TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHẠM THỊ TÓ LIÊN
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU DỊCH TREO TE BAO CAY DINH LANG POLYSCIAS
FRUTICOSA L HARMS TRONG MUC
DICH THU NHAN SAPONIN
CHUYEN NGANH SINH LY THUC VAT MA SO: 01 —05 - 17
NGUOI HUGNG DAN KHOA HOC: PGS TS VO THI BACH MAI
Trang 2LOG CAM ON
Dé tad duwe thực liện tai BE mba Sink li Shue oGt, Khoa Sink học,
Guiting Pai toe Khoa hoe Gu ahiin, Thanh phd Wé Chi Minh
“Đời đâu tiên có xin gửi lời cam ou din cb GS FS Mai Frain Giger Ciếng, sgười đã hết làng oi sink oién giang day, truyén dat nhitug kién Unie
od kink ughiéim quy bau cho ching cou trong suét Uiei gian hoe tại trường, Ci PGS SS O6 Shi Bach Mai, uquwdi da giang day, tin tink hung
dan, teuyén dat ahiing kink anghiim, ding ciên cat fecoag suốt thời gian học, lam oG hodan chink ludn oan
Shiy DGS T&S Bai Grang Oitt, agudi da gidng day, teuyén dat ahiing kink nghiệm động vién em trong tuỐốt thời gian lọc, tìm cà góa ý chó luậm
Omg
Shay GS Hguyén Du Ganh, người đã giảng dụu oà déug viéu em trong
suot théé gian hoe od lam ludu ode
Cae Shay, C6 tham gia giang day dé teuyén dat ahiéu kién thức bể toi trong thời gian hoe taé tring
BGK Futituag C7202 (Xguuến Chị Mink Khai - Bin Gre cà BGH Cường (hồ Thing Wing Khiéu da tao diéu kiéa tt ahdt cho em trong qua tidak hee od tute hiéa luda odun
Châu Ca Dhan Glob Fooang, Glu Gran Ghanh Huong, Glu Grink Cảm: Cú đã tận tình giúp đã, động ciên cà tuân tạo tuoi điều kiện thuận loi
Trang 3Fbai chi Shut 0a Uyéin dé gitp dé em edt ahiéu trong qua teink lan luda
Odin
Cie Fhdy, Cb trong héi ding dé dank thời gian đọc cà góp y kiétn che cube laude oda nay
Cb Duan, eu Kitt, nqiiit da tao diéu kién thudn loi cà ding siéu trong suốt thời gian lam luds ode
Cae ban than yéu cia lig cao học khdéa 14: Hitn, Bip, Giang, Ankh
Dai, Shai, Shoa, Mai Auk, Diuoug eing ede bạn cao học bhúa 15 dé chitin thanh, doan Biết od chia sé trong cing vide od hee tan
Cuối cùng Can xin biét on Ba, Me da sink thank, yéu thương, lo lang cho
con; cing Ong Dé 0G Wai em trong gia định đã luda chia sé, bd trợ cà động oién teoug hoe lip aing nhut froadg cuộc sống nà công diệo,
Sp HE Chi Minh, agay 30 thang 6 nam 2008
Trang 4MỤC LỤC
CAC CHU VIET TẮT cocnonHenee re
DANH MỤC ẢNH .Q nnrere DANH MỤC BẰNG ung
DANH MỤC HÌNH on rye
MỞ ĐẦU 00c n2 1n 222 eo
Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
z A
1 Thực vật va hop chất thứ 0
£ A 2
2 Quá trình biến dưỡng thứ cấp ở thực vật Son ae 4 4, Dinh lang va saponin trong cây Đình lãng
AL Phan load ccccccssccceccesscccceetensssssccceeeees
4.2.Nguồn gốc - phân bế
4.3.Hợp chất tự nhiên có trong cây Định lăng
or In 1+1
5 Các nghiên cứu trong nước về cây Định lăng,
co
Nghiên cứu về nuôi cấy mô
6 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật và quá trình biến
nuôi cấy hai giai ỞOẠI che
dưỡng thứ cấp với hệ thống
6 1 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vậttrong việc sản sinh các hợp
chất thứ cấp - -.- c2 nn Hee
IE iu ti
Nuôi cấy cơ QUan cà coi
Trang 5hưởng đến sự sản sinh các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô 13
7.1 Sự tạo cơ quan và biệt hoá tế bàÀO can rhehree 14
7.2 Nuôi cấy mô, tế bào thức vật, quá trình biến dưỡng thứ cấp 15
7.3 Nuôi cấy tế bào và thu nhận hợp chất thứ cấp 16 7.4 Dich treo t€ DAO LY tI Gng oe ccc cecccsccesessesseeceneesssseecsucscssseseeneess 17 7.5 Các yếu tố ảnh hướng đến sự tạo dịch treo tế bào 17
§ Một số yếu tố tác động lên hợp chất thứ cấp con re 19 8.1 Thành phần môi trường và điều kiện nuÔi cấy .-.e 19 8.2 Chọn lựa dịng tế bào có khả năng sản sinh cao các hợp chất thứ cấp20
8.3 Đồng hố ginsenoside bởi xử lí Acid jasmOniC co cscecceee 20
8.4 Nông đỘ SUCTOS€ HH HH HH HH HH Hết 21 §.5 NguỒn niIrOE€N L c LH HT HH HH HH HH 0x11 dc 22
8.6 Các yếu tố thẩm thấU L HH ng HH HH nước 22
hs: 0)0871)00):1<£ 23
9 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật và vai trị của chúng trong ni cấy tế bào
thu nhận hợp chất thứ cấp ác TH H HH2 HH HH HH nà 23
In, on Đoo33 24 LÊ 0/004: 8 ad 3 26
9.3 Sự kết hợp giữa auxin Và Cy{OkÍTD uc các HH He 27 Phần 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
1v 5i 0 ˆ 29
1 Vật Hiệu nUỒi CẤY L ng TH Hy TH HH HH HH xxx, 29
Trang 61 Sự tạo dịch treo tế bào tỲ mÔ SGO nha Hy ngài 29
2 Ảnh hưởng của sucrose lên sự tạo thành địch treo tế bào 30 3 Theo dõi sự tăng trưởng của dịch treo tế bào theo thời gian 31
4 Sự gia tăng sinh khối của dịch treo và mối liên hệ với khả năng tạo rễ 3Í
5 Quan sát hình thái giải phẫu c2 211212211 ca re 31
N3 ng na 31
7 Đo hoạt tính chất điều hoà sinh trưởng thực VẬ( cv 33
§ Định tính và định lượng saponin trong dịch treo tế bào và rễ được tạo từ
dich treo t€ BAO ce na 36
Phần 3: KẾT QUÁ
1 Sự tạo dịch treo tế ĐÀO cuc LH HT TT TH nH TH HT yệp 38
2 Ảnh hướng của sucrose lên sự tạo địch treo tế bàoO ca 40
3 Sự tạo rễ của dịch treo tế ĐÀO du cuc ng ng TH ket, 4I
4 Theo dõi sự tăng trưởng dịch treo tế bào theo thời g1an c 43 5 Theo đối sự tăng trưởng của dịch treo tế bào khi chuyển sang môi
trường tạo rễ theo thỜi g14D c HH HH HH HH HH ro 45
6 Sự thay đối cường độ hô hấp của dịch treo tế bào tạo rễ qua các giai đoạn
58) 0100 ae .4 46 7 Sự thay đổi cường độ hô hấp của dịch treo tế bào tạo rễ qua các giai đoạn
118110): 20008 G ‹4diÃLÃ 48
8 Sự thay đổi chất điều hoà sinh trưởng thực vật của dịch treo tế bào qua các
lv ii 0p đã 8n 49
9 Su thay đổi chất điều hoa sinh trưởng thực vật của dịch treo tế bào trên
môi trường tạo rễ qua các giai đoạn tăng trƯỞNG uc ch nhe 49
Trang 711 Phát hiện saponin có trong dịch treo tế bào và rễ được tạo thành từ
010090: 17 a.aa la 55
12 Định lượng saponin tồn phần có trong dịch treo tế bào - 56
13 Định lượng saponin toan phần có trong rễ được tạo từ dịch treo tế bào.56
Phần 4: THẢO LUẬN
