Dư lượng thuốc trừ sâu đượcchiết ra khỏi mẫu bang dung dich dém va acetonitrile, dugc lam sach voi theo phuong phap QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe va phân tích b
Trang 1ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHÍ MINH
TRUONG DAI HOC BACH KHOA
PHAN NGUYEN THU XUAN
XÁC ĐỊNH DONG THOI DU LƯỢNG TREN 40 HOP
CHUYEN NGANH: KY THUAT HOA HOCMA SO CHUYEN NGANH: 60.52.75
LUAN VAN THAC SI
TP HO CHI MINH, tháng 12 năm 2014
Trang 2ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHÍ MINH
TRUONG DAI HOC BACH KHOA
PHAN NGUYEN THU XUAN
XÁC ĐỊNH DONG THOI DU LƯỢNG TREN 40 HỢPCHAT THUOC TRU SAU PHO BIEN O VIET NAM
TRONG NHIEU THUC PHAM BANG PHUONGPHAP QuEChERS VA PHAN TICH BANG LC-
MS/MS
CHUYEN NGANH: KY THUAT HOA HOCMA SO CHUYEN NGANH: 60.52.75
LUAN VAN THAC SI
TP HO CHI MINH, thang 12 năm 2014
Trang 3CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BACH KHOA —DHQG -HCMCán bộ hướng dẫn khoa hoc : TS Trần Thị Kiều Anh
Thành phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:(Ghi rõ họ, tên, học ham, học vi của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lýchuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)
CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA
Trang 4NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Phan Nguyễn Thu Xuân - - MSHV:13050206
Ngày, tháng, năm sinh : 12/044/1990 5S Sa Nơi sinh: Đồng ThápChuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học Mã số : 60.52.75 I TÊN ĐÈ TÀI: “ Xác định đồng thời dư lượng trên 40 hợp chất thuốc trừ sâu
pho biến ở Việt Nam trong nhiều thực phẩm bằng phương pháp QuEchERS
và phân tích băng LC-MS/MS’
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:1 Khảo sát các điều kiện thích hợp dé phân tích đồng thời các hợp chất thuốc trừ
sâu phô biên tại Việt Nam.
2 Thâm định phương pháp đã xây dựng.3 Áp dụng quy trình để kiểm soát, đánh giá chất lượng sản phẩm, lượng thuốc trừ
sau tôn dư theo thời gian trong một vài loại thực phâm trên thi trường.II NGÀY GIAO NHIỆM VU : 20/01/2014
Ill NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 21/11/2014
IV.CÁN BỘ HƯỚNG DAN : TS Trần Thị Kiều Anh
Tp HCM, ngày thang năm 20
CÁN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO
(Ho tên và chữ ky) (Họ tên và chữ ký)
Trang 5Lời Cám ƠnTrước tiên tôi xin chân thành cảm ơn quý Thây Cô trường Đại HọcBách Khoa Thành Phố Hồ Chi Minh, quý Thay Cô Khoa Kỹ Thuật Hóa Họcđã giảng dạy và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thànhtốt khóa học và thực hiện luận văn Thạc Sĩ.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Ngô Quốc Việt, anh Nguyễn
Thanh Trung và các anh chị tai Khu Thí Nghiệm của Trung tâm 3 đã giúp đỡ
và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn đến cô Trần Thị KiềuAnh đã hướng dan, góp ý và dầu dắt tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập
và thực hiện luận văn với cô.
Và tôi cũng xin cảm ơn đên các gia đình và các bạn bè đã luôn tintưởng, ủng hộ tôi trong suôt quá trình làm việc của mình.
Trang 6Tóm tat luận văn
Phương pháp dùng để xác định đồng thời dư lượng của trên 40 hợp chấtthuốc trừ sâu được sử dụng pho bién hién nay tại Việt Nam, trong đó có họ
Carbamate (Indoxacarb, Fenobucarb, Oxamyl, Aldicarb ), họ Lân hữu cơ(Malathion, Methidation, Diazinon, Dimethoate ), ho Triazole (Hexaconazole,
Propiconazole, Tebuconazole, Fenbuconazole ) va một số ho thuốc trừ sâu khác.Thử nghiệm phương pháp trên 100 mẫu thật trong thực phẩm như các nhóm rau quảtươi, nhóm chứa nhiều tinh bột, thực phẩm khô, thực phẩm chứa nhiều chất béo, giavị, thuốc lá được lay từng nhiều nguồn khác nhau Dư lượng thuốc trừ sâu đượcchiết ra khỏi mẫu bang dung dich dém va acetonitrile, dugc lam sach voi theo
phuong phap QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) va
phân tích bang sắc ký lỏng ghép khối pho (LC-MS/MS) với thời gian thực hiện 13phút cho trên 40 cấu tử Định trị phương pháp và kiểm soát chất lượng được thựchiện một cách chặt chẽ Với điều kiện tối ưu, khoảng nông độ làm việc của các cầutử từ 10 — 1000 ug/L và đường chuẩn được dựng tại các nồng độ 10 ug/L, 20 ug/L,50 pg/L, 100 pg/L và 200 ug/L với hệ số tương quan tuyến tinh > 0.99 cho tất cảcác câu tử Dựa trên thé tích tiêm mẫu là 50uL, thu được hiệu suất thu hồi trongkhoảng 78.8% — 115.6% và độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10% Giới han pháthiện của phương pháp tại nồng độ 0.02 mg/Kg và giới hạn định lượng tại nồng độ
0.05 mg/Kg được cho là có khả nang phân tích vì phù hợp với giới hạn cho phép
của các cau tử nghiên cứu được quy định trong quyết định số 46/ 2007/ QD-BYTcủa Bộ Y Tế và theo tiêu chuẩn Châu Âu Regulation EC số 396/2005
Trang 7This paper reports a method for determination simultaneously residues of 40common pesticides in Viet Nam, such as the Carbamates (Indoxacarb, Fenobucarb,Oxamyl, Aldicarb ), the Organophosphates (Malathion, Methidation, Diazinon,Dimethoate ), the Triazoles (Hexaconazole, Propiconazole, Tebuconazole,Fenbuconazole ) and other groups’ constituents.
Applied testing method on over 100 real samples of food such as vegetables,fruit, tomatoes, from different sources The pesticides residue was simultaneouslyextracted and cleaned using a buffered QUEChERS method (Quick, Easy, Cheap,Effective, Rugged and Safe), followed by Liquid Chromatography — MassSpectrometry/Mass Spectromatry analysis (LC-MS/MS) for 40 constituents in 13minutes The performed method was evaluated and quality controlled strictly Theresults showed the matrix-matched calibration curve linearity Un optimumconditions, the correlation coefficients were >0.99 in the range of pesticidesconcentrations from 10 to 1000 ug/L in different selected matrix samples Based oninjected volume sample 50 uL, the recoveries (spiked at three different levels 0.05mg/kg, 0.1 mg/kg and 0.2 mg/kg) were from 78.8% to 115.6% and the relativestandard deviations (RSD) were lower than 10% for all constituents The limit ofdetection (LOD) for 0.02 mg/Kg concentration and the limit of quantitation (LOQ)of 0.05 mg/Kg concentration might be analysed because of matching up withpermissible limits of studied constituents, defined in Ministry of Public Health’sdecision No 46/2007 / QD-BYT and Europe’s Regulation EC No 396/2005.
Trang 8LỜI CAM ĐOAN
Nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Môi Trường —
Phong Thí nghiệm Sắc Ký Quang Phổ - Khu Thí Nghiệm Trung Tâm Kỹ Thuật
Tiêu Chuẩn Do Lường Chất Lượng 3
Kết quả nghiên cứu này do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dan củaCô TS Trần Thị Kiéu Anh
Các két qua nghiên cứu trình bày trong luận văn nay là các sô liệu trung
thực, không sao chép kết quả nghiên cứu của tác giả khác
Tôi xin cam doan.
