Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật vật liệu: Nghiên cứu tổng hợp hệ Nanogel Heparin Pnipam có khả năng mang thuốc chống ung thư

Do đó, các hướng nghiên cứu vận chuyển, nhả chậm thuốc đã được nghiên cứu và phát triển mạnh trong những năm gần đây, thay vì tổng hợp thuốc mới thì tập trung vào hướng chất mang nhả thu

Tính cấp thiết của đề tài

Trongthập kỷ qua, việc điều trị bệnh ung thư thường được biết đến với các phương pháp hóa trị hoặc xạ trị Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế, chẳng hạn như thời gian sống của bệnh nhân thường ngắn (dưới 1 năm), chất lượng cuộc sống cũng bị giảm vì các tác dụng phụ của thuốc trên tủy xương, gây thiếu máu và giảm sức đề kháng của cơ thể có thể dẫn đến nhiều bệnh nhiễm trùng và gây tử vong

Do đó, các hướng nghiên cứu vận chuyển, nhả chậm thuốc đã được nghiên cứu và phát triển mạnh trong những năm gần đây, thay vì tổng hợp thuốc mới thì tập trung vào hướng chất mang nhả thuốc nano nằm giảm tác dụng phụ của thuốc mà vẫn giữ được hiệu quả của thuốc, vì chất mang nano có thể dễ dàng di chuyển trong hệ tuần hoàn máu và sau đó lưu trữ ở vị trí khối u thông qua hiệu ứng tăng cường thẩm thấu và lưu trữ (EPR) [31] Trên cơ sở tham khảo nhiều công trình nghiên cứu về chất mang thuốc nhả chậm của các tác giả trong và ngoài nước, cùng với sự hỗ trợ, tư vấn từ PGS.TS Huỳnh Đại Phú và PGS.TS Trần Ngọc Quyển tác giả tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp hệ nanogel HEPARIN- PNIPAM có khả năng mang thuốc chống ung thư”

Mục tiêu của đề tài

Điều chế và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp nanogel nhạy nhiệt trên cơ sở copolymer Hep-PNIPAM Đánh giá khả năng mang và nhả chậm thuốc 5-Fluorouracil tiêu diệt tế bào ung thư.

Nội dung nghiên cứu

Hoạt hóa Hep với Cita bằng tác nhân ghép cặp carbodiimide EDC/NHS và khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Hep/Cita, thời gian phản ứng đến độ chuyển hóa bằng phương pháp phân tích 1 H-NMR

Khử liên kết disulfide trên Hep-Cita để tạo thành Hep-SH bằng chất khử 2ME và khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất khử, thời gian phản ứng đến độ chuyển hóa bằng phương pháp phân tích 1 H-NMR

Ghép PNIPAM vào Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM và khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Cita/PNIPAM, thời gian phản ứng đến độ chuyển hóa bằng phương pháp phân tích 1 H-NMR

Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại để đánh giá cấu trúc, hình thái và kích thước copolymer tổng hợp

Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên hệ copolymer Hep-PNIPAM để tạo thành hệ nanogel chứa thuốc Đánh giá lượng thuốc 5-FU mang trên copolymer/nanogel và khả năng nhả chậm của thuốc.

Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại để xác định cấu trúc, hình thái và kích thước hạt nanogel như:

- Sử dụng phổ 1 H-NMR để đánh giá độ chuyển hóa của các phản ứng tổng hợp copolymer

- Sử dụng phương pháp đo IR để xác định các loại dao động đặc trưng của các liên kết trong sản phẩm được tạo thành

- Hình thái và kích thước nanogels được đánh giá bởi kính hiển vi truyền qua (TEM) và (DLS)

- Sử dụng phương pháp đo GPC để xác định khối lượng phân tử trung bình của copolymer tổng hợp

- Đánh giá khả năng mang và nhả chậm thuốc bởi phổ tử ngoại và khả kiến (UV-Vis)

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Các nghiên cứu của nanogel nhạy nhiệt trên cơ sở Hep-PNIPAM có thể góp phần đưa ra hệ chất dẫn truyền hiệu quả các loại thuốc kém tan là cơ sở cho các nghiên cứu xa hơn trong điều trị ung thư

Trong tương lai, nghiên cứu này có cái nhìn sâu hơn vào các vật liệu y sinh tiềm năng mới để tăng cường việc dẫn truyền hiệu quả của thuốc vào các tế bào ung thư để giảm liều lượng, tác dụng phụ của thuốc.

TỔNG QUAN

Tổng quan về bệnh ung thư

1.1.1 Định nghĩa bệnh ung thư

Ung thư (cancer) là tên dùng chung để mô tả một nhóm các bệnh phản ảnh những sự thay đổi về sinh sản, tăng trưởng và chức năng của tế bào Các tế bào bình thường trở nên bất thường (đột biến) và tăng sinh một cách không kiểm soát, xâm lấn các mô ở gần (xâm lấn cục bộ) hay ở xa (di căn) qua hệ thống bạch huyết hay mạch máu Di căn là nguyên nhân gây tử vong chính của ung thư (International Agency for Research on Cancer, 2014)

Hình 1.1: Nguyên nhân gây ung thư (International Agency for Research on

Ung thư xuất phát từ một tế bào đơn lẻ, đơn vị cơ bản của sự sống Sự chuyển dạng từ một tế bào bình thường thành một tế bào ung thư là một quá trình nhiều giai đoạn, từ một tổn thương tiền ung thư đến khối u ác tình Những thay đổi này là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của một người và ba loại tác nhân bên ngoài, bao gồm:

- Các tác nhân sinh ung vật lý, như tia cực tím và bức xạ ion hóa;

- Các tác nhân sinh ung hóa học, như a-mi-ăng (asbestos), các thành phần của khói thuốc lá, aflatoxin (một chất nhiễm bẩn thức ăn), và arsenic (một chất nhiễm bẩn nước uống)

- Các tác nhân sinh ung sinh học, như nhiễm trùng một số virus, vi khuẩn hay ký sinh trùng

1.1.2 Các tính chất đặc trưng của tế bào ung thư

Tế bào ác tính thường có các đặc điểm sau: Tránh được việc già rồi chết theo tiến trình, có khả năng phát triển vô hạn, tự cung cấp các yếu tố phát triển, không nhạy cảm đối với các yếu tố chống tăng sinh, tốc độ phân bào gia tăng, thay đổi khả năng biệt hóa tế bào, không có khả năng ức chế tiếp xúc, khả năng xâm lấn mô xung quanh, khả năng di căn đến nơi xa, khả năng tăng sinh mạch máu, có nhiệt độ cao hơn và pH thấp hơn tế bào thường

Mô ung thư có hình ảnh đặc biệt dưới kính hiển vi Các đặc điểm nổi bật có thể thấy là một số lớn các tế bào phân chia, thay đổi hình dạng và kích thước nhân, thay đổi hình dạng và kích thước tế bào, mất các đặc điểm chuyên biệt của tế bào, mất cấu trúc mô bình thường, và ranh giới của khối u không rõ

Hình 1.2: Hình thái tổ chức của mô bình thường đến khi phát triển thành khối u

1.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư hiện nay

Ung thư có thể được điều trị bằng phẫu thuật, hóa trị liệu, xạ trị liệu, miễn dịch trị liệu (tăng cường hệ miễn dịch), ức chế nội tiết tố, kiểm soát triệu chứng hay các phương pháp khác Việc chọn lựa phương pháp điều trị phụ thuộc vào vị trí và độ (grade) của khối u, giai đoạn của bệnh, cũng như tổng trạng của bệnh nhân Một số điều trị ung thư thực nghiệm cũng đang được phát triển

Các loại thuốc điều trị ung thư có nhiều nhược điểm, để khắc phục các nhược điểm trên thì việc tổng hợp và nghiên cứu chất mang ở kích thước nano để mang thuốc đến đích là mục tiêu của các nhà khoa học hiện tại Do đó, trong những năm gần đây các nhà khoa học đã phát triển việc nạp thuốc hóa trị liệu dưới dạng hạt nano có thể giúp giảm các tác dụng phụ và tăng khả năng hòa tan để có thể đưa thuốc trực tiếp vào các khối u góp phần tăng sinh khả dụng của thuốc Viện ung thư Quốc Gia (NCI) đã xác định tiềm năng công nghệ nano là tác động thay đổi mô hình vào việc phát hiện, điều trị và phòng ngừa ung thư, một lĩnh vực mà công nghệ nano thực hiện phân phối thuốc.

Tổng quan về công nghệ nano trong y dược

1.2.1 Khái niệm về công nghệ nano

Công nghệ nano là một bước tiến vượt bậc, nó cho phép con người tạo ra những vật liệu mới với những tính năng tưởng chừng như không thể Nó tham gia và tạo sự đột phá trong nhiều ngành công nghiệp quan trọng như: điện, hóa học, mỹ phẩm, nhựa, cơ khí chế tạo, dược phẩm… Những sản phẩm của công nghệ nano đã ngày càng xuất hiện thường xuyên Để hiểu rõ khái niệm vật liệu nano, chúng ta cần biết hai khái niệm có liên quan là khoa học nano (nanoscience) và công nghệ nano (nanotechnology) Theo Viện hàn lâm hoàng gia Anh quốc:

Khoa học nano (nanoscience): là ngành khoa học nghiên cứu về các hiện tượng và vận dụng vào các vật liệu tại các quy mô nguyên tử, phân tử và đại phân tử Tại các quy mô đó, tính chất của vật liệu khác hẳn với tính chất của chúng tại các quy mô lớn hơn [7]

Công nghệ nano ( nanotechnology ): là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước của các hạt và vật liệu trên quy mô từ 1 đến 100 nanomet (1 nm = 10 -9 m) [7]

Vật liệu nano: đối tượng của hai lĩnh vực khoa học và công nghệ nano, nó liên kết hai lĩnh vực trên với nhau Kích thước của vật liệu nano từ 0,1 nm đến 100 nm

Kích thước nano: Nano (viết tắt n) là một tiền tố được viết liền trước một đơn vị đo lường quốc tế để chỉ đơn vị nhỏ gấp 10 9 hay 1.000.000.000 lần

1 nanomet = 1 mét / 1.000.000.000 = 10 -9 mét Độ lớn này được công nhận năm 1960 Thuật ngữ nano (có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp nanos) dùng để chỉ một phần tỉ lệ của vật nào đó Nanomét là một phần tỉ của mét tức là có kích cỡ khoảng 10 nguyên tử hydrogen [7]

1.2.2 Các loại hạt nano dẫn truyền thuốc

Phần lớn các thuốc chống ung thư gây độc với cả tế bào bệnh lẫn tế bào lành

Hơn nữa, các dược chất này nhanh chóng bị miễn nhiễm bởi các tế bào ung thư

Việc đưa hóa trị liệu vào trong cơ thể có tế bào ung thư thì làm tăng khả năng điều trị bệnh nhưng không làm giảm các tác dụng phụ của thuốc mang lại vì vậy kết hợp hóa trị liệu với chất mang vận chuyển thuốc nhằm giải quyết các vấn đề trên

Sử dụng hệ chất mang thuốc trên cơ sở hạt kích thước nano có thể giảm thiểu các tác dụng phụ, tăng độ hòa tan, kéo dài thời gian tồn tại của thuốc trong hệ tuần hoàn máu, và tăng hiệu quả điều trị của nhiều loại thuốc, các hệ chất mang thuốc này đã được cải tiến so với thế hệ cũ làm cho chúng có khả năng hướng đích, kiểm soát phát hành thuốc tại tế bào ung thư dựa trên sự khác nhau về đặc điểm sinh học giữa các tế bào ung thư và tế bào lành, và đặc biệt làm cho tế bào ung thư mất khả năng kháng thuốc Hơn thế nữa, các hệ mang thuốc này còn có thể mang các loại thuốc thế hệ mới như gene, protein, peptide phát hiện sớm tế bào [18] Một số hạt nano dẫn truyền thuốc tiêu biểu:

Khái niệm dendrimer được Donald A Tomalia và cộng sự đưa ra đầu tiên vào năm 1985 Dendrimer được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa là nhánh cây Từ đó đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc, tính chất, phương pháp tổng hợp và ứng dụng của dendrimer trong nhiều lĩnh vực khác nhau [18]

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử dendrimer [33]

Baker và cộng sự cho rằng dendrimer nhắm mục tiêu vào khối u mạch máu bằng cách sử dụng một polyamidoamine methotrexate- (PAMAM) với các ligand nhắm mục tiêu nhỏ Dendrimer có thể giúp giảm độc tính bằng cách ngăn ngừa sự tiếp xúc giữa các nhóm amin proton thiết bị đầu cuối với màng tế bào ức chế khối u phát triển, và thời gian tồn tại lâu hơn so với sử dụng thuốc ở liều lượng bằng nhau [30] Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Ngọc Quyển giới thiệu phương pháp cải tiến trong đó dạng hydrate cisplatin được tạo phức với dendrimer Kết quả cho thấy sử dụng siêu âm có thể giảm 95% thời gian để tạo phức giữa hydrate cisplatin với dendrimer và hiệu suất mang cisplatin tăng 10% so với các nghiên cứu của nhiều nhóm công bố trước đó Hệ chất mang nano dendrimer-cisplatin có hoạt tính cao trong tiêu diệt tế bào ung thư phổi [31]

Hình 1.4: Nano dendrimer – cisplatin và nhả chậm cisplatin hydrate để liên kết vào tế bào DNA của tế bào ung thư [31]

Hình 1.5: Cấu trúc hóa lý của hạt nanogel phân phối thuốc [18]

Nanogel gây sự chú ý với sự vận chuyển thuốc và các hoạt chất sinh học, quá trình vận chuyển thuốc vào trong cơ thể mang hiệu suất cao và vận chuyển nhiều loại thuốc ung thư Việc phân phối thuốc và các hạt nano polymer với polyethylene glycol (1990 và 1994) làm tăng thời gian lưu thông, duy trì thời gian điều trị hiệu quả, giảm thiệt hại cho các tế bào khỏe mạnh và giảm thiểu thời gian phục hồi…

Tại mô ung thư, sự phát triển của tế bào ung thư đòi hỏi sự tăng sinh mạch máu, các vi mạch máu mới được hình thành tại các mô ung thư và có kích thước lên đến vài trăm nanomet Do đó, với kích thước nhỏ khi biến tính với một số polymer tương hợp sinh học, nên khả năng khuếch tán của chất mang thuốc đến vùng mô tập trung các tế bào ung thư nhanh và khá dễ dàng Mặt khác với kích thước nói trên, chất mang thuốc này còn tải được hầu hết các loại thuốc đang điều trị nhiều loại ung thư hiện nay [18]

Hệ thống cấp độ nano phân phối thuốc đầu tiên là các lipid được mô tả đầu tiên vào năm 1960 và sau này gọi là liposome Kể từ đó, đã có một số phát triển quan trọng mở đường cho công nghệ nano hiện tại [18]

Lipid tạo thành một lớp kép dựa trên tương tác kỵ nước trong màng liên tục với các nhóm đầu ưa nước Các phân tử ưa nước có thể được gói gọn trong pha nước bên trong màng trong khi các phân tử kỵ nước có thể được thực hiện nhiệm vụ của màng lipid Tính chất hóa lý của các liposome có thể được thay đổi để kiểm soát bề mặt và kích thước bằng cách trộn các phân tử lipid thương mại Liposome mang lại nhiều lợi ích như phân phối thuốc

Ngoài ra bề mặt vỏ liposome được thiết kế với thành phần hóa học thích hợp sao cho hạt biết tránh các tế bào khỏe mạnh không phải là mục tiêu tấn công mà chỉ có thể tác dụng với tế bào ung thư và nhả thuốc khi gặp môi trường có nhiệt độ và pH nhất định Tuy nhiên, túi lipid còn một số hạn chế khác như sự bất ổn trong máu, hòa tan kém của nhiều loại thuốc trong dung dịch lipid / bề mặt, liposome có tác dụng phụ nghiêm trọng do tích lũy của liposome trong mô da Trong khi động học vận chuyển thuốc kéo dài rất khó để kiểm soát liposome [18]

1.2.2.4 Nano silica cấu trúc rỗng

Nano silica là silica dạng hạt với kích thước dưới 100nm Silica tổng hợp không có ở dạng tinh thể và thường được tạo ra ở dạng bột Các mạch polymer hấp thụ trên bề mặt silica cũng làm giảm tính ưu nước của silica, ghép mạch polymer vào hạt nano silica là một phương pháp có hiệu quả để tăng tính kị nước và tương tác của hạt nanosilica với polymer nền

Hình 1.7 : Hạt nanosilica cấu trúc rỗng [32]

Phương pháp tiếp cận tế bào ung thư của các chất mang nano trong điều trị

Sử dụng chất mang nano là một trong những giải pháp hiệu quả nhất vì nhiều kết quả thử nghiệm đã chỉ ra rằng thuốc khi được nang hóa trong các hệ chất mang nano thì kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu và tích lũy nhiều trong khối u ung thư vì chất mang nano có thể dễ dàng tuần hoàn trong máu và sau đó lưu trú ở vị trí khối u thông qua hiệu ứng tăng cường thẩm thấu và lưu trữ (EPR) Hiệu ứng này bắt nguồn từ sự khác nhau giữa mạch máu ở mô thường và mô ung thư [18]

Thẩm thấu là sự di chuyển của các phân tử nanogel mang thuốc ở những màng mỏng mà nanogel có thể thấm qua được Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến dược động học của các hạt nano như: điện tích bề mặt, kích thước, hình dạng hạt nano và các đặc tính tàng hình là một trong những yếu tố quan trọng nhất Ở đây tính thẩm thấu của các phân tử nanogel mang thuốc có thể thấm qua các khối u và các tế bào thường Dựa vào tính thẩm thấu thì các hạt nanogel sẽ đi vào khối u nhưng không vào các mô khỏe mạnh, do đó tăng tính chọn lọc của các loại thuốc sử dụng [18]

1.3.2 Hiệu ứng EPR Để tăng tính đặc hiệu của một loại thuốc cho các khối u so với các tế bào thường thì sự vận chuyển của các hạt nano thông qua tính tăng cường thẩm thấu và lưu trữ, hiệu ứng EPR trong tế bào là do sự khác biệt giữa các mạch máu xung quanh mô ung thư và mô thường, tế bào ung thư có nhiệt độ cao hơn so với tế bào thường [18] Ngoài ra quá trình trao đổi chất của tế bào ung thư mạnh hơn tế bào thường, vùng mô của tế bào ung thư làm tăng cường phát triển mạch máu và có pH thấp hơn tế bào thường Có 2 cách chất mang nano vận chuyển thuốc:

1.3.2.1 Vận chuyển thụ động dựa vào hiệu ứng EPR

Sự vận chuyển thụ động xuất phát từ hiện tượng tăng tính thấm và tăng hiệu quả lưu giữ đặc trưng ở các mô ung thư Tại hầu hết các mô khoẻ mạnh, kích thước các khe hở lớp nội mô thành mạch máu thường nhỏ hơn 2 nm Phân tử thuốc vẫn có thể lọt qua các khe hở này làm hại tế bào lành Tuy nhiên chất mang thuốc nano với kích thước 10-100 nm thì không lọt qua được các khe hở này để gây độc cho tế bào lành Còn tại mô ung thư, do sự phát triển của tế bào ung thư đòi hỏi sự tăng sinh mạch máu, các vi mạch máu mới được hình thành tại các mô ung thư có kích thước lớn từ 100 nm đến 800 nm Do đó các phức hợp chất mang thuốc tồn tại trong tuần hoàn máu có thể vượt qua dễ dàng và đi vào mô ung thư Hơn nữa, sau khi xâm nhập vào, các phức hợp này sẽ tập trung ở dịch gian bào bao quanh các tế bào ung thư bởi 2 yếu tố: không gian và áp suất thẩm thấu lớn hơn tại các khe giữa ở các tế bào ung thư so với ở các tế bào bình thường Các phức hợp chất mang-thuốc sau khi đã đi vào các khe hở tế bào này sẽ bị kẹt giữ lại khi các tế bào ung thư phát triển

Thêm vào đó, do không có hệ bạch huyết cần thiết, tốc độ đào thải các phức hợp này ra khỏi mô ung thư là rất hạn chế [18]

Hiệu ứng EPR cho phép các hạt nano nhắm mục tiêu thụ động đến các khối u do sự bất thường trong mạch máu của khối u Kích thước nhỏ của các hạt nano cho phép chúng lưu thông trong một thời gian dài và tích lũy vào mô khối u thông qua mạch máu khối u bị rò rỉ Mạch máu bị rò rỉ tăng tính thấm thành mạch trong các khối u, cho phép các hạt nano thẩm thấu qua mạch lên đến 400 nm Khi gặp các khối u thì các hạt nano tự nhả thuốc, lúc này thuốc sẽ thực hiện chức năng của mình [18]

Hình 1.8: Quá trình "nhắm mục tiêu thụ động" thông qua tăng cường khả năng thẩm thấu và tác dụng duy trì (EPR) [29]

1.3.2.2 Vận chuyển chủ động đến tế bào ung thư

Ligand nhắm mục tiêu trên bề mặt của các hạt nano có thể liên kết với các thụ thể trên tế bào ác tính dẫn đến phân phối thuốc Có hai phương pháp phổ biến cho vận chuyển chủ động tiếp cận tế bào ung thư

 Phương pháp tiếp cận đầu tiên này là để nhắm mục tiêu vi mô khối u, bao gồm tế bào ngoại bào hoặc bề mặt tiếp nhận trên tế bào nội mô mạch máu của khối u [18]

Hình 1.9: Quá trình “Nhắm mục tiêu chủ động”của các hạt nano đến tế bào ung thư [18]

 Phương pháp thứ hai là để nhắm mục tiêu các thụ thể bề mặt tế bào khối u trong tế bào.Các ligand trên bề mặt của các hạt nano có thể liên kết với các thụ thể trên tế bào nội mô dẫn đến phân phối thuốc trên nội mô và chống sự hình thành mạch [2]

Hình 1.10 : Quá trình “ nhắm mục tiêu chủ động” các hạt nano phân phối thuốc trên nội mô và chống sự hình thành mạch [18]

Chất mang thuốc nanogel hoạt động theo tính chất của mô ung thư nên mới hấp dẫn được các tế bào mang bệnh Tại hầu hết các mô khỏe mạnh, kích thước các khe hở lớp nội mô thành mạch máu thường nhỏ hơn 2 nanomét Các khe hở này quá nhỏ so với kích thước của hầu hết các chất mang nanogel [18] Các hạt nanogel sau khi thực hiện xong nhiệm vụ của mình thì được chuyển hóa và loại bỏ khỏi cơ thể thông qua con đường trao đổi chất bình thường [18].

