trong mẫu chưa chiếu xạ ước tính khoảng 250ppb.

Tiến hành thí nghiệm, đo trên thiết bị Analyzer SQF – 505 và thu được kết quả như sau:

Bảng 3-3 Phổ sóng vuông của dung dịch phân tích trong mẫu tôm sú chiếu xạ tại các suất liều 1kGy, 2kGy, 3kGy, 4kGy, 4.5kGy, 5kGy, 7kGy

Các giá trị đo được có độ lệch chuẩn nằm trong khoảng 0.030 – 0.694 %

Hình 3-15 Phổ sóng vuông của Erythromycin trên mẫu tôm sú ở liều hấp thu 1kGy

Hình 3-16 Phổ sóng vuông Erythromycin trên mẫu tôm sú ở liều hấp thu 2kGy

Hình 3-19 Phổ sóng vuông của Erythromycin trên mẫu tôm sú ở liều hấp thu 4.5kGy

Hình dạng sóng phổ của dung dịch phân tích được của mẫu tôm sú thêm Erythromycin tại tất cả liều chiếu cong đều, ổn định hơn so với mẫu tôm càng xanh nuôi bằng thức ăn chứa Erythromycin sau khi chiếu xạ Ở các mẫu tôm sú khi chiếu xạ, thông số thế bán sóng của dung dịch phân tích biến đổi tương tự ở mẫu tôm càng xanh sau khi chiếu xạ, dao động trong khoảng -1154 đến -1234mV, lệch 11% - 17% so với thế bán sóng của Erythromycin chuẩn Do vậy chưa thể kết luận đó là sóng phổ của Erythromycin A ban đầu

Giả sử, thế bán sóng của dung dịch phân tích là thế bán sóng của dẫn xuất của Erythromycin A Bằng phương pháp thêm chuẩn, thiết lập mối tương quan giữa nồng độ thêm vào và cường độ dòng để xác định hàm lượng Erythromycin như sau:

Hình 3-22 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ thêm vào và cường độ dòng

Erythromycin trong mẫu tôm sú chiếu xạ ở 1kGy

Erythromycin trong mẫu tôm sú chiếu xạ ở 3kGy y = 6.810x + 1669.

Nồngđộ thêm vào (ppb)Cườngđộ dòng (nA)

Erythromycin trong mẫu tôm sú chiếu xạ ở 4.5kGy

Erythromycin trong mẫu tôm sú chiếu xạ ở 5kGy y = 6.948x + 1595

Dựa vào đồ thị tính kết quả thu được từ phương pháp thêm chuẩn, ta có bảng hàm lượng Erythromycin tính toán được với mỗi mẫu được chiếu xạ tại các liều chiếu khác nhau:

Bảng 3-4 Kết quả hàm lượng Erythromycin mẫu tôm sau chiếu xạ

Mẫu tôm thêm Erythromycin sau khi chiếu xạ

Bảng 3-5 Hiệu suất phân hủy của Erythromycin sau khi chiếu xạ trong mẫu tôm sú

Hàm lượng Ery ban đầu (ppb)

Hàm lượng Ery sau chiếu xạ (ppb)

Ph m Th Ki u H nh Trang 62 4 249.4 229.65 7.92

Kết quả phân tích cho thấy Erythromycin trong mẫu tôm thêm Ery không giảm đáng kể sau khi chiếu xạ dù ở liều xạ 1 hay 7kGy, xấp xỉ so với hàm lượng Erythromycin ban đầu Liều chiếu không cao, năng lượng các bức xạ của các suất liều khảo sát không đủ lớn để phá vỡ cấu trúc phân tử của Erythromycin Erythromycin không bị biến đổi do chiếu xạ Đem mẫu tôm bổ sung Erythromycin đã được chiếu xạ tại 4kGy và 7kGy phân tích tại Trung Tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TPHCM bằng phương pháp LC – MS/MS nhận thấy Erythromycin vẫn còn trong mẫu đem đi chiếu xạ và thu được kết quả sau (theo chứng thư số MM11061276, MM11061277):

Bảng 3-6.So sánh kỹ thuật cực phổ sóng vuông với kỹ thuật LC – MS/MS mẫu tôm sú

Chỉ tiêu so sánh Kỹ thuật cực phổ sóng vuông LC – MS/MS

Hàm lượng mẫu chiếu xạ tại 4kGy 229.65 207.1

Hàm lượng mẫu chiếu xạ tại 7kGy 243.71 247.6

Mặc dù thế bán sóng của dung dịch phân tích không nằm trong khoảng thế bán sóng của Erythromycin nhưng nếu cho giả thiết đó là thế bán sóng của dẫn xuất của Erythromycin thì nhận thấy kết quả phân tích 2 phương pháp là gần nhau chứng tỏ kết quả đúng

Như vậy, Erythromycin vẫn còn trong mẫu sau khi chiếu xạ và thậm chí với hàm lượng xấp xỉ hàm lượng ban đầu (249.4ppb) Khi phân tích bằng phương pháp LC-

MS/MS, Erythromycin được nhận danh và xác định hàm lượng rõ hơn khi phân tích bằng phương pháp cực phổ sóng vuông Điều này có thể giải thích là phương pháp LC/MS/MS do nhận danh Erythromycin bằng các mảnh m/z được phân cắt từ phân tử Erythromycin A ban đầu Các mảnh này có thể cũng là sản phẩm của sự xạ phân nên phương pháp đo bằng kỹ thuật LC/MS/MS không nhận ra sự biến đổi của erythromycin sau chiếu xạ

Bằng phương pháp cực phổ sóng vuông, peak phổ của dung dịch thu được lại không có thế bán sóng trong khoảng thế bán sóng của Erythromycin, chứng tỏ Erythromycin trong mẫu sau khi chiếu xạ có biến đổi và biến đổi thành dạng dẫn xuất khác của Erythromycin Điều này có thể giải thích như sau:

• Trong tế bào sinh vật, có sẵn cơ chế hóa sinh học tiêu diệt, chống lại sự tấn công các gốc tự do như 1 số enzyme chống oxy hóa: peroxidase, SOD dismutase… vô hiệu hóa ngay từ đầu chất tiền thân của các dạng oxy hoạt động khác

• Trong quá trình chiếu xạ và quá trình trích ly Erythromycin, do có mặt oxy, mặc dù các gốc tự do sẽ phản ứng với thành phần thực phẩm (glicid, lipid không bão hòa…), vi sinh vật trước nhưng các gốc tự do đó vẫn phản ứng với các nhóm chức của Erythromycin A làm Erythromycin A bị biến đổi thành dạng khác