Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu vi bao kháng thể IGY

Nghiên cứu vi bao kháng thé IgY đãtiễn hành khảo sát ảnh hưởng của các chất bao và điều kiện vi bao đến hiệu quả củaquá trình vi bao kháng thé IgY kháng EV71 bao gồm: nông độ sodium algi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HUỲNH THÀNH ĐẠT

NGHIÊN CỨU VI BAO KHÁNG THẺ IGY

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực PhẩmMã số: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHI MINH, thang 01 năm 2018

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa —- ĐHQG —- HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Trần Bích Lam

TRUONG KHOACHỦ TỊCH HỘI DONG KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUOC GIA TPHCM CONG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Ty do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Huỳnh Thành Đạt MSHV: 1570884Ngày, tháng, năm sinh: 20/09/1993 Nơi sinh: Tp Hồ Chí MinhChuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 60540101

I TÊN DE TÀI: NGHIÊN CỨU VI BAO KHANG THE IGYIl NHIỆM VỤ VA NOI DUNG:

- Khảo sát ảnh hưởng của các chat bao va điều kiện vi bao đến hiệu quả của quatrình vi bao kháng thê IgY khang EV71 trong khuôn gel chitosan-alginate.

- Khảo sát độ bền của chế phẩm vi bao với điều kiện mô phỏng môi trường trongda day (simulated gastric fluid - SGF).

- Đánh giá kha năng tự giải phóng in vitro của IgY (In vitro IgY release).HI NGÀY GIAO NHIEM VU : 10/07/2017

IV NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 03/12/2017v CAN BO HUONG DAN: TS Tran Bich Lam

Tp HCM, ngay thang năm 20

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO(Ho tén va chit ky) (Họ tên va chữ ky)

TRUONG KHOA KY THUẬT HÓA HOC

(Ho tén va chit ky)

LOI CAM ON

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Cô TS Tran Bích Lam đã tận tinh hướngdẫn, định hướng và giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thànhluận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Cô PGS TS Cao Thị Bảo Vân đã tạo điều kiện, địnhhướng và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn Chân thành cảm ơn Anh

Chị trong Labo Sinh học phân tử - Khoa Vi sinh Miễn Dịch, Viện Pasteur Tp HCM

đặc biệt là Ths Phạm Thanh Hồng đã luôn giúp đỡ, hỗ trợ và chia sẻ kinh nghiệmgiúp tôi hoàn thành luận văn này.

Cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học,Trường Đại học Bách Khoa Tp HCM đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức,kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cam ơn Ba Mẹ, Di Tám, Ngọc Lan, em Dai, gia đình vàbạn bè đã luôn bên cạnh hỗ trợ, động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất giup

tôi hoàn thành tốt luận văn nay

TP HCM, thang 01 năm 2018

Học viên thực hiện

Huynh Thành Đạt

TOM TAT LUAN VAN

Vi bao chitosan — alginate được đánh giá là một phương pháp hiệu qua dé duakháng thé IgY vào cơ thé qua đường ăn uống Nghiên cứu vi bao kháng thé IgY đãtiễn hành khảo sát ảnh hưởng của các chất bao và điều kiện vi bao đến hiệu quả củaquá trình vi bao kháng thé IgY kháng EV71 bao gồm: nông độ sodium alginate,nông độ CaCh, nồng độ chitosan, pH môi trường vi bao Kết quả thí nghiệm đã đưara các thông số tôi ưu nhằm tăng hiệu quả vi bao kháng thé IgY như sau: Nông độsodium alginate: 2.5% (w/v), nồng độ CaClạ: 1.5% (w/v), pH môi trường vi bao:3.5, nông độ chitosan: 0.2% (w/v) Hiệu quả vi bao đạt 63.926%

Chế phẩm vi bao sau sấy có hoạt tinh kháng thé IgY kháng EV71 còn lại trong hạtvi bao đạt 35.011%, khả năng tải kháng thể IgY của hạt vi bao đạt 80.496 —81.572% va độ am chế phẩm vi bao là 37.25%

Độ 6n định của IgY trong môi trường mô phỏng dạ dày, SGF, đã được cải thiệnđáng kể, khi được vi bao bang chitosan — alginate, hoạt tinh kháng thé của IgY đượcgiữ lại đến 3 giờ trong SGF có pepsin Hơn nữa, khả năng tự giải phóng in vitro củaIgY (In vitro IgY release) cho thấy IgY đã bắt đầu giải phóng sau 2 giờ ủ trong SGFkhông pepsin Sau khi chuyển sang môi trường mô phỏng ruột, SIF khôngpancreatin, hạt vi bao bắt đầu phân rã và giải phóng gần như hoàn toan sau 16 giờ ủ

ABSTRACT

Chitosan — alginate microcapsules are considered the effective approach to deliver

IgY via oral route This research was to study the effect of loading environments

and some factors including: Alginate concentration, CaCl2 concentration, chitosan

concentration, pH to the [gY encapsulation efficiency for the inhibition of EV7].

The results showed that the efficiency of encapsulation [gY was improved at

con-centration of 2.5 % (w/v) sodium alginate, 1.5% (w/v) CaCl2, 0.2 % (w/v) chitosan,

and pH 3.5 Under optimum conditions, IgY encapsulation efficiency was 63.926

%.

After free-dried microcapsules product showed 35.011 % of activity against EV71,

the capacity of loading IgY was 80.496 — 81.572 % and residual moisture of

prod-uct was 37.25 %

The IgY stability in stimulated gastric fluid (SGF) was significantly improved when

encapsulated by chitosan — alginate microcapsules, the activity of IgY was fully

maintained for 3 hours in SGF with the appearance of pepsin In addition, the

capa-bility of In vitro IgY release showed that IgY was released after 2 hours in SGF

without pepsin After being transferred to stimulated intestinal fluid (SIF) without

pancreatin beads of microcapsule started to degrade and completely released IgY

after 16 hours.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn này là do tôi thực hiện dưới sựhướng dẫn của Cô TS Trần Bích Lam Các kết quả nghiên cứu và các kết luậntrong luận văn nảy là trung thực và không sao chép từ bat cứ một nguồn nào, dưới

bất ky hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn

và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu Mọi sao chép không hợp lệ viphạm qui chê dao tạo, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Tác giả luận văn

Huỳnh Thành Đạt

MỤC LỤC

LOI CẢM ON C1 t1 1 121115111 111111 1511111101 2110101 110120 01011111 001011101111 Hy iiTOM TAT LUẬN VĂN uececccccecececccececececcscscevevevevevscacacacacacucucececececsesesavavavavavavaces iiiABSTRACT viccccccccscsccscssscscscsescscsssscscscscsssscscscsssssscscsvsvsssscscsssvsssscscsssssescscesscseseeseseaes iv