Phan Nguyễn Thu Xuân
Trang 9MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIET TAT 2 2 se £eEsEsEsE+eeeEsesed ivDANH MUC BANG 0 VDANH MỤC HINH VE, ĐỎ 'THỊ, - - - s31 ESESESESESEveEeeserereesered viMỞ DAU _ Ăn Hee |CHƯƠNG 1: TONG QUAN - che 21.1 — Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực Vật: -c-scsc se cesesksksesersesed 21.2 Du lượng thuốc bảo vệ thực Vật: ccccccecescscesscececeseseecscsceseesevecsceeeees 21.3 Tác hại của thuốc bảo vệ thực Vật: - 5 sex cerseserees 2
1.4 Nhóm lân hữu CƠ Ăn vn 314.1 Khái niệm va ứng dụng - - - - « s nnnn ke 3
1.4.2 Công thức chung và một số dạng thường gặp -. - 31.4.3 Cơ chế tác động và độc tính - - + 2 s+s+E+EzE£Erkrtrrerrsred 4
1.5 Nhóm carbarmaf© 00000 HT ke 415.1 Khái niệm và ứng dụng - «<< ng ke 41.5.2 Công thức chung - - - << s00 ke 5
1.5.3 Cơ chế tác động và độc tính - - + 2 s+s+E+EsE£Erkrkererrsred 5
1.6 Nhóm triazZOÌ@ L0 0 ng 51.6.1 Khái niệm va ứng dụng - - - - s nnnn ke 5
1.6.2 Cơ chế tác động và độc tính - - + 2 +s+s+E+EzE£Erkreekerrsred 61⁄7 _ Tính chất các hợp chất thuốc trừ sâu sẽ nghiên cứu 61.8 Tổng quan một số phương pháp chiết và làm sạch mẫu trong việc xácđịnh đồng thời nhiều thuốc trừ sâu [8] ¿+ 2-5 + 2 2 +2+E+E+Ez££E£EzEsezreree 13
1.8.1 Chiết ran long SLE (solid - liquid extraction) -s-5<¿ 131.8.2 Chiết lỏng lỏng LLE (liquid-liquid extraction) - 141.8.3 Kỹ thuật chiết pha rắn SPE (solid phase extraction) 151.8.4 Kỹ thuật chiết pha ran với chất hap phụ không phân cực l61.8.5 Ky thuật chiết pha ran với chất hap phụ trao đổi ion l61.8.6 Chiết vi lượng pha ran SPME (solid phase micro extraction) 16
Trang 101.8.7 Phương pháp QuEChERS - - << S1 ng k, 17
1.9 Tổng quan về phương pháp Sắc ký: - + 5c 2 sec 191.9.1 Đại cương về phương pháp sắc ký: -5- - cc+ccscscsccee 191.9.2 Giới thiệu một số phương pháp sắc KY? -5-5-: 201.9.3 Nguyên tắc hoạt động: 555cc 2tvrctererrrererrred 201.9.4 Các đại lượng cơ bản của sắc lS%ỔỐ.Ố:ÍỔỐỞỔỒồỒ 211.9.5 Ứng dụng: - c5 c2 S* 2t 221 121211111111 111111111 221.10 Sắc ký lỏng (LC) -c- 5c c1 1 12 2 1111111211111 111121110101 01 11 ty 221.10.1 Giới thiệu về sắc ký lỏng: - 5255 ccccccecrsrrerrerered 23
1.10.2 Các phương pháp thường sử dụng -«sssssss++esss 23
1.10.3 Một số kỹ thuật thường gặp trong LC: -5:©c+5<55¿ 251.10.4 Cột sử dụng trong sắc ký lỏng: - - 555cc csccseecee 25
1.10.5 Bơm cao áp Q9 ke 26
1.10.6 Detector sử dụng trong sắc ký lỏng 55 55c csccscecs2 26
1.10.7 Dinh tính và định lượng: << 5555 sseesseks 28
1.II sắc ký lỏng đầu dò Khối phố (LC — MS) ues 291.11.1 Giới thiệu về khối phố: - + 2-5-5 25252 2E£E+EzEEE£EzEeeerrsred 291.11.2 Cấu tạo cơ ban của hệ thống khối phổ -55- 5+: 30
I.II.3 Các kỹ thuật Ion hOá << G100 ngư 31
L114 Các hệ thống tách KhOi ccc cscsesesescsessesescsssseseseseesseeees 33* Nguyên tắc chung của khối phối MS - - 555+ccs+esesrecxee 35* Nguyên tắc chung của khối phố MS/MS c-cccccccccceceee 36
1.11.5 Bộ phận phát hiện ion (IDef€CfOT): << << <2 37
CHƯƠNG 2: DOI TƯỢNG — PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 392.1 _ Đối tuong— Mục tiêu — nội dung nghiên cứu: -‹- 392.1.1 Đi tượng: CS ST 1 121 1111110111111 111111 re 39
21.2 0ì 050 - 4 39
2.1.3 Yo nghĩa thực tiỄn: -. c5: 56s E23 151 121211 1E ckred 39
2.2 Phuong pháp nghiÊn CỨU: - <9 ng ke 392.3 Phương tiện nghiÊn CỨU: << 00119 1 kg 40
2.3.1 Thiết bị, ụng CỤ - E2 2 12121 1511111211111 11111111111 40
Trang 112.3.2 Hoá chất, chất Chuan c.cccccccccccccccccsscsscscescssesscsccecsecsecscacsecsecscsacees 402.3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn: 5-52 2 522s+E+E2££E£Eztzeerrered Al
CHƯƠNG 3: THUC NGHIIỆM - + tt SE S312 vs ree 44
3.1 _ Tối ưu các điều kiện xác định đồng thời dư lượng thuốc trừ sâu trên
3.2.2 Đánh giá phương pháp phân tich << - <2 50
3.2.3 Phân tích đồng thời nhiều thuốc trừ sâu trên một số đối tượng mẫu
thẬ — 2L2 HH HH H111 rưke 60
CHUONG 4: KET QUA - BAN LUẬN 656 + csEsE‡E+E+eEsEseseseseree 614.1 Chon các điều kiện phân mảnh tối ưu cho từng chat phân tích 614.1.1 Thanh phan pha động - +2 + 22+ S£+E+Ez£E+EvErerrerrered 63
4.1.2 Đánh giá phương pháp phân tích - 555555 <s+2 66
500079 82TÀI LIEU THAM KHHẢO S131 E S391 SE v2 xe reered 84
Trang 12DANH MỤC KY HIEU, CHỮ VIET TATSPE (Solid phase extraction): Chiét pha ran
SLE (Solid — liquid extraction): Chiét ran longLLE (Liquid — liquid extraction): Chiét long longSPME (Solid phase micro extraction): Chiết vi lượng pha ranADI (Acceptable Daily Intake): Lượng ăn vào hang ngày chấp nhận được
ESI: ElectroSpray Ionization — kỹ thuật phun ion.
APCI: Atmospheric pressure chemical ionization — lon hóa hóa học tai áp suấtkhí quyền
HPLC: High Performance Liquid Chromatography - Sac kí lỏng hiệu năng cao.LC-MS/MS: Sac ký lỏng ghép khối pho hai lần
LC-MS: Sắc kí lỏng ghép khối phố
LOD: Limit Of Detection - Giới han phát hiện.LOQ: Limit Of Quantification - Giới hạn định lượng.
