Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật vật liệu: Nghiên cứu khả sát các chế độ tạo Nanocapsules Chitosan chứa thuốc Curcumin bằng phương pháp Coaxial Electrospraying

TÓM TẮT LUẬN VĂN Hạt nanocapsule chitosan chứa thuốc curcumin được chế tạo thành công bằng phương pháp coaxial electrospraying – phương pháp cho phép chế tạo các hạt polymer nhiều lớp c

TỔNG QUAN

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO HẠT POLYMER CÓ CẤU TRÚC LÕI – VỎ

Một trong những mối quan tâm chính của quá trình tổng hợp hạt nano có cấu trúc lõi – vỏ là có thể điều khiển được kích thước và hình dạng hạt Điều này có thể đạt được thông qua việc tổng hợp trong nhũ tương hoặc micell bằng cách sử dụng hợp chất hoạt động bề mặt phù hợp Các micell đóng vai trò là nhân và nền phát triển của các hạt nano

Nhũ hoá là phương pháp phổ biến được sử dụng để chế tạo các hạt polymer mang thuốc có cấu trúc lõi - vỏ

Hình 1.1 Các phương pháp chế tạo hạt polymer có cấu trúc lõi – vỏ trong dung dịch

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 4 Để chế tạo hạt polymer có cấu trúc lõi – vỏ trong dung dịch, có 4 phương pháp thường được sử dụng:

- Polymer hoá nhũ tương hai bước (I): là phương pháp đầu tiên được sử dụng để chế tạo hạt polymer có cấu trúc lõi – vỏ

- Nhũ hoá bằng cách sử dụng các hợp chất bề mặt (II)

- Tạo cấu trúc lõi – vỏ bằng cách gắn các hạt cation polymer có kích thước nhỏ lên hạt anion polymer có kích thước lớn hơn (III), theo sau đó là quá trình xử lý nhiệt

- Block – copolymer có cấu trúc ưa nước và kị nước được sử dụng để tạo thành các hạt micell, theo sau đó là quá trình đóng rắn pha vỏ hoặc pha lõi

Tuy nhiên, phương pháp chế tạo hạt trong dung dịch tồn tại những nhược điểm sau:

- Các phương pháp chế tạo thường sử dụng các hợp chất hoạt động bề mặt Các hợp chất này thường tồn tại trong sản phẩm thu được, làm giảm tính chất của các loại thuốc đưa vào và có thể gây độc trong quá trình sử dụng

- Việc phân tán thuốc vào hệ dung dịch có thể làm hao tổn một lượng lớn thuốc do thuốc không nằm trong lõi của các hạt mà phân tán trong hệ dung dịch Để khắc phục những nhược điểm nêu trên, một phương pháp mới được nghiên cứu và sử dụng để chế tạo các hạt polymer có cấu trúc lõi –vỏ: Phương pháp Coaxial electrospraying

1.1.2 PHƯƠNG PHÁP COAXIAL ELECTROSPRAYING 1.1.2.1 Giới thiệu

Coaxial electrospraying là một kỹ thuật tạo hạt polymer có cấu trúc nhiều lớp với kích thước micro – nanomet từ dung dịch polymer bằng cách sử dụng lực tĩnh điện (lực điện trường) và đầu kim có cấu trúc đồng tâm

1.1.2.2 Cơ sở lý thuyết của phương pháp Coaxial electrospraying

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 5 Về cơ bản, phương pháp này được cải tiến dựa trên phương pháp Electrospraying, nên cơ sở lý thuyết của phương pháp Coaxial electrospraying cũng tương tự như phương pháp Electrospraying Về lý thuyết, phương pháp Electrospraying là một phương pháp phun chất lỏng dựa trên tác động của lực điện trường Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này dựa trên lý thuyết của các giọt chất lỏng nhiễm điện trong quá trình phun [2]

Khi hiệu điện thế cao áp được đặt vào hệ sẽ làm xuất hiện một điện trường lớn Điện trường đặt trên các giọt polymer trên đầu kim có thể làm biến đổi hình dạng của giọt polymer này Các điện tích tạo ra một lực tĩnh điện bên trong giọt polymer cạnh tranh với sức căng bề mặt của dung dịch tạo thành nón Taylor – một điểm đặc trưng của giọt polymer được tích điện Khi lực điện trường có thể đủ mạnh để có thể thắng được sức căng bề mặt trên các giọt, các giọt polymer này bị tách thành các hạt nhỏ và di chuyển về phía bộ phận thu mẫu Do lực đẩy Coulomb của lực điện trường mà các hạt được tạo thành không bị kết tụ lại với nhau trong quá trình bay đến bộ phận thu mẫu Khi các hạt di chuyển trong khoảng không giữa các điện cực, dung môi bốc hơi một phần và polymer hóa rắn ở dạng hạt khi đến bộ phận thu mẫu

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý của phương pháp Electrospraying [2]

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 6 Tuy nhiên, đầu kim được sử dụng trong phương pháp Coaxial electrospraying được cấu tạo từ nhiều kim được thiết kế đồng tâm, mỗi đầu kim sẽ được sử dụng để dẫn 1 luồng dung dịch polymer khác nhau Kết quả là hạt thu được sẽ có cấu tạo đa lớp