0900.) 62979025 V0190922 vi

DANH MUC BANG 2 ixDANH MUC HINH 2 XDANH MỤC TỪ VIET TẮTT G6 S51 9318 SE 3118 1E 11111 ng: xiMO DAU wiececccccscccsccssscsesscscscscssscscscscsscscscscscsssscscscsvsvsecscscsvssscsesescsesscscssavsssecscssesseeeeas |CHUONG 1: TONG QUAN 1 4

1.1 Kháng thỂ 1gY wiccccccccccscsccscsesscscsssscsessessssssssssesecsssesscseseesesesesscsesesseseseesesen 4IV an 9 ae 43 6

IS 9 98 aadaad.ãAaa A11⁄⁄<Ã, 10

II W,VHiiadddđiiiiidd II

1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng IgY và sản phẩm vi bao IgY 13CHUONG 2: DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 152.1 › 90099) 152.1.1 Kháng thé IgY kháng Enterovirus 71 (EV 71) cccccccscscsscssssssessessseeseseseseees 152.1.2 Chat D0 cccccccccscsscsescscscsssscscscscsssscscscsesssscscscscsessescscsssesscscsssssesseseecens 152.1.3 Hóa chất và thiết bị s11 1121 1E 111919111 1111211 ng ree l62.2 PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU - ¿2-5-5252 +e+E+Ezezxerereeree 172.2.1 Quy trình vi bao kháng thể IgY kháng EV71 5cscc+csc5¿ 172.2.2 Nội dung nghiên CỨU - Ăn ve 19

2.3 CÁC PHƯƠNG PHAP PHAN TÍCH cc-ccccsrxtsrxerrerrrerved 242.3.1 Định lượng protein bang phương pháp Bradford - 5-5: 242.3.2 Định lượng protein băng phương pháp ELISA -. 5555 5+: 252.3.3 Xác định độ bền của chế phẩm vi bao với điều kiện mô phỏng môi trườngda dày (simulated gastric fluid — ST) - << c9 1 re 26

2.3.4 Xác định phan trăm tải của IgY (IgY Loading Percentage) và hiệu quả vibao (Encapsulation Efficiency — EEZ) - - - - - << << s99 re 27

2.3.5 Đánh giá khả năng tự giải phóng In vitro của IgY (In Vitro IgY Release)282.3.6 Xác định hiệu quả vi bao (EIE/2) on net 282.3.7 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy) 292.4 PHƯƠNG PHÁP XU LÍ SỐ LIỆU - ¿+ 6 + E+E+E+E+E£e£eEsEsxzezesee 29CHUONG 3: KET QUÁ VA BAN LUẬN -ccccccccirrirrrerrrrrrrrrrrrkee 30

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến hiệu quả vi bao 30

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ CaCl› đến hiệu quả vi bao 31

3.3 Khảo sát anh hưởng của pH môi trường vi bao đến kha năng vi bao 32

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Chitosan đến hiệu quả vi bao 35

3.5 Khảo sát độ bên của chế phẩm vi bao trong điều kiện mô phỏng môi trườngSEN) 36

3.6 Xác định tải lượng IgY của chất bao (IgY Loading Percentage) 373.7 Đánh gia khả năng tự giải phóng In Vitro của IgY -« «<< «2 383.8 Đánh giá kha năng vi bao của chế phẩm vi bao - 2 2525255255: 403.9 Đặc điểm hat Vi ĐaO -.- St 11191 111 5 1111515113 1111121111 1g ri Al3.10 Đánh giá kết quả nghiên COU c.cccecccsessssessesssessesssesseseseseseseseseseesesesn 43CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, -¿ 2+2 SE E+E+E+eE+E+Eseeeesesez 45

AL KET LUẬN SG G11 511191 1E 1111191111 911111011 11g nọ 454.2 KIÊN NGHỊ, G- G111 E53 911 1E 519115111 0 1111112111 11g11 gen 46TÀI LIEU THAM KHẢO G1 E 12t E5 919191 1 E111 91 51 1 E111 neo 47PHU LUC 1 - CÁC PHƯƠNG PHÁP PHAN TÍCH

PHU LUC 2 — CAC KET QUA THÍ NGHIỆM 2 2 + 5x2 £sEsEsxzezecxe 53

DANH MUC BANG

So sánh tính chat kháng thé IgG ở động vat có vú vaIgY ở gà 6Các chất đa điện li sử dụng trong phương pháp vi bao tạo gel[S] 9Thông số kỹ thuật của Chitosan c.cccccscsscsessscsessesessscsssesesssssseseseeeeen 15Thông số kỹ thuật của Sodium alginate c.ccccccscsesessesesesseseseeeseseesesen 16Hóa chat sử dung trong quá trình nghiên cứu - 2 + 55555: 16Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu -. - 5+ 25555: 17Hoạt tính kháng thé IgY còn lại trong SGE - 55 5s+ccscsccee 37Phan trăm tải IgY (IgY Loading Percentage) - ¿5c ccscsccee 38Hàm lượng kháng thé IgY còn lại trong hạt Vi bao -« 41Hoạt tính kháng thé IgY còn lại trong hạt Vi bao -. - 5s 41Độ âm chế phẩm Vi bao ¿5-2-5252 SE E9 2323921252121 211 121223 42

DANH MUC HINH

Cau trúc của kháng thé IgY và [gGu.e.cececccscsccsssessesssessesesessssssesssseseeseseeeeees 5Các loại cau trúc cơ bản của hạt Vi ĐaO cóc s xxx E32 seserxes 7Quá trình vi bao tạo gel[8] - c9 99990001101 1 ng và 9

Công thức cầu tạo của ChitOSAN ceececssescssssessssesessesesessesesessesesesseseseeseseeess 10Công thức cau tạo của Alginate -¿:- 5+ Sex xxErkekrrrrrrrrerree 12Sự hình thành gel giữa alginate và Ca”T - ¿5+ Sc 2t +ssrsseresed 12Quy trình vi bao kháng thé IgY kháng EV71 + - scs+5se: 18Sơ đồ nội dung nghiên COU - - ¿2 +52 +E+E+E££E+EeE£Eexererrerrrrerree 20Phan ứng giữa protein và Coomasie G — 25Ö SH HS re 25

Nguyên tac của phương pháp ELISA -2- + 255252 5s+s+secscseẻ 26Ảnh hưởng của nông độ sodium alginate đến hiệu quả vi bao 30Ảnh hưởng của nông độ CaCl› đến hiệu quả vi bao - 3lẢnh hưởng của pH đến hiệu quả vi bao - - 25552 sex 33Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng thể IgY còn lại 33Ảnh hưởng của nông độ Chitosan đến hiệu quả vi bao - 35Độ bên của chế phẩm vi bao trong điều kiện mô phỏng môi trường dạ dày