MRL (Maximum Residue Level): Giới han dư lượng tối đa
QuEChERS (Quick-Nhanh chóng, Easy-Don giản, Cheap-Rẻ,
Effective-Hiệu qua, Ruged-On định, Safe-An toàn): tên một phương pháp chiết.p.a: pure analysis — tinh khiết phân tích
ppb: một phan tỉ.ppm: mot phan triéu.ppt: một phan ngàn tỉ
ACN: AcetonitrileTPP: Triphenyl phosphateGCB: Graphitized carbon black — Than hoat tinhPSA: Primary and secondary amine exchange material — amin bac | va bac 2
Trang 13DANH MỤC BANGBảng 1.1: Tinh chất một số hợp chất thuốc trừ sâu: 5-5- 2 555252 s52 6Bảng 2.1: Chất chuẩn sử dụng có giấy chứng nhận hàm lượng và còn hạn sử dụng40Bảng 3.1: Chương trình gradient nồng độ - + 2 255 + S2 £E£E£E+EzEzEErkrkrreree 46
Bảng 3.2: Lượng nước thêm vào mẫu - ¿2225222 +* SE z2 £EEzEzEeEeErtrrrsrerees 49
Bang 3.3: Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu 25-52 255252 5s+s+s£s>x+2 52Bang 3.4: Tiêu chí chấp nhận hiệu suất thu hồi cho các khoảng nồng độ phân tích
0 9019/1900 5 54
Bảng 3.5: Khoảng tỉ lệ ion cho phép để định danh mẫu dương tính 60Bảng 4.1: Điều kiện tối ưu cho quá trình phân mảnh ion trên đầu dò MS/MS 61
Bang 4.2: Độ thu hồi giới han phát hiện (LOD) của Dimefluthrin tại nồng độ 0.001
mg/Kg trong nên cà chua ¿- - ¿2 5£ SE2ES£SE‡E#EEEE£EEEEEEEEEEEEEEE E111, 66Bang 4.3: Độ thu hồi giới hạn định lượng (LOQ) của Dimefluthrin tại nông độ0.003 mg/Kg trong nên cà chua . - ¿6 52262952 SE‡E#EEEEEEEEEEEEEEEErErkrkrrkrrrreee 67
Bang 4.4: Két qua khảo sát giới han phát hiện (LOD), giới hạn định lượng ((LOQ)
và phương trình hồi quy tuyến tính của các hợp chất khảo sát trên nền cà chua và
r8 8 :4Ả 67
Bang 4.6: Kết quả hiệu suất thu hồi trung bình (R%), độ lệch chuẩn (SD), độ lệchchuẩn tương đối (RSD %) của phương pháp trên nền mẫu cà chua và rau cải với 3mức thêm chuẩn (0.04 mg/Kg, 0.10 mg/Kg và 0.02 mg/KQ) - 72Bảng 4.6: Bang tính excel thống kê hàm anova 1 yếu tố xác định độ chụm của
phương pháp - - E1 09.00 nọ re 76Bảng 4.7: Kết quả phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trên một số mẫu thực S0
Trang 14DANH MỤC HÌNH VE, DO THỊHình 1.1: Cau tạo co bản của một thiết bị sắc KY 20Hình 1.2: Sac ký đồ của ba cầu tử trong đó có một cau tử không bị lưu giữ 2lHình 1.3: Cột dùng trong sắc ký lỏng ¿55525252 2tEEecterrerrerered 26Hình 1.4: Các bước cơ bản của một quá trình phân tích khối phố 30Hình 1.5: Các bộ phận cơ bản của máy khối phô -. - 525555: 31Hình 1.6: Hệ thống khối phố đầu dò ba tứ cực của hãng AB SCIEX hiệu máy
APT 3200TM LC/MS/MS 2c 2< 1 21 12112111211 111111 1101.1111011 110111 34
Hình 1.7: Sơ đỗ khối phố một tứ CUC - + 255 + 2 2£2£E+E+EzEzEEzEreresree, 35Hình 1.8: Minh họa bộ lọc khỗi tứ cực và khi có hiệu điện thế áp vào cần tứ
202 35
Hình 1.9: Sơ đỗ khối phố ba tỨ CỰC ¿- 5+ 25225 E+E2EEE2EEEEEEEEEErErrrrrreee 36
Hình 1.11: Minh hoa quá trình tách các ion từ hỗn hợp R,M,N 36Hình 1.12: Sự phân mảnh diễn ra Ở Q2 - Gk s12 1S H12 12 g1 gxcra 37Hình 1.13: Bộ phan phát hiện nhân electron CEM - -«« «<< «<<2 38
Hình 3.2: Biểu đồ kiểm soát chất lượng ¿-¿- - +52 S22 rrkrkrrrrees 58Hình 4.1: Sac ký đồ kết quả khảo sát chương trình gradient pha động 64Hình 4.2: Sắc ký đô giới hạn phát hiện LOD (a) và giới hạn định lượng LOQ(b) của Dimefluthrin trong NEN CA ChU s11 1119128 E3 re: 66Hình 4.3: Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu lên đường chuẩn của cấu tửAcephate (Trường hop tín hiệu trong nền mẫu thấp hơn trong dung môi) 70Hình 4.4: Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu lên đường chuẩn của cấu tửProfenofos (Trường hợp tín hiệu trong nền mẫu cao hơn trong dung môi) 7]Hình 4.5: Biểu đồ kiểm soát mức độ 6n định của thiết bị khi phân tích cau tử
Simazine theo thời Ø141 - - << <1 1109990101010 nọ và 77
Hình 4.6: Đánh giá độ bền của Dichlorovos và Dimefluthrin theo thời gian lưu
MAU 2 thang 80 0Ẽ0Ẽ77 78
Trang 15MỞ ĐẦUViệt Nam là một nước nông nghiệp lâu đời, năng suất và sản lượng cây trồngluôn là van dé đáng quan tâm của các nhà nông Nhờ sử dụng phân bón và hóa chấttrong sản xuất nông nghiệp mà năng suất cây trồng tăng lên rõ rệt Bên cạnh mặttích cực đó thì mặt tiêu cực là người nông dân lam dụng hoá chất trong sản xuấtnông nghiệp, nhất là các loại rau ăn lá như cải ngọt, mông toi, cải be xanh, cải bap,
cải thảo, rau muông, dưa leo, cà chua
Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới, mỗi năm con người đã sử dụng hàngchục triệu tấn thuốc bảo vệ thực vật các loại bao gom thuốc trừ sâu, thuốc diệt nắm,diệt co , ngoài một phân thuốc có tác dụng diệt trừ các loài địch hại mùa màng,phan lớn khối lượng thuốc còn lại được đưa vào môi trường Sự hiện diện và tồnlưu thuốc bảo vệ thực vật trong môi trường nước, đất, cây cỏ đã làm ngộ độc, gâychết cho nhiều loài động vật Thuốc bảo vệ thực vật ảnh hưởng trực tiếp đến conngười: gây ngộ độc mãn tính, ngộ độc cấp tính dẫn đến tử vong hoặc làm biến doigen gây nên các bệnh về di truyền ảnh hưởng đến nhiều thế hệ sau Do tác hại to lớnnay trong nhiều năm trở lại đây vấn đề ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật luôn được
quan tâm nghiên cứu.
Ở nước ta đã có một số công trình khảo sát về tình hình sử dụng thuốc trừ sâuvà ảnh hưởng của thuốc trừ sâu đến sức khoẻ người nông dân Tuy nhiên phân lớncác nghiên cứu xác định dư lượng của thuốc trừ sâu này chỉ được thực hiện trêntừng nhóm thuốc trừ sâu riêng lẽ, và các nghiên cứu chỉ dừng lại ở đó mà chưa đượcáp dụng vào thực tế vào các trung tâm kiểm định chất lượng sản phẩm
Từ những lý do trên, với sự hỗ trợ trang thiết bị của Trung Tâm Ky Thuật TiêuChuan Do Luong Chất Lượng 3 và dựa trên những công trình nghiên cứu liên quanđược công bố trong và ngoài nước, chúng tôi tiễn hành thực hiện đề tài “Xác địnhđồng thời dư lượng trên 40 hop chất thuốc trừ sâu phố biến ở Việt Nam trongnhiều nhóm thực phẩm bằng phương pháp QuEChERS và phân tích bằng LC-
MS/MS”.