1.1.2.3 Thiết bị Coaxial electrospraying Hệ Coaxial electrospraying được cấu tạo gồm bốn phần chính:

• Bộ phận tạo áp: Máy biến áp (high voltage supply) máy biến áp dùng để tạo điện trường E lớn giữa đầu kim và bảng điện cực nhận

• Hệ thống phun dung dịch bao gồm thiết bị truyền lực: máy bơm vi lượng, ống tiêm chứa dung dịch polymer, ống dẫn

• Đầu kim có cấu trúc đồng tâm: Việc chế tạo đầu kim đồng tâm đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình thiết lập hệ Coaxial electrospraying Ngoài việc đầu kim trong và đầu kim ngoài phải đồng tâm, việc thiết kế để sự dẫn điện đồng đều giữa 2 đầu kim này cũng đóng vai trò quyết định đến sự thành công của quá trình Coaxial electrospraying

• Bộ phận thu mẫu: là nơi thu mẫu Có nhiều dạng cấu tạo hệ thu mẫu Mỗi hệ thống thu mẫu đều có ưu và nhược điểm Trong đó phổ biến là sử dụng màng thu nhôm hoặc thu mẫu trong dung dịch

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 7

Hình 1.2 Sơ đồ thiết bị Coaxial electrospraying sử dụng bộ phận thu mẫu trong dung dịch [3]

Ngoài ra, để có thể theo dõi và phân tích chính xác quá trình hình thành nón Taylor và ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình Coaxial electrospraying, hệ thống camara với độ phóng đại lớn được tích hợp thêm vào hệ thống thiết bị

1.1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình Coaxial electrospraying

Như đã nói ở phần trên, phương pháp Coaxial electrospraying được thiết kế dựa trên nguyên lý của phương pháp Electrospraying Do đó, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình Coaxial electrospraying cũng giống như các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình Electrospraying Theo các nghiên cứu về phương pháp Electrospraying, hình dạng, đường kính và cấu trúc hạt thường chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố:

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 8

• Tính chất của hệ dung dịch polymer: nồng độ polymer trong dung dịch, sức căng bề mặt của dung dịch polymer, độ dẫn điện của dung môi và polymer, độ bay hơi của dung môi sử dụng,

• Các thông số thực hiện quá trình Coaxial electrospraying: điện áp đặt vào, tốc độ phun, khoảng cách đầu phun và bộ phận thu mẫu

• Yếu tố về môi trường: nhiệt độ, độ ẩm tương đối,…

1.1.2.4.1.Ảnh hưởng của dung dịch polymer và hệ dung môi a Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch polymer

Khi tiến hành Electropspraying dung dịch polymer, các giọt polymer trải qua quá trình bay hơi và khuếch tán đồng thời Các chuỗi rối hình thành trong quá trình và quyết định đến hình thái cuối cùng của hạt Sự đồng đều và kích thước hạt sẽ nhỏ hơn khi giới hạn được chuỗi rối [3] Số lượng rối trên một chuỗi trong dung dịch, (ne)sol, được tính toán thông qua nồng độ dung môi: ( ) e sol w e n M

Quá trình Electrospraying chỉ xảy ra đối với trường hợp 1 chuỗi rối trên mạch

HẠT NANO POLYMER ỨNG DỤNG TRONG VIỆC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

Trong những năm gần đây, việc ứng dụng các hệ dẫn truyền thuốc có kích thước nano đang được mở rộng nghiên cứu và bước đầu được đưa vào thử nghiệm Để có thể sử dụng trong việc điều trị ung thư, hệ dẫn truyền thuốc phải đáp ứng các yêu cầu sau:

• Tiếp cận được vị trí tế bào ung thư, nơi thường cách khá xa vị trí đưa thuốc vào cơ thể

• Duy trì tại vị trí tế bào ung thư, có thể nhả thuốc một cách có điều khiển theo thời gian, hạn chế tác dụng phụ của thuốc và phải có sự tương thích sinh học

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 22

Hình 1.13 Cơ chế thuốc trong mạch máu đi vào tế bào [18]

Như được trình bày ở hình 1.13, việc dẫn truyền thuốc có chọn lọc bằng cách sử dụng các hạt nano được thực hiện bằng cơ chế lỗ hổng tế bào Với các tế bào khỏe mạnh, các kích thước lỗ hổng dường như là rất nhỏ, các hệ dẫn truyền thuốc sẽ không có khả năng đi qua thành tế bào để có thể tiến sâu vào bên trong tế bào Tuy nhiên, khi tế bào bị tổn thương – tế bào ung thư – thì sẽ xuất hiện các lỗ hổng tế bào lớn, các hệ mang thuốc nano có thể dễ dàng đi qua các lỗ hổng này để tiến vào sâu trong tế bào Đó chính là cơ chế chọn lọc tế bào của hệ dẫn truyền thuốc có kích thước nano

Bảng 1.1 trình bày một số kích thước lỗ hổng tế bào ở một số loại tế bảo của các cơ quan trong cơ thể Có thể thấy rằng, các tế bào bị ung thư có kích thước lỗ hổng tế bào lớn hơn khá nhiều so với các tế bào thông thường Ví dụ, tế bào khối u có kích thước lỗ hổng tế bào vào khoảng 200 – 780 nm Với kích thước này, hệ dẫn truyền thuốc có thể dễ dàng vượt qua thành tế bào để tiến sâu vào bên trong