¬ Ắ.Ắ 36

Khả năng tự giải phóng In Vitro của ÍBŸY ke 39

Hình ảnh chụp SEM chế phẩm vi bao sau say thang hoa.(A) Do phong daiX50 (B) Độ phóng đại X100 (C) Độ phóng đại X250 (D) Độ phóng đại X500 42

DANH MỤC TỪ VIET TAT

Từ viết tắt Chú thíchEV71 Enterovirus 71

IgY Immunoglobin Yolk

OD Mat do quang hocRCF Relative Centrifugal Force

SGF Simulated Gastric FluidSIF Stimulated Intestinal Fluid

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đềBệnh tay chân miệng gây ra bởi một nhóm Enterovirus thuộc ho Picornaviridae;với hai tác nhân chủ yếu là Coxsackie vi rút A (CAV) 16 và Enterovirus 7111]

Triệu chứng đặc trưng của bệnh như SỐT, phát ban, hình thành các bọng nước trên

tay chân và các vết loét trong miệng Trong đó bệnh do Enterovirus 71 (EV71) gâyra có thé dẫn đến những biến chứng nghiêm trọng như viêm màng não, liệt mềmcấp, viêm co tim, phù phối cấp, dẫn đến tỉ lệ tử vong cao ở trẻ em Năm 1997 dichEV71 bùng phát và lan rộng tại khu vực Châu A — Thái Bình Dương như Trung

Quốc, Nhật Bản, Malaysia, Singapore, Úc, Đài Loan, Hàn Quốc và Việt Nam với

hơn 40.000 trường hợp nhiễm bệnh va hơn 14 trường hợp tử vong [2, 3] Ở ViệtNam, năm 2011 được xem là năm bùng phát dịch tay chân miệng nặng nè nhất, vớihơn 106.508 ca bệnh và 162 trường hợp tử vong được ghi nhận từ 63 tỉnh thành trênkhắp cả nước Từ năm 2012 đến 2015 tình hình bệnh tay chân miệng vẫn diễn biếnkhá phức tạp ở các địa phương với tỉ lệ tử vong cao nhất được ghi nhận là 45 trườnghợp vào năm 2012 Tính đến cuối năm 2016 tổng số ca bệnh được ghi nhận là48.866 với | trường hợp tử vong (WHO, 2017(c)) Tuy nhiên, bệnh tay chân miệnghiện chưa có thuốc đặc trị và chưa có vắc xin phòng ngừa Hiện nay trên thế giới đãcó một số nghiên cứu vac xin đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sang Tuy nhiêncác nghiên cứu vắc xin gặp nhiều khó khăn như sau: cần rất nhiều thời gian nghiêncứu, thử nghiệm Bệnh do nhiều chủng virus gây ra, các chủng Enterovirus gâybệnh khác nhau ở các quốc gia khác nhau Tại Việt Nam 2 tác nhân chính là:

Coxsackie A-16 và Enterovirus 71 phân tuýp B4, C4, C5 Đáp ứng miễn dịch giữa

Coxsackie A16 và Enterovirus 71 cho miễn dịch chéo yếu.Trước tình hình bệnh tay chân miệng do virus EV71 vẫn diễn biến phức tap gây ranhững thiệt hại lớn về kinh tế và xã hội, Viện Pasteur Tp Hỗ Chí Minh đã nghiêncứu và đạt được thành công lớn trong nghiên cứu hoàn thiện quy trình quy trình sảnxuất kháng thé IgY kháng virus EV71 Kết quả thử nghiệm tiền lâm sang cho thay

hiệu quả phòng ngừa bệnh của kháng thể IgY đạt 100% Hiệu quả điều trị củakháng thể IgY bước đầu cũng được đánh giá và đạt hiệu quả rất khả quan gần như

100% (Đề tài nghiên cứu cấp sở Khoa học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh).Công nghệ sản xuất các sản phẩm chứa kháng thể IgY đã được các nước tiên tiễn ápdụng và thương mại hóa như Nhật Bản, Canada Một số sản phẩm đã được đưa rathị trường như: viên ngậm điều trị và phòng ngừa sâu răng viêm lợi (IgY Gate DC-PG, Nhật Bản), viên ngậm chứa kháng thé kháng cúm (IgY Gate F, Nhật Bản), IgYkháng các bệnh đường ruột (Intest Immune DF, Canada) Trong khi đó, tại thịtrường Việt Nam chưa sản xuất được bất ky sản phẩm chứa kháng thé IgY nàophòng ngừa bệnh đặc biệt là bệnh tay chân miệng cho virus EV71 gây ra Chính vithế, đề tài “Nghiên cứu vi bao kháng thể IgY” được thực hiện nhằm tiếp nối nghiêncứu quy trình sản xuất kháng thể IgY kháng virus EV71 của Viện Pasteur từ đó xâydựng quy trình vi bao kháng thể IgY có hiệu qua vi bao kháng thé cao tạo tiền décho các nghiên cứu ứng dụng trong sản xuât sản phầm thực phâm sau này.

Mục tiêu nghiên cứuXây dựng quy trình vi bao kháng thé IgY trong khuôn gel chitosan — alginate nhằmbảo vệ hoạt tính kháng thé chống lại các yếu tố gây biến tính in vitro và in vivo đểcó thé bố sung vào thực phẩm

Đối tượng nghiên cứuKháng thể IgY kháng Enterovirus 71 (EV71) do Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minhcung cấp

Phạm vi nghiên cứuNghiên cứu này được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm.Nội dung nghiên cứu

— Khảo sát ảnh hưởng của các chat bao và điêu kiện vi bao đên hiệu quả của quatrình vi bao kháng thé IgY kháng EV71 trong khuôn gel chitosan — alginate

— Khảo sát độ bên của chế phẩm vi bao với điều kiện mô phỏng môi trường trongda dày (simulated gastric fluid - SGF).

— Đánh giá khả nang tự giải phóng in vitro cua IgY (In vitro IgY release).Ung dung

Trong nghiên cứu nay sé đưa ra được các yếu tố tối ưu của các chất bao va điềukiện môi trường vi bao ảnh hưởng đến hiệu quả vi bao kháng thể

Tạo tiền dé để bổ sung chế phẩm vi bao kháng thể IgY vào sản xuất sản phẩm thựcphẩm

CHƯƠNG 1: TONG QUAN

1.1 Kháng thé IgY [5]Dựa theo chức năng hoạt dong, hệ thống miễn dịch ở gà được phân chia thành hệthống miễn dịch không đặc hiệu và miễn dịch đặc hiệu Trong đó hệ thông đáp ứngmiễn dịch dịch thể (thuộc hệ thống miễn dịch đặc hiệu) của gà gồm 3 lớp kháng thểIgM, IgA và IgY Hai lớp kháng thé IgM va IgA ở ga tương tự như ở động vật cóvú về trọng lượng phân tử, đặc điểm hình thái học và tính linh động (Diana Pauly,2011).