Trang 16CHUONG 1 TONG QUAN1.1 GIOI THIEU VE THUOC BAO VE THUC VAT:
Dinh nghia: Thuốc bảo vệ thực vat (thuốc trừ sâu) hay còn gọi là nông dược, lànhững chất độc có nguồn gốc từ tự nhiên hay hóa chat tong hợp được dùng dé bảo vệcây trồng và nông sản nhằm chống lại sự phá hoại của những sinh vật gây hại đến tài
nguyên thực vật Những sinh vật gây hại chính bao gồm: sâu hại, bệnh hại, cỏ dai,
chuột và các tác nhân khác Hóa chất bảo vệ thực vật gom nhiều nhóm khác nhau,được gọi theo tên nhóm sinh vật gây hại, ví dụ như thuốc trừ sâu dùng dé trừ sâu hại,thuốc trừ bệnh dùng dé trừ bệnh cho cây [1,2]
1.2 DU LƯỢNG THUỐC BAO VE THỰC VAT:Du luong thuốc bao vệ thực vật là phân còn lại của hoạt chất, các sản phẩmchuyển hoá và các thành phan khác có trong thuốc, tổn tại trên cây trồng, nông san,đất, nước sau một thời gian dưới tác động của các hệ sống (living systems) và điềukiện ngoại cảnh (ánh sáng, nhiệt độ, âm độ ) Dư lượng của thuốc được tính bangmg (miligam) thuốc có trong | kg nông san, dat hay nước (mg/L) Như vậy, du lượng
thuốc bảo vệ thực vật bao gom bat ky dan xuất nào của thuốc cũng như các sản phẩm
chuyển hoá của chúng có thé gây độc cho môi sinh, môi trường Dư lượng có thé cónguôn gốc từ những chat đã xử lý vào đất hay trên bề mặt vật phun; phan khác lại bắtnguồn từ sự ô nhiễm (biết hay không biết) có trong không khí, đất và nước [1]
Theo quy định châu Âu, giới hạn cho phép tối đa thuốc bảo vệ thực vật trongnông sản từ 0.01-5.0 mg/kg tùy vào từng loại thuốc trừ sâu, từng loại thực phẩm,nhưng đối với một số thuốc trừ sâu độc hại nhất thì dư lượng thuốc trừ sâu cho phép
là 0.01 mg/kg [3].
1.3 TÁC HAI CUA THUOC BAO VE THUC VAT:
Hau hệt hóa chat bảo vệ thực vat đêu độc với con người va động vat máu nóngở các mức độ khác nhau Dựa theo đặc tính hóa chât bảo vệ thực vật mà ta chia làm
hai loại: chất độc cấp tính và chất độc mãn tính
Trang 17Chất độc cấp tính: mức độ gây độc phụ thuộc vào lượng thuốc xâm nhập vàocơ thé Ở dưới liều gây chết, chúng không đủ khả năng gây tử vong, dan dan bị phângiải và bài tiết ra ngoài Loại này bao gồm các hợp chất họ pyrethroid, những hợp
chat họ lân hữu co, ho carbamate và những loại thuôc có nguôn gôc sinh vat.
Chất độc mãn tính: là những chất có khả năng tích lũy lâu dài trong cơ thể vìchúng rất bền, khó bị phân giải và bài tiết ra ngoài Thuốc loại này gồm nhiều hợpchất chứa clo hữu cơ, chứa thạch tín (asen), chứa chì, chứa thuỷ ngân đây là những
loại rat nguy hiêm cho sức khoẻ con người.
Hóa chất bảo vệ thực vật có thể thâm nhập vào cơ thể con người và động vậtqua nhiều con đường khác nhau, thông thường qua ba đường chính: hô hấp, tiêu hoávà tiếp XÚC trực tiếp Khi tiếp xúc với hóa chất bảo vệ thực vật, con người có thể bịnhiễm độc cấp tính hoặc mãn tính, tùy thuộc vào phạm vi ảnh hưởng của thuốc [4].1.4 NHÓM LAN HỮU CƠ
1.4.1 Khái niệm và ứng dụng
Thuốc trừ sâu lân hữu cơ (còn gọi thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu co) là cáchợp chất có nguồn sốc tong hop, được cầu tao từ một phân tử phospho hóa trị V với2 sốc hydrocacbon (R1, R2), một nhóm chức X chứa lưu huỳnh (S) hoặc nito (N) vàmột nguyén tử oxi (O) Khi thay thế các sốc RI, R2 hoặc nhóm chức ta được mộtchất mới có độc tính khác với chất ban đầu [1] Ví dụ như fenitrothion, malathion,parathion, diazinon Lân hữu cơ có tác dụng tốt trong diệt cỏ, diệt côn trùng, gópphan nâng cao năng suất cây trông nên được sử dung rộng rãi trong sản xuất nôngnghiệp ở nước ta Hiện nay đã tổng hợp được hơn 400 loại lân hữu cơ khác nhau.1.4.2 Công thức chung và một số dạng thường gap
O(S)RI—P—R2
X
R1, R2: Gốc hydrocacbon
X: Chứa lưu huỳnh hoặc nito
Trang 181.4.3 Co chế tác động và độc tínhLân hữu cơ tác động vào hệ thần kinh của cá thể trúng độc băng cách ức chếhoạt tính của men acety cholinesteraza (AchE), dẫn đến làm tê liệt quá trình dẫntruyền kích thích của các xung than kinh, gây nên cảm giác hưng phan cùng với cáchoạt động loạn nhịp, choáng váng, các chi và đầu co giật liên tục, yếu dan và chết [1].Dưới tác dụng của điều kiện tự nhiên như ánh sang, nhiệt do, độ âm và vi sinhvật quá trình chuyển hoá các lân hữu cơ diễn ra rất phức tạp, xuất hiện nhiều hợpchất trung gian có độc tính cao gấp nhiều lần so với dạng chất ban đầu Các hợp chấtlân hữu cơ hầu như không tích lũy lâu trong lipit, mô mỡ, lipoprotein nhưng lại dễhoa tan và tích lũy rất lâu trong dẫn xuất ester của các acid hữu cơ vòng thom Chúngcó thể gây ngộ độc cấp tính cho sinh vật khi tiếp xúc trực tiếp, nuốt nhằm hoặc quađường hô hap Đồng thời lân hữu cơ cũng có thé gây độc mãn tính mà không có triệuchứng ban dau cụ thé nào.
1.5 NHÓM CARBAMATE1.5.1 Khai niệm và ứng dụng
Thuốc trừ sâu nhóm carbamate là các hợp chất có nguồn gốc tong hop từ axitcarbamic, cu thé là dẫn xuất ester của axit carbamic (còn gọi là urethane) Một sỐchất tiêu biểu: carbaryl, carbofuran, thiobencarb, diethofencarb, Nhóm này có hiệuquả thương mại cao nên được dùng nhiều trong nông nghiệp như thuốc trừ sâu, diệtcỏ, diệt nắm Hiện nay có hơn 50 loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm này đang được sử
dụng trên thị trường.
Thuốc trừ sâu ho carbamate được sử dụng thay thế cho những loại thuốc trừ sâu
chứa Clo như DDT (dichloro diphenyl trichlorothane) hay chứa phospho Nguyên
nhân là bởi carbamate không bên, dễ bị phân hủy dưới tác động của môi trường Tuynhiên, thuốc trừ sâu học carbamate được nghi ngờ là có khả năng gây ung thư và độtbiến gen Hợp chất carbamate đa số là những chất độc đối với con người và được xếpvào nhóm độc I hoặc II theo tiêu chuẩn Việt Nam Việc tăng sử dụng thuốc trừ sâu họcarbamate đặt ra van đề về nguy cơ đối với nghé trồng rau mà môi trường sống của
COn người.
Trang 191.5.2 Cong thức chung
O
Rw x+ 02 R'
H
Với R, R’ là nhóm alkyl hay nhóm aryl.
R: là nhóm methyl thường sử dụng làm thuốc diệt côn trùng.R: là nhóm aryl thường sử dụng làm thuốc diệt cỏ
R: nhóm benzimidazole thường sử dụng làm thuốc diệt nam móc.1.5.3 Co chế tác động và độc tính
Trong môi trường tự nhiên, thuộc trừ sâu nhóm carbamate là những chat ít bênnhưng có độc tinh rat cao đôi với con người và động vat.