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 23

Bảng 1.1 Kích thước lỗ hổng tế bào của một số cơ quan và một số tế bào nhiễm bệnh

Các nghiên cứu chỉ ra rằng, tùy thuộc vào vị trí của tế bào ung thư, mà kích thước hạt lý tưởng của các hệ dẫn truyền thuốc sẽ khác nhau Kích thước hạt được cho là “lý tưởng” để hệ dẫn truyền thuốc có thể đi vào các tế bào ung thư là phải nhỏ 200 nm [18]

Ngoài ra, để hạn chế và bù lại quá trình đào thải nhanh, kích thước trung bình hạt nên nằm trong khoảng 70 ± 20 nm

1.2.2 Ứng dụng hạt nano polymer có cấu trúc lõi – vỏ so với cấu trúc hạt thông thường Các hạt polymer có kích thước được sử dụng để điều khiển quá trình vận chuyển thuốc đã được nghiên cứu rộng rãi từ 50 năm trở lại đây Có rất nhiều bài báo cáo về quá trình chuẩn bị, sự ảnh hưởng của các thông số đến quá trình nhả thuốc và những khó

Tế bào của các cơ quan hoặc tế bào bị nhiễm bệnh

Kích thước lỗ hổng tế bào Động vật mẫu

Thận 20 – 30 nm Heo ghine, thỏ, chuột

Lá lách 150 nm Chuột bạch

Tủy xương 85 – 150 nm Heo ghine, thỏ, chuột

Xương, tim, tế bào cơ ≤ 6 nm Chuột bạch

Da, mô dưới da, tế bào niêm mạc ≤ 6 nm Chuột bạch

Hàng rào máu não Không có

Khối u não 100 – 380 nm Chuột Lang

Tế bào bị sưng tấy 80 nm – 1,4 àm Chuột Hamster

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 24 khăn phải đối mặt trong suốt quá trình Hầu hết những bài báo cáo đều tiến hành tạo hạt bằng phương pháp truyền thống và hạn chế rất nhiều thông tin về cơ chế nhả thuốc

Một cách tổng quát, quá trình nhả thuốc xảy ra theo hai cơ chế khác nhau: khuếch tán thụ động và sự phân hủy của polymer Theo lý thuyết, hệ vận chuyển thuốc lý tưởng phải giải phóng thuốc theo bậc không, nghĩa là hàm lượng thuốc nhả ra phải là hằng số theo thời gian Tuy nhiên, quá trình nhả thuốc của các hạt trong thực thế lại chia thành hai quá trình dễ dàng nhận biết [6]:

• Sự giải phóng bùng nổ của các phân tử thuốc nằm trên và ngoài bề mặt của các hạt bởi vì bề mặt phía ngoài của hạt dễ dàng bị thủy phân

• Sự nhả thuốc chậm và cân bằng hơn từ các phân tử thuốc nằm ở phía bên trong hạt khi các hạt bị phân hủy

Quá trình nhả thuốc của các hạt polymer bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: bản chất của polymer (trọng lượng phân tử, phối trộn hay độ kết tinh ); bản chất của phân tử thuốc được đưa vào polymer, độ hoạt động và sự phân bố của thuốc trong polymer; hình thái, độ xốp và sự phân bố kích thước hạt

Các hệ vận chuyển thuốc các hạt thường mắc phải một nhược điểm là quá trình nhả thuốc ban đầu thường lớn và khó kiểm soát do không kiểm soát được vị trí của thuốc đưa vào trong hạt Để giải quyết yếu điểm đó, hạt có cấu trúc lõi – vỏ được tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm Nghiên cứu của Shi Xu và các cộng sự cho thấy rằng, sau 5 h, lượng thuốc nhả ra của hạt có cấu trúc lõi – vỏ chỉ bằng một nửa lượng thuốc nhả ra so với hạt thông thường Hiện tượng nhả thuốc bùng nổ ở giai đoạn đầu cũng được giảm đi đáng kể trong trường hợp hạt có cấu trúc lõi – vỏ Trong 1h đầu tiên, lượng thuốc nhả ra từ hạt có cấu trúc lõi – vỏ chỉ 20 % Trong khi đó, hạt bình thường có lượng thuốc nhả ra trong 1 h đầu lên gần tới 60% [16]

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 25

Hình 1.14: So sánh sự nhả thuốc có kiểm soát của hạt FA-Chitosan chứa thuốc Gemcltabine có cấu trúc lõi – vỏ (a) và không có cấu trúc lõi vỏ (c) [16]

GIỚI THIỆU VỀ CURCUMIN

Curcumin được chiết tách chủ yếu trong củ nghệ vàng – Curcuma Longa – thuộc họ gừng có nguồn gốc từ Ấn Độ, được sử dụng rộng rãi trong việc chăm sóc sức khỏe, làm thực phẩm và chất nhuộm [19]

Curcumin có tên khoa học: (1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)hepta-1,6-diene-3,5-dione Công thức phân tử: C21H20O6, trọng lượng phân tử: 368.385 g/mol