So với IgM va IgA của gà, kháng thé IgY gà có trọng lượng phan tử thấp hon,chiếm đến 75% tong số lượng kháng thé (E.N.Lee, 2002) IgY trong huyết thanhđược truyền vào noãn hoản trưởng thành trong nang trứng thông qua màng noãn(oolemma) Vì vậy kháng thể này có tên gọi là “kháng thể lòng đỏ trứng”: YolkImmunoglobulin — IgY) Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra răng, lượng kháng thểIgY được chuyển vào lòng đỏ tỉ lệ thuận với lượng kháng thé trong huyết thanh củagà mẹ Ngoài ra, thời gian kháng thé IgY đặc hiệu được tìm thay trong trứng gà mớiđẻ, trễ từ 5-6 ngày so với nồng độ kháng thé trong huyết thanh (E.N.Lee, 2002).Hiện nay, khuynh hướng sử dụng trứng gà làm nguồn sản xuất kháng thể ứng dụngtrong chuẩn đoán và điều trị bệnh ở người và vật nuôi rất được quan tâm So vớiphương pháp sản xuất kháng thể truyền thống, thì thu thập trứng và tách chiết khángthể từ lòng đỏ được xem là một phương pháp sản xuất mang lại hiệu suất cao, giảmsự xâm lấn, cũng như đau đớn đối với động vật dùng làm thí nghiệm Thông thườngmột con gà có thé đẻ 200 - 280 trứng mỗi năm va một lòng đỏ trứng chứa hơn

100mg kháng thể IgY (Carlander D, 2002).Về cấu trúc, kháng thé IgY gần giống với kháng thé IgG ở người, bao gôm 2 chuỗinặng (Hv) với trọng lượng phân tử từ 67-70 kDa và hai chuỗi nhẹ với trọng lượngphân tử 25kDa/chuỗi liên kết với nhau bang các cầu nối disulfide

Kháng thé IgY có trọng lượng phân tử xấp xỉ 180kDa, lớn hơn so với trọng lượng150kDa của kháng thé IgG Điểm khác biệt chủ yếu của IgY va IgG là số lượng

vùng hang định (constant region) C trên chuỗi nặng, IgG có 3 vùng C (Cul, CH2 vàCH3), IgY có 4 vùng C (CHI, CH2, C3 và Ca4) Trong cau trúc ở chuỗi nặng củakháng thé IgG, hai vùng Culva C2 được phân biệt bởi vùng bản lề, do đó làm tăng

tính linh hoạt đoạn Fab trong cầu trúc phân tử của kháng thê Ngược lại, chuỗi nặng

của IgY không chứa vùng bản lẻ, nhưng các vùng gan với ranh giới của CHI- CH2và CH2-CH3 có chứa các nhóm proline và glycine Các vùng này góp phân làmgiảm tính linh hoạt của cấu trúc phân tử Cấu trúc bên ngoài chuỗi nhẹ trong khángthé IgY tương tự như ở IgG, bao gồm một vùng biến đổi (VL) và một vùng hangđịnh (CL) Tuy nhiên, cầu nối disulfide giữa VL và vùng CL hiện diện trong khángthé IgG lại không có trong cau trúc của kháng thé IgY Điều nay làm cho lực nộiphân tử (intra-molecular force) của kháng thể IgY yếu hơn so với IgG (Hình 1.1)(Wallach Michael, 2011).

Sự khác nhau trong cau trúc phân tử dẫn đến sự khác nhau trong cách liên kết vatương tác hoá sinh học của kháng thé IgY so với kháng thé IgG Kháng thể IgYkhông hoạt hoá các nhân tố bố thé, không bám với vùng thụ thé Fe ở động vật cóvu, cũng như các nhân tố RF (rheumatoid factors), HAMA (human anti-murineantibodies) Các ưu điểm này giúp mở ra một phương hướng mới trong việc sửdụng IgY vào các lĩnh vực nghiên cứu, chan đoán va ứng dụng y học

Hình 1.1 Cấu tr cc a kháng thé IgY va IgG

Bang 1.1 So sánh t nh chất kháng thé IgG ở déngv tc v valgY ở gà

Động vật có vú Gà (IgY)

(IgG)

Nguôn thu nhận Huyét tương Lòng đỏ trứng

Loại kháng thể Đa dòng Đa dòngPhương pháp thu nhận Lây máu (mang | Thu thập trứng

tính xâm lan)

Lượng thu nhận 200 mg/40 ml 50-100 mg/1

mau trứng

Kháng thê đích ~ 5% 2—10%Khôi lượng phân tử 150 kDa 180 kDa

Tuong tac protein A/G Có KhôngTương tác với yeu tô Có Khôngrheumatoid

Kích hoạt bô thê Có Không

Liên kết với thụ thê Fc Có KhôngĐiểm đăng điện của kháng thể IgY dao động từ 5.7-7.6 Ở pH 3.5, hoạt tính IgYgiảm và gân như hoàn toàn mất hoạt tính sinh học ở pH 3 (Shimizu et al 1988,1992, 1993b) [4] Trong môi trường kiém, hoat tinh IgY 6n dinh khi pH không vượtquá 11 Do đoạn Fe của IgY có cau trúc lớn hơn IgG, nên cau trúc của kháng théIgY có tính ky nước hon so với IgG Các nghiên cứu thực hiện vé tính bền vững củakháng thé IgY với nhiệt độ cho thấy, ngưỡng nhiệt độ của kháng thé IgY tôn tại bềnvững trong khoảng 60°C đến xấp xỉ 70°C Khi nâng nhiệt độ lên cao hơn, hoạt tínhcủa IgY bị phá huỷ hoàn toàn Kháng thể IgY có khả năng kháng lại sự phân huỷcủa trypsin và chymotrypsin, nhưng lại rất nhạy cảm với enzyme pepsin Tính bềnvững của IgY đối với pepsin phụ thuộc rất nhiều vào độ pH của môi trường va tỉ lệgiữa cơ chất và enzyme Với môi trường có độ pH từ 5 trở lên, IgY có thé kháng lạisự phân huỷ bởi enzyme pepsin Tuy nhiên ở độ pH thấp hơn, IgY bị phân cắtgân như hoàn toàn [5]

1.2 Ky thuật vi bao

1.21 Các kỹ thuật vi baoVi bao là một phương pháp bao gói các vi chất hay vật liệu (các thành phần thựcphâm, enzyme, tê bao, hoặc các vật liệu khác) trong các viên bao nhỏ và chỉ giải

phóng các thành phần bên trong khi gặp điều kiện thích hợp (dung môi, lực cắt,nhiệt độ, pH, enzyme), thường được gọi la “microcapsules” Microcapsules giúpbảo vệ các thành phan thực phẩm nhạy cảm, đảm bảo chồng lại sự mất mát về chấtdinh dưỡng, giữ được hương vi và có thé chuyển chất lỏng thành các thành phan randé dàng xử lý [6] Kích thước của các hạt vi bao trong khoảng từ vai pm đến vàimm và có vô số các hình dạng khác nhau tùy thuộc vao vật liệu và phương phápđược sử dụng làm ra nó.