Về cơ chế tác động của nhóm nay tương tự như các thuốc trừ sâu lân hữu cơ.Các hop chat carbamate kìm hãm men acetyl cholinesteraza qua quá trình carbarylhóa các vi trí hoạt động cua men Quá trình này là quá trình thuận nghịch, sự liên kếtgiữa các hợp chat carbamate với enzyme acety cholinesteraza thường không bền, nên
Thuốc trừ sâu nhóm Triazole là nhóm thuốc mới chứa nhiều hoạt chất trừ nắm.Nhóm thuốc này dùng phun lên cây hoặc để xử lý hạt, cây giống Một số sản phẩm
đại diện như propiconazole, difenoconazole,
Trang 20Ngoài ra, nhóm thuôc trừ sâu này còn ngăn cản quá trình tông hợp chât melanin
làm cho sợi nam không xâm nhập hoặc không phát triển được trong các tế bào của
Trang 21Thuộc nhóm carbamateTinh thé min màu trang5 Propoxur ano
C1, HisNO3 Mea 92°C
M=209,24 g/mol D6 tan 1,859 g/L (25°C)
Oo" 69 Thuộc nhóm carbamate
CO Tinh thê không mau
6 Carbaryl D=1,2 g/cmô
C¡H¡¡NO; T;e=l51°CM=201,22 g/mol ¬a Phân hủy trước khi sôi
on D—NH Tinh thé màu nâu sáng
Trang 22Tinh thé không màu
12 Aldicarb ° 9 Thuộc nhóm carbamate ˆ
sulfone C7H14N2045 Phan hủy trước khi tới diém
Chât lỏng màu vàng nhạtC¡aH¡zNO; Không tan trong nướcM=207,27 g/mol
S OS AL Thuộc nhóm lân hữu cơ Lah chât lỏng không màu
CeH, iN2OuPS3M=302,33 g/mol
D=1 445 g/cm?
D6 tan 220 mg/L (25°C)
Trang 23Thuộc nhóm lân hữu cơWSN 8 GHs Chat long không mau dé
"¬ Ì g không màu đên
17 Diazinon AA AN + mau nau sâm.H3C O“ \`O“ cH
O— “3 D=1,23 g/cm?
C;2H;¡N›;O»2PS Độ tan 40 mg/L (25°C)
M=304,35 g/mol
H3C ờ Thuộc nhóm lân hữu co.
b-# Tinh thê ran màu xám trăng
Hac S CHạ D=1,3 g/cm?
18 Dimethoate = T;„=25°C
O
C;H¡2NO;PS; Tsa= TC229.26 Độ tan 25 g/L (25°C)
Ho ~\Y
Thuộc nhóm triazole.19 Hexaconazole Tinh thê mau trang
Tye=l 11°C
C;4H¡zC1;NO ne314.21
N
« 9N-N 9
22 | Fenbuconazole
Trang 2424 Penconazole ¬
Ci3HsClyN3M=284,18 g/mol Thuộc nhóm triazole.
Cl
AL Be Thuộc nhóm triazine
26 Simazine ÀN NZ Nế D=1,3 g/cm?
C;H¡zCIN; i22M=201 66 g/mol Độ tan 5 mg/L (25°C)
5 Ler Thuộc nhóm carbamaterts O l Bột mịn màu trắng
Trang 25Tan tốt trong dung môi hữu
Trang 26Thuộc nhóm carbamate.Chât lỏng màu vàng nhạt
IL dén nau vang.
x^ D=1 45 s/cm340 Thiobencarb | H3C N S sen
hee
CH:
4] D-Allethrin ar CHe
CyoH26O03M=302 41 g/mol
Trang 27374,37 g/mol
O
O -P-o Sử dụng làm nội chuẩnO Chat ran khong mauAA Triphenyl D=1,184 g/cm?
hosphateP T;„=50°C
C¡sH¡zOxP Tọa 244°C326.28 g/mol Tan trong dung môi hữu cơ
s* Các hợp chat được nghiên cứu đồng thời cùng một quy trình xứ lý mẫu và phân
tích với các phương pháp được giới thiệu dưới day:
1.8 TONG QUAN MOT SO PHƯƠNG PHÁP CHIET VA LAM SẠCH MAU
TRONG VIEC XAC DINH DONG THOI NHIEU THUOC TRU SAU [5]Mục đích chính của các quy trình chiết là có thé tách được các hợp chat thuốctrừ sâu từ nền mẫu bang quy trình chiết thích hợp Trong các quy trình đều cần làmsạch băng chiết pha ran hoặc chiết lỏng long để loại bớt tạp chat ban từ nền mẫu.1.8.1 Chiết ran lỏng SLE (solid - liquid extraction)
Phương pháp chiết này được sử dụng rộng rãi dé phân tích thuốc trừ sâu từ
nên mâu ran, dau tiên dung môi chiét len lỏi sâu vào giữa các thành phân mâu dé
tiếp xúc với chất phân tích, sau đó chất phân tích khuếch tán đi vào dung môi chiết.Yếu tổ quan trọng nhất của kỹ thuật chiết ran lỏng này là lựa chọn dung môi thíchhợp Tuy nhiên những yếu tô khác như áp suất, nhiệt độ cũng có ảnh hưởng quan
Trang 28trọng lên hiệu quả chiết Khi tăng áp suất sẽ làm tăng khả năng phân tán của dungmôi đi sâu vào nền mẫu răn, tăng nhiệt độ sẽ làm tăng khả năng hòa tan của cácchất phân tích vào dung môi Các kỹ thuật hỗ trợ trong chiết rắn lỏng đó là lắc,chiết soxhlet, đánh siêu âm, microwave Mỗi kỹ thuật đều có những ưu nhược điểm
riêng.
Lắc: là cách đơn giản và thuận tiện thường sử dụng chiết thuốc trừ sâu từ tráicây va rau quả Chỉ cần cho dung môi thích hợp rồi lắc trong một khoảng thời gianxác định Kỹ thuật lắc với dung môi đơn giản và thuận tiện nhưng không hiệu quảtrong những trường hợp chất phân tích có liên kết chặt chẽ với nền mẫu Trongtrường hợp này đánh siêu âm là cách hỗ trợ tốt, giúp cho sự khuếch tán của dungmôi vào mẫu, tăng thêm sự tiếp xúc để quá t nh chiết được hiệu quả hơn, giảm đượclượng dung môi và thời gian chiết
Chiết soxhlet: khi quá trình lắc không đủ tốt để chiết, lúc đó cần hỗ trợ bằngcách gia nhiệt Hiệu quả chiết tốt nhưng cũng có nhược điểm về thời gian chiết lâu,
sử dụng một lượng lớn dung môi.
Chiết bằng microwave: Mẫu và dung môi chiết được gia nhiệt băng vi sóng,có sự kiểm soát về áp suất, nhiệt độ và năng lượng Kỹ thuật này cho hiệu quả chiếttương tự như chiết soxhlet tuy nhiên giảm được thời gian chiết (thời gian chiếtkhoảng 15 phút) và giảm được dung môi chiết so với kỹ thuật chiết soxhlet (dung
môi sử dụng 25-50ml).
1.8.2 Chiết long lỏng LLE (liquid-liquid extraction)
Hiện nay, chiết lỏng lỏng là phương pháp pho biến nhất cho việc chiết đồngthời nhiều thuốc trừ sâu trên đối tượng mẫu chứa hàm lượng nước cao Phươngpháp chiết lỏng lỏng dựa vào sự phân bố của chất phân tích trên 2 loại dung môikhông trộn lẫn vào nhau Hiệu quả của quá trình chiết dựa vào ái lực của chất phân
tích với dung môi, ti lệ dung môi môi pha, so lân chiét mâu.
Hau hết phương pháp chiết lỏng lỏng đều thích hợp cho việc xác địnhnhiều thuốc trừ sâu trên nhiều nền mẫu: nước, thực phẩm, môi trường Tuy nhiên,đối với các hợp chất có độ phân cực cao thì phương pháp chiết lỏng lỏng cho hiệu
Trang 29suất thu hồi tương đối thấp Ví dụ như atrazine trong nước cho hiệu suất quá trìnhchiết lên đến 90% nhưng trong khi đó desisopropylatrazine (16%), desethylatrazine(46%), hydroxyatrazine (46%) Dé tăng hiệu suất thu hồi, ta thay đối pH để tránh sựion hóa của chat phân tích có tính axit, bazơ hay thêm muối dé day chất phân tíchqua tướng hữu cơ là giải pháp tối ưu nhất cho việc chiết đồng thời nhiều thuốc trừ
được.
1.8.3 Kỹ thuật chiết pha ran SPE (solid phase extraction)
Giống như chiết lỏng lỏng, chiết pha ran dựa trên ái lực khác nhau của chất
phân tích giữa hai pha.