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 26

Hình 1.15 Cấu trúc hóa học của Curcumin

1.3.1 Tính chất vật lý Curcumin là những tinh thể màu vàng cam, có điểm nóng chảy ở 183C

Curcumin không tan được trong nước, Ether Tuy nhiên, lại tan tốt trong Etanol, Chloroform, Dimethylsulfoxide(DMSO), Acetone,…

Tùy thuộc vào dung môi sử dụng mà dung dịch Curcumin có bước sóng hấp thu cực đại (λmax) khác nhau: trong Etanol là 425 nm, trong Acetone là 415 - 420 nm, trong Metanol là 430 nm

Curcumin bền trong môi trường pH acid nhưng không bền trong môi trường pH kiềm Trong môi trường kiềm, Curcumin dễ dàng bị phân hủy

Việc tìm hiểu khả năng bị phân hủy của Curcumin đóng vai trò rất quan trọng trong việc lựa chọn dung môi và môi trường dung dịch sử dụng để thực hiện quá trình Coaxial electrospraying Việc lựa chọn dung môi và môi trường phải đảm bảo thuốc Curcumin được bảo đảm về mặt tính chất, các tính chất dược lý không bị thay đổi sau quá trình Coaxial electrospraying a Phân hủy trong môi trường kiềm Curcumin tương đối bền trong môi trường acid nhưng lại bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường kiềm Ở pH = 8,5, chỉ sau 5 phút Curcumin đã bắt đầu phân hủy

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 27 thành Ferulic Acid và Feruloylmethane Sau đó, Feruloylmethane còn bị phân hủy thành

Pfeiffer và cộng sự [20] nghiên cứu sự phân huỷ của các thành phần Curcuminoid trong hệ đệm Phosphate pH = 7,4 ở 37C trong điều kiện có và không có huyết thanh bào thai bò Kết quả cho thấy Curcuminoid phân huỷ nhanh chóng trong điều kiện không có huyết thanh (phân huỷ 90% trong 12 giờ ủ) và Curcuminoid ổn định hơn trong điều kiện có huyết thanh Độ bền của các dẫn xuất Curcuminoid là khác nhau, kém bền nhất là Curcumin, tiếp đến là Demethoxycurcumin và Bisdemethoxycurcumin

Các Curcuminoid này bị phân huỷ tạo thành Vanilin, Ferulic Acid, Feruolymethane và Trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal

Nghiên cứu của Ying Jan Wang và cộng sự [21] cũng cho thấy 90%

Curcumin bị phân huỷ sau 30 phút trong môi trường đệm Phosphate pH = 7,2 ở 37C

Hình 1.16 Sự phân hủy của Curcumin

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 28 b Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng

Curcumin không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch Khi tiếp xúc với ánh sáng, Curcumin bị phân huỷ ngay cả ở dạng rắn và bị phân huỷ nhanh hơn khi ở trạng thái dung dịch Sản phẩm phân hủy là Vanillin, Vanillic Acid, Ferulic Aldehyde, Ferulic Acid Curcumin có thể bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng ngay cả khi có mặt oxi và không oxi

• Không có oxi, Curcumin có thể bị vòng hóa

• Khi có mặt oxi và ánh sáng, Curcumin phân huỷ tạo thành 4-Vinylguaialcol và Anilin

1.3.3 Tính chất dược lý của Curcumin

Curcumin có giá trị hoạt tính sinh học cao là do trong công thức cấu tạo của Curcumin có các nhóm hoạt tính sau:

• Nhóm Parahydroxyl: hoạt tính chống oxy hoá (1)

• Nhóm Keto: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào (2)

• Nhóm liên kết đôi: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào (3)

Hình 1.17 Phân bố các nhóm chức của Curcumin

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 29 Curcumin có hoạt tính sinh học chủ yếu như kháng oxy hóa, kháng virus, kháng nấm Những nghiên cứu trong những năm gần đây đã chỉ ra thêm rằng Curcumin làm giảm Cholesterol trong máu, hạn chế sự đông kết tiểu cầu, ngăn chặn sự nghẽn mạch và nhồi máu cơ tim, hạn chế các triệu chứng của bệnh đái tháo đường loại II, viêm khớp mãn tính ,bệnh đa xơ cứng, bệnh Alzheimer, ức chế sự tái tạo của virus HIV, nâng cao việc điều trị vết thương, bảo vệ khỏi tổn thương gan, tăng sự bài tiết của mật Đặc biệt, Curcumin trong những nghiên cứu gần đây được quan tâm đặc biệt vì có khả năng kháng ung thư và tiêu diệt tế bào ung thư [22, 23]

Ngoài ra, Curcumin cũng được chứng minh là không có tính độc cho dù sử dụng liều cao Có nhiều nghiên cứu về hàm lượng và liều dùng của Curcumin, theo đó hàm lượng Curcumin cao nhất mà cơ thể người có thể hấp thu là 12000 mg/ngày, trung bình từ 4000-8000 mg/ngày [24]

Tuy nhiên, khả năng hấp thu kém, sự thiếu tinh khiết, sự trao đổi và đào thải của

Curcumin trong tế bào diễn ra rất nhanh Điều này làm giảm đáng kể đặc tính sinh học của hợp chất polyphenol này Để giải quyết vấn đề này, đã có nhiều hướng tiếp cận để tăng hoạt tính sinh học của Curcumin Bằng cách sử dụng các hệ mang, sự đào thải của Curcumin đã được giảm đi đáng kể Những hệ mang có khả năng tăng cường hoạt tính sinh học của Curcumin có thể là các nanoparticles, liposome, micell và hệ photpholipid [22, 25].