1 Sự tạo thành dịch treo tế bào ¿- c 111v v HS Ty Hy re, 59
2 Dịch treo tế bào va kha năng sản xuất saponin c5 << s<ss2 60
3 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật nội sinh 63
4 Vai trò của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật ngoại sinh trong sự tăng trưởng của dịch treo tế bào và sản xuất hợp chất thứ cấp trong tế bào 65
5 Tạo rễ từ dịch treo tế bào và sẳẩn xuất saponin - . ¿cscx cv: 66
Phan 5: KÉT LUẬN - ĐẺ NGHỊ
KẾT LUẬN -2 6c Sc t2 SE 12712 1811711 1111111111111 Eeesre 68 DE NGHI cieescsccscsssssscssessessessessucssessecsessusscssssansessevssessessessessecsesansaucarsarsaussesaveaneaveaes 69 CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU .- St St t1 E1211511111111511112111151551 1e Excxe 70
Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO - - s2 St 2E2E3252E125252525555ExsEe se 71
Trang 82,4—-D AIA AIB BA CDHH CDHSTTV cs Ki MS TDZ PLT
CAC CHU VIET TAT
acid 2, 4 — dichlorophenoxyacetic acid abscisic
acid indol acetic acid indol butyric benzyl adenin
cường độ hô hấp
Trang 9DANH MUC CAC ANH
Ảnh 1: Mé seo 8 tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung 2, 4— D 2,0 mg/1 38
Ảnh 2: Tế bào tạo nhóm trên mơi trường MS có bổ sung 2, 4— D 2,0mgi 38
Ảnh 3: Dịch treo tế bào trên mơi trường có nồng độ sucrose 25g/1 - 39
Ảnh 4: Dịch treo tế bào trên mơi trường có nồng độ sucrose 35g/1 39
Ảnh 5: Dịch treo tế bào sau 2 tuần chuyển sang môi trường tạo rễ 41
Ảnh 6: Dịch treo tế bào sau 4 tuần chuyển sang môi trường tạo rễ 41
Ảnh 7: Dich treo tế bào sau 6 tuần chuyển sang môi trường tạo rễ 51
Anh 8: Tế bào tạo nhóm trên mơi trường MS có bổ sung TDZ 0,5mg/1 và BA Ảnh 9: Sự phát triển của tế bào dịch treo sau khi chuyển sang môi trường tạo 7 ”571.001777 51
Ảnh 10: Sự phát sinh rễ từ dịch treo tế bào trên môi trường tạo rễ sau 4 tuần nuôi 2 -aildầầÀầ Ẽäẽäẽ sa 52
Trang 10-H1-
DANH MỤC CÁC BẰNG
Bảng 1: Sự tăng trưởng của dịch treo tế bào trên môi trường MS có bổ sung TDZ
0,5 mg/l va BA 0,5 mg/l theo thOd 21a cty ng HH to kh 43 Bảng 2: Sự tăng trưởng của địch treo tế bào sau khi chuyển sang môi trường tạo rễ MS có b6 sung TDZ 0,5mg/l, NAA 1,0 mg và BA 0,5 mg/1 theo thời gian 44
Bảng 3: Cường độ hỗ hấp của địch treo tế bào trên mơi trường MS có bổ sung TDZ
0,5 mg/l va BA 0,5 mg theo thot 21am cuc KT vn 46
Bảng 4: Cường độ hô hấp của dịch treo tế bào trên môi trường tạo rễ MScó bổ
sung TDZ 0,5mg/l va BA 0,5mg/l va NAA 1,0me/I theo thời g140, ee 47
Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính chất điều hồ sinh trưởng thực vật của địch treo tế
bào trên môi trường tạo rễ MS có bổ sung TDZ.0,5 mg/1 và BA 0,5 mg/1 49
Bảng 6: Sự thay đối hoạt tính chất điều hồ sinh trưởng thực vật của dịch treo tế
bào trên môi trường tạo rễ MS có bể sung TDZ 0,5Smgi, BA Ó,5 mgii và NAA
LOMA = 4 50 Bảng 7: Sự thay đối saponin toan phần của địch treo tế bào trên môi trường tạo rễ MS có bể sung TDZ 0,5 mgø/1 và BA 0,5 mg/1 theo thời BIAH co 56 Bảng 8: Sự thay đổi saponin toàn phần của dịch treo tế bào trên môi trường tạo rễ
Trang 11DANH MUC CAC HINH
Hinh 1 Duong cong tang trudéng cia dich treo tế bào trong mơi trường MS có bổ C01019) bo VÀ C60 nh (0ŒI))ađẦ 43 Hinh 2: Duong cong tang trưởng của dịch freo tế bào trong môi trường
MS có bể sung TDZ 0,5mg/l, NAA 1,0 mg/l va BA 0,5 mg/l theo thdi gian 44
Hình 3: Sự thay đổi cường độ hô hấp của dịch treo tế bào trên mơi trường MS có
bể sung TDZ 0,5 mg/l va BA 0,5 mg/I theo tho] gian oo chen Hư 46 Ch
Hình 4: Sự thay đối cường độ hỗ hấp của dịch treo tế bào trên môi trường tạo rễ
MS cé bé sung TDZ 0,5mg/l, NAA 1 mg/l va BA 0,5 mgi theo thời gian 47
Hình 5: Sự thay đổi hoạt tính chất điều hồ sinh trưởng thực vật của dịch treo tế
bào trên mơi trường MS có bổ sung TDZ 0,5 mg và BA 0,5 mg/1 theo thời gian 49
Hình 6: Sự thay đổi hoạt tính chất điều hoà sinh trưởng thực vật của dịch treo tế
bào trên môi trường tạo rễ MS có bổ sung TDZ 0,5mg/, NAA | mg/l va BA 0,5
ME/] theo COL 271) 00707070707 33ÝÝ 530
Hình 7: Sự thay đổi saponin toàn phần của dịch treo tế bào trên môi trường MS
có bổ sung TDZ.0,5 mg/1 và BA 0,5 mgi theo thời gian co ccccceec 56 Hình 8: Sự thay đổi saponin toàn phần của dịch treo tế bào tạo rễ trên môi
Trang 13dụng dược lý giống Nhân sâm như tăng cường thể lực, tăng sức để kháng, tăng khả năng thích nghị
Cây Định lăng có chứa hai hợp chất chính quan trọng là polyacetylen và
saponin, các hợp chất này có nhiều ở rễ và lá [69] Saponin triterpen có tác dung
tích cực chống oxi hóa, chống stress [12]
Tuy nhiên lượng saponin trferpen tự nhiên trong cây Định lăng khá hạn chế,
không đáp ứng được nhu cầu về dược liệu Hiện nay, để thu nhận một lượng lớn các
hợp chất thứ cấp không phụ thuộc vào nguồn thực vật trồng trong tự nhiên người ta
tiến hành nuôi cấy mô để thu nhận sinh khối, đặc biệt là nuôi cấy tế bào [ L5]
Mặc khác, để tạo năng suất cao trong việc thu nhận các hợp chất thứ cấp thì trong ni cấy tế bào người ta kết hợp xứ lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
ngoại sinh như auxin và cytokinin ở các nồng độ thích hợp giúp hình thành nhiều
mô hay cơ quan có khả năng tao saponin triterpen
Chính vì vậy, trong để tài này chúng tôi tập trung vào các việc:
1 Tim hiểu môi trường thuận lợi giúp tạo dịch treo tế bào cây Định lăng
bo Theo đối sự tăng trưởng của dịch treo tế bào cây Dinh lăng
Trang 15giúp cân bằng khơng khí, cung cấp thức ăn, Và còn là một nguồn nguyên liệu trong y được
Thực vật sản xuất ra một lượng lớn các chất hữu cơ mà có một số chất không tham gia trực tiếp vào quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, những chất này
được gọi là sản phẩm thứ cấp Sản phẩm thứ cấp khơng có vai trò trong sự đồng
hóa, hơ hấp, vận chuyển và biệt hóa Sản phẩm thứ cấp khác các sản phẩm sơ cấp & ché có sự phân bố giới hạn trong thực vật, các sản phẩm thứ cấp chuyên biệt chỉ được tìm thấy trong một loài nhất định hoặc chỉ liên quan trong một nhóm lồi được phân loại, trong khi các con đường sơ cấp cơ bản được ầm thấy xuyên suốt trong