Trong chiết pha rắn, mẫu được cho qua chất hấp phụ ran (có nhiều loại chấthấp phụ ran phân cực, không phân cực, trao đổi ion hay ái lực) nhi trong cột.Những chất phân tích có ái lực lớn với pha rắn hấp phụ sẽ được giữ lại trên cột,trong khi đó những chất khác sẽ đi qua cột Tap chất được rửa với dung môi dé loạibỏ nhưng chất phân tích vẫn giữ lại, sau đó chất phân tích bị giữ trên cột đượcrửa giải bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp chọn lọc với chất phân tích
Ưu điểm: Bằng phương pháp này ta có thé làm giàu mẫu nhằm hạ giới hạn pháthiện của phương pháp Phương pháp dễ thực hiện, có thé làm hàng loạt cho nhiềumẫu cùng một lúc Tiết kiệm được lượng lớn dung môi, ít gây độc hại với con người
và môi trường.
Với kỹ thuật chiết SPE, mẫu có thể làm giàu nhiều lần tăng độ nhạy chophân tích các hợp chat Van dé quan trong trong chiết SPE là lựa chọn pha ran happhụ thích hợp hiểu được mối tương quan giữa chất phân tích và chất hấp phụ là
vân đề quan trọng.
Trang 301.8.4 Ky thuật chiết pha ran với chất hấp phụ không phân cực
Kỹ thuật này có thể làm giàu lượng vết và làm sạch chất phân tích cho nhữngmẫu lỏng phân cực Mạch n-alkyl gan trên silica như C8, C18 được dùng để giữ cácthuốc trừ sâu không phân cực và phân cực trung bình Cơ chế của quá trình lưu giữ
dựa vào lực Van der Waals và những phản ứng ky nước.
Ưu điểm: băng kỹ thuật này ta có thể cho một lượng lớn mẫu qua cột và sauđó rửa giải bằng một lượng nhỏ dung môi hữu cơ như: methanol, acetonitrile,
ethyl acetate
Nhược điểm: đối với thuốc trừ sâu có tinh phân cực do không có khả nănglưu giữ trên cột sẽ cho hiệu suất thu hỗi rất thấp Hiện nay, để tăng hiệu suất thu hồicho một số thuốc trừ sâu có độ phân cực cao, người ta sử dụng những chất hấp phụcó ái lực tốt hơn với chất phân tích Những chất hấp phụ đó bao gồm styrenedivinylbenzene gắn trên nền polymer Như vậy, với chất hấp phụ mới, ta sẽ làmtăng hiệu suất thu hồi cho một số thuốc trừ sâu có độ phân cực cao
1.8.5 Ky thuật chiết pha rắn với chất hấp phụ trao doi ion
Thuốc trừ sâu dạng ion hay dễ bị ion hóa có thể được chiết bằng nhữngchất hấp phụ trao đối ion Ở một pH nhất định, chất phân tích sẽ ton tại dạng ion vàđược hấp phụ trên bề mặt chat hap phụ theo cơ chế trao đối ion va sau đó chất phântích được rửa giải bằng dung dịch đệm có pH thích hợp
Ưu điểm: phương pháp này có thể áp dụng tốt cho chất phân tích ở dạng ionhay chất dễ ion hóa
Nhược điểm: phương pháp này hạn chế cho những mẫu mà trong nền mẫuchứa nhiều ion hữu cơ Sự hiện diện của hàm lượng lớn ion hữu cơ trong nền mẫusẽ gây tình trạng quá tải làm cho chất phân tích không được hấp phụ lên cột, nhưvậy sẽ dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp
1.8.6 Chiết vi lượng pha ran SPME (solid phase micro extraction)
Phương pháp chiết nay đơn giản, không dùng dung môi hữu cơ độc hai, vathực hiện nhanh với nhiều loại sợi chiết được làm sẵn với nhiều loại chất hấp thukhác nhau phủ lên sợi chiết Soi chiết silica được phủ lên một lớp pha tĩnh tương
Trang 31tự như cột sắc ký, sợi chiết được đặt bên trong một cây kim bảo vệ Tương tự nhưchiết pha ran, chiết SPME cũng dựa trên sự phân bố của chất phân tích giữa nền mẫuvà pha tĩnh Chiết vi lượng pha ran gồm hai bước chính là chiết và giải hấp, ngoàira còn có thé thực hiện thêm bước rửa nếu cần.
Chiết: quá trình chiết có thể thực hiện bằng cách chiết ở phần khoảng không(đối với các hợp chất dễ bay hơi từ nền mẫu lỏng hoặc mẫu rắn), hoặc đưa trực tiếpsợi chiết tiếp xúc với mẫu Đầu tiên mẫu được bỏ vào lọ kín, cắm cây kim vào lọrồi day sợi chiết ra dé hấp thu chat phân tích lên pha tĩnh phủ bên ngoài sợi chiết.Sau đó sợi chiết được kéo vào bên trong kim bao vệ và rút ra khỏi mẫu
Việc lựa chọn sợi chiết với thành phần pha tĩnh hợp lý là yếu tố chính củakỹ thuật này Bé dày pha tĩnh phủ bên ngoài sợi chiết và độ xốp của pha tĩnh cũnglà yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết, bên cạnh đó một số yếu tố như nhiệt độ,
thời gian chiết, pH cũng cần tối ưu dé đạt được hiệu quả chiết tốt nhất
Giải hap: các chất phân tích bị hap thu vào pha tĩnh của sợi chiết được giảihấp ra để phân tích Có thể giải hấp trực tiếp băng cách gia nhiệt ở buông tiêm mẫusắc ký khí hoặc rửa giải bằng dung môi thích hợp Gần đây đã có hệ thống kết nốitrực tiếp với sắc ký lỏng, các hợp chất được giải hap băng thành phan pha động củahệ thống sắc ký lỏng
1.8.7 Phương pháp QuEChERS
QuEChERS được phát triển bởi United States Department of Agriculture (Sởnông nghiệp Hoa Kỳ) vào năm 2003 QuEChERS là từ viết tắt của Quick, Easy,
Cheap, Effective, Rugged and Safe Phương pháp nay đơn giản và khá hiệu quả
trong việc chiết và làm sạch một số mẫu có nên phức tạp QuEChERS là một kỹthuật đã được áp dụng cho việc phân tích đa — dư lượng thuốc trừ sâu [6, 7]
Cơ sở lý thuyết: Mẫu sau khi đã đồng nhất được chiết với dung môi
Acetonitrile với các tác nhân loại nước, tạo pH như MgSO¿x, NaCl, Na3Citrat2H.O,
Na;HCitrate.I142 HO Dịch chiết thu được tiếp tục được chiết và làm sạch với hỗnhợp muối PSA (primary and secondary amine exchange material: amine bậc và bậc2) và MgSO¿a Dịch chiết cuối cùng được dùng dé phân tích bang LC — MS/MS
hoặc GC — MS [8].
Trang 32Ưu điểm: Chuẩn bị mẫu nhanh dé dàng, có thé xử lý mẫu nhanh cho một lượngmẫu lớn Chi phí thấp không can các thiết bị cầu kỳ tinh vi Sử dụng lượng ít hóachất, dung môi Giảm được ảnh hưởng tới sức khỏe đối với kiểm nghiệm viên.
Nhược điểm: Khi hydrat hóabăng cách cho muối khan vào có thể dẫn tới sựtỏa nhiệt và làm mat mẫu do nhiệt hoặc lam bay hơi cầu tử cần phân tích Một sỐthuốc trừ sâu bị phân hủy trong môi trường acetonnitil (ACN) nên axit hóa ACN détránh sự phân hủy đó Thanh phần nền mẫu này làm ảnh hưởng tới quá trình chiếtcũng như phân tích Một số thuốc trừ sâu tiến hành theo phương pháp QuEChERSthường bị mất hay phân hủy bởi pH
Một số chú ý:Trong quá trình chuẩn bị mẫu, trước khi xay nhỏ thì mẫu đã cắt nhỏ cần đượcbảo quản trong tủ lạnh (-18°C) dé tránh sự phân hủy của một số thuốc trừ sâu Ởnhiệt độ phòng một số cầu tử của thuốc trừ sâu có thé bị mat đi nhưng mặt khác mứcđộ đồng nhất không được tốt khi dé lạnh
Với một số trái cây khô việc đồng nhất mẫu khi nghiền nhỏ có thể gặp khókhăn Do đó thêm nước trước khi nghiền nhỏ.Lượng dung môi và muối thêm vào cầnphải ty lệ với khối lượng mẫu, thé tích dịch chiết
Đối với một số cau tử thuốc trừ sâu có tính acid (như phenoxyalcanoic) sẽtương tác với PSA Do đó việc phân tích cần tiễn hành trên LC/MS/MS Dịch chiết sẽđược sẽ được tiêm trực tiếp vào vial (200 wL) Không qua quá trình làm sạch bang
PSA.