Câu tử được được bao bên trong gọi là lõi nhân, vật liệu bao bên ngoài được gọi làvỏ bao Việc hình thành các dạng vi bao phụ thuộc chu yếu vào cầu tao của lõi nhâncần vi bao và quá trình hình thành lớp vỏ bao

Các hạt vi bao với 4 hình thái thường gap:— Đơn lõi (monocore): hạt vi bao bao gồm 1 nhân và lớp vỏ bao bên ngoài.— Dạng đệm (matrix): nguyên liệu cần vi bao là lõi nhân được phân tán đồng nhấttrong vỏ bao.

— Vi bao nhiều lớp (multi-layer capsule): màng vi bao là sự kết hợp của nhiều lớpmang có tinh chất khác nhau

— Đa lõi (polycore): hạt vi bao chứa nhiều nhân là các hat hay các giọt lỏng bềntrong lớp vỏ bao (Jianing và cộng sự, 2011).

Mononuclear Polynuclear Matnx

Hình 1.2 Các loại cấu tr cco banc a hạt vi baoVật liệu nhân thường có những tính chất sau:

— Là chất rắn hoặc lỏng.— Chất lỏng có khả năng hòa tan hoặc phân tán

— Chất có hoạt tính sinh học hoặc được tính.Chất mang thường có những đặc tính:

— Không phản ứng với vật liệu nhân.— Hoạt động ôn định va tương thích với vật liệu nhân.— Đa dạng va giá thành rẻ.

Kỹ thuật vi bao phụ thuộc vào tính chất vật lý và hóa học của vật liệu sử dụng vibao Có nhiều phương pháp khác nhau sử dụng trong vi bao Có 3 phương pháp vibao thường được sử dụng như sau [7]:

— Phương pháp vật lý: sấy phun, ép dun.— Phương pháp hóa lý: tạo giọt đơn hay phức hợp (phân tách pha nước), quá trìnhphân chia nhũ tương — dung môi (phân tách pha hữu cơ), tạo gel.

— Phương pháp hóa học: trùng hợp bề mặt, bao thé phân tử.l2.2 Phương pháp vi bao tạo gel

Phương pháp vi bao tạo gel được sử dụng rất phố biến trong ngành dược phẩm đặcbiệt là trong sản xuất thuốc cung cấp qua đường miệng Phương pháp này dựa trênkhả năng liên kết chéo của các chất đa điện ly dưới sự hiện diện của các ion nhưCa?*, Ba?" và Al** tạo thành dang hydrogel [7] Các hạt hydrogel được tao ra bangcách nhỏ dung dich polymer có chứa chat nhân vào dung dich ion dương da hóa trị.Các ion dương này sẽ khuếch tán vào polymer mang chất nhân, tạo thành mạng lướiba chiều của liên kết ion chéo [8]

Polyelectrolyte solution[Sodium Alginate (-)/Gellan gum (-)/CMC (-)/Pectin (-)/ Chitosan (+) + Drug]

{

|Counter ion solution

|GelispheresAdded drop wise under magnetic stirring by needle

[Calcium chloride solution (+)/Sodium tripolyphosphate (-)]

Hình 1.3 Quá trình vi bao tạo gel[8]

Trong phương pháp vi bao tao gel, các nghiên cứu hiện nay ngày càng quan tamđến việc sử dụng polymer tự nhiên làm chất mang do khả năng tương thích sinh họcvà khả năng phân hủy sinh học cao Các polymer tự nhiên hoặc bán tong hợp như:Alginates, Gellan Gum, Chitosan, Pectin và Carboxymethyl cellulose được sử dụngrộng rãi trong phương pháp vi bao này Các chất đa điện ly tự nhiên chứa anion/cation nhât định trên câu trúc hóa hoc của chúng, những anion/ cation tạo thành câutrúc mạng lưới băng cách kết hợp với ion trái dau cùng điện tích trong dung dịch vàtạo gel bang các liên kết chéo [8]

Bang 1.2 Các chất da điện li sử dụng trong phương pháp vi bao tạo gel[8]

Table 1: Polyelectrolytes used in lonotropic gelationNatural polymers Synthetic monomers/polymers Multivalent CationsChitosan Hydroxyethylmethacryate (HEMA) Calcium (Ca‘?)

Alginate N-(2-Hydroxy propyl}methacrylate (HPMA) Potassium (K')

Fibrin N-Vinyl-2-pyrrolidone (NVP) Ferric (Fe), Barium (BA?) Sodium (Na*) Magnesium(Me*)Collagen N-Isopropylacrylamide (NIPAMM) Aluminium (Al*)

Gelatin Vinyl acetate (VAc) Zinc (7n?)

Hyaluronic acid Acryolic acid (AA)

Dextran Methacrylic acid (MAA)

Polyethylene glycol acrylate/methacrylate(PEGA/PEGMA)

Polyethylene glycol diacrylate/dimethacrylate(PEGDA/PEGDMA)

1.3 ChitosanChitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tach nhóm acetyl (quá trìnhdeacetyl hoá chitin) khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino Nói cáchkhác, chitosan là một polymer của D-glucosamin, được phát hiện lần đầu tiên bởiRouget vào năm 1859 [9] Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin vàcellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở carbon thứ 2.

Chitosan là sản phẩm của quá trình deacetyl hóa chitin băng kiểm đặc (mức độdeacetyl hoá của chitin đạt trên 50%); là một polymer chứa các don vi làGlucosamine và N-acetyl-glucosamine liên kết với nhau băng liên kết B-14-glycoside Trong tự nhiên, chitosan xuất hiện ở thành tế bào của một số loài nắm,tuy nhiên, trong thương mai chitosan được sản xuất bang cách deacetyl hoá chitin

[9].