CHITOSAN

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 30

Hình 1.18: Cấu trúc phân tử Chitin và Chitosan.[26]

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của Chitin trong đó nhóm ‒NH2 thay thế nhóm ‒ NHCOCH3 ở vị trí C2 Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết 1,4-glycoside

Chitosan có tên khoa học: Poly(β-(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose) hay Poly(β- (1,4)-D-glucosamine) Công thức phân tử: (C6H11NO4)n

Chitosan có nhiều đặc tính sinh học đa dạng như: khả năng kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, có khả năng phân hủy sinh học, độ tương thích sinh học cao, an toàn với tế bào cơ thể Do đó, Chitosan được sử dụng rất nhiều trong lĩnh vực vật liệu y sinh như làm hệ dẫn truyền thuốc, tạo sợi làm hệ scaffold, làm màng sợi dùng để chữa trị vết thương [27-29]

Dựa vào những tính chất đặc biệt kể trên, nhiều nghiên cứu đã sử dụng Chitosan để chế tạo hệ dẫn truyền Curcumin và đã có những kết quả khả quan Việc kết hợp Chitosan với Curcumin thông qua quá trình hòa tan hai loại hợp chất này không làm thay đổi nhiều tính chất dược lý của thuốc Curcumin [30-31] Do đó, trong luận văn này, Chitosan sẽ được sử dụng để chế tạo hạt nanocapsule làm hệ dẫn truyền thuốc Curcumin

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 31

THỰC NGHIỆM

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

• Có đường kính nhỏ hơn 200 nm và đường kính hạt trung bình trong khoảng 70 ± 20 nm

• Hạt thu được có cấu trúc lõi – vỏ.

NỘI DUNG ĐỀ TÀI

• Nghiên cứu khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nanocapsule

Chitosan chứa thuốc Curcumin bằng phương pháp Coaxial electrospraying.

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Chitosan có tên khoa học: Poly(β-(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose) hay Poly(β- (1,4)-D-glucosamine) Công thức phân tử: (C6H11NO4)n

Chitosan sử dụng trong đề tài được mua từ nhà cung cấp ACROS Organics Trọng lượng phân tử Mw= 100000 – 300000 Độ Deacetyl hóa DDA= 80 – 85%

Curcumin nguyên liệu ở dạng bột màu cam, mịn, không mùi không lẫn tạp chất khác, với hàm lượng curcumin tổng > 90%, sản xuất bởi Viện Dược liệu Hà Nội, chiết xuất từ củ nghệ vàng Curcuma Longa L

Công thức phân tử: CH3COOH Khối lượng phân tử: 98,078 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 16,5°C Nhiệt độ sôi: 118,1°C Nồng độ: 99,5% Hình dạng: Chất lỏng trong suốt, không màu Xuất xứ: Ấn độ

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 32 2.3.1.4 Đệm PBS

Phosphate Buffered Saline (PBS) là một dung dịch đệm được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu sinh học Đệm PBS giúp duy trì độ pH ổn định thông thường là pH khoảng 7,4 Nồng độ dung dịch và nồng độ ion của đệm tương thích với cơ thể của con người Thành phần của PBS bao gồm: Sodium Chloride (NaCl), Potassium Chloride (KCl), Sodium Phosphate (Na2HPO4) và Potassium Phosphate (KH2PO4) Đệm PBS trong luận văn được mua từ nhà cung cấp Sigma-Aldrich Dung dịch đệm được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1 viên hỗn hợp PBS (1g) vào 500 ml nước cất 2 lần

Tween 20 (Polysorbate 20) là một dạng chất hoạt động bề mặt có tác dụng ổn định và không độc hại, được sử dụng rất nhiều trong khoa học, dược lý và ứng dụng trong kỹ thuật y sinh Nó là dẫn xuất của Polyoxyethylene từ Monolaurate Sorbitan, và phân biệt với các loại khác trong họ Polysorbate nhờ chiều dài của Polyoxyethylene và Acid béo, ngoài ra còn có Ester Các sản phẩm thương mại còn có chứa một số chất hóa học khác

Tween 20 sử dụng trong luận văn được mua từ nhà cung cấp Sigma-Aldrich

2.3.2 Thiết bị và quy trình thực nghiệm

2.3.2.1 Dụng cụ - Thiết bị thực nghiệm

• Hệ thiết bị Coaxial Electrospraying

Hệ thống Coaxial Electrospraying sử dụng trong luận văn được thiết kế và lắp đặt tại Phòng thí nghiệm trọng điểm vật liệu Polymer & Composite Hệ thống gồm 5 bộ phận chính: Hệ cấp nguồn cao thế, hệ máy bơm vi lượng và ống tiêm, hệ thống điều khiển nhiệt độ, buồng thí nghiệm và bộ kim tiêm đồng trục Ngoài ra, hệ ống dẫn được sử dụng để kết nối ống tiêm với hệ kim đồng trục Thiết kế hệ của hệ thống Coaxial electrospraying được trình bày ở hình 2.1