giới thực vật
Tất cả các cơ quan: rễ, thân, lá ở thực vật đều có thể sản xuất hợp chất thứ cấp, ngoài tác động là bảo vệ các cơ thể thực vật thì hợp chất thứ cấp còn cung cấp
nguồn nguyên liệu cho y được Tuy nhiên, trong điều kiện nuôi trồng tự nhiên năng suất của các hợp chất thứ cấp không ổn định vì ảnh hưởng của điểu kiện định
dưỡng, điều kiện thời tiết khí hậu và thời gian thu hoạch dài
Do vậy, để thu nhận một lượng lớn và thời gian thu hoạch liên tục các hợp
Trang 162 Quá trình biến dưỡng thứ cấp ở thực vật
Các sẵn phẩm cacbohydrat trong quang hợp được tích lũy và sử dụng qua các con đường đị hóa hơ hấp mà qua đó tế bào thực vật tạo năng lượng và sườn cacbon Các sườn cacbon này được sử dụng để tổng hợp amino acid, protein, các hợp chất
thứ cấp Cần thiết cho hoạt động sống của thực vật
Khác với các sản phẩm sơ cấp, sản phẩm thứ cấp khơng có vai trị trong sự
đồng hố và hô hấp tế bào Sản phẩm thứ cấp không được tổng hợp rộng rãi ở mọi
thực vật như sản phẩm sơ cấp mà nó chỉ hiện ở một số loài thực vật Trong tế bào
hợp chất thứ cấp thông thường hiện diện trong không bào [63]
Chức năng cơ bản của sản phẩm thứ cấp ở thực vật là bảo vệ cây tránh khỏi
động vật ăn thực vật và sự tấn công của mầm bệnh Người ta đã ứng dụng những
sản phẩm thứ cấp như sản xuất thuốc, chất độc, hương liệu và nguyên vật liệu công
nghiệp
Đầu những năm 60, nhiều sản phẩm thứ cấp đã được chứng minh là có vai trò sinh thái quan trọng trong thực vật Sắn phẩm thứ cấp cũng được chứng minh là chất
dẫn dụ côn trùng đến thụ phấn
Các phản ứng enzym tạo nên nhiều con đường biến dưỡng, bao gồm các quá trình đồng hoá và đị hoá Con đường đồng hoá và dị hoá được xem là “con đường
biến dưỡng sơ cấp” và các chất cần thiết có liên quan đến sự phát triển của cây
được gọi là “các chất biến dưỡng sơ cấp” [24] Con đường biến dưỡng sơ cấp tạo ra
các cacbohydrat, amino acid, các acid béo thông dụng, các nucleoud,
Trang 17Tuỳ theo dạng sản phẩm tạo thành, các hợp chất biến dưỡng thứ cấp của thực
vật được phân thành 3 nhóm chính là terpenoid, phenol và các hợp chất chứa nitơ [24]
- Hop chat chifa phenol 1A nhiing hdp chat chifa vong thom được tổng hợp theo
con duGng acid shikimic hoic con dudng acid malonic
- — Hợp chất thứ cấp chứa nitơ như alkaloid được sinh tổng hợp từ amino acid
- = Terpenoid là một chất được tổng hợp từ Acetyl - CoA theo con đường mevalonic
Saponin là một hợp chất terpennoid và rất nhiều saponin có tác dung như được
Trang 18CO; | Photosynthesis V Carbohydrates \ Pentose phosphate pathway \ Erythrose 4-phosphate
Shikimic acid pathway |g
Glycolysis Ỷ Phosphoenol pyruvic acid \ Acetyl CoA | Ỷ
ị Ỷ , Alinhali Tricarboxylic Mevalonic acid _ Aromatic Iphatic arid cyols nathway
amino acid | | amino acid
Nitrogen + containing Malonic acid
secondary products palhway
v > T trpenes Vv k > « e Phenolic > compounds
Trang 193 Saponin
Đựa vào cấu trúc người ta chia saponin thành hai nhém 1a saponin triterpen (cé 30C cấu tạo bởi 6 nhóm Hemiterpen) và saponin steroid có 27C Trong họ Nhân Sâm thường chứa saponin trierpen [24]
Saponin là một nhóm hợp chất thứ cấp có vai trị quan trọng trong thực vật, saponin hiện điện cả cây một lá mẩẫm và cây hai lá mầm, Quá trình tổng hợp
saponin trong thực vật phụ thuộc vào sự đi truyền, các loại mô khác nhau, tuổi của
thực vật và các yếu tố môi trường xung quanh (K Haralampidis, M Trolanowska
và E Osbourn, 2002)
Saponin có nhiều tác dụng được lý như có tính phá huyết, tạo phức hợp với cholesterol, kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống tạo khối u, nhiều saponin
có tác dụng diệt các loài nhuyễn thể, Saponin có tính chất tạo bọt khi gia nhiệt, tính chất này có thể áp dụng để định tính saponin [9]
Một số nguyên liệu chứa saponin dùng để pha đầu gội, giặt len đạ, tơ lụa Saponin trong cây Định lăng còn có tác dụng bồi bổ, làm cơ thể nhanh chóng phục
hồi, tăng thể trọng, ăn ngon, ngủ tốt, có tác dụng giúp hình thành và cũng cố trí nhớ
đặc hiệu trên súc vật có trí nhớ kém [7]
Trong cây Định lăng lượng saponin hiện diện rất hạn chế khoảng 1,65% ở lá
Vì vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp giải quyết việc gia tăng sinh
Trang 20Acetyl CoA Acetatoacetyl CoA -Hydroxy- methyl-glutaryl CoA
(HMG-CoA) Mevalonic acid | Mevalonic acid-5PP (MVA-PP) y IsopentenylPP 7 + TC GeramylPP ——————> Monoterpenes DimethylallylPP
Diterpenes GeranylgenanylPP <—_—— FarnesyIPP > Sesquiterpenes
ị Phytoene | Tetraterpenes Squalene Saponin Saponin triterpenenoid steroid
S.T.Tetrecylic S.T.Pentacylic Spirosttan Furostan
Cucurbitan Olean
Lanostan Ursan Dammaran Lupan
Hopan
Trang 214, Dinh ling va saponin trong cay Dinh lang
Cay Dinh lang Polyscias fruticosa L Harms thuéc ho Ngii Gia Bi Araliaceae
[4], cùng họ Nhân sâm là cây thuốc được sử dụng nhiều trong y học dân gian Việt
Nam và Trung Quốc Theo Ngô Ứng Long, cây Định lăng có nhiều tác dụng được lý giống Nhân sâm, đặc biệt dược liệu từ cây Định lăng tác dụng tăng cường thể lực,
tăng sức để kháng và tăng khả năng thích nghĩ
Phân loại:
Họ Araliaceae
Giống polyscias
Loài Polysctas fruticosa L Harms Tên thông thường Định lãng lá nhỏ, Nam dương lâm 4.1 Phan loại
Cây Định lăng Polyscias fruficosa L Harms là một cây bụi cao khoảng từ 0,5 —
2m, thân khơng có lơng; rễ, lá có mùi thơm; hoa nhố 5 cánh, trái tròn hơi đẹp có
mầu trắng bạc [4]
4.2 Nguân gốc ~ phân bố
Cây Định lăng có nguồn gốc từ vùng đảo Polynesie (Thái Bình Dương), thuộc họ Araliaceae, chỉ Polyscias Forst và Forst.f chỉ này gần 100 loài trên thế giới phân
bế rãi rác ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đáo Thái Bình
Duong [1] Ở Việt Nam, hiện có hơn 10 lồi Định lăng [4], đa số Định lăng trồng