Công thức phan tử: (C6H1104N)nKhối lượng phân tử: Mehitosan= (161.07)n

HOH;C

Hình 1.4 Công thức cấu tạo c a chitosan

Chitosan được sử dụng rộng rãi trong vi bao bởi chitosan có khả năng đáp ứng sinhhọc và phân hủy sinh học cao, trong cơ thé người chitosan được phân giải dé dàngbởi enzyme lysozyme Bên cạnh đó, chitosan còn được xem là một chất kết dínhsinh học, các nghiên cứu cho thay chitosan có thé duy trì sự hap thụ và bảo vệ thuốctrong hệ tiêu hóa do vậy chitosan thường được sử dụng dé vi bao các thành phandược phẩm có hoạt tính sinh học cung cấp cho cơ thể qua đường miệng đến cácvùng cụ thé của hệ tiêu hóa như dạ day ruột non và niêm mac Một nghiên cứu khác

cho thấy, chitosan hoạt động như một chất tăng cường thâm thấu IIlum et al (1994)

lần đầu tiên đã công bố về khả năng thâm thấu của chitosan Chitosan có thé tăngcường kênh vận chuyển hấp thụ, điều này có vai trò quan trọng trong việc vậnchuyển các chất ưa nước, các hợp chất như peptide sinh học và các oligonucleotidesqua màng Cơ chế của việc tăng thâm thấu qua mảng dựa trên tính chất mang điệntích dương của polymer khi đó polymer tương tác với màng tế bào màng làm thayđôi cấu trúc của các protein liên kết [10]

1.4 AlginateAlginate là polysaccharide dị hợp mạch thăng được chiết tách từ các loại tảo khácnhau, với 2 đơn vị cau trúc là B-D-mannuronie và ø-L-guluronic acid Alginate hìnhthành từ sự liên kết giữa các monomer này ở các vị trí C-1 và C-4 băng liên kếtglucozide, tỉ lệ của 2 hợp phan này (mannuronic: guluronic acid) thường là 1:5

Calcium alginate được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực vi bao Vi bao bang alginatecó những ưu điểm: dé tạo gel bao vi khuẩn, không độc cho cơ thể, rẻ tiền, điều kiệnxử lý dễ dàng, dễ chuẩn bị và thực hiện đơn giản, dễ hoà tan trong ruột và giảiphóng tế bào Tuy nhiên hat alginate cũng có một vài nhược điểm như: dễ bị tonthương bởi môi trường acid và mat độ ôn định co học trong môi trường acid lactic.Hơn nữa gel alginate hình thành trong môi trường có sự hiện diện của những ioncanxi, trạng thái gel bi phá hủy khi bi ion đơn tri hoặc tác nhan tạo phức hấp thụ ioncanxi như đệm phosphate, lactate va citrate Da có nhiều nghiên cứu nham tim ragiải pháp để khắc phục những nhược điểm trên hướng tới mục tiêu cuối cùng là bảovệ hạt vi bao đến vị trí mong muốn dé phóng thích chất nhân bên trong Phủ thêmlớp bảo vệ hạt alginate được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm với những vật liệunhư: chitosan, tinh bột biến tính, xanthan gum [10]

Trong những năm gan đây, việc vi bao trong gel aginate calcium đang được quantâm Dịch huyền phù bao gồm sodium alginate và chất nhân sẽ cho nhỏ giọt vàodung dịch tao gel như CaC]s, các hạt gel như alginate calcium sẽ hình thành và códạng hình cầu Trong mỗi hạt gel, tạo thành một mạng lưới (matrix) bao quanh chất

nhân, cấu trúc hạt gel như vậy sẽ tạo thành các lỗ xốp, thuận tiện cho việc khuếch

tán cơ chất vào và khuếch tán sản phẩm ra khỏi hạt gel [8, 10]

O08 0 H

ipo

e—_ O89 Ohydrogel =Hình 1.6 Sự hình thành gel giữa alginate va Ca“?* Ban chất liên kết giữa chitosan và alginate

Các polysaccharid sinh học như là alginate và chitosan hiện nay đang được chútrọng nghiên cứu vì chúng có nhiều khả năng ứng dụng trong lĩnh vực vi bao tế bảo,vận chuyền thuốc và kỹ thuật mô Một yếu t6 có thé phat triển vat liệu sinh hoc sử

dụng alginate và chitosan là khả năng liên kết giữa nhóm cacboxyl của alginate vànhóm amino của chitosan thông qua liên kết ion của hai nhóm nay tạo nên một cấutrúc 3 chiều Hình dạng của liên kết này không phụ thuộc vảo tỷ lệ khối lượng G/Mtrong cấu trúc của alginate Khả năng điều chỉnh đặc tính hóa lý của sự liên kết giữaalginate và chitosan được thực hiện thông qua quá trình điều chỉnh các nhóm chức

Trong quá trình tạo hạt, hỗn hợp dung dịch IgY/alginate được cho vào môi trường

vi bao có sự hiện diện ion Ca”! và chitosan Màng liên kết giữa các pha được hìnhthành bởi phức hợp giữa hai chất đa điện ly mang điện tích trái dấu polyanion algi-nate và polycation chitosan Tốc độ khuếch tán của ion canxi hướng vào lõi alginatenhanh hơn so với chitosan vì ion canxi có trọng lượng phân tử thấp hơn và do vậyhình thành lõi gel Sau đó, màng chitosan-alginate được hình thành [13] Alginatecó đặc tính bị co rút lại trong môi trường có pH thấp và hòa tan trong môi trường cópH cao Ngược lại, chitosan hòa tan trong môi trường pH thấp và không tan trongmôi trường pH lớn hơn 7 [10] Trong phương pháp cố định tế bào bang cách vi baotrong phức hợp alginate — chitosan, kích thước thực tế của hat phan lớn phụ thuộcvào tỷ lệ giữa alginate va chitosan, khối lượng của các polymer này va pH của dungdich [11].

Chitosan

Hình 1.7 Liên kết giữa chitosan va alginate1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dung IgY và san phẩm vi bao IgYKháng thé IgY có các đặc tính hóa sinh học rat phù hop với việc điều trị miễn dichthông qua đường uống[ 12] Những năm gần đây, các tính chất của alginate và chi-

tosan đã được ứng dụng trong sản xuất vi bao thông qua đường uống vào co thé khimang các chất nhân khác nhau: Peptides (Hari et al, 1996), protein (Anal, Bhopat-kar, Tokura, Tamura & Stevens, 2003) và các loại thuốc (Anal & Stevens, 2005) đểchuyển đến dạ dày và đường ruột [13] IgY đã được ứng dụng trong lĩnh vực chănnuôi thú y và phòng chữa bệnh cho người.

* Ứng dụng của khang thé IgYNăm 2002, Carlander sử dụng kháng thé IgY như công cụ phòng chống các bệnhnhiễm trùng ở bệnh nhân xơ gan Các bệnh nhân được sử dung kháng thé IgYkháng P aeruginosa dưới dạng dung dịch súc miệng vào buổi tối (70ml, 0.7 mg/mlIgY) Kết quả của phương pháp này cho thấy giúp giảm các triệu chứng nhiễmkhuẩn P aeruginosa ở bệnh nhân xơ gan Đông thời giúp giảm việc sử dụng thuốckháng sinh trong quá trình điều trị [14, 15]

Năm 2011 Michael G Wallach va cộng sự sử dụng kháng thé IgY đặc hiệu với virút cúm HIN1, H3N2 và H5N1 trên mô hình chuột thử nghiệm, kết quả 100% độngvat thí nghiệm được bảo vệ khỏi vi rút gây bệnh.

* Các nghiên cứu vi bao kháng thé IøYNăm 2005 Jennifer Kovacs-Nolan, Yoshinori Mine đã nghiên cứu ảnh hưởng củamôi trường dạ dày và ruột đến chế phẩm vi bao kháng thể IgY kháng VP8, nghiêncứu nảy sử dụng chất bao là tinh bột bắp, PEG 6000 và Eudragit L100-55

s* Các nghiên cứu vi bao kháng thé IgY sứ dung chất bao chitosan va alginateNăm 2007 và năm 2009 Xiao —Yu Li và cộng sự đã nghiên cứu khảo sat ảnh hưởngcủa pH, nông độ chitosan đến hiệu quả vi bao kháng thé IgY

Năm 2015 Kawin Punyokun và cộng sự đã nghiên cứu vi bao kháng thé IgY khángVibrio Harveyi nhằm đánh giá khả năng bi phân hủy trong môi trường dạ day varuột.

CHƯƠNG 2: DOI TUONG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 DOI TƯỢNG2.1.1 Kháng thé IgY khang Enterovirus 71 (EV 71)Khang thé IgY kháng EV71 được cung cấp bởi Labo Sinh hoc phân tử, Khoa Visinh mién dich, Vién Pasteur Tp Hồ Chí Minh

Địa chỉ: 167 Pasteur, Phường 8, Quận 3, Hồ Chí Minh.2.1.2 Chất bao

a ChitosanChitosan dang bột min, do Công ty TNHH Hùng Tién san xuấtDia chi: lô 45A khu công nghiệp Tra Nóc, Quận Bình Thủy, TP Can Tho

Bang 2.1 Thông số kỹ thu tc a Chitosan

Thông số Giá trịMàu sắc Mau trang nga

Ham luong tro (%) <1

D6 am (%) < 10Độ deacetyl hóa (%) 97.2

pH 7-9

b Sodium alginateSodium alginate có xuất xứ từ An Độ, do công ty HiMedia cung cấp

Bang 2.2 Thông số kỹ thu tc a Sodium alginate

Thông số Giá trịMau sacMau vang nau

18 | Nước cất 2 lần Viện Pasteur Tp HCM

Bảng 2.4 Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu

2100STT Thiết bị Xuất xứ

1 | Máy ly tâm lạnh GYROZEN, Hàn Quốc2 | Máy khuấy từ IKA, Đức

3 | Máy rửa ELISA PW 40, Sanofi Pasteur

4 | Máy đọc kết qua ELISA Thermo scientific5 | Tủ âm lắc GFL 30316 | Cân sấy âm OHAUS7 | May do pH Thermo scientific8 | Tuam Jouan

9 | May vortex Labora, Anh

10 | Cân điện tử 4 số lẻ SatoriusII | Tủ lạnh SANYO

¡2 | May say thang hoa EYELA FDU Nhat Ban

2.2 PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU2.2.1 Quy trình vi bao kháng thé IgY kháng EV71

Kháng thê IgY kháng EV71

Vv Vv

Sodium aleinate Phối trộn Chuẩn bị môi trường

s IgY — Sodium alginate vi bao

Ỷ

Tạo hạt

ỶLọc và rửa hạt

Ỷ

Say thăng hoa

San pham vi bao

Hình 2.1 Quy trình vi bao kháng thé IgY kháng EV71THUYÉT MINH QUY TRÌNH

s* Phối trộn lợY — Sodium alginateDung dich kháng thé IgY được phối trộn với dung dịch sodium alginate theo tỷ lệthé tích IgY — Sodium alginate là 1:3, khuấy déu hỗn hợp với tốc độ khuấy 200vòng/ phút.

s* Chuan bị môi trường vi bao

Chitosan được hòa tan bang acid acetic 1% (v/v), khuấy đều dung dịch trongkhoảng 20 — 30 phút, sau đó dung dịch chitosan được lọc qua vải lọc để loại bỏ cáccầu tử không tan Môi trường vi bao được chuẩn bị bằng cách hòa trộn dung dịchCaClz với dung dich Chitosan, tỷ lệ thể tích dung dịch CaC]› : Chitosan là 1:1

s* Tao hat

Hỗn hợp dung dich sodium alginate/ IgY được cho vào bom tiêm (đường kính kimtiêm 0.60 mm), sau đó nhỏ giọt IgY — sodium alginate băng bơm tiêm vào môitrường vi bao (nhỏ giọt cách môi trường vi bao 8 cm, nhỏ giọt chậm và liên tục) lắcđều hỗn hợp và dé hạt vi bao 6n định cấu trúc trong 1h ở nhiệt độ 4 — 6°C, tỷ lệ thétích dung dich sodium alginate/ IgY và môi trường vi bao là 1: 20 [16, 17].

s* Loc và rửa hat

Hạt vi bao sau khi ôn định cau trúc, tiễn hành lọc qua vải lọc để thu hạt Sau đódùng 50 ml nước cất dé rửa hạt

s* Say thăng hoaHat vi bao sau lọc sẽ được tiễn hành say thăng hoa ở áp suất 3.6 Pa, thời gian sấy 16— 17h Quá trình sấy thăng hoa được thực hiện trong thiết bị EYELA FDU 2100,Nhật Bản.

Sản phâm vi bao sau say được lưu trữ trong lọ kín, có túi hút âm, bao quản ở nhiệtđộ phòng.

2.2.2 Nội dung nghiên cứuNội dung nghiên cứu của luận văn là khảo sát ảnh hưởng của các chất bao và điềukiện vi bao đến hiệu qua của quá trình vi bao kháng thé IgY kháng EV71 trongkhuôn gel chitosan — alginate Đồng thời, khảo sát độ bền của chế phẩm vi bao vớiđiều kiện mô phỏng môi trường trong dạ dày (simulated gastric fluid — SGF) vađánh giá khả năng tự giải phóng in vitro của IgY (In vitro IgY release) Nội dung vatrình tự khảo sát thí nghiệm được trình bày như hình 2.2.

Nông độ sodium alginate khảo sát:

1 Khảo sát anh hưởng của nông độ sodium alginate 1.5%, 26, 2.5%, 3%

5 Khao sát độ bền của chế phẩm vi bao với điều

kiện mô phỏng môi trường dạ dày

+ Tỷ lệ thể tích dung dịch IgY : Alginate = | : 3 (v/v)+ Tỷ lệ thể tích dung dịch Chitosan : CaCls = 1: I (v/v)+ Ty lệ thể tích dung dịch (IgY : Alginate) : (Chitosan : CaCl2) = 1 : 20 (v/v)+ Nong do chitosan: 0.2% (w/v)

+ Nông độ CaCl: 1.5% (w/v)+ pH môi trường vi bao: 4Thông số thay đổi:

Nong độ sodium alginate: 1.5%, 2 %, 2.5%, 3% (w/v)

Thông so can xác định:Hiệu quả vi bao (Encapsulation Efficiency - EE%)

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nông độ CaChMục đích: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ CaCls đến hiệu quả vi baoThông số cô định:

+ Tỷ lệ thể tích dung dịch IgY : Alginate = | : 3 (v/v)+ Tỷ lệ thể tích dung dich Chitosan : CaCls = 1: | (v/v)+ Ty lệ thể tích dung dịch (IgY: Alginate) : (Chitosan : CaCl2) = 1 : 20 (v/v)+ Nong do chitosan: 0.2% (w/v)

+ Nong độ sodium alginate: Kết quả thi nghiệm 1+ pH môi trường vi bao: 4

Thông số thay đổi:Nong độ CaClo: 1%,1.5%, 2%, 2.5% (wiv)Thông số cần xác định:

Hiệu quả vi bao (Encapsulation Efficiency - EE%)

Thí nghiệm 3: Khao sát ảnh hưởng của pH trong môi trường vi baoMục đích: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường vi bao đến khả năng vi baoThông số có định:

+ Tỷ lệ thể tích dung dịch IgY : Alginate = | : 3 (v/v)+ Tỷ lệ thể tích dung dịch Chitosan : CaCls = 1: I (v/v)+ Ty lệ thể tích dung dịch (IgY: Alginate) : (Chitosan : CaCl2) = 1: 20 (v/v)+ Nong do chitosan: 0.2% (w/v)

+ Nong độ sodium alginate: Kết quả thi nghiệm 1

+ Tỷ lệ thể tích dung dịch IgY : Alginate = | : 3 (v/v)+ Tỷ lệ thể tích dung dịch Chitosan : CaCls = 1: I (v/v)+ Ty lệ thể tích dung dịch (IgY: Alginate) : (Chitosan : CaCl2) = 1 : 20 (v/v)+ Nong độ CaCl›: Kết quả thí nghiệm 1

+ Nông độ sodium alginate: Kết quả thí nghiệm 2+ pH môi trường vi bao: Kết quả thí nghiệm 3Thông số thay đổi:

Nong độ chitosan: 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3% (w/v)Thông số cần xác định:

Hiệu quả vi bao (Encapsulation Efficiency - EE%)

Thí nghiệm 5: Khảo sát độ bên của chế phẩm vi bao với điều kiện mô phỏng môitrường da day (simulated gastric fluid — SGF)

Mục đích: Khảo sát độ bên của chế phẩm vi bao với điều kiện mô phỏng môitrường trong dạ dày

Thông số có định:+ Tỷ lệ thé tích dung dịch phối trộn IgY : Alginate = 1 : 3 (v/v)+ Tỷ lệ thể tích dung dich Chitosan : CaCls = 1: | (v/v)

+ Ty lệ thể tích dung dịch (IgY : Alginate) : (Chitosan : CaCl2) = 1 : 20 (v/v)+ Nong độ CaCl›: Kết quả thí nghiệm 1

+ Nông độ sodium alginate: Kết quả thí nghiệm 2+ pH môi trường vi bao: Kết quả thí nghiệm 3+ Nông độ chitosan: Kết quả thí nghiệm 4+ Áp suất say thăng hoa: 3.6 Pa

+ Thời gian say thăng hoa: 17h+ Nong độ enzyme pepsin: 3.2 mg/ ml+ Ty lệ enzyme : co chat = | : 20+ Nhiệt độ ủ: 37°C

Thông số thay đổi:Thời gian ủ: 0,0.5,2,3 va4h

Thông số cần xác định:Hoạt tính kháng thé còn lại

Thí nghiệm 6: Đánh giá kha nang tự giải phóng In vitro của IgY (In Vitro IgYRelease)

Mục đích: Khao sat khả nang tự giải phóng in vitro cua IgYThông số có định:

+ Tỷ lệ thể tích dung dịch IgY : Alginate = | : 3 (v/v)+ Tỷ lệ thể tích dung dich Chitosan : CaCls = 1: | (v/v)+ Ty lệ thể tích dung dịch (IgY: Alginate) : (Chitosan : CaCl2) = 1: 20 (v/v)

+ Nong độ CaCl›: Kết quả thí nghiệm 1+ Nông độ sodium alginate: Kết quả thí nghiệm 2+ pH môi trường vi bao: Kết quả thí nghiệm 3+ Nông độ chitosan: Kết quả thí nghiệm 4+ Áp suất say thăng hoa: 3.6 Pa

+ Thời gian say thăng hoa: 17h+ Môi trường mô phỏng dạ day: NaCl 0.03M, pH 1.2, không có enzyme pepsin.+ SIF: KH2POs, pH 6.8, không có pancreatin.

+ Nhiệt độ ủ: 37°CThông số thay đổi:Thời gian u: 0, 2, 3, 4, 5, 6 va 16h

Thông số cần xác định:Nông độ protein giải phóng

2.3 CAC PHƯƠNG PHÁP PHAN TÍCH

2.3.1 Dinh lượng protein bằng phương pháp Bradford

“+ NguyÊn tac

Phuong pháp Bradford dựa trên sự thay đôi độ hấp thụ được tạo thành từ liên kếtcủa Cooomassie Brilliant Blue G — 250 với protein trong dung dich acid CoomassieBrilliant Blue G — 250 là một trong hai hình thức hóa hoc của hop chấttripheylmethane disulfonated, thường ton tại ở hai dạng mau đỏ và xanh O dạngproton hóa, thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu đỏ da cam Thuốc nhuộm này cókhả năng liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm ky nước và cácnhóm mang điện tích dương trên phân tử protein Trong môi trường của các gốcmang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và có màu xanh xuất hiện Cácprotein khi phản ứng xanh Coomassive sẽ hình thành hợp chất màu, có khả năng

Các kháng thể sử dụng trong phương pháp ELISA được gắn với enzyme băng liênkết đồng hoá trị Kháng nguyên được gan với giếng plastic và kháng thé liên kết vớienzyme được gan với kháng nguyên Kháng thé không gắn kháng nguyên sẽ bị rửa