Tổng quan về nanogel nhạy nhiệt

1.4.1 Tính chất của nanogel nhạy nhiệt

Các nanogel nhạy nhiệt được nghiên cứu đầu tiên là các polymer đáp ứng nhiệt trong nghiên cứu hệ dẫn thuốc Các nanogel đó có thể trương hoặc nhả trương khi có sự thay đổi nhiệt độ ở môi trường xung quanh Các polymer dạng nanogel nhạy nhiệt như PNIPAM, methyl cellulose, pluronic, tetronic, và N-vinyl caprolactam, được đặc trưng bởi nhiệt chuyển pha sol-gel phụ thuộc nhiệt độ, tương đương với nhiệt độ hòa tan giới hạn dưới (LCST), và bằng nhiệt độ chuyển pha gel- sol, Tp- nhiệt độ hòa tan giới hạn trên (UCST) tương đương với nhiệt độ hóa rắn của gel [15]

Các nanogel nhạy nhiệt âm có một điểm LCST, chúng có thể được định nghĩa như nhiệt độ giới hạn dưới mà polymer trương trong dung dịch trong khi trên nhiệt độ đó thì polymer co lại (ngược lại với trạng thái trương) Thấp hơn điểm LCST, giới hạn entanpi, liên quan đến liên kết hydro giữa polymer và phân tử nước, giữ vai trò làm cho polymer trương Khi nhiệt độ tăng lên cao hơn điểm LCST, giới hạn entanpi (tương tác kỵ nước) chiếm ưu thế hơn, làm cho polymer bị co lại Hiệu quả quá trình tạo liên kết hydro phụ thuộc vào nhiệt độ âm; trên điểm LCST, các liên kết hydro giữa các nhóm monome dư và các phân tử nước, chúng làm tăng sự phá vỡ khi tăng nhiệt độ Mạch chính của polymer, chuỗi dài của các liên kết C-C mà chuỗi nhánh được gắn vào là kỵ nước và có xu hướng làm giảm diện tích bề mặt của chúng với các phân tử có tính phân cực cao Nguyên nhân là do sự hình thành các khối kết hợp như hình dưới đây [1]

Khi các liên kết hydro giữa các nhóm phụ và nước xuất hiện, quá trình tập hợp lại của mạch chính sẽ tránh được vì các tương tác liên kết hydro với các phân tử nước là mạnh hơn các tương tác của mạch chính Khi các liên kết hydro bị phá vỡ bởi nhiệt độ tăng, quá trình gộp lại diễn ra là do sự co của các nanogel nhạy nhiệt khi nhiệt độ tăng [25]

Hình 1.11: Mạch chính của nanogel nhạy nhiệt [16]

(a) quá trình polymer bị trương, b) các polymer gộp lại

Các copolymer phân hủy sinh học trên cơ sở PNIPAM, Poly acrylamide , poly dimethyl acrylamide, hoặc copolymer khối trên cơ sở poly etylen glycol và poly propylene glycol được sử dụng như các chất mang thuốc, bao gồm cấu trúc mạng lưới không gian ba chiều ở dạng polymer nhạy nhiệt được đưa ra Copolymer ưa nước-kị nước thuận nghịch nhiệt bao gồm các đơn vị cấu trúc xuất phát từ ít nhất một monomer được lựa chọn từ N-n-propylacrylamide, NIPAM và N,N- dietylacrylamide và các chất hoạt động bề mặt được tổng hợp bởi Ito [38]

1.4.2 Ưu điểm vượt trội của nanogel nhạy nhiệt ứng dụng trong y sinh

Các nanogel nhạy nhiệt nói riêng và các nanogel thông minh nói chung có đặc tính trương và nhả trương do đó chúng được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, công nghệ sinh học, y học như là thành phần giữ nước cho đất trồng trọt, sản xuất vật liệu siêu thấm, chất trao đổi ion, làm mỹ phầm [3, 5, 8, 13] Đặc biệt trong đó là ứng dụng trong y học

Hình 1.12 Cơ chế nhả thuốc của nanogel nhạy nhiệt [16]

Poloxame dưới dạng nanogel nhạy nhiệt có thể được áp dụng để tăng hiệu quả của thuốc chữa mắt Để giảm nồng độ của polymer và để có nhiệt độ chuyển pha cao hơn nhiệt độ phòng (25 o C) và gel hóa ở nhiệt độ màng (35 o C), kết hợp các đồng phân pluronic hoặc bổ sung các polymer khác như: polyethylene glycol, polyacrylic acid, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose [16]

Poloxame cũng có thể dùng để dẫn thuốc trực tràng: Hiện nay những loại thuốc đưa vào trực tràng có các dạng: chất lỏng, nửa rắn (thuốc mỡ, kem, bọt) và thuốc rắn dưới dạng viên nén dài Các viên nén dài thường gây khó khăn khi đặt thuốc, hơn nữa trong trực tràng các viên nén khó được cố định ở vị trí cần thiết, một trong số đó có thể di chuyển lên ruột và làm cho chúng bị ảnh hưởng [16]

Các nhà nghiên cứu đã phát triển những viên thuốc nén lỏng mới với nhiệt độ tạo gel là 30-36 o C Poloxame 407 và poloxame 188 đã được ứng dụng để làm cho gel có đặc tính nhạy nhiệt Các polymer keo dán sinh học được sử dụng để điều biến độ bền của gel và lực kéo dãn sinh học [11]

Các nanogel nhạy nhiệt còn có thể được sử dụng làm hệ phân phát thuốc ngoài đường tiêu hóa, đặt thuốc vào hệ dẫn sau đó tiêm hay ghép nó vào tế bào cơ thể như nanogel nhạy nhiệt thuận nghịch tổng hợp từ các poloxam Một số nanogel nhạy nhiệt cũng có thể được sử dụng để chữa các bệnh ngoài đường tiêu hóa

Copolymer Regel- (PLGA-PEG-PLGA) đã được sử dụng như một chất mang thuốc để nhả insulin cho cơ thể Sau khi tiêm vào da, lượng insulin tiết ra đã đạt được độ ổn định trong 15 ngày B.Jeong và cộng sự đã đưa ra quá trình tổng hợp nanogel có khả năng phân huỷ sinh học polyetylen oxide) và poly L- lactic acid tồn tại ở dạng sol khi nhiệt độ cao (xấp xỉ 45 o C) và tạo thành dạng gel khi được tiêm vào cơ thể

A.Chenite cũng đã phát triển một nanogel nhạy nhiệt mới có liên kết của chitosan và muối polyol, đưa vào gel cấy ghép khi tiêm Các tác giả dự đoán đây có thể là chất đầu để tạo ra một loạt các gel đóng rắn nhiệt mới có khả năng tương hợp sinh học cao với các hợp chất sinh học Nanogel được tạo thành từ xyloglucan được coi như một tá dược của quá trình nhả có kiểm soát mitomycin trong cơ thể [16]

Trong số các nanogel nhạy nhiệt có ý nghĩa quan trọng trong y học là các polymer của acrylamit và dẫn xuất của nó như poly(N-isopropylacrylamide) Những polymer chứa liên kết peptid này thường được khảo sát khả năng nhả thuốc với các đối tuợng cũng chứa liên kết peptit khác như albumin hay insulin do chúng có khả năng tương hợp sinh học cao [4]

1.4.3 Các tương tác tạo nanogel

Liên kết ngang vật lý trong nanogel có thể được tạo thành nhờ nhiều yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, lực ion…và một loạt các tương tác hóa lý khác như tương tác kỵ nước, tương tác ion, liên kết hydro…[37]

Các phân tử polymer có chứa một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước có thể được tạo thành bằng phản ứng trùng hợp hoặc bằng cách trực tiếp tạo ra một khối copolymer Các phân tử polymer này có thể hòa tan trong nước ở nhiệt độ thấp Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng, phần kỵ nước có xu hướng xoay vào trong để giảm thiểu diện tích bề mặt tiếp xúc trực tiếp với nước Nhiệt độ mà tại đó xảy ra hiện tượng gel hóa phụ thuộc vào nồng độ của các polymer, độ dài đầu kỵ nước và cấu trúc hóa học của polymer [37]

Hình 1.13 : Tương tác kỵ nước [37]

Tương tác tĩnh điện đã được nghiên cứu rộng rãi để tạo liên kết ngang trong quá trình gel hóa Một lợi thế của phương pháp này là sự phân hủy sinh học có thể xảy ra như sự phân ly ion trong ngoại bào, phá vỡ mạng lưới liên kết ngang [37]

Tình hình nghiên cứu các hệ nanogel dẫn truyền thuốc

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 2011 nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Ngọc Quyển (ở Hàn Quốc) đã tổng hợp thành công chất mang nanogel âm điện-nhạy nhiệt trên cơ sở heparin để mang nhả chậm các protein điện tích dương hoặc các tác nhân kích thích phát triển sinh học nhằm ứng dụng trong y sinh

Năm 2011, N.Sanoj Rejinold và cộng sựđã công bố nghiên cứu tổng hợp nano chitosan-g-poly (N-vinylcaprolactam) nhạy nhiệt để mang 5-FU Hiệu suất mang thuốc của vật liệu là 43% [34]

Hình 1.16: Tải thuốc 5-FU lên nano chitosan-g-poly (N-vinylcaprolactam) nhạy nhiệt [34]

Năm 2012, Liu và cộng sự đã công bố copolymer heparin-polyethyleneimine mang HSulf-1 gene tăng cường hoạt tính kháng ung thư cổ tử cung khi điều trị kết hợp với cisplatin [36]

Hình 1.17: Phản ứng tổng hợp nanogel HPEI giữa heparinvà PEI2K khi xúc tác bởi EDC / NHS [36]

Năm 2012, Yoon Ki Joung và cộng sự đã công bố 1 hệ chất mang nanogel trên cơ sở Heparin-Pluronic (Hep-Pr) mang hai loại thuốc là paclitaxel và DNas

Kết quả cho thấy khả năng gây độc tế bào cao hơn so với sử dụng đơn thuốc, đây là một chiến lược đầy hứa hẹn cho sự kết hợp 2 loại thuốc để nâng cao hiệu quả điều trị ung thư [41]

Hình 1.18: Sơ đồ sự hình thành nanogel Heparin-Pluronic mang 2 loại thuốc

Năm 2013, Libi Rutkin & Mohamed Badran đã công bố sử dụng alginate, một polysaccharide phân lập từ tảo nâu Để tạo ra các hydrogel, các cation hóa trị hai khác nhau như canxi…tăng khả năng hòa tan trong hệ thống phân phối thuốc

Năm 2013, Xin Wei và cộng sự đã tổng hợp thành công hệ nanogel trên cơ sở cholesteryl – HA (CHA) mang các loại thuốc (etoposide, salinomycin, và curcumin) để nhắm mục tiêu và ức chế khối u hiệu quả Các hạt nanogel nhỏ với đường kính 20– 40nm có hiệu suất tải thuốc lên tới 20% [40]

Hình 1.19: Các bước tổng hợp nanogel cholesteryl – HA [40]

Năm 2014, Wei wu và cộng sự đã tổng hợp thành công nanogel trên cơ sở Heparin với kích thước 80-200 nm để mang thuốc Doxorubicin (DOX) Hiệu suất mang thuốc của vật liệu đạt 30% Kết quả thử nghiệm trên khối u của chuột cho thấy nanogel HEP DOX có sự tích lũy đáng kể 9,3% ID / g DOX trong khối u [43]

Hình 1.20: Sơ đồ quá trình điều chế nanogel Heparin [43]

Năm 2015, Ishita Matai, and P Gopinath đã công bố 1 hệ nano dendrimer trên cơ sở Alginate (AG) và G5.0 poly(amidoamine) (PAMAM) phân phối hiệu quả thuốc chống ung thư Epirubicin (EPI) trên tế bào ung thư vú (MCF-7) [20]

Hình 1.21: Các bước tổng hợp nanogel AG-G5mang thuốc EPI [20]

Năm 2016, Dipankar Das và cộng sự đã công bố hệ nanogel [n-Dxt-p (lactide)] được tổng hợp từ dextrin và poly (lactide) mang hiệu quả thuốc doxorubicin hydroclorid (DOX) với hiệu suất tải 28,26 ± 0,20% và cho thấy độc tính cao đối với tế bào ung thư MG63 [14]

Hình 1.22: Các bước tổng hợp nanogel n-Dxt-p (lactide) [14]

Một số công trình nghiên cứu khác của nước ngoài đã chỉ ra rằng các loại thuốc chống ung thư (Camptothecin, 6-Mercaptopurin, Methotrexate, Adriamycin,

5- 34 Fluorouracil, Doxorubicin và Paclitaxel) khi được bao bọc trong chất mang nano làm tăng đáng kể độ tan, khả năng lưu trữ và hoạt tính chống ung thư của thuốc

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Bắt đầu từ năm 2007, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa,

Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện khoa học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh được xem là đơn vị đầu tiên nghiên cứu tổng hợp dendrimer với nhiều dạng khác nhau

Năm 2009, Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Huỳnh Đại Phú đã có công bố về việc sử dụng poly (β-amino este) (PAE) liên hợp với copolymer triblock nhạy nhiệt/pH (PCL-PEG-PCL) hoặc (PACL-PEG-PCLA) để tổng hợp hydrolgel nhằm phân phối và kiểm soát thuốc/protein [9]

Hình 1.23: Các bước tổng hợp pentablock copolymer PAE-PCLA-PEG-PCLA-

Từ năm 2010-2013, nhóm tác giả Nguyễn Cửu Khoa cũng cho thấy dendrimer ở thế hệ chẵn (với các nhóm amine trên bề mặt) có độc tính với tế bào cao hơn so với dendrimer thế hệ lẻ (với các nhóm chức ester trên bề mặt) Điều này có thể giải thích bởi nhóm amine tích điện dương nên có thể tạo liên kết tốt hơn với màng tế bào (tích điện âm) và gây độc cho tế bào bởi điện tích dương trên bề mặt của chúng

Năm 2013, PGS.TS Lê Mai Hương và TS Hà Phương Thư công bố trên

Journal of nanomaterials 1 hệ thuốc nano gồm phức bis(menthone thiosemicarbazonato) Platinum(II) được bao bọc trong block copolymer polylactide-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (PLA-TPGS) Nghiên cứu đặc tính của hạt nano này bao gồm hình thái bề mặt, phân bố kích thước, cấu trúc và hoạt tính sinh học trong trị liệu (Ha Phuong Thu, Phan Thi Hong Tuyet,Mai Thi Thu Trang , 2013)

Năm 2013-2014, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Ngọc Quyển cũng có 1 vài công bố trên các tạp chí ISI về các hạt nano dendrimer mang thuốc chống ung thư 5-fluouroacil và cisplatin Trong đó chất mang nano pegylated dendrimer đã vận chuyển và nhả chậm hiệu quả thuốc 5-fluoroacil tiêu diệt tế bào ung thư vú và khối u trên chuột Kết quả nghiên cứu được công bố trên tạp chí có uy tín về Công nghệ Nano Y Sinh (J Biomed Nanotech, IF 5.3)

Trong những năm gần đây phòng vật liệu Hóa dược - Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã nghiên cứu và chế tạo ra một số hệ nano mang thuốc điều trị ung thư như dendrimer, nanogel, liposome, miclles Các hệ mang thuốc này còn có thể mang các loại thuốc thế hệ mới như gene, porotein, peptide và các loại maker phát hiện sớm tế bào Với định hướng trên, nhiều nghiên cứu sơ khởi về hệ chất mang thuốc nano đã được công bố trên nhiều tạp chí ISI Một số công trình nghiên cứu của phòng như tổng hợp hệ chất mang nano carboxylated dendrimer mang hiệu quả cisplatin tiêu diệt tế bào ung thư phổi, hệ chất mang nano nhạy nhiệt mang hiệu quả thuốc ưa nước và kỵ nước, hệ chất mang nhả chậm protein và heparin nhạy với điều kiện sinh lý nội bào…

Hình 1.24: Hệ chất mang nhả chậm protein và heparin nhạy với điều kiện sinh lý nội bào

Tổng quan về các polymer sinh học Heparin, PNIPAM và thuốc chống ung thư 5-Fluorouracil

Heparin đuợc tìm thấy trong các hạt của các dưỡng bào (mast cells) và các tế bào bạch cầu đa nhân ái kiềm của động vật có vú Việc khám phá ra hoạt tính chống đông của heparin vào năm 1916 là do công của 2 người: Jay McLean khi đó đang là một sinh viên y khoa năm thứ 2 và thầy hướng dẫn của McLean là William Henry Howell Heparin được trích ly từ mô gan của chó thí nghiệm, do đó nó đã được Howell đặt tên là heparin (hepar tiếng Hy Lạp có nghĩa là gan) Heparin dùng trong y khoa được trích ly từ màng nhày ruột heo hoặc bò [19]

Hình 1.25 : Mô hình phân tử Heparin

Heparin là một hỗn hợp không đồng nhất những chuỗi mucopolysaccharide có chiều dài rất khác nhau (do đó có trọng lượng phân tử rất khác nhau, từ 3.000 đến 30.000 Da, trung bình 15.000 Da) Khối lượng phân tử trung bình của hầu hết các chế phẩm Heparin thương mại nằm trong khoảng 12.000 - 15.000 Da Về cấu tạo Heparin tương đối phức tạp, gồm (75-95%) đơn vị trisulfateddisaccharide lặp đi lặp lại (hình1.26a), bằng liên kết 1-4 glicozit (axit 2-O-sulfo--L-iduronic liên kết 14 với 6-O-sulfo-N-sulfo--D-glucosamine( 4] IdoA2S (14) GlcNS6S [1

) Ngoài ra, trong cấu trúc phân tử Heparincũng có thêm một số cấu trúc disaccharide nhỏ khác tương ứng với trình tự thay đổi (hình1.26b).[19]

Hình 1.26 Khung cơ bản của phân tử Heparin Đơn vị chính (a) và đơn vị thay đổi (b) với là X là SO 3 - hoặc H, Y là SO 3 - hoặc

Heparin là một trong những polymer sinh học đang được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi trên thế giới Nhiều nghiên cứu cho thấy Heparin có nhiều hoạt động sinh học hữu ích trên các khối u chống ung thư, chống tăng sinh mạch máu (đóng góp của giảm tăng trưởng khối u), điều tiết miễn dịch, kháng viêm, chống đông và chất chống oxy hóa (K Senthilkumar và et al năm 2013; K Park và cộng sự, 2014) Do vậy Heparin được sử dụng kết hợp với các loại thuốc để hỗ trợ việc điều trị ung thư Bên cạnh đó Heparin cũng có tác dụng ức chế một số loại tế bào ung thư

Heparin thể hiện tác dụng chống đông với sự tham gia của một protein có trong huyết tương là antithrombin, gọi tắt là AT (tên gọi tắt trước đây là AT III)

Phân tử Heparin đóng vai trò như một trạm để AT và yếu tố đông máu kết hợp với nhau Sau khi kết hợp với AT, yếu tố đông máu bị bất hoạt hóa Phức hợp AT-yếu tố đông máu tách rời khỏi phân tử Heparin nhường chỗ cho sự tạo thành những phức hợp mới, do đó một phân tử Heparin có thể bất hoạt hóa nhiều yếu tố đông máu Với sự tham gia của AT, Heparin bất hoạt hóa các yếu tố đông máu sau : IIa, IXa, Xa, XIa và XIIa Heparin ức chế đường đông máu hoạt hóa tiếp xúc do bất hoạt hóa XIa và XIIa và ức chế đường đông máu yếu tố mô do bất hoạt hóa IXa, Xa

(a) (b) và IIa Vị trí gắn của AT trên phân tử Heparin là một chuỗi pentasaccharide đặc hiệu Chỉ có khoảng 1/3 các chuỗi mucopolysaccharide của Heparin không phân đoạn có pentasaccharide đặc hiệu này Các chuỗi không có pentasaccharide đặc hiệu có hoạt tính chống đông rất thấp khi heparin được dùng ở liều trị liệu Ngày nay, pentasaccharide đặc hiệu này đã được tách rời ra thành thuốc chống đông fondaparinux

Heparin không hấp thu khi được dùng đường uống, thuốc chỉ có thể dùng đường tĩnh mạch hoặc tiêm dưới da Sau khi được tiêm vào cơ thể, một phần Heparin gắn vào các protein trong huyết tương (ngoài AT), các đại thực bào và các tế bào nội mô Do đó, dù là dùng đường tĩnh mạch hoặc tiêm dưới cũng cần cho một liều nạp để bão hòa các vị trí gắn này.Thời gian bán loại thải của Heparin tùy thuộc liều dùng Ở liều trị liệu, Heparin được loại thải chủ yếu trong đại thực bào và tế bào nội mô (do khử polymer) Ở liều cao, Heparin được thải thêm qua đường thận

Heparin có 2 tác dụng phụ chính chảy máu và giảm tiểu cầu, Heparin còn có thể gây loãng xương (khi dùng kéo dài), rụng tóc lông, hoại tử da và phản ứng dị ứng (rất hiếm gặp)

Các hydrogel nguồn gốc PNIPAM và dẫn xuất đã được nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau từ công nghiệp dệt, xử lý môi trường đến vật liệu mang thuốc nhả chậm do bản chất tương hợp sinh học và khả năng đáp ứng lại với các kích thích môi trường bên ngoài như nhiệt độ, pH, cường lực ion

PNIPAM cũng như các đồng polymer của nó có thể được tổng hợp từ monome N- isopropylacrylamide (NIPA) thông qua các quá trình trùng hợp hóa học

Hình 1.27 Cấu tạo của monomer để tổng hợp polymer nhạy nhiệt PNIPAM [16]

Tính chất của chúng có thể dễ dàng được sửa đổi bằng cách điều chỉnh điều kiện trùng hợp, hàm lượng các chất xúc tác, chất khơi mào, tác nhân chuyển mạch polymer, chất điều chỉnh tốc độ phản ứng trùng hợp cũng như thành phần và tỷ lệ các monomer được đưa vào Sự đặc biệt của PNIPAM dựa trên LCST nằm ở giữa nhiệt độ cơ thể và nhiệt độ phòng (LCST ~ 32 °) làm cho nó rất thú vị cho các ứng dụng y sinh học (Vihola et a., 2005)

Hình 1.28: Cấu trúc phân tử của PNIPAM(maleimide -Poly (N- isopropylacrylamide)

Hình 1.29: Tính chất tách pha phụ thuộc cân bằng giữa các nhóm kị nước và ưa nước [16] Ở nhiệt độ thấp, liên kết hydro giữa các đoạn ưa nước của mạch polyme và các phân tử nước chiếm ưu thế làm tăng quá trình hòa tan trong nước Khi nhiệt độ tăng, tương tác kỵ nước giữa các đoạn kỵ nước được củng cố trong khi liên kết hydro bị suy yếu Kết quả làm co polymer do tập hợp giữa các mạch polymer qua tương tác kỵ nước Nói chung, thành phần kỵ nước trong mạch polymer càng cao thì nhiệt độ LCST càng thấp Bởi vậy, LCST có thể thay đổi nhờ điều chỉnh tỷ lệ các đoạn ưa nước và kỵ nước của polymer Đối với trường hợp hydrogel PNIPAM, với sự có mặt của các tác nhân liên kết chéo, polymer thể hiện tính chất không gian ba chiều, M Constantin đã chứng minh được nhiệt độ chuyển thể tích pha hoàn toàn trùng với điểm LCST [26]

Hình 1.30: Liên kết hydro của nước với PNIPAM a) ở nhiệt độ dưới LCST, b) ở nhiệt độ trên LCST – PNIPAM là hoàn toàn mất nước và không tan trong nước [16]

Là một polymer ưa nước điển hình, PNIPAM có khả năng hấp thụ một lượng nước nhất định để tạo thành vật liệu gel ưa nước trong những điều kiện nhất định