hiện nay được sử dụng làm cây cảnh, chỉ có vài lồi được sử dụng làm thuốc, loài
Dinh lang dude sử dụng làm thuốc phé bién nhat la Polyscias fruticosa L Harms
Trang 22
Ré Đinh lăng có vị ngọt, tính bình; lá có vị nhạt, hơi đắng, tính bình Có thể thu hoạch rễ ở những cây trồng 3 năm trở lên (trồng càng nhiều năm thì hệ rễ càng phát triển và lượng hợp chất thu được càng nhiều) Có thể thu rễ vào mùa đông sau
đó rửa sạch phơi khơ và bảo quản ở chỗ mát Có thể thu lá quanh năm, thường dùng
tươi [1], [3]
Hinh: Cay Dinh lang Polyscias fruticosa L Harms
4.3 Hop chất tự nhiên có trong cây Dinh lang Polyscias fruticosa L Harms Dinh lang chifa cac alkaloid, glycoside, saponin va cac acid amin tan trong
Trang 23Ổ tất cả các bộ phận như rễ, thân, và lá đều có chứa saponin nhưng nhiều nhất
là ở vỏ rễ và lá [1] Ngoài ra trong Định lăng còn chứa 20 acid amin và có các loại acid amin khong thay thế được như lysin, methionin, trytophan, cystein [6]
Trong lá
Trong lá, Định lăng có chứa saponin trierpen (chiếm 1,65%), tính dâu,
phyfosterol, tamin, acid hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic Saponin triterpen có thành phần aglycon và acid oleanolic, đây là một chất có tác dụng được liệu [72] Có 5 hợp chất polyacetylen được phân lập từ lá của cây Định lăng là: Panaxydol,
panoxydol, Heptadeca ~ 1,8 (BE) —- đien — 4,6diyn — 3,4 diol, Hepta deca — 1,8 CB) — đien — 4,6diyn — 3oi — 10on và Heptadeca — 1,8 (2) — 4,6diyn — 301 — 100n [1]
Trong rễ
Trong rễ, Định lăng có chứa 5 hợp chất polyacetylen, bao gồm: Panaxydol, panoxydol, heptadeca — 1,8 (E)- dien - 4,6 điyn — 3,10 điol là 3 hợp chất giống trong lá, các hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng
ung thu [1]
5 Các nghiên cứu trong nước về cây Dinh lăng
Về tác dụng được lý
- Đinh lăng có tác dụng bồi bổ cơ thể, tăng thể trọng, thúc đẩy sự hình thành và
cũng cố trí nhớ đặc hiệu trên súc vật có trí nhớ kém, tăng lực, tăng sức dẻo dai của
cơ thể, có tác dụng lên hệ nội tiết,
- — Định lăng có tác dụng chống stress
- — Định lăng có tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động mạch dự trên
Trang 24-11-
- — Kích thích sự hoạt động của K”, Na”, ATPase
Nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Đỉnh lăng
Tạo cây con [2]: “Nhân giống cây Định Lăng Polyscias ƒuficosa L Harms thông qua con đường tạo phôi soma trong nuôi cấy in — vitro” Cay con được tạo thành từ mô phân sinh của cây Đinh lăng trong môi trường có thành phần là MS có
bổ sung BAP 2,0 mg/1, sau 60 ngày từ mô phân sinh tạo thành chổi và chồi nách
Tạo phéi soma [5]: “Nghiên cứu nhân nhanh cây Đình lăng Poiyseias ƒruficosa L Harms bang phuong phap in — vitro” Vat liệu sử dụng là chổi đỉnh và chổi bên còn non của cây Đinh lăng Môi trường sử dụng là mơi trường MS có bổ sung vitamin Morel, nước dừa 10%, sucrose 30g/1 và các chất điều hoà sinh trưởng thực vật Cây con được tái sinh qua con đường tạo phôi soma
Tạo mô sẹo và phát sinh phôi thể hệ [10]: “Nghiên cứu sự phát sinh hình thái trong ni cấy in — vitro cay Dinh lang Polyscias fruticosa L Harms” Mô sẹo được tạo thành từ các chổi in — vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4 - D 2,0mg/ các
mô sẹo phát triển tốt nhất trên môi trường này và từ đó tạo phơi trên mơi trường
khơng có chất điều hồ sinh trưởng ngoại sinh, những vật liệu này có thể phát hiện
saponin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hay khả năng tạo bọt
“Nghiên cứu khả năng tạo rễ tạo rễ từ nuôi cấy i — vữro và nuôi trồng thủy
canh để thu nhận saponin trên cây Dinh lang Polyscias fruticosa L Harms”
(Nguyễn Trần Châu Đỗ Mai Anh, Võ Thị Bạch Mai, 2007)
BH KHOA HOC TU NHIEN
THU VIEN 01970
Trang 25
6 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật và quá trình biến dưỡng thứ cấp với hệ thống nuôi cấy hai giai đoạn:
6.1 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật trong việc sản sinh các hợp chất
thứ cấp
Tao cay tai sinh
Là một kỹ thuật phổ biến và được áp dụng thành cơng ở nhiều lồi thực vật khác nhau, được tiến hành qua hai phương phấp: tạo phôi sinh đưỡng và tạo cơ
quan Phôi sinh dưỡng là loại mô mà cấu trúc phôi bắt nguồn từ mơ khơng có khả
năng sinh sản Phơi có thể tạo trực tiếp từ mô cây [58]
Sự tái sinh cây bởi cơ quan đạt được thơng qua hình thành chổi trực tiếp trên
mẫu cấy hoặc thông qua con đường tạo mô seo Chối tái sinh đó sẽ kéo đài và phát
triển thành chổi hồn chính, chổi hồn chính này sẽ được chuyển sang môi trường
tạo rễ sau khi hình thành rễ, cây tái sinh hoàn chỉnh được chuyển vào hỗn hợp đất
thích hợp với nhiệt độ và ánh sáng thích hợp cho cây phát triển
Nuôi cấy cơ quan
Một số loài thực vật cần sự biệt hoá về mặt hình thái như chỗi và rễ mới có thể
tổng hợp được hợp chất thứ cấp như Daucus carota, Atropa, Datura, Sanecio,
Cephaelis, Berneris [50]
Nuôi cấy mô sẹo
Nuôi cấy mô sẹo của các loài khác nhau cho thấy chất biến dưỡng thứ cấp có
thể được sinh ra trong trình trạng mơ chưa phân hoá như cafein ở Coffea arabica
Trang 26-13-
6.2 Quá trình biến đưỡng thứ cấp và hệ thống nuôi cấy hai giai đoạn
Quá trình tế bào thực vật sản sinh hợp chất thứ cấp được chia làm hai nhóm:
nhóm Í giai đoạn và nhóm 2 giai đoạn:
Nhóm 1 giai đoạn là sự nhân sinh khối và sự sẵn sinh các hợp chất thứ cấp xây ra cùng một lúc Do vậy các yếu tố ảnh hưởng lên sự tăng trưởng cũng sẽ ảnh hướng lên sự sản sinh các hợp chất thứ cấp
Nhóm 2 giai đoạn là sự nhân sinh khối và tạo các sản phẩm thứ cấp xảy ra tách biệt nhau Đây là điểm quan trọng trong nuôi cấy tế bào thu nhận các sản phẩm thứ
cấp
Trong nhóm giai đoạn 2, sự tăng trưởng tế bào bị kìm hãm để ưu tiên cho việc
hình thành các sản phẩm thứ cấp, sự tăng trưởng bị loại bỏ hay thiếu đi thành phần
định dưỡng trong nội trường Hai chất dinh dưỡng đóng vai trị quan trọng trong hệ
thống nuôi cấy là nguồn carbon và oxy Đây là hai chất cần thiết trong quá trình