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 33

Hình 2.1 Hệ thiết bị Coaxial electrospraying

Hệ cấp nguồn điện cao thế được chế tạo và hiệu chỉnh bởi Phòng thí nghiệm Vật lý kĩ thuật, khoa Khoa học ứng dụng, trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Hiệu điện thế cao áp tạo ra có giá trị từ 0 kv đến 45 kV, với bước nhảy là 2,5 kV

Lưu lượng của hệ dung dịch polymer được điều khiển bởi hệ máy bơm định lượng Perfusor ® compact S, B Braun Co., hình 2.2 Máy bơm có thể vận hành với lưu lượng nhỏ nhất là 0,1 ml/h và lưu lượng lớn nhất là 50 ml/h Kích thước ống tiêm có thể sử dụng được là từ 10 ml đến 50 ml

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 34

Hình 2.2 Máy bơm định lượng Perfusor ® compact S, B Braun Co

Nhiệt độ của buồng thí nghiệm được điều khiển nhờ hệ thống điều khiển nhiệt tự động Hệ thống điều khiển nhiệt sử dụng đồng hồ đo nhiệt hiệu: RKC REX-C410, xuất xứ Trung quốc Đầu dò nhiệt được thiết kế ở vị trí nằm phía trước và song song với hệ thống kim đồng tâm để đảm bảo nhiệt độ đo được là chính xác nhất Hệ 2 bóng đèn sợi đốt công suất 40 W được sử dụng để tạo nhiệt độ cho buồng thí nghiệm

Buồng thí nghiệm được thiết kế kín để hạn chế sự ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đồng thời duy trì nhiệt độ được ổn định Phần vỏ bọc được thiết kế bằng mica trong suốt có độ dày 3 mm để có thể dễ dàng quan sát trong quá trình thực hiện thí nghiệm Buồng thí nghiệm gồm bộ phận điều chỉnh khoảng cách từ đầu kim đến đế thu mẫu Đế thu mẫu được chế tạo bằng đồng để đảm bảo khả năng dẫn điện tốt và đồng đều trên toàn bộ bề mặt đế thu Đế thu được đặt trên một tấm gỗ dày cách điện để hạn chế sự rò rỉ điện cho hệ Mặt trên phía sau buồng thí nghiệm được gắn 2 quạt nhỏ có công suất 12 W để có thể hút không khí chứa dung môi trong quá trình tiến hành thí nghiệm để tránh tình trạng dung môi nằm trong buồng thí nghiệm không thể thoát ra ngoài, ảnh hưởng đến quá trình bay hơi của dung môi

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 35

Hình 2.3 Hệ đầu kim đồng tâm

Hệ kim đồng tâm được cung cấp bởi nhà sản xuất Ramé-hart instrument co., Mỹ, hình 2.3 Cấu tạo gồm hai kim tiêm được thiết kế đồng tâm, kích thước kim ngoài và kim trong lần lượt là 18 G và 24 G (kích thước đường kính trong của hai kim lần lượt là 0,840 mm và 0,305 mm) Chiều dài kim phía ngoài là 2,5 cm, kim phía trong dài hơn kim phía ngoài 0,5 mm Hệ kim được thiết kế để có thể dẫn điện trên toàn bộ hệ kim

Chi tiết thiết kế của đầu kim được trình bày ở hình 2.4 Hệ kim được gắn lên giá đỡ chế tạo bằng hệ composite Epoxy và sợi thủy tinh để đảm bảo hệ kim luôn song song với hướng của trọng lực đồng thời giúp việc thay đổi khoảng cách đầu kim và màng thu một cách dễ dàng

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 36

Hình 2.4 Thiết kế chi tiết của hệ kim đồng tâm

Hệ ống tiêm được sử dụng trong luận văn là hệ ống tiêm nhựa Vinahankook 20 ml có đầu cao su Do dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm là acid Acetic nên cấu tạo của phần cao su hoàn toàn không ảnh hưởng đến dung dịch polymer Hệ dung dịch được dẫn truyền từ bơm tiêm đến hệ đầu kim đồng tâm bằng hệ dây dẫn truyền dịch cung cấp bởi công ty cổ phần nhựa y tế MEDIPLAST được làm từ nhựa PVC

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 37

Hình 2.5 Ống tiêm nhựa 20 ml

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 38

• Hệ thống sấy chân không

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 39 2.3.2.2 Nội dung thực nghiệm

Phần thực nghiệm sẽ đươc tiến hành theo các bước khảo sát như mô tả ở hình 2.7

Hình 2.7 Quy trình thực nghiệm

❖ Bước 1: Kiểm tra nguyên liệu

Nguyên liệu Chitosan sẽ được phân tích TG để đánh giá hàm lượng ẩm còn tồn tại ở trong nguyên liệu

❖ Bước 2: Đánh giá khả năng bao phủ của hệ dung dịch polymer

Như đã trình bày ở phần tổng quan, khả năng tạo thành hạt có cấu trúc lõi – vỏ có thể được dự đoán thông qua việc đánh giá hệ số bao phủ của dung dịch pha vỏ lên dung dịch pha lõi Hệ số bao phủ được tính toán dựa trên sức căng bề mặt của 2 pha dung dịch

Mục tiêu của phần thí nghiệm này là dự đoán khả năng hình thành cấu trúc lõi – vỏ của hệ dung dịch được sử dụng