Về cấu trúc hóa học, phân tử PNIPAM chứa cả các nhóm ưa nước và kỵ nước

Trong môi trường chứa nước, các phần ưa nước và kỵ nước này có thể tự sắp xếp để đạt được hình dạng khác nhau theo sự thay đổi nhiệt độ dung dịch Khi nhiệt độ dung dịch tăng cao hơn nhiệt độ dung dịch tới hạn cận dưới (Low critical solution temperature – LCST) của nó, chuỗi polymer chuyển từ dạng cuộn xoắn thành dạng cầu và bị kết tủa ở nhiệt độ cao Khi gia nhiệt trong nước trên 32 o C PNIPAM chuyển từ trạng thái ngậm nước trương lên thành trạng thái mất nước co lại và mất khoảng 90% trọng lượng đồng thời nhả ra lượng chất lỏng sinh học ở nhiệt độ gần của cơ thể người Do đó PNIPAM đã được nghiên cứu bởi nhiều nhà khoa học cho các ứng dụng có thể có trong kỹ thuật mô và kiểm soát phân phối

Hình 1.31: Sự thay đổi hình dạng của PNIPAM theo sự thay đổi của nhiệt độ

Nhiều loại thuốc chống ung thư được nghiên cứu mang bởi nanogel như Doxorubicin, Methotrexat, Paclitaxel, 5- Flourouracil, Cisplatin,…Trong đề tài này tác giả sử dụng 5-Fluorouracil (5-FU) là một trong những loại thuốc phổ biến được sử dụng để điều trị ung thư từ năm 1958, bao gồm ung thư vú, đại trực tràng, dạ dày, tuyến tụy, ung thư da, nó thường được sử dụng như loại thuốc hóa trị.5-FU giảm sự phát triển của khối u thông qua sự ức chế không thể đảo ngược trong quá trình tổng hợp DNA Cũng như các thuốc trị ung thư khác, 5-FU cũng gây ra nhiều tác động bên như đau đầu, ngứa, rát, viêm da và tổn thương hệ thần kinh trung ương [33]

Hình 1.32: Cấu trúc phân tử 5FU

5-FU là một chất tương tự uracil với một nguyên tử flo tại vị trí C5 Cơ chế xâm nhập vào tế bào của 5-FU tương tự như uracil 5-FU bị biến đổi nội bào qua quá trình trao đổi chất: fluorodeoxyuridine monophosphate (FdUMP), fluorodeoxyuridine triphosphate (FdUTP) và fluoroudine triphosphate (FUTP) ngăn chặn quá trình tổng hợp RNA và TS

Ý nghĩa của việc sử dụng hệ nanogel Hep-PNIPAM làm chất mang thuốc

Liệu pháp hóa trị là một trong ít phương pháp điều trị hiệu quả căn bệnh ung thư Trong quá trình hóa trị, hoạt chất phá vỡ các tế bào phát triển nhanh (tế bào ung thư) nhưng đồng thời cũng phá vỡ các tế bào lành và gây ra những phản ứng phụ không mong đợi Đó là hạn chế lớn của liệu pháp này Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới đang cố gắng tìm những giải pháp mới nhằm nâng cao hiệu lực của thuốc và giảm tác động phụ của quá trình chữa bệnh, đặc biệt là đối với bệnh ung thư Đó là ý tưởng làm sao dẫn được thuốc tới trực tiếp tế bào ung thư và bảo vệ các tế bào lành của cơ thể

Việc sử dụng các phân tử kích thước nano trong lĩnh vực phân phối thuốc cũng mang lại rất nhiều lợi thế so với công nghệ hóa trị đang được sử dụng Ngoài tác dụng mang thuốc, phân phối thuốc và giải phóng thuốc có kiểm soát, kết quả là giảm hiệu ứng phụ, giảm độ độc với cơ thể, các hệ nang hóa thuốc nano còn có khả năng nang hóa thuốc hướng tới đích là các tế bào bệnh [39] Đồ thị trên hình 1.35 biểu diễn nồng độ của thuốc có trong máu thông qua các phương pháp sử dụng thuốc khác nhau: Thuốc uống (a); Thuốc được tiêm qua tĩnh mạch (b) và Thuốc giải phóng chậm từ chất mang (c) [17]

Kết quả nghiên cứu cho thấy: nồng độ thuốc trong máu của phương pháp uống thuốc (a) sẽ tăng lên từ từ, có lúc vượt qua ngưỡng cho phép, rồi lại hạ xuống ngưỡng cho phép; nồng độ thuốc được tiêm qua đường tĩnh mạch (b) thì ngay lập tức đã ở trên ngưỡng độc, sau đó giảm nhanh; còn thuốc giải phóng chậm có nồng độ trong máu (c) tăng từ từ và luôn trong giới hạn cho phép Đồ thị cho thấy thời gian có hiệu lực của thuốc giải phóng chậm dài hơn nhiều so với các loại thuốc uống hay tiêm thông thường [33] Do đó phương pháp sử dụng hệ dẫn thuốc giải phóng chậm có kiểm soát mang đến rất nhiều lợi thế so với các phương pháp sử dụng thuốc truyền thống như tăng hiệu lực của thuốc, giảm độ độc của thuốc, giảm tác dụng phụ và tạo sự thuận tiện cho người bệnh

Hình 1.35: Nồng độ thuốc trong máu tương ứng với các phương pháp sử dụng thuốc: a) Thuốc uống; b) Thuốc được tiêm qua tĩnh mạch và c) Thuốc giải phóng chậm từ chất mang.[33]

Copolymer nhạy nhiệt trên cơ sở Heparin - PNIPAM được tận dụng nhằm điều chế các hạt nanogel để mang hiệu quả thuốc chống ung thư mang điện tích dương dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các nhóm tích điện âm, sulfate (-SO3-) và carboxylate (-COO-) có trên sường của Heparin Dung dịch copolymer giúp tăng độ hòa tan của thuốc chống ung thư và hình thành của các hạt nanogel có thể mang thuốc khi nhiệt độ tăng hơn 32 0 C.Hơn nữa, PNIPAM là một loại polymer nhạy nhiệt, nó được sử dụng trong phân phối thuốc bởi vì việc phát hành kiểm soát các loại thuốc bằng cách điều chỉnh nhiệt độ dung dịch tới hạn thấp (LCST) của PNIPAM Sự xuất hiện của PNIPAM trong copolymer có thể mang thêm một loại thuốc chống ung thư kém hòa tan khác (5-FU) vì PNIPAMcó chứa các phân đoạn kỵ nước cho nên khi nhiệt độ tăng lên, sự tương tác kỵ nước được thành lập để đóng gói các loại thuốc bên trong

Hình 1.36: Quá trình hình thành nanogel mang thuốc 5-FU dưới tác động của nhiệt độ

THỰC NGHIỆM

Hóa chất thiết bị và dụng cụ

Bảng 2.1: Danh sách các hóa chất sử dụng

STT Hóa chất Khối lượng phân tử (g/mol) Nguồn gốc

2 Poly(N-isopropylacrylamide) maleimide terminated (PNIPAM) 5.500 Acros Organics 3 Cystamine dihydrochloride (Cita) 225,2 Acros Organics

- Bình cầu, ống đong, pipet, cá từ, giấy đo pH, bình tam giác, cốc thủy tinh

- Túi thẩm tách Spectra Por Regenerated Cellulose Membrane MWCO 35005000 Da, 60008000 Da, 120004000 Da và các dụng cụ khác

- Cân điện tử - HADAM AEP-250G (4 số lẻ) - Máy khuấy từ gia nhiệt hiện số Thermo SP131320-33 (50-1200v/p), Mỹ, - Máy đo pH HI2211

- Máy đông khô chân không FDU-2100 Eyela, Nhật Bản, đông khô ở -800C, tại Viện Công nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,

- Quan sát hình thái, kích thước mẫu (TEM) được chụp bằng máy JEOL JEM 1400 ở 140 KV, Nhật Bản, Trường Đại học Bách Khoa, TP.HCM

- Phân tích quang phổ hồng ngoại FT-IR trên máy Equinox 55 Bruker, Đức, tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Sắc ký gel GPC Đo bằng máy Agilent 1260, Hoa Kỳ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, TP.HCM

- Kích thước hạt và thế zenta được xác định dựa trên nguyên lý tán xạ ánh sáng động học (DLS) – Đại Học Cần Thơ

- Máy đo UV-Vis, Evolution 300 , ThermoF, Trường Đại Học Lạc Hồng

- Phổ 1 H-NMR đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500, được thực hiện bằng cách sử dụng D2O làm dung môi ở tần số 500 MHz, Viện Khoa học Vật liệu Hà Nội.

Tiến hành thí nghiệm

2.2.1 Tổng hợp copolymer Hep-PNIPAM

Giai đoạn 1: Gắn Cystamine lên Heparin

Hình 2.1: Quy trình gắn Cystamine lên Heparin

Cân Heparin (20mg) cho vào bình cầu chứa 10ml nước cất, khuấy tan ở nhiệt độ phòng Sau đó thêm NHS (10 mg) và EDC (4l) vào khuấy trong 15 phút

Hòa tan lượng Cita cần thiết với 10ml nước cất Tiếp tục nhỏ giọt Cita vào bình cầu để thực hiện phản ứng Sau đó, thẩm tách bằng màng có kích thước 60008000 MWCO trong 4 ngày bằng nước

Hình 2.2: Phản ứng tổng hợp Hep-Cita

 Phân tích:Lấy 1 ít mẫu đi đo phổ 1 H-NMR để thiết lập công thức tính độ chuyển hóa

Giai đoạn 2: Khử liên kết disulfide trên Hep-Cita để tạo thành Hep-SH

Hình 2.3: Quy trình khử liên kết disulfide trên Hep-Cita để tạo thành Hep-SH Thuyết minh quy trình

Thêm 2-ME vào dung dịch Hep-Cita để thực hiện phản ứng Sau đó, thẩm tách bằng màng có kích thước 60008000 MWCO trong 4 ngày bằng nước (pH 45)

Hình 2.4: Mô hình phân tử Hep-SH

Hình 2.5: Quá trình thẩm tách mẫu Hep-SH bằng màng 6000  8000 MWCO (a),

Sản phẩm Hep-SH sau khi đông khô (b)

 Phân tích:Lấy 1 ít mẫu đi đo phổ 1 H-NMR để thiết lập công thức tính độ chuyển hóa

Giai đoạn 3: Gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM

Hình 2.6: Quy trình gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-

Thẩm tách Đông khô PNIPAM

PNIPAM được thêm vào dung dịch Hep-SH để thực hiện phản ứng Sản phẩm thu được đem đi thẩm tách bằng màng có kích thước 12.00014.000 MWCO trong 4 ngày bằng nước Cuối cùng lấy mẫu thẩm tách xong đem đi đông khô Sản phẩm thu được ở dạng bột có màu trắng mịn

Hình 2.7: Phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-

Hình 2.8: Hệ phản ứng Hep-SH với PNIPAM (a), Sản phẩm Hep-PNIPAM sau khi đông khô (b)

-Lấy 1 ít mẫu đi đo phổ 1 H-NMR để thiết lập công thức tính độ chuyển hóa

-Phân tích TEM, FT-IR, GPC, DLS để xác định hình dạng và cấu trúc copolymer sau khi tổng hợp

2.2.2 Nang hóa thuốc 5-fluorouracil lên copolymer Hep-PNIPAM để tạo thành hệ nanogel chứa thuốc

Hình 2.9: Quy trình ghép thuốc 5-FU lên copolymer Hep-PNIPAM Thuyết minh quy trình

Hòa tan 100 mg Hep-PNIPAM vào 10 ml nước cất Sau đó hòa tan 120 mg

5-fluorouracil vào bình cầu chứa Hep-PNIPAM và khuấy đều trong vòng 24 giờ

Sản phẩm thu được đem thẩm tách bằng màng có kích thước 3500÷5000 MWCO trong nước ấm ở 37 0 C, tiến hành 3 lần, mỗi lần 20 phút để loại bỏ lượng thuốc không nang hóa vào được trong hệ chất mang nanogel Hep-PNIPAM

2.2.3 Khảo sát khả năng nhả chậm thuốc

 Chuẩn bị dung dịch đệm ABS

Cân 136g CH3COONa và 25ml Glacial Acid Acetic hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 500ml dung dịch Chỉnh pH= 5.5 bằng dung dịch acid acetiec 0,1M

 Khảo sát quá trình nhả thuốc

Mẫu Hep-PNIPAM đã mang thuốc 5-FU được sử dụng để khảo sát quá trình nhả thuốc Cách thực hiện như sau:

Màng 35005000 MWCO 3 lần (20 phút/lần)

Khuấy Thẩm tách 10ml Nước

Hình 2.10: Quy trình khảo sát khả năng giải phóng thuốc 5-FU của nanogel

Hep-PNIPAM Thuyết minh quy trình

Trích 3 ml dung dịch mang thuốc (Hep-PNIPAM-5FU) cho vào màng thẩm tách 30003500 MWCO tiến hành thẩm tách trong 10 ml đệm ABS ở nhiệt độ 37 0 C Để xác định lượng 5-FU được giải phóng ra ta tiến hành lấy mẫu nước thẩm tách bên ngoài màng Sau 1h lấy 10ml để xác định lượng thuốc nhả ra sau đó thay thế bằng lượng tương đương ABS là 10 ml vào mỗi ống

Quá trình tương tự lặp lại sau 2h, 3h, 7h, 10h, 24h, 48h, 72h Hàm lượng thuốc được phóng thích ra môi trường được xác định bằng phương pháp đo UV-Vis

Hình 2.11: Mẫu thẩm tách để đánh giá khả năng nhả chậm thuốc

Thẩm tách 5FU/10ml đệm ABS

1 10ml sau mỗi thời gian 2 Thêm 10ml đệm ABS

Nhiệt độ: 37 o C 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ 7 giờ, 10 giờ, 24 giờ 48 giờ, 72 giờ

Các phương pháp phân tích và đánh giá

Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại để xác định cấu trúc, hình thái và kích thước hạt nanogel như:

 Đánh giá cấu trúc copolymer ghép được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp phân tích hiện đại, được sử dụng rộng rãi để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ Phương pháp này cho phép đọc các thông tin tính hiệu từ các nguyên tử và cấu trúc lập thể từ đó chuyển chúng thành các phổ tương quan Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hiện diện của các đồng vị tự nhiên của hydro và carbon, từ đó mà có phổ NMR của 1 H và 13 C (Phan Thị Cẩm Tú, 2014)

Hình 2.12: Máy đo phổ NMR (Phan Thị Cẩm Tú, 2014)

 Đánh giá cấu trúc copolymer ghép được bằng phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR)

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) là một trong những kỹ thuật phân tích rất hiệu quả Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: Các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hơp chất hoá học dao động với nhều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại.Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ hồng ngoại vượt lên trên những phương pháp phân tích cấu trúc khác là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp (Nguyễn Hữu Đình, Trần Thị Đà, 1999)

Hình 2.13: Máy đo phổ hồng ngoại IR(Nguyễn Hữu Đình, Trần Thị Đà, 1999)

 Xác định kích thước hạt nanogels bằng phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua ( TEM- Transmission Electron Microscopy)

TEM là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm tia điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số… (Phan Thị Cẩm Tú, 2014)

Hình 2.14: Kính hiển vi điện tử truyền qua (Phan Thị Cẩm Tú, 2014)

 Xác định kích thước hạt nanogels và thế zenta bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động học (DLS)

DLS cung cấp một phương pháp đơn giản và nhanh chóng cho xác định cỡ hạt nhỏ hơn micromet Là một phương pháp phân tích linh hoạt để phân loại những đặc tính vật lý của những hạt nhỏ Phụ thuộc vào cấu hình và ứng dụng, hệ có thể được sử dụng như một thiết bị đo hạt, đo thế zeta, khối lượng phân tử MW,… Dựa vào đặc tớnh vật lý của hệ mẫu, dải hạt đo được từ 0.3 nm – 8 àm Giới hạn dưới bị ảnh hưởng bởi nồng độ, mẫu tán xạ mạnh hay yếu, và sự có mặt của một số hạt kích thước lớn không mong muốn Giới hạn trên bị ảnh hưởng bởi mật độ của hạt vì DLS được tính toán dựa trên chuyển động Brownian, không phụ thuộc vào trọng lượng hạt Điện tích trên bề mặt hạt được phân loại bằng phương pháp đo thế zeta trong mẫu huyền phù Mẫu được tiêm vào cell dùng một lần và kết quả đo thế zeta được tính từ thế điện di di động của hệ hạt Thế zeta của mẫu được sử dụng nhiều nhất để xác định độ ổn định của hệ Giá trị thế Zeta lớn chỉ ra rằng các hạt tích điện lớn và hệ có xu hướng bền vững (Berne, B.J and Pecora, R., 2000)

Hình 2.15 Máy tán xạ ánh sáng động học (DLS) (Berne, B.J and Pecora, R ,

 Đánh giá khối lượng phân tử trung bình copolymer bằng phương pháp đo sắc ký thẩm thấu Gel (GPC)

GPC (Gel permeation chromatograply) là một kỹ thuật phân tích thường được sử dụng trong lĩnh vực polymer để xác định trọng lượng phân tử tương đối của mẫu polymer cũng như sự phân bố trọng lượng phân tử Khác với các kỹ thuật tách khác mà phụ thuộc vào sự tương tác hóa học hoặc vật lý để chất phân tích riêng biệt, GPC phân cách dựa vào kích thước hoặc khối lượng thủy động lực học của các chất phân tích

Hình 2.16: Máy đo sắc ký lọc Gel (GPC)

 Khảo sát khả năng nhả chậm thuốc bằng phương pháp phổ tử ngoại và khả kiến (UV-Vis)

Phương pháp phổ tử ngoại và khả kiến viết tắt là UV-Vis (Ultraviolet- Visible) là phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ Vùng bức xạ được sử dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóng khoảng từ 200 đến 800nm Hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ tuân theo định luật Bouger - Lam bert - Beer

Hình 2.17 Máy quang phổ UV-Vis (Phòng thí nghiệm Hóa Dược – Khoa Dược

Trường Đại Học Lạc Hồng)

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới độ chuyển hóa của phản ứng hoạt hóa Hep-Cita

3.1.1 Phân tích cấu trúc và thiết lập công thức tính độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep dựa trên 1 H-NMR

Hình 3.1: Phổ 1 H-NMR của Hep-Cita được tổng hợp với tỷ lệ mol Hep/Cita=1/5, nhiệt độ 0 o C, thời gian $ giờ

Hình 3.1 cho thấy phổ 1 H-NMR của Hep-Cita trong đó sự xuất hiện của các tín hiệu cộng hưởng đã chỉ ra các proton H1 của polysaccharide trong Hep xuất hiện tại vị trí δ = 5,100 ppm-5,450 ppm Các tín hiệu cộng hưởng của proton H khác của polysaccharide trong Hep cũng xuất hiện tại δ = 3,100 ppm- 4,510 ppm Tín hiệu ở vị trí δ = 2,870 ppm (a) và δ = 3,030 ppm (b) đại diện cho các proton H của nhóm (- CH2-CH2-) trong phân tử Cita Một mũi cao duy nhất ở vị trí δ = 2,010 ppm đại diện cho proton của nhóm acetyl (COCH3) trong mạch phân tử của Hep

 Công thức tính độ chuyển hóa, ta dựa vào phổ 1 H NMR như sau [39]:

Trong đó: x% : Độ chuyển hóa

S H(-CH2-) (a) , S H(-COCH3) : Lần lượt là diện tích tích phân của peak a và peak acetyl CH3

H(-CH2-) (a): Tổng số proton của nhóm –CH2 tại vị trí (a) trên Cita

H(-COCH3): Tổng số proton của nhóm –COCH3 trên mạch phân tử Hep

S H(H1Hep) : Diện tích tích phân của proton H1 trên mạch phân tử Hep

 𝐻(𝐻1𝐻𝑒𝑝) : Tổng số proton của H1 trên mạch phân tử Hep (5×7 = 35 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑜𝑛)

3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ Hep/Cita đến độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Hep/Cita tới độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep Quá trình thực hiện được tiến hành với cùng khối lượng Hep (20mg; 0,0016mmol), thể tích EDC (4 l; 0,022 mmol), khối lượng NHS (10 mg, 0,087mmol), tại nhiệt độ 30 o C, thời gian phản ứng 24 giờ Tỷ lệ mol Hep/Cita được thay đổi từ (1/2) đến (1/15) Các thông số thực nghiệm và độ chuyển hóa được thống kê ở bảng sau:

Bảng 3.1: Độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep theo tỷ lệ mol

Hep/Cita tại nhiệt độ 30 o C, thời gian phản ứng 24 giờ

Tỷ lệ Hep/Cita (mol/mol) m Hep (mg) m Cita (mg)

Gía trị 1 H NMR Gía trị lý thuyết Độ chuyển hóa (%) S H

Dựa trên bảng 3.1 ta xây dựng biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng như sau:

Hình 3.2: Biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep theo tỷ lệ mol

Kết quả trên hình 3.2 cho thấy rằng, khi tăng tỷ lệ Hep/Cita thì độ chuyển hóa của phản ứng tăng Cụ thể độ chuyển hóa tăng lần lượt từ tỷ lệ Hep/Cita là 1/2 (51,39%), 1/5 (55,76%), 1/10 (64,20%), nhưng khi tỷ lệ Hep/Cita = 1/15 thì độ chuyển hóa giảm (57,40%) Kết quả trên cho thấy độ chuyển hóa của tỷ lệ Hep/Cita

= 1/10 khá cao vì các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy khi sử dụng tác nhân ghép cặp EDC/NHS thì chỉ đạt độ chuyển hóa cao nhất vào khoảng 60-70%

Từ đó, tác giả chọn độ chuyển hóa tối ưu là 64,20% tương ứng với tỷ lệ Hep/Cita 1/10 cho khảo sát tiếp theo

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep Quá trình thực hiện được tiến hành với cùng tỷ lệ mol Hep/Cita = 1/10 tương ứng với khối lượng Hep (20mg; 0,0016mmol), khối lượng Cita (3,75 mg, 0,0166mmol), thể tích EDC (4 l; 0,022 mmol), khối lượng NHS (10 mg, 0,087mmol), tại nhiệt độ 30 o C Thời gian phản ứng được thay đổi từ 18 giờ đến 30 giờ Các thông số thực nghiệm và độ chuyển hóa được thống kê ở bảng sau:

Tỷ lệ Hep/Cita (mol/mol)

Bảng 3.2: Độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep theo thời gian phản ứng tại nhiệt độ 30 o C, tỷ lệ Hep/Cita=1/10

(giờ) m Hep (mg) m Cita (mg)

Gía trị 1 H NMR Gía trị lý thuyết Độ chuyển hóa (%) S H

Dựa trên bảng 3.2 ta xây dựng biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng như sau:

Hình 3.3: Biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep theo thời gian phản ứng

Kết quả trên hình 3.3 cho thấy rằng, khi tăng thời gian phản ứng thì độ chuyển hóa của phản ứng tăng Cụ thể độ chuyển hóa tăng lần lượt từ thời gian phản ứng 18 giờ (44,40%), 24 giờ (64,20%), 30 giờ (65,70%) Tuy nhiên, giữa 30 giờ so với 24 giờ thì thời gian phản ứng kéo dài hơn nhưng độ chuyển hóa lại tăng lên không đáng kể Vì vậy, thời gian tối ưu cho phản ứng này là 24h và tác giả chọn thời gian này để tiếp tục cho khảo sát tiếp theo

Thời gian phản ứng (giờ)

3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến độ chuyển hóa của phản ứng gắn Cita lên Hep

Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR của Hep-Cita được tổng hợp với tỷ lệ mol Hep/Cita=1/10, nhiệt độ @ o C, thời gian $ giờ

Kết quả phổ 1 H NMR cho thấy rằng khi tăng nhiệt độ lên trên 40 o C thì nhóm (-CH2-CH2-) của Cita bị dịch chuyển về vùng từ trường thấp hơn với tín hiệu cộng hưởng ở vị trí δ = 3,030 ppm (a) và δ = 3,380 ppm (b) Điều này có thể giải thích được vì phân tử Cita dễ bị oxy hóa ở nhiệt độ cao [22] Do vậy, các khảo sát tiếp theo đều được thực hiện tại nhiệt độ 30 o C

 Phản ứng gắn Cita lên Hep đạt được độ chuyển hóa tối ưu với tỷ lệ mol Hep/Cita = 1/10, thời gian phản ứng $ giờ và nhiệt độ 0 o C.

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-SH với chất khử 2ME

3.2.1 Phân tích cấu trúc và thiết lập công thức tính độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita với chất khử 2ME dựa trên 1 H NMR

Hình 3.5: Phổ 1 H-NMR của Hep-SHđược tổng hợp với tỷ lệ mol Cita/2ME=1/2, nhiệt độ 0 o C, thời gian $ giờ

Hình 3.5 cho thấy phổ 1 H-NMR của Hep-SH với vị trí các đỉnh hấp thu tương tự như phổ 1 H-NMR của Hep-Cita Trong đó, sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng các proton H của polysaccharide trong Hepcũng xuất hiện tương tự tại vị trí δ = 5,100 ppm-5,450 ppm và δ = 3,100 ppm- 4,510 ppm trên phổ đồ, tín hiệu proton của nhóm acety (COCH3) cũng xuất hiện 1 mũi cao duy nhất tại vị trí δ = 1,999 ppm Tuy nhiên, tín hiệu proton của nhóm (-CH2-CH2-) trong phân tử Cita khi bị khử liên kết S-S chỉ xuất hiện 1 tín hiệu tại vị trí δ = 2,850 ppm (a), tín hiệu tại δ 3,030 ppm (b) chỉ xuất hiện 1 tín hiệu rất thấp của nhóm (-CH2-CH2-) trong phân tử Cita khi chưa bị khử liên kết [21] Dựa vào đặc điểm này ta có thiết lập công thức tính độ chuyển hóa của phản ứng

 Công thức tính độ chuyển hóa, ta dựa vào phổ 1 H NMR như sau:

Trong đó : y% : Độ chuyển hóa

S H(a) , S H(b) : Lần lượt là diện tích tích phân của peak a và btrên phổ 1 H-NMR của Hep-SH

3.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khử 2-ME đến độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-SH Để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất khử 2ME tới độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-SH Quá trình thực hiện được tiến hành với giai đoạn hoạt hóa Hep-Cita có cùng tỷ lệ Hep/Cita = 1/10, thời gian phản ứng 24 giờ, nhiệt độ = 30 o C Giai đoạn thêm chất khử 2ME được cố định tại thời gian phản ứng 24 giờ, nhiệt độ 30 o C và tỷ lệ mol giữa Cita/2ME được thay đổi từ 1/2, 1/3, 1/4 Các thông số thực nghiệm và độ chuyển hóa được thống kê ở bảng sau:

Bảng 3.3: Độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-SH với chất khử 2ME theo tỷ lệ mol Cita/2MEtại nhiệt độ 30 o C, thời gian phản ứng 24 giờ

Gía trị 1 H NMR Độ chuyển hóa (%) S H (CH 2 ) (a) S H ( CH 2 ) (b)

Dựa trên bảng 3.3 ta xây dựng biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng như sau:

Hình 3.6: Biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-

SH với chất khử 2-ME theo tỷ lệ mol Cita/2ME

Kết quả trên hình 3.6 cho thấy rằng, khi tăng hàm lượng 2ME thì độ chuyển hóa của phản ứng tăng Cụ thể độ chuyển hóa tăng lần lượt từ tỷ lệ Cita/2ME là 1/2 (72,46%), 1/3 (90,47) và khi tỷ lệ là 1/4 thì tín hiệu ở peak (b) không còn xuất hiện nữa, chứng tỏ độ chuyển hóa đạt tối ưu 100% Từ kết quả trên, tác giả chọn tỷ lệ

Cita/2ME = 1/4 cho khảo sát tiếp theo

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-SH Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-SH Quá trình thực hiện được tiến hành với giai đoạn hoạt hóa Hep-Cita cùng tỷ lệ Hep/Cita = 1/10, thời gian phản ứng = 24 giờ, nhiệt độ = 30 o C Giai đoạn thêm chất khử 2ME được cố định với tỷ lệ mol giữa Cita/2ME = 1/4, nhiệt độ 30 o C và thời gian phản ứng được thay đổi từ 12 giờ đến 24 giờ Các thông số thực nghiệm và độ chuyển hóa được thống kê ở bảng sau:

Tỷ lệ Cita/2Me (mol/mol)

Bảng 3.4: Độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-SH với chất Khử 2ME theo thời gian phản ứng tại nhiệt độ 30 o C, tỷ lệ Cita/2ME=1/4

Gía trị 1 H NMR Độ chuyển hóa (%) S H (CH 2 ) (a) S H ( CH 2 ) (b)

Dựa trên bảng 3.4 ta xây dựng biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng như sau:

Hình 3.7: Biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-

SH với chất khử 2-ME theo thời gian phản ứng

Kết quả trên hình 3.7 cho thấy rằng, khi tăng thời gian phản ứng thì độ chuyển hóa tăng Cụ thể là ở thời gian 12 giờ thì vẫn còn tín hiệu của peak (b) xuất hiện và chỉ đạt độ chuyển hóa là (81,91%), nhưng khi tăng thời gian phản ứng lên 18 giờ và 24 giờ thì tín hiệu ở peak (b) không còn xuất hiện nữa, chứng tỏ độ chuyển hóa đạt tối đa 100% Từ kết quả trên, tác giả chọn thời gian phản ứng tối ưu là 18 giờ và tiếp tục cho khảo sát tiếp theo

 Phản ứng khử Hep-Cita để tạo thành Hep-SH với chất khử 2ME đạt được độ chuyển hóa tối ưu với tỷ lệ mol Cita/2ME = 1/4, thời gian phản ứng = 18giờ

Thời gian phản ứng (giờ)

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới độ chuyển hóa của phản ứng gắn

3.3.1 Phân tích cấu trúc và thiết lập công thức tính độ chuyển hóa của phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM dựa trên 1 H NMR

Hình 3.8: Phổ 1 H-NMR của copolymer Hep-PNIPAMđược tổng hợp với tỷ lệ mol

Cita/PNIPAM=1/1, nhiệt độ 0 o C, thời gian $ giờ

Hình 3.8 cho thấy phổ 1 H-NMR của copolymer Hep-PNIPAM trong đó ngoài các tín hiệu của mạch phân tử Hep thì các tín hiệu cộng hưởng của PNIPAM cũng xuất hiện rõ ràng trong phổ Một đỉnh cao duy nhất ở vị trí δ = 1,115 ppm đại diện cho proton của nhóm (-CH3) trong mạch phân tử PNIPAM Các tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm (-CH2-) trong PNIPAM xuất hiện tại các vị trí (f) δ = 2,790 ppm, (e) δ = 2,630 ppm, (c) δ = 1,820 ppm - 2,190 ppm và (d) δ = 1,280 ppm - 1,680 ppm Một đỉnh cao duy nhất ở vị trí δ = 3,870 ppm (b) đại diện cho proton của nhóm ((CH3)2-CH-NH-) trong PNIPAM Tín hiệu cộng hưởng (g) trong khoảng δ = 3.359 ppm đại diện cho proton (-CH2) trong vòng thơm của PNIPAM đã chỉ ra liên kết giữa PNIPAM và Hep-SH

 Công thức tính độ chuyển hóa, ta dựa vào phổ 1 H NMR như sau [39]

S H(a) , 𝑆 𝐻(𝐻1 𝐻𝑒𝑝) : Lần lượt là diện tích tích phân của peak (a) và peak H1 Hep

𝐻 (–𝐶𝐻3−)(𝑎): Tổng số proton của nhóm CH3 tại vị trí (a) trên PNIPAM

 𝐻(𝐻1 𝐻𝑒𝑝) : Tổng số proton của H1 trên mạch phân tử Hep (5×7 = 35 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑜𝑛)

3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ Cita/PNIPAM đến độ chuyển hóa của phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Cita/PNIPAM tới độ chuyển hóa của phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM Quá trình thực hiện được tiến hành với giai đoạn hoạt hóa Hep-Cita cùng tỷ lệ mol Hep/Cita

=1/10, thời gian phản ứng 24 giờ, nhiệt độ 30 o C Giai đoạn thêm chất khử 2ME được thực hiện tại thời gian phản ứng 18 giờ và tỷ lệ mol Cita/ 2ME = 1/4, nhiệt độ 30 o C Giai đoạn thêm PNIPAM được cố định tại thời gian phản ứng 24 giờ, nhiệt độ 30 o C và tỷ lệ mol Cita/PNIPAM được thay đổi từ 1/1 đến 1/3 Các thông số thực nghiệm và độ chuyển hóa được thống kê ở bảng sau:

Bảng 3.5: Độ chuyển hóa của phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH tạo thành copolymer Hep-PNIPAM theo tỷ lệ mol Cita/PNIPAM tại nhiệt độ 30 o C, thời gian phản ứng 24 giờ

(mol/mol) m Cita (mg) m PNIPAM (mg)

Gía trị 1 H NMR Gía trị lý thuyết Độ chuyển hóa (%) S H

Dựa trên bảng 3.5 ta xây dựng biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng như sau:

Hình 3.9: Biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM theo tỷ lệ mol Cita/PNIPAM

Kết quả trên hình 3.9 cho thấy rằng, khi tăng hàm lượng PNIPAM thì độ chuyển hóa của phản ứng tăng Cụ thể độ chuyển hóa tăng lần lượt từ tỷ lệ Cita/PNIPAM = 1/1 (34,68%), 1/2 (71,79) và khi tỷ lệ là 1/3 thì tín hiệu proton của H1 Hep không còn xuất hiện nữa, chứng tỏ độ chuyển hóa đạt tối ưu 100% và hoàn toàn hợp lý vì các công trình nghiên cứu trứơc đây đã cho thấy phản ứng giữa nhóm thiol và maleimide có thể đạt độ chuyển hóa hoàn toàn trong thời gian ngắn [28]

Từ kết quả trên, tác giả chọn tỷ lệ mol Cita/PNIPAM = 1/3 cho khảo sát tiếp theo

Tỷ lệ Cita/PNIPAM (mol/mol)

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ chuyển hóa của phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới độ chuyển hóa của phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM Quá trình thực hiện được tiến hành với giai đoạn hoạt hóa Hep-Cita cùng tỷ lệ mol Hep/Cita 1/10, thời gian phản ứng 24 giờ, nhiệt độ 30 o C Giai đoạn thêm chất khử 2ME được thực hiện tại thời gian phản ứng 18 giờ và tỷ lệ mol Cita/ 2ME =1/4, nhiệt độ 30 o C

Giai đoạn thêm PNIPAM được cố định với tỷ lệ mol Cita/PNIPAM = 1/3, nhiệt độ

30 o C và thay đổi thời gian phản ứng từ 12 giờ đến 24 giờ Các thông số thực nghiệm và hiệu suất gắn được thống kê ở bảng sau:

Bảng 3.6: Độ chuyển hóa của phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH theo thời gian phản ứng tại nhiệt độ 30 o C, tỷ lệ Cita/PNIPAM=1/3

(mol/mol) m Cita (mg) m PNIPAM (mg)

Gía trị 1 H NMR Gía trị lý thuyết Độ chuyển hóa (%) S H

Dựa trên bảng 3.6 ta xây dựng biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng như sau:

Hình 3.10: Biểu đồ độ chuyển hóa của phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM theo thời gian phản ứng

Thời gian phản ứng (giờ)

Kết quả trên hình 3.10 cho thấy rằng, khi tăng thời gian phản ứng thì độ chuyển hóa tăng Cụ thể là ở thời gian 12h thì vẫn còn tín hiệu của proton H1 Hep xuất hiện và chỉ đạt độ chuyển hóa là (70,81%), nhưng khi tăng thời gian phản ứng lên 18h và 24h thì tín hiệu của proton H1 Hep không còn xuất hiện nữa, chứng tỏ độ chuyển hóa tối đa 100% Từ kết quả trên, tác giả chọn thời gian phản ứng tối ưu cho phản ứng này là 18h

 Phản ứng gắn PNIPAM lên Hep-SH để tạo thành copolymer Hep-PNIPAM đạt được độ chuyển hóa tối ưu với tỷ lệ mol Cita/PNIPAM = 1/3, thời gian phản ứng giờ.

Nghiên cứu phân tích copolymer/nanogel Hep-PNIPAM dựa vào FT-IR, GPC,

Mẫu copolymer Hep-PNIPAM sau khi được tổng hợp với các thông số phản ứng tối ưu:

 Phản ứng hoạt hóa Hep-Cita với tỷ lệ Hep/Cita =1/10, thời gian phản ứng

24 giờ, nhiệt độ phản ứng 30 o C

 Phản ứng khử 2ME với tỷ lệ Cita/ 2ME = 1/4, thời gian phản ứng 18 giờ, nhiệt độ phản ứng 30 o C

 Phản ứng gắn PNIPAM với tỷ lệ Cita/PNIPAM = 1/3, thời gian phản ứng 18 giờ, nhiệt độ phản ứng 30 o C được tiến hành phân tích để xác định các liên kết hình thành, kích thước, hình dạng và khối lượng phân tử trung bình bởi FT-IR, TEM, DLS và GPC

3.4.1 Phân tích copolymer Hep-PNIPAM bằng FT-IR

Bên cạnh những tín hiệu từ phổ 1 H-NMR, cấu trúc copolymer được tiếp tục khẳng định bởi quang phổ hồng ngoại (FTIR) để mô tả các nhóm chức trong copolymer Hep-PNIPAM Hình 3.11 cho thấy dải hấp thu ở 3303,69 cm-1 và

1649,72 cm-1 đại diện cho liên kết N-H và C=Otương ứng, mũi ở 2974,30 cm-1 đại diện cho liên kết của –CH và 1460,99 cm-1 là liên kết - CH dao động uốn Những đỉnh xuất hiện trên xác định các liên kết điển hình trong trong cấu trúc PNIPAM

Hình 3.11: Phổ FT-IR của copolymer Hep-PNIPAM được tổng hợp với phản ứng hoạt hóa Hep-Cita với Hep/Cita =1/10, thời gian 24 giờ; phản ứng khử 2ME với Cita/ 2ME = 1/4, thời gian 18 giờ; phản ứng thêm PNIPAM với Cita/PNIPAM = 1/3, thời gian 18 giờ và các phản ứng đều được thực hiện tại

Theo quang phổ FT-IR, một đỉnh mạnh và rộng xuất hiện ở 3438,27 cm-1 đã tìm ra sự hiện diện của nhóm hydroxyl (-OH) trong Hep, sự xuất hiện của liên kết - CC- trong vòng thơm ở 1548,41 cm-1, tín hiệu của nhóm axit carboxylic có thể được thấy ở 1387,87 và 1368,74của liên kết -C-O- trong Hep Đỉnh khác hấp thu ở

1336,93 cm-1 và 1033,77 cm-1 chỉ ra liên kết -C-N- và931,89 cm-1 của -NH- của amin trong Hep Hơn nữa, các liên kết amide của-NH- của Cita xuất hiện ở 883,49 cm-1 xác nhận các liên kết giữa Hep và Cita Như vậy, dựa trên các kết quả trong Hình 3.8 và Hình 3.11 của phổ 1 H-NMR và FT-IR cho thấy sự tiếp hợp thành công của PNIPAM vào Hep để tạo thành copolymer

3.4.2 Phân tích copolymer Hep-PNIPAM bằng GPC

Hình 3.12: Kết quả phân tích GPC của copolymer Hep-PNIPAM được tổng hợp với phản ứng hoạt hóa Hep-Cita với Hep/Cita =1/10, thời gian 24 giờ; phản ứng khử 2ME với Cita/ 2ME = 1/4, thời gian 18 giờ; phản ứng thêm PNIPAM với Cita/PNIPAM = 1/3, thời gian 18 giờ và các phản ứng đều được thực hiện tại

Khối lượng phân tử trung bình của copolymer Hep-PNIPAM

- Phân tích GPC: Mw= 47.389 g/mol

Khối lượng phân tử theo lý thuyết được tính theo công thức sau:

MW = Mw(Hep) +( Mw (Cita)

Kết quả trên cho thấy khối lượng phân tử của copolymer tổng hợp Hep- PNIPAM theo lý thuyết và kết quả phân tích GPC cho thấy không có sự chênh lệch

MwG.399 g/mol đáng kể, điều này góp phần khẳng định kết quả phản ứng gắn PNIPAM vào Hep- SH được tính bởi 1 H-NMR đạt độ chuyển hóa gần như 100%

3.4.3 Phân tích nanogel Hep-PNIPAM bằng TEM và DLS

Hình 3.13 (a) Ảnh TEM và (b) Phân phối kích thước DLS tại 35 o C của mẫu nanogel Hep-PNIPAM được tổng hợp với phản ứng hoạt hóa Hep-Cita với Hep/Cita =1/10, thời gian 24 giờ, phản ứng khử 2ME với Cita/ 2ME = 1/4, thời gian 18 giờ; phản ứng thêm PNIPAM với Cita/PNIPAM = 1/3, thời gian 18 giờ và các phản ứng đều được thực hiện tại 30 o C

Dựa trên các kết quả từ ảnh TEM (hình 3.13a) cho thấy các hạt copolymer/nanogelHep-PNIPAM tại 35 o C tạo ra có dạng hình cầu, với kích thước vào khoảng 200nm 20 nm Ngoài ra, kết quả cũng đã được xác nhận bởiDLS trong đó trình bày kích thước trung bình của copolymer vào khoảng 199,2 nm (Hình

Bằng cách phân tích FT-IR, 1 H-NMR, TEM, DLS, GPC kết luận đã tổng hợp thành công copolymer/nanogel Hep-PNIPAM để tiến hành cho bước mang thuốc tiếp theo.

Nghiên cứu khả năng ghép thuốc 5-FU lên copolymer/nanogel Hep-PNIPAM và khả năng nhả chậm của thuốc

Mẫu copolymer Hep-PNIPAM sau khi được tổng hợp với các thông số phản ứng tối ưu như:

 Phản ứng hoạt hóa Hep-Cita với tỷ lệ Hep/Cita =1/10, thời gian phản ứng

24 giờ, nhiệt độ phản ứng 30 o C

 Phản ứng khử 2ME với tỷ lệ Cita/ 2ME = 1/4, thời gian phản ứng 18 giờ, nhiệt độ phản ứng 30 o C

 Phản ứng gắn PNIPAM với tỷ lệ Cita/PNIPAM = 1/3, thời gian phản ứng 18 giờ, nhiệt độ phản ứng 30 o C được tiến hành phân tích đánh giá khả năng mang và nhả chậm thuốc 5-FU như sau:

3.5.1 Tính toán hiệu suất và khả năng mang thuốc 5-FU

Kết quả mang thuốc 5-FU của hệ nanogel Hep-PNIPAM được xác định bằng phương pháp đo UV-Vis Đường chuẩn 5-FU được xây dựng từ các dung dịch 5-FU có nồng độ lần lượt là 0; 0,05; 0,075; 0,1; 0,15; 0,2 mg/ml Đồ thị biểu diễn mối liên hệ giữa nồng độ 5-FU và độ hấp thu sẽ cho ra kết quả là một phương trình đường thẳng dạng y = ax + b, trong đó y là độ hấp thu còn x là nồng độ

Bảng 3.7: Bảng số liệu đường chuẩn Nồng độ 5FU

(mg/ml) Độ hấp thu

Từ số liệu bảng 3.7 ta xây dựng được đồ thị đường chuẩn của dung dịch 5-FU

Hình 3.14: Đồ thị đường chuẩn của 5-FU

Khi tiến hành khảo sát khả năng mang cũng như phóng thích thuốc của vật liệu, từ kết quả phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) ta sẽ biết được độ hấp thu, gắn vào phương trình đường chuẩn y= 31.842x - 1.3342 ta tính được lượng thuốc mang vào nanogel và lượng thuốc nhả ra trong 72 giờ

Bảng 3.8: Kết quả mang thuốc 5-FU của nanogel Hep-PNIPAM

Lượng thuốc 5-FU ban đầu 120 mg

Tổng lượng thuốc 5-FU được mang 61,906mg

Khả năng mang thuốc của hạt 28,14%

Hiệu suất lượng thuốc 5-FU được mang trên hệ nanogel Hep-PNIPAM được tính theo công thức

 Kết quả trên cho thấy hiệu suất tải thuốc 5-FU vào nanogel đạt 51,59% và khả năng mang thuốc của hạt đạt 28,14% y = 31.842x - 1.3342 R² = 0.991

3.5.2 Phân tích khả năng nhả thuốc 5-FU của copolymer Hep-PNIPAM Bảng 3.9: Phần trăm lượng thuốc 5-FU nhả theo thời gian

Thời gian 1 giờ 2 giờ 3 giờ 7 giờ 10 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ

% Nhả thuốc 11,12 13,17 22,74 31,79 40,21 48,62 57,19 66,11 Hạt được khảo sát khả năng nhả thuốc trong 72 giờ

- Trong 7 giờ đầu hạt giải phóng được 31,79% lượng thuốc được mang trong nanogel

- Trong 3 giờ tiếp theo, tức là từ 7 giờ đến 10 giờ hạt chỉ phóng thích thêm 8,42 % thuốc

- Tại thời điểm 24 giờ có 48,62% lượng thuốc được phóng thích Như vậy trong khoảng thời gian từ 10 đến 24 giờ thì thuốc được phóng thích thêm 8,41% thuốc

- Tại thời điểm 48 giờ, có 57,19% lượng thuốc được phóng thích Như vậy, trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 hạt giải phóng thêm được 8,57% thuốc Ở thời điểm 72 giờ, có 66,11% thuốc được phóng thích So với thời điểm 48 giờ thì thuốc được phóng thích thêm 8,92 %

Từ kết quả bảng 3.9 ta xây dựng được đồ thị:

Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn khả năng nhả chậm thuốc 5-FU của nanogel Hep-

Thời gian (giờ) Phầ n tră m nhả thu ốc (%)

Theo kết quả nhả thuốc 5-FU ở hình 3.15 cho thấy khoảng 66,11% lượng thuốc được phóng thích sau 72 giờ Trong khi đó, kết quả nhả thuốc 5-FU tự do đạt đến 97% trong vòng 24h thử nghiệm [42] Nanogel mang đơn thuốc 5 FU có xu hướng nhả chậm thuốc, giúp kéo dài thời gian lưu hành thuốc trong tế bào cũng như hiệu quả điều trị Quá trình nhả thuốc đang có xu hướng đi lên, có nghĩa là thuốc sẽ tiếp tục được phóng thích vào tế bào trong thời gian dài sau đó Ở đây có thể suy luận rằng, tương tác kỵ nước mạnh giữa PNIPAM và thuốc 5-FU đã giữ nó bên trong nanogel lâu hơn dẫn đến quá trình nhả chậm và bền vững thuốc.