Khi tạo hệ đệm băng cách thêm muối thì pH của mẫu năm trong khoảng 5 — 5,5.Đây là khoảng pH thích hợp cho việc định lượng thuốc trừ cỏ có tính acid, làm chocác TTS có kiềm không bên được bảo vệ (captan, folpet, tolylfluanid)
Một số nền mẫu có tính acid pH < 3 (như chanh ) thì có thể dùng NaOH 5Nđể điều chỉnh pH
Trong nên mẫu, MgSO, có thể hút âm tạo thành cục, nên sau khi thêm muối vàocần vortex liên
Với loại mẫu như ngũ cốc hay trái cây say khô khi xử lý có thé bị ảnh hưởngboi chất béo hay độ nhớt tới quá trình phân tích bang GC Có thé loại bỏ chất béo vanhớt băng cách để dịch chiết trong tủ lạnh ở nhiệt độ thấp (hơn 1 giờ hoặc để qua
Trang 33đêm) Hoặc cũng có thé loại bang cách sử dụng C18 cùng với PSA và MgSO¿.Đối với mẫu có hàm lượng sắc tố (như cả rot, ớt) hoặc chất diệp lục (như raudiép, rau cải ) quá trình chiết làm sạch sử dụng PSA, MgSO, kết hợp với GCB(graphitized carbon black: than hoạt tính) Nhưng có một số loại thuốc trừ sâu phâncực có ái lực lớn đối với cau trúc phân cực của GCB có thé làm cho hiệu suất thu hỏibị giảm đi Qua một số quá trình khảo sát cho thấy hiệu suất thu hồi giảm đi khôngđáng kế vì sau khi chiết làm sạch băng GCB van còn một lượng nhỏ sắc t6 va
chlorophyll.
Luong GCB cé thé str dung:+ 2,5mg cho ca rốt, rau diép, và các loại tương tu: ty lệ MgSO, : GCB (60:1)
+ 7,5 mg cho hạt tiêu đỏ ngọt, rau chan vit, thịt cừu va các loại tương tu: tỷ lệMgSOu„:GCB (20:1)
> Với những ưu điểm và hiệu quả của các phương pháp được trình bày ởtrên, trong dé tài này sẽ dùng phương pháp QuEChERS thực hiện chiết và làmsạch mẫu Mục đích nham chiết đồng thời nhiều hop chất thuốc trừ sâu, cácbước thực hiện đơn giản, không dùng nhiều hóa chất độc hai, thời gian xử lýmẫu nhanh thích hợp cho phương pháp phân tích sắc ký với đầu dò khối phốMS/MS có độ chọn lọc cao Để hiểu rõ hơn về quá trình, chúng ta sé tìm hiểu vềphương pháp sắc ký:
1.9 TONG QUAN VE PHƯƠNG PHÁP SAC KÝ:
1.9.1 Đại cương về phương pháp sắc ký:Sắc ký là một kỹ thuật tách và nhận diện những thành phan trong một hỗn hop.Những hợp chat trong một hỗn hợp có những xu hướng khác nhau để hap phụ vào bémặt hoặc hoa tan vào dung môi [9] Quá trình đó dựa trên sự chuyển dịch của hỗnhợp phân tích qua lớp chất bất động (được gọi là pha tĩnh) được thực hiện nhờ mộtchat lỏng hoặc chất khí có khả năng di chuyền (gọi là pha động) [10] Những thànhphân ưu tiên liên kết tốt với pha tĩnh hơn sẽ được giữ lại trong pha tĩnh lâu hơn Kếtquả là chất tan được rửa giải theo thứ tự tăng dần hệ số phân bố trong pha tĩnh Nhưvậy các chất sẽ được tách ra khỏi nhau [11]
Trang 341.9.2 Giới thiệu một số phương pháp sắc ký:Sắc ký được chia thành ba nhóm cơ bản dựa theo trạng thái của pha động baogôm: Sac ký khí (GC), sắc ký long (LC) và sắc ký lưu chất siêu tới han (SFC).
1.9.3 Nguyên tac hoạt động:Tuy theo phương pháp được sử dụng, các thiết bị có thé rất đơn giản đến rấtphức tạp, nhưng dù có phức tạp đến đâu thì bộ phận của thiết bị thường bao gồm bốn
phần chính như sau: bộ nạp mẫu, pha động pha tĩnh và đầu đò [12]
Mau (sample) sau khi được bơm vao trong hệ thống qua bộ nạp mau (injectionport) sẽ được pha động (mobile phase) chuyển đến cột sắc ký, tại nơi đây sẽ xảy ratương tác giữa các chất trong mẫu và pha tĩnh (stationary phase) Tuỳ theo từng loạitương tác mà tại đây sẽ xảy ra quá trình tách Sự thay đối thành phan các chất di quacột sẽ được phát hiện bằng đầu đò (detector) Tín hiệu sẽ được chuyển thành tín hiệuđiện trước khi đi đến bộ ghi
mobile phase | injection stationary phase mobile phase
| =H
port (separation of the mixture)
WN
mobile stationary detectors dpplicobilly
phase phase (examples)
I
Hình 1.1: Cau tao co bản của một thiết bị sắc ký
Trang 351.9.4 Các đại lượng cơ bản của sắc ký
fe\—— START ~ae
Hình 1.2: Sắc ky đồ của ba cau tử trong đó có một cau tử không bị lưu giữ
tụ: thời gian chết của cau tử không có khả năng bị lưu giữ bởi cột.tr, tr,:thoi gian lơiu hiệu chỉnh là thời gian lơiu không tính đến thờigian chết
tr = th + tự: :thời gian lưu của cau tử
W),: độ rộng của day pic.
- Độ phân giải của cột Rs là đại lượng biểu thị khả năng tách hai cautử ra khỏi nhau, được tính băng công thức:
Š Wo Mp2 Wp1t+Wp2
Khi R, = 0.75: hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhiều.Khi R, = 1.0: hai pic chong lắp nhau khoảng 4%
Khi R, = 1.5: hai pic chồng lap nhau khoảng 0,3%
Khi R,>1.5: hai pic tach nhau hoàn toàn ra khỏi nhau.
- Hệ số phân bố K là đại lượng quan trọng đặc trưng cho kha năng lưugiữ trong phương pháp sắc ký
Trang 36Hệ số chứa (dung lượng cét)ki:
aldehyde, cetone, vitamin, gluxit Ngoài ra kỹ thuật này còn dùng khử độ cứng cua
nước, khử độ khoáng của nước, tinh chế thuốc thử hoá học, tách và phân tích các hợpchất cao phân tử như protein, polymer, rượu, bia, sữa, đường [10]
Phương pháp sắc ký lỏng còn được sử dụng trong việc phân tích các hợp chấtamino axit, peptit, protein, lipid, các chất có trong máu, huyết thanh, nước tiểu, Phân tích các chất trong sữa, dầu thực vật, mỡ động vật [13]
1.10 SẮC KÝ LỎNG (LC)Sắc ký lỏng là một phần quan trọng trong phương pháp sắc ký Nó là một công
cụ mạnh đóng góp lớn cho ngành phân tích hiện đại.
Trang 371.10.1 Giới thiệu về sắc ký lỏng:Sắc ký lỏng có pha động là chất lỏng và pha tĩnh thường là chất ran tro như
silica gel (SiO2.xH,O), alumina (Al,O3.xH2O) hoặc cellulose được chứa trong mộtcột thuỷ tinh.
Một loạt các dung môi được sử dụng trong kỹ thuật này, bao gồm các nước,
hydrocacbon, hợp chất thơm, rượu, xeton, các hợp chất halogeno va este Một hỗn
hợp các dung môi cũng có thể được sử dụng sau khi được tối ưu hoá [9]
1.10.2 Các phương pháp thường sử dụng
a) Sắc ký lỏng pha thuận (NPLC)Sắc ký lỏng pha thuận (hoặc sắc ký hấp phụ): pha tĩnh sẽ là các hạt silica(Si02.xH,O), alumina (AlsOs.xH;O) hay cacbon gan với những nhóm phan cực, ví
dụ như aminopropyl (NH;), cycanopropyl (CN) và nhóm chức diol (2OH).
Pha động trong NPLC có thành phân là chất không phân cực, dung môi hữu cơ
như methanol, ethanol, 2 — propanol, acetonitrile, ethyl acetate, tetrahydrofuran,
cacbon tetrachloride, hexan, hoặc kết hợp của hai hay ba dung môi hữu co [13].Ứng dụng: Phương pháp được dùng nhiều dé tách các chất tương đối phân cực,các chất hữu cơ không tan trong nước có phân tử lượng nhỏ hơn khoảng 5000.Phương pháp nay mạnh hơn han các phương pháp khác trong việc tách đồng phân
b) Sắc ký lỏng pha dao (RPLC)Pha tĩnh thường không phân cực hoặc rất ít phân cực Để tạo ra pha tĩnh khôngphân cực, silica sẽ được alkyl hoá các nhóm không phân cực Thông dụng nhất làoctadecylsily silica (ODS — C18) Ngoài ra còn liên kết cộng hoá trị với các nhómnhư Octyl (Cg), Hexyl (Cs), propyl (C3), phenyl va cyclohexyl liên két voi bé matsilica tao ra bề mặt pha tinh không phân cực hoặc ky nước [14]
Trong phương pháp này, nước và những hợp chất hữu cơ ưa nước sẽ làm dung
môi, cũng thường được sử dụng như methanol, acetonitrile và tetrahydrofuran Pha
động trong phương pháp này thường được dùng là nước nên kinh tế hơn rất nhiều, ít
tôn dung môi hữu cơ và có ý nghĩa sinh học cao.
Trang 38Ứng dụng: Phương pháp được sử dụng phố biến, được thực hiện trong hơn70% ứng dụng của sắc ký lỏng [13] Phương pháp có thé thực hiện với những hợpchất từ không phân cực, phân cực ít, đến rất phân cực.
RPLC có công suất cao chủ yếu được sử dụng để tách các phân tử nhỏ, peptide,
nucleotide và không thường được sử dụng cho protein [15].
c) Sắc ký trao đôi ion (IELC)Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đối thuận nghịch giữa các ion linhđộng của pha tĩnh ran với các ion trong mẫu can phân tích Khi cho dung dịch nàyqua cột được nạp day pha tĩnh, các pha tĩnh trong trường hợp này được gọi là chấttrao đối ion (ionit) Bản chất của quá trình tách là do ái lực khác nhau của các Iontrong dung dịch đối với trung tâm trao đối ion (nhóm chứa ion của ionit)
IELC là một công cụ tách rất mạnh vì nó có tính chọn lọc cao và có công suất
cao Mặc dù kỹ thuật này được sử dụng cho một loạt các mẫu khác nhau nhưng đặc
biệt hiệu quả cho việc tách các protein vì nó lưỡng tính nên có khả năng trao đối cảcation lẫn anion Người ta ước tính rằng 70% tách các protein liên quan đến phương
pháp này [15].
d) Sắc ký rây phân tử (SELC)Sắc ký rây phân tử (sắc ký gel, sắc ký thâm thấu gel, lọc gel ) là phương pháptách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử của các chất Cho dung dịch cần
phân tích đi qua các vật liệu có khả năng tạo thành bộ khung gel hoặc các rây phân
tử Pha tĩnh trong sắc ký gel là dung môi ở trong các lõi của gel, còn pha động cũngchính là dung môi chạy qua Pha tĩnh và pha động trong sắc ký gel được cấu tạo từmột chất hay từ một hỗn hợp các chất
Ưu điểm: Phương pháp này rất đơn giản cho các phân tử chất tan tách biệt, bởivì nó không phải là cần thiết dé thay đối thành phan pha động trong quá trình rửa
giải.
Khuyết điểm: Hạt silica có thể có tiềm năng xúc tác cho các phản ứng phânhủy các phân tử chất tan Tuy nhiên, khả năng tách của phương pháp này bị hạn chế
Trang 39Đối với một cơ sở tách biệt cần thiết là trọng lượng phân tử của các phân tử chất tankhác nhau ít nhất 10% đến 20% [15].
1.10.3 Một số kỹ thuật thường gặp trong LC:
a) Gradient rửa giải:
Nhiều trường hợp mẫu chứa nhiều cấu tử có độ phân cực khác nhau trongkhoảng rộng nên một phép tách với pha động không thay đối thành phan có thé dẫnđến: tốn thời gian, hao phí dung môi, pic kéo đuôi Chương trình dung môi này đòi
hỏi độ phân cực của pha động tăng lên theo thời gian rửa giải [14].
Ưu điểm: Sử dụng chương trình dung môi sẽ rút ngắn đáng kể thời gian phân
tích, độ phân giải của phương pháp tăng lên, pic nhọn hon va độ nhạy tăng.
b) Chương trình tốc độ dòng:Đề thực hiện chương trình tốc độ dòng, người ta thường áp đặt tốc độ dòng thấpở giai đoạn đầu của quá trình tách và tăng tốc độ ở phan sau Sự thay đổi này có théđược thực hiện từng nắc hoặc liên tục Phương pháp này làm cho độ phân giải tănglên ở phan dau của sắc ký đồ và giảm đi ở phan sau (thường không cần thiết)
Ưu điểm: Giảm thời gian phân tích mà không ảnh hưởng đến độ phân giải,không cần tái sinh cột tách như chương trình dung môi, có thé ap dung cho cac hé sắcký lỏng không thể chạy theo chương trình dung môi [10]
Nhược điểm: Tốc độ dòng thay đổi gây ra áp suất trong cột thay đổi liên tụcgây ảnh hưởng đến tudi thọ của cột
1.10.4 Cột sử dụng trong sắc ký long:Các cột sử dụng trong LC được làm băng vật liệu thép không rỉ (thép Cr-Ni-
Mo) với mặt trong của cột được làm nhẫn
Kích thước pho biến của một cột là đường kính ngoài bang 6,35 mm; đườngkính trong khoảng 2 — 4 mm và chiều dài nhiều khoảng 12,5 - 25 cm Cột được nhôicác hạt có cỡ đường kính 3, 4, 5, 10 zm Chất nhồi trong cột thường là silicagen hoặcsilicagen có bọc hoặc gắn hóa học một màng mỏng chất hữu cơ Bên cạnh silicagenngười ta còn dùng Al,O3, hạt polime xốp, hạt chất trao đôi ion [16]
Trang 401.10.6 Detector sử dụng trong sac ký longDetecror dùng trong sắc ký lỏng bao gồm:a) Detector hấp thu tử ngoại: (Ultra violet — UV):
Chi dùng được cho các hợp chat hap thu tử ngoại va pha động không được hapthu bước sóng trong vùng bước sóng cần nghiên cứu Detector UV được sử dụngrộng rãi vì rất dễ vận hành, không phụ thuộc nhiệt độ và vận tốc pha động Với mộtsố chất không hấp thu tử ngoại, muốn đo được với detector UV, người ta thườngchuyền các chat đó thành các dẫn xuất có khả năng hấp thu UV [11]
Ứng dụng: Phân tích hydrocacbon thơm, cetone, aldehyde, các hợp chất vòng
thơm
b) Detector đo chỉ số khúc xạ: (Refrative index detector):Nguyên tắc của detector này dựa vào chỉ số chiết suất của dung dịch và dungmôi nguyền chất Việc đo chiết suất được thực hiện thông qua việc đo chỉ số khúc xạcủa tia đơn sắc đi qua mẫu và dung môi, hoặc phát hiện cường độ tia phản xạ tỷ lệnghịch với chiết suất Detector rất bền, nhạy, dùng pho biến trong sắc ký ray phân tử
[11].