Một loạt các cặp dung dịch Chitosan và Chitosan chứa Curcumin với nồng độ Chitosan từ 2 wt% đến 5 wt% sẽ được xác định sức căng bề mặt để tính toán độ che phủ

Việc lựa chọn nồng độ Chitosan từ 2 wt% đến 5 wt% được dựa trên kết quả nghiên cứu

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 40 trước đây của nhóm tác giả [16] Quá trình chuẩn bị dung dịch để tiến hành đo sức căng bề mặt được thực hiện theo quy trình sau:

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH – ĐÁNH GIÁ

Hệ thống đo sức căng bề mặt bao gồm một máy bơm tiểu ly có gắn kim tiêm và một thấu kính quan sát được kết nối với máy tính Dung dịch polymer trong kim tiêm cài trên máy bơm sẽ tạo giọt, được quan sát thông qua thấu kính Hình ảnh hiển thị trên máy tính, sức căng bề mặt được tính toán thông qua các thông số cài đặt trên phần mềm kèm theo hệ thống và dựa trên giọt dung dịch có thể tích lớn nhất mà đầu kim còn giữ lại được

Mẫu dung dịch polymer được đo sức căng bề mặt tại : Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Vật liệu Polymer và Composite, Nhà C6, Đại học Bách Khoa Tp.HCM bằng thiết bị Dataphysics OCA 20, hãng sản xuất: Dataphysics Mẫu được đo sức căng bề mặt ở nhiệt độ thường

2.4.2 Quan sát hình thái bề mặt hạt bằng Kính hiển vi điện tử quét – SEM Việc phát các chùm điện tử trong SEM được thực hiện từ súng phóng điện tử (có thể là phát xạ nhiệt, hay phát xạ trường ), sau đó được tăng tốc Tuy nhiên, thế tăng

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 46 tốc của SEM thường chỉ từ 10 kV đến 50 kV vì sự hạn chế của thấu kính từ, việc hội tụ các chùm điện tử có bước sóng quá nhỏ vào một điểm kích thước nhỏ sẽ rất khó khăn Điện tử được phát ra, tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử hẹp (cỡ vài trăm Amstrong đến vài nanomet) nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu nhờ các cuộn quét tĩnh điện Độ phân giải của SEM được xác định từ kích thước chùm điện tử hội tụ, mà kích thước của chùm điện tử này bị hạn chế bởi quang sai, chính vì thế mà SEM không thể đạt được độ phân giải tốt như TEM Ngoài ra, độ phân giải của

SEM còn phụ thuộc vào tương tác giữa vật liệu tại bề mặt mẫu vật và điện tử Khi điện tử tương tác với bề mặt mẫu vật, sẽ có các bức xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này

Mẫu được phân tích SEM tại Khu công nghệ cao Tp Hồ Chí Minh Mã hiệu máy được sử dụng là: SEM – Hitachi S4800, Khu công nghệ cao Tp Hồ Chí Minh

Mẫu hạt thu được trên màng nhôm sẽ được đem đi phân tích trực tiếp mà không thông qua bất cứ quá trình chuẩn bị mẫu nào nữa

2.4.3 Tính toán và vẽ biểu đồ phân bố kích thước hạt

Sau khi có kết quả SEM, dùng phần mềm ImageJ để tiến hành đo đạc kích thước hạt Số lượng hạt được đo trên mỗi mẫu là 100 hạt Kết quả thu được sẽ được vẽ biểu đồ phân bố bằng phần mềm Origin

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 47

Hình 2.9 Giao diện phần mềm Image J

Hình 2.10 Giao diện phần mềm Origin

2.4.4 Phân tích cấu trúc hạt bằng Kính hiển vi điện tử truyền qua - TEM TEM có cấu trúc tương tự như kính hiển vi quang học với nguồn sáng (lúc này là nguồn điện tử), các hệ thấu kính (hội tụ, tạo ảnh…), các khẩu độ… Đầu tiên, điện tử

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 48 được tạo ra từ nguồn phát điện tử là các súng phát xạ điện tử Súng phát xạ điện tử hoạt động nhờ việc đốt nóng dây tóc điện tử, cung cấp năng lượng nhiệt cho điện tử thoát ra khỏi bề mặt kim loại Khi điện tử được tạo ra, sẽ bay đến cathode rỗng (điện cực Wehnet) và được tăng tốc nhờ một thế cao áp một chiều Chùm điện tử được được điều khiển thông qua hệ thống thấu kính từ, sao cho chùm điện tử truyền qua có độ lệch thích hợp tương ứng với từng loại thấu kính tiếp đó, hệ thống TEM có nhiều thấu kính với vai trò khác nhau ( thấu kính phóng đại, thấu kính nhiệu xạ, thấu kính hội tụ …)

Cơ chế tạo ảnh dựa trên cơ chế quang học, nhưng với độ tương phản xuất phát từ khả năng tán xạ điện tử

Mẫu hạt được phân tích TEM tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Vật liệu Polymer và Composite, Nhà C6, Đại học Bách Khoa Tp.HCM

Các hạt thu được trên màng nhôm sẽ được cạo ra và hòa tan vào dung dịch nước cất Trước khi tiến hành tạo mẫu để thực hiện phép đo, mẫu dung dịch chứa hạt Chitosan/