biến dưỡng thứ cấp
Sự sẵn sinh chất thứ cấp thường ánh hưởng đến thay đổi về mặt hình thái, các
mơ thường liên quan đến biến dưỡng thứ cấp là rễ và vó cây
Hiện nay, có nhiều hệ thống sản xuất hợp chất thứ cấp để thu sinh khối Có 3
hệ thống nuôi cấy khác nhau liên quan đấn sản xuất hợp chất thứ cấp qua hai giai
đoạn là nuôi cấy lông rễ, nuôi cấy tế bào được cố định qua hệ thống bắt giữ và nuôi
cấy dịch treo tế bào
7 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật, sự tạo cơ quan biệt hoá và các điều kiện ảnh
hưởng đến sản sinh hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô
Trang 27điều kiện thích hợp (điều kiện định dưỡng khoáng, chất điều hoà sinh trưởng thực
vật, độ pH thích hợp, ) sẽ tạo thành một cơ thể thực vật hồn chính Đây là cơ sở
khoa học cho việc nuôi cấy mô, tế bào thực vật [57] Trong kỹ thuật này thì các cơ
quan thực vật, các mô và các tế bào đã biệt hố có thể bị khử biệt hoá Tuy thuộc
vào môi trường nuôi cấy những tế bào được biệt hố có thể tiếp tục tăng trưởng và
khơng phân hố (mô sẹo) hoặc tái biệt hố thành các mơ hay các cơ quan chuyên
biệt khác biểu hiện qua thay đổi về sự phát sinh hình thái (chổi, rễ) và các chức năng sinh lý khác nhau [13] Từ đây có thể điểu chỉnh sự tạo khối tế bào, mô, cơ
quan trong điều kiện nuôi cấy được kiểm soát nghiêm ngặt để thu nhận các hợp
chất thư cấp trong các vật liệu trên
Năm 1960, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đầu tiên được áp dụng để nghiên cứu
con đường sẵn xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp
Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi và đang dần được cải tiến dân
nhằm gia tăng các cơ quan, mô, tế bào có khả năng sẵn xuất hợp chất thứ cấp để
thu nhận một lượng lớn các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên phục vụ cho công
nghiệp được liệu, mỹ phẩm
Nhiều hợp chất thứ cấp đã được sản xuất với một số lượng lớn trong hế thống
bioreacter như Nhân sâm Panax sp., taxol trong cây Thông đỏ
Các hợp chất thứ cấp có thể thu nhận từ mô sẹo, dịch treo tế bào, rễ bất định,
phôi, Hiện nay, các nghiên cứu đã tiến hành trên rễ bất định và chuyển gen vào rễ bất định để gia tăng việc sản xuất các hợp chất gingsennoside của Nhân sâm [23] 7.1 Sự tạo cơ quan và biệt hoá tế bào
Các tế bào thực vật được tái biệt hoá thành các cơ quan như chối, rễ và hoa,
Trang 28
hình thành cơ quan trong điều kiện nuôi cấy ín ~ vữro lần đầu tiên được công bố
bởi White (1939) với chổi của cây lai thuốc lá, và bởi Nobecourt (1939) với rễ của
cây cà rốt
7.2 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật và quá trình biến dưỡng thứ cấp
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật ra đời mở ra một cuộc cách mạng trong nhân
giống thực vật và thu nhận các cơ quan sản xuất hợp chất thứ cấp Tuy nhiên, để
thu được lợi nhuận cao và giảm chỉ phí cho người lao động, một hệ thống tự động
trong vi nhân giống được để nghị đầu tiên là cây Begonia (Takayama, 1981)
Bioreacter được sử dụng rộng rãi trong ngành sản xuất vi sinh, sẵn xuất các chất có hoạt tính sinh học ở thực vật Mục đích của việc ni cấy lỏng lắc và
bioreacter là tăng nhanh số lượng sinh khối, nuôi cấy tế bào huyền phù nhằm chiết xuất các hoạt chất sinh học thứ cấp [11]
Để tạo được các chất biến dưỡng thứ cấp như trong điều kiện tự nhiên, nuôi
cấy mô, tế bào thực vật là một phương pháp hữu hiệu, kỹ thuật này mang lại rất
nhiều lợi ích:
- — Duy trì các hợp chất có ích trong nhiều năm mà không phụ thuộc vào điều kiện khí hậu cũng như các yếu tố khác trong tự nhiên
- — Các tế bào ni cấy có thể sản sinh một lượng lớn hơn các hợp chất mong
muốn
- Có thể thay đổi điều kiện nuôi cấy để làm gia tăng sản lượng ni cấy
Có hơn 30 hệ thống nuôi cấy tế bào được phát hiện cho thấy có thể tạo ra các đòng tế bào sản sinh các hợp chất mong muốn tốt hơn trong các cây tương ứng [6Ï],
Trang 297.3 Nuôi cấy tế bào và thu nhận hợp chất thứ cấp
Nuôi cấy dịch treo tế bào là một hệ thống phổ biến nhất trong phương pháp thu
nhận hợp chất thứ cấp bằng con đường công nghệ sinh học, đã có rất nhiều lồi
thực vật được nuôi cấy thành công nhờ phương pháp này, nhờ vào khả năng nhân nhanh trong điều kiện nuôi cấy được kiểm soát nghiêm ngặt Trong dịch treo tế
bào, các tế bào nuôi cấy phân bố đồng nhất trong cả môi trường nuôi cấy Tốc độ tăng trưởng của dịch treo tế bào trong môi trường lồng tốt hơn nhiều so với môi
trường bán rắn [57] Hiện nay, người ta thường sử dụng phương pháp nuôi cấy dịch
treo tế bào để sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp bằng các hệ thống
bioreacter [8], chẳng hạn như anthraquinone 6 Morinda citrifolia, ajimalicine 6 Cathranthus roceus [77], anthocyanin 6 Vitis vinifera [76], va saponin 6 Panax
ginseng [34] Những nghiên cứu cho thấy bằng cách thay đổi các điều kiện nuôi cấy
trong mỗi trường, sự tổng hợp saponin có thể được duy trì Ỏ điều kiện mô và tế bào
chưa biệt hố (mơ sẹo và dịch treo tế bào) và cũng có thể các loại mô và tế bào đã biệt hoá như rễ
Dịch treo tế bào được xem như là một phương pháp hiệu qua để tạo được các hợp chất thứ cấp Mặt dù có vài trường hợp được thương mại hoá nhưng khó khăn
lớn nhất là các chất biến dưỡng thứ cấp thường được tạo ra trên các tế bào đặc biệt trong những giai đoạn phát triển nhất định (Balandrin và cs., 1985)
Việc sử dụng các tế bào chưa biệt hố về mặt hình thái để sản sinh ra các hợp chất thứ cấp theo cách tương tự như vị sinh vật và có nhiều trường hợp các tế bào
này sản sinh các hợp chất nhiều hơn cây nguyên (vì các tế bào này chuyên biệU) Tuy vậy, vẫn chưa có bằng chứng nào cụ thể về mối liên hệ giữa quá trình biến
Trang 30-17-
Dịch treo tế bào là dịch chứa các tế bào cô lập và các nhóm nhỏ phân tấn va di
chuyển trong môi trường lỏng đi động [69]
Dịch treo tế bào thường được khởi phát bằng cách đặt mô sẹo (được tạo ra trên môi trường đặc) vào môi trường lỏng lắc Giống như đối với mô sẹo, môi trường
dịch treo tế bào có một hay cịn vài loại auxin (thường ở nống độ thấp hơn sự tạo
seo hay là nuôi cấy các cơ quan trong môi trường đặc), kết hợp với cytokinin hay
không [69], [13]
Sự tăng trưởng của dịch treo tế bào phụ thuộc vào các quá trình phân chia tạo
nhóm và tách rời tế bào Sự phân chia tế bào trong dịch treo tuỳ thuộc chủ yếu vào
sự hiện điện của auxin ở nồng độ thích hợp trong mơi trường nuôi cấy Sự phân chia tế bào tích cực dẫn đến sự tạo nhóm tế bào Mức độ tách rời tuỳ thuộc vào nguồn gốc của mơ sẹo, q trình nuôi cấy mô sẹo, hàm lượng hormone frong mô cấy, các thành phần khác của môi trường [ 13]
7.3 Dich treo tế bào lý tưởng
Dịch treo tế bào lý tưởng có sự phân chia tế bào tích cực, sự cân bằng tốt giữa
hai quá trình tạo nhóm tách rời tế bào và có tính đồng nhất cao về hình thái và sinh
hoá Dịch treo tế bào lý tưởng là một dịch mịn hầu như chỉ bao gồm các tế bào đồng nhất có khả năng sinh phôi, cô lập hay hợp lại thành nhóm nhỏ vài đến vài chục tế
bào [13]
Tế bào có khả năng sinh phôi là các tế bào nhỏ, hình cầu với tế bào chất đậm
đặc, nhân to, lượng protein dự trữ lớn và một vài hạt tỉnh bột 25], H13J
7.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo dịch treo tế bào
- — Mật độ tế bào khởi đầu: các tác giá cho rằng mật độ tế bào ban đầu đóng vai
Trang 31tế bào ban đầu quá cao cũng sẽ làm giảm mức độ tăng trưởng của địch treo tế bào vì có sự cạnh tranh chất định dưỡng trong môi trường nuôi cấy [69]
- — Sự cấy chuyển: địch treo tế bào thường được cấy chuyển vào cuối giai đoạn
tăng trưởng nhanh Tuy nhiên, nếu cấy chuyển quá nhiều lần trong thời gian đài sẽ làm giảm khả năng sinh phôi của tế bào (Dewin, 1993)
- Ánh sáng: nhu cầu về ánh sáng trong quá trình tạo dịch treo tế bào thường
tương tự với mô sẹo trước đó Sự tạo mơ sẹo có thể thực hiện trong tối hay ngoài
sáng Sự hình thành và tăng trưởng của dịch treo tế bào có thể xây ra trong điều kiện tối hoàn toàn trong trudng hop cia Solanum tuberosum L [19], hay Daucus carota [69], và cũng có thể xảy ra trong điên kiện ngoài sáng như của Pyrus
communis (Mehra và Jaidka, 1985) Đối với Nhân sâm sự tạo sẹo thường được thực
hiện trong tối [74] Ánh sáng và quang kỳ, chất lượng quang phổ ảnh hướng đến
nuôi cấy mô sinh tổng hợp ginsenoside được kích thích bởi điều kiện chiếu sáng
hơn tối [38]
- - Nhiệt độ: nhiệt độ có ánh hưởng rất lớn đến quá trình hình thành và tăng trưởng của dịch treo tế bào, Thường nhiệt độ áp dụng trong q trình ni cấy dịch
treo tế bào duy trì giống như nhiệt độ nuôi cấy mô sẹo [69]
- — Nhu cầu oxygen: lượng oxygen có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình nuôi cấy
Một lượng oxygen trong mơ cấy có thể chịu ảnh hướng bởi nồng độ các chất khí
trong khơng khí, tốc độ khuếch tán vào trong bình nuồi cấy mô và tốc độ khuếch
tán vào (ế bào hay mô cấy Thực vat tang trưởng và phát triển phụ thuộc vào hô
hấp Sự hô hấp của vài loài cây có thể gia tăng khi hàm lượng oxygen trong khí
Trang 32-19-
bào thực vật có thể giảm khi nguồn oxygen trong khí quyển bị giới hạn Sự chết tế
bào sẽ xây ra khi nồng độ oxygen giảm xuống dưới nồng độ tới hạn
8 Một số yếu tố tác động lên sản xuất hợp chất thứ cấp: 8.1 Thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy
Một trong những các yếu tế chính ảnh hưởng đến kỹ thuật nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy Có nhiều mơi trường được dùng trong nuôi cấy mo
thực vật, chẳng hạn như MS (Murashige và Skoog, 1962), B5 (Gamborg, 1968),
White (1954), NN (1969) Các môi trường này điều có thành phần cơ bản là các khoáng đa lượng và các khoáng vị lượng nhưng ở các môi trường khác nhau thì các
thành phần khác nhau Các loại mơ khác nhau có cách đáp ứng được với các loại
môi trường khác nhau [51] Loại môi trường và yếu tố đa lượng — vi lượng trong tạo rễ bất định ở Nhân sâm Panax ginseng nuôi cấy bằng bioreacter MS thích hợp tăng
trưởng của rễ, nhưng MS 1⁄2 và 3⁄4 có tác dụng trong việc tạo ginsenoside Không
giống như tăng trưởng của rễ cần NH¿” việc đồng hoá ginsenoside bị ngăn cần bởi
NH¿” trong môi trường nông độ K”, Mg”” thấp; Ca” có tác dụng tốt trong việc sản
sinh ginsenoside Việc đồng hoá của ginsenoside cũng tăng nếu tăng nồng độ
CuSO,, ZnSO., MnSO, Tuy nhiên, KI, CoCl; kìm hãm sự tang trưởng của rễ bất định và sản sinh ginsenoside khi chúng ở trong mơi trường có nồng độ cao Do vậy,
cần khảo sát nồng độ của K”, CoCl; ở mức thấp khi nuôi cấy rễ bất định Nhân sâm Khi nuôi cấy L.erythrorhizon thì sinh tổng hợp shikonin bị ức chế bởi NH," va
việc thêm nitrat là cần thiết vào cuối pha tăng trướng
Trang 33Cho nên lựa chọn nguồn nitơ là tỉ lệ NH,*/NO, t6i wu tay loai cây để sản xuất chất
biến dưỡng thứ cấp
Đối với Nhân sâm Panax ginseng va Dinh lang Polyscias fruticosa L Harms thi
môi trường sự dụng để nuôi cấy mô thực vật là môi trường MS
Tuỳ theo các loài thực vật khác nhau, các loại mô khác nhau, và các mục đích
ni cấy khác nhau mà người ta có cách điều chỉnh thích hợp, như là thêm chất điều
hoà sinh trưởng thực vật, thêm vitamin, hay điều chỉnh các yếu tố vật lý, nguồn
sucrose, ngudn nitrogen, d6 pH, lượng oxygen, lượng carbon đioxide cho phù hợp
8.2 Chon lựa địng tế bào có khả năng sản sinh cao các hợp chất thứ cấp
Đặc tính sinh lý của tế bào trong cùng môi trường nuôi cấy không phải lúc nào
cũng giếng nhau Chính vì vậy, việc chọn đòng tế bào đồng nhất và nhân các dịng
tế bào đó lên nhiều lần để gia tăng lượng sản phẩm là một việc rất quan trọng trong công tác nuôi cấy tế bào để thu nhận các hợp chất thứ cấp Việc nhân dòng các sản
phẩm này có thể áp dụng nhiều phương pháp khác nhau, như nuôi cấy dưới các
điều kiện ánh sáng khác nhau hay thêm tiền chất
Việc bổ sung tiền chất hay các chất liên quan đến kích thích sẵn sinh hợp chất
thứ cấp là rất quan trọng trong q trình ni cấy, như thêm các amino acid vào môi trường nuôi cấy để gia tăng sự tổng hợp các hợp chất thứ cấp Jasmonic acid là một
chất được xem là cắm ứng tích cực và hữu hiệu lên việc tạo hợp chất thứ cấp trong
nuôi cấy mô thực vật để thu nhận các hợp chất thứ cấp [37], trong nuôi cấy mô tế
Trang 34
§.3 Đồng hố ginsenoside bởi xử lí Acid jasmonie [38]
Hai giai đoạn nuôi cấy bằng bioreacter để giúp gia tăng sinh khối và đồng hoá
ginsenoside:
Dung 5 loai acid jasmonic: Methyl dihidro jasmonate (MDJ), methyl epi-
jasmonate (MEJ), methyl epi-dihidro jasmonate (MEDJ), jasmonic acid (JA), va
methyl jasmonate (MeJA) Ham ludng ginsenoside tang trong tat ca các xứ lý Đặc biét, MEJ cho két qua déng hoá ginsenoside cao nhất nhưng kìm hãm tăng trưởng của rễ Trọng lượng tươi, khô, tỷ lệ tăng trưởng của rễ giảm trong khi tăng lượng ginsenoside xử lí Để giải quyết vấn để này, người ta tiến hành nuôi cấy theo hai
bước Sự tăng trưởng của rễ sẽ tối đa 40 ngày, sau đó xử lí jasmonas 7 ngày để tăng đồng hoá ginsenoside So với đối chứng thì hàm lượng tăng 5-7 lần sau khi xử If jasmonate, sự đồng hoá ginsenoside cũng bị tác dụng bởi các thành phần nuôi cấy trong suốt quá trình xử lí khơi mào Tác động khơi mào sẽ mạnh mẽ khi xử lí trong môi trường đã được sử dụng, nhưng nếu sử dụng mơi trường tình khiết thì tác động khơng quan trọng
Sự đồng hoá ginsenoside sau khi xử lí Methyl jasmonate:
Trong s6 cdc jasmonate thi methyl jasmonate có tác động cao nhất và giá thành thấp, hàm lượng ginsenoside tổng cộng và nhóm ginsenoside Rb tăng từ từ và
đạt tối đa trong 7 ngày sau khi xử lí và rất ít thay đổi sau đó
8.4 Nông độ sucrose
Trong việc nuôi cấy dịch treo tế bào thì sucrose là nguồn carbon quan trọng,
sucrose có thể tác động đến một số lượng lớn các yếu tố như: tốc độ tăng trưởng và
Trang 35(Zhong và cs.,1996) cho thấy rằng nồng độ sucrose ban đầu tác động lên sự tăng trưởng tế bào và sản sinh ginsenoside trong Nhân sâm Chúng sẽ duy trì sự
tăng trưởng tế bào tối wu khi nồng độ sucrose 30g/1 sẵn xuất saponin tối ưu Kết qua
xác nhận vai trò rất quan trọng của nồng độ sucrose ban dau trong sự tăng trưởng
của rễ bất định của Nhân sâm Trong số các nồng độ sucrose: 10g/1, 20g/1, 30g/1, 50g/1, 60g/1, 9Ö g/1: trọng lượng khô của rễ tăng tối đa ở 5Og/1, trọng lượng tươi và tốc độ tăng trưởng cũng tối đa Tuy nhiên, sự tăng trưởng của rễ bắt đầu giảm từ
nông độ sucrose trên 70g/1 Tác động của nồng độ sucrose trong việc sinh tổng hợp
ginsenoside không quan trọng như trong trường hợp tăng sinh khối 8.5 Nguồn nitrogen
Trong các nghiên cứu tỉ lệ NHạ / NÓ: trong mơi trường MS thì NĨ: đóng vai trị quan trọng hơn trong tạo sinh khối và ginsenoside hơn NHạ Ginsenoside được
tạo tối đa khi sử dụng NÓ: là nguồn cũng cấp chính niơ, tí lệ 1⁄2 của NHƯNO; thu
được sinh khối của rễ là lớn nhất và tỉ lệ này cũng cho thấy tạo ginsenoside cao Tương tự kết quả nghiên cứu nuôi tế bào Nhân sâm Qingueƒfolium [73] cho rằng tạo saponin và polysaccharide đạt được cao nhất khi tỉ lệ ammon/ niữrate 0:1 hay 1:2 trên một 36 đối tượng khác thì ta cũng thay rang nông độ cao của ammonium ức chế sự tăng trưởng mô sẹo ở cây Thông hay tre ché tao shikonin & Lithospermum erythrorhizon Noi chung nifrate và aramonium có tác động khác nhau lên nuôi cây tế bào cũng như mô và cơ quan Nitrate kích thích tơng hợp các hợp chất thứ cấp, ngược lại ammonium ức
chế Vì thé rất quan trọng khi chon lựa nguồn nitrogen và tỉ lệ anmon/nitrate thích đối với từng loài khác nhau
8.6 Yếu tố thẩm thấu
Sorbitol và manitol cũng tác động lên trọng lượng khô của rễ và sự đồng hoá
Trang 36-23-
nhưng lượng ginsenoside thì cần thấp hơn Đặc biệt nồng độ manitol cao (0,5M) sẽ
ức chế mạnh mẽ đồng hoá ginsenoside
8.7 pH môi trường
pH trong nuôi cấy mô thực vật pH là yếu tố quan trọng Ảnh hưởng lên sự gia
tăng sinh khối và sản xuất các hợp chất thứ cấp Trong nuôi cấy tế bào cây đậu đó
Vigan angularis hoạt động của enzym PLA (phenylalanin amonia lysase) va
isoflavone glucoside được thấy do sự ảnh hưởng của pH ti 6 — 6,5 trong nuôi cấy tế
bào
Nuôi cấy rễ Nhân sâm pH môi trường ban đầu: 6 - 6,5 trước khi hấp khứ trùng bởi vì sự tăng trưởng của rễ và ginsenoside sẽ cao nhất ở pH này Sự tăng trưởng rễ
và đồng hố ginsenoside kìm hãm khi pH dưới 4 hoặc trên 7 [38]
9, Chất điền hoà sinh trưởng thực vật và vai trò của chúng trong nuôi cấy tế
bào thu nhận hợp chất thứ cấp
Thuật ngữ “chất điều hoà thực vật” (plant regulator) được dùng để chỉ một
cách tổng quát những hợp chất hữu cơ (bao gồm các sẵn phẩm thiên nhiên của thực vật và các sản phẩm được tổng hợp nhân tạo) có tác dụng kích thích hay can tang
trưởng ở thực vật, nói cách khác, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó
khi tác dụng ở nông độ thấp Chúng không phải là chất dinh dưỡng hay những
nguyên tố khoáng cần thiết cho thực vật [40], [131L
Hiện nay, người ta phân biệt có các nhóm điều hoà tăng trưởng thực vật có tác
động trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào như : auxin, cytokinin, giberelin, acid
Trang 379.1 Auxin
Là một nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được nghiên cứu lâu dai va ti mỉ nhất Auxin có tác dụng rất lớn lên sự tăng trưởng hình thực vật và phát sinh hình thái thực vật [63]
Năm 1962, F.W.Went ở Hà Lan lần đầu tiên nghiên cứu một nhóm chất gọi là
auxin — đây là nhóm chất điều hồ sinh trưởng thực vật lần đầu tiên được xác định
(Tomic và cs., 1998) Chất điều hoà sinh trưởng thực vật được xem như là một chất hữu cơ hiện diện trong cây và hoạt động với một lượng nhỏ, tác dụng điều khiển sự
tăng trưởng và các chức năng khác nhau
Ở mức tế bào, auxin kích thích sự hoạt động của bơm proton qua màng nguyên sinh chất, làm gia tăng nồng độ HỶ ớ khoảng gian bào, khi đó pH giảm
(Marré, 1979) Sự giảm pH của vách làm cho vài cầu nối extensin, hemicellulose,
các hợp chất pectid với celluloz bị phá vỡ, Ca”" nối lién cdc chuỗi hợp chất peptid bị loại đi, vài enzym thuỷ giải được hoạt hoá giúp cho sự tổng hợp hoặc phân huỷ
polysaccharid và protein được thực hiện, giúp duy trì sự lỏng lêo của vách tế bào
(Smith va Wood, 1996)
Ở mức phân tử, auxin kích thích sự tổng hợp mRNA liên quan trong sự tổng
hợp enzym chuyên biệt, bao gầm enzym tạo tiền chất của celluloz và các hợp chất
của vách [13]
Ngồi ra, auxin cịn giúp kéo dài tế bào nhờ điều khiển sự hấp thu các chất hoà
tan trong tế bào [63]
Tác động của auxin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thay đổi tuỳ theo loài và
tuỳ thuộc vào nông độ của hiện diện của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
Trang 38-25-
khi dùng riêng lẽ hoặc kết hợp với các chất điều hoà sinh trưởng thực vật khác [51]; Kích thích sự phát sinh rễ và kìm hãm sự kéo dài rễ [66], [13] Các loại auxin khác nhau thường sử dụng với nồng độ khác nhau như AIA thường sử dụng với nồng độ
1- 31mg/; NAA và 2, 4- Ð từ 0,1 - 3,0mg/1 [57]
Một số auxin có tác động riêng biệt lên sự tạo rễ và phát triển của mô cấy
hoặc chổi tái sinh NAA và AIA có tác động sinh lý quan trọng trong sự tăng trưởng
và hình thái; kích thích sự phát triển của chổi bên và hình thành rễ; kéo đài thân lá
bởi cơ chế kéo dài tế bào Auxin có vai trị trong biến đưỡng thứ cấp, ở những loài
thực vật khác nhau thì cảm ứng bởi những auxin khác nhau, ví dụ: để cẩm ứng tạo rễ và chổi tái sinh của Brassia rapai, NAA được xem như là một auxin có hiện quả
[66] Ở nhiều loài khác nhau AIB cũng được dùng để tạo rễ và tái sinh chổi [32] Trong quá trình biến dưỡng thứ cấp sự tác động của auxin cũng rất khác nhau,
Như trong quá trình sinh tổng hợp nicoũn 6 Nicotiana tabacum 134], tiên chất shikonin 6 Lithospermum erthrorhizon [61], va anthraqinon 6 Morinda citrifolia [77]
bi kim ham béi 2, 4 — D Trong trường hợp nuôi cấy dịch treo té bao cha Panax
ginseng dé thu nhận saponin khi cảm ứng các auxin khác nhau như 2, 4~ D, NAA,
AIA, IBA thì nhận thấy kết quả là chỉ có IAA là có thể đáp ứng được với sự tạo các
hợp chất thứ cấp là saponin ở mức cao nhất [35] Tuy nhiên, nếu sử dụng AlA Ở
nổng độ quá cao thì sự sản xuất saponin trong hệ thống nuôi cấy sẽ bị giảm Nhưng trong giai đoạn cắm ứng để tạo mô sẹo là vật liệu cho quá trình ni cấy thì loại
auxin su dung là 2, 4 —~ Ð
Sự hiện điện của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong môi trường nuôi
cấy địch treo tế bào, đặc biệt là auxin có một vai trị rất quan trọng, auxin kích thích
Trang 39số loài thực vật, sự tạo địch treo tế bào cần có sự kết hợp giữa một auxin và một
cytokinin Nhu su tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của lá khoai tây Solanum tuberosưm L cần có sự kết hợp giữa NAA và BA [19] Đôi khi sự duy trì địch treo tế bào có thể không cần thiết của sự hiện điện của các chất điểu hoà tăng trưởng
thực vật như trong trường hợp thuốc lá Nicotiana tabacum (Lee va Park, 1991) Các loài thực vật khác nhau có sự đáp ứng khác nhau với các nổng độ auxin
trong quá trình tạo dịch treo tế bào, có lồi chỉ cần một lượng auxin rất nhỏ dẫn đến
sự tăng trưởng của địch treo như Catharanthus roseus chi can 0,2mgA, trong khi ỗ
Solanum Iycopersicoides cần đến 2, 4 ~ Ð 15mg/l
92 Cytokinin
Tham gia vào quá trình tăng rộng của tế bào, phân chia và phát sinh hình thái tế bào, cần sự lão hoá (Salisbury, 1992)
Cytokinin kích thích sự tăng trưởng của tế bào với điều kiện có auxin Cytokinin tác động lên hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào
Cytokimin bắt nguồn từ N°-subtituted adenin [56] va được phát hiện cách đây
hơn 40 nim (Miller va cs., 1955) Trong nuôi cấy mô người ta thường ding zeatin
và một số hợp chất tổng hợp như kinetin BAP, TDZ Nước dừa (phần lỏng) được
dùng với nồng độ 10- 20% cũng là một nguồn cũng cap cytokinin [57]
Trong nuôi cấy tế bào các loại mô có ít sự hién dién cia cytokinin, auxin s€
kích thích sự phân đơi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng khơng có
sự phân vách, sự phân vách xây ra khi có lượng cytokinin ngoại sinh [13]
Cytokin có vai trị thúc đẩy sự phiên mã RNA và kích thích tổng hợp các
protein và các enzym đặc hiệu hoạt động trong các m6 xdc dinh (Anderson, 1975)
Trang 40-27-
pH của vách giống như cơ chế của auxin ở trụ hạ điệp cây mầm dưa chuột Cwcwmus
sativus L (Rayle va cs., 1982)
Đối với cắm ứng tao seo thi cytokinin giúp quá trình tạo seo hình thành nhanh
hơn Sử dụng auxin kết hợp với cytokinin giúp tạo chỗi (Profum và cs., 1985) Dùng
cytokinin ở nồng độ thấp (0,01g/) kết hợp với auxin 1,0 -5,0mg/1 có thể kích thích
tạo rễ [57]
Một vài quá trình sinh lý có thể bị ảnh hudng bdi cytokinin va liên quan đến
các thay đổi trong hàm lượng nội sinh (Mok, 1997) Chúng ảnh hưởng đến biểu hiện
gen ở phổ rộng trong nuôi cấy mô và các loại tế bào đáp ứng theo thời gian và cách phân chia tế bào, trong phân nhánh chổi, lão suy lá, sự phát triển diệp lục tố và
biến dưỡng dinh dưỡng [56]
Cytokinin có nhiều tác động khác nhau trong quá trình tổng hợp các hợp chất
thứ cấp Có lẽ cytokinin là dấu hiệu của quá trình biến dưỡng thứ cấp vì cytokinin
kích thích biệt hố tế bào, đây là điều kiện tiên quyết giúp sự tích luỹ alkaloid qua nhiều trường hợp [44] Kinetin có tác dụng làm gia tăng alkaloid tổng cộng trong cả
mô sẹo, thân và lá so với đối chứng ở cây Dautura stramonium [26], TDZ c6 ảnh
hưởng lên sự tạo, kéo đài và trăng trưởng rễ: so với đơi chứng thì khi bố sung TDZ vào
môi trường đã có NAA 3,0mg/l thì thấy ức chế mặc dù sứ dụng ở nổng độ thấp từ 0,05mg/1 đến TDZ 0,Img/l
9,3 Sự kết hợp giữa auxin va cytokinin
Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy với tỉ lệ nhất
định có vai trị trong sự biệt hố tạo mơ sẹo, hình thành cơ quan chổi, rễ cho từng