Curcumin được đánh siêu âm ở nhiệt độ 40 o C với thời gian 30 phút để hạn chế hiện tượng kết tụ giữa các hạt

2.4.5 Phương pháp sắc ký khí GC

Phép đo nhằm xác định lượng dung môi còn lại sau khi đã sấy chân không mẫu hạt

Phép đo được thực hiện tại phòng Phân tích thí nghiệm trung tâm, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh

Mẫu hạt và dung môi sẽ được phân tích đồng thời để có thể so sánh và đối chiếu

2.4.6 Phương pháp phân tích nhiệt khối lượng TG

Phép đo nhằm xác định hàm lượng ẩm có trong bột Chitosan nguyên liệu Phép đo được thực hiện tại trường Đại Học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh Nhiệt độ đo từ 30 o C đến 250 o C, với độ tăng nhiệt là 10 o C/ phút

2.4.7 Phương pháp phân tích đo độ hấp thu UV – VIS

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 49 Phép đo nhằm xác định hàm lượng Curcumin nhả ra khi tiến hành thử nghiệm nhả thuốc In vitro Mẫu được đo UV-VIS tại Khoa Công nghệ Hóa học – Trường Đại học Công nghiệp Tp.Hồ Chí Minh

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 50

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU BAN ĐẦU

Do dung môi sử dụng để tiến hành quá trình Coaxial electrospraying là Acid acetic có nồng độ 90% nên độ ẩm sẽ ảnh hưởng đến nồng độ của acid acetic Nguyên liệu Chitosan là dạng bột, có khả năng hút ẩm cao nên trong quá trình bảo quản sẽ có một lượng ẩm tồn tại Do đó, cần đánh giá độ ẩm để xử lý trước khi tiến hành hòa tan Chitosan bằng acid acetic

Hình 3.1: Phổ TG của mẫu Chitosan nguyên liệu

Kết quả TGA cho thấy, ở nhiệt độ gần 100 0 C, mẫu nguyên liệu bị mất đi một phần khối lượng Phần khối lượng mất đi chính là lượng ẩm có trong nguyên liệu ban đầu

Qua kết quả phân tích, hàm lượng ẩm có trong nguyên liệu là 6,2 wt% Do đó, mẫu cần phải được sấy khô trước khi tiến hành pha dung dịch.

DỰ ĐOÁN KHẢ NĂNG TẠO THÀNH CẤU TRÚC CORE-SHELL CỦA HẠT

Như đã trình bày ở phần tổng quan, sức căng bề mặt và sức căng liên diện pha của 2 dung dịch sử dụng để phun có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của hạt thu được Để đạt được cấu trúc lõi – vỏ như mong muốn, hệ số che phủ của dung dịch pha ngoài (dung dịch Chitosan) lên dung dịch pha trong (dung dịch Chitosan chứa thuốc Curcumin) (λ shell/ core) phải lớn hơn 0 Nghĩa là: λ shell/ core = γ core – γ shell - γ shell/ core > 0 (5)

Trong đó γ core là sức căng bề mặt của dung dịch Chitosan chứa Curcumin, γ shell là sức căng bề mặt của dung dịch Chitosan, γ shell/ core là sức căng liên diện giữa 2 pha

Trong trường hợp này, do dung dịch trong 2 pha là hai dung dịch có khả năng hòa tan vào nhau nên sức căng liên diện giữa 2 pha sẽ có giá trị gần bằng không (γ shell/ core ≈ 0)

Do đó hệ số che phủ có thể tính bằng công thức: λ shell/ core = γ core – γ shell (6)

Bảng 3.1 trình bày giá trị sức căng bề mặt của dung dịch Chitosan (γ shell) và sức căng bề mặt của dung dịch Chitosan có chứa thuốc Curcumin (γ core) với những nồng độ Chitosan khác nhau, đồng thời cũng đưa ra giá trị tính toán hệ số che phủ của pha dung dịch Chitosan lên pha dung dịch Chitosan chứa thuốc Curcumin (λ shell/ core)

Bảng 3.1: Sức căng bề mặt của dung dịch Chitosan và dung dịch Chitosan chứa thuốc

Curcumin và hệ số che phủ tương ứng

Nồng độ Chitosan (wt%) γ shell γ core λ shell/ core

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 52 Kết quả đo sức căng bề mặt của các dung dịch cho thấy không có sự khác biệt nhiều về sức căng bề mặt giữa dung dịch Chitosan và dung dịch Chitosan chứa thuốc Curcumin Dựa vào biểu thức (6), hệ số che phủ (λshell/ core) cũng được tính toán Kết quả cho thấy các giá trị hệ số che phủ (λshell/ core) đều dương với các dung dịch chứa Chitosan với nồng độ từ 2 wt% tới 5 wt% Điều này cho thấy các cặp dung dịch đều phù hợp để tiến hành chế tạo hạt nanocapsule có cấu trúc lõi – vỏ

Ngoài ra, kết quả đo sức căng bề mặt cho thấy không có nhiều sự thay đổi về sức căng bề mặt của dung dịch Chitosan khi nồng độ Chitosan tăng từ 2 wt% lên 5 wt% Kết quả cho thấy với hàm lượng thấp, Chitosan sẽ không tác động nhiều đến sức căng bề mặt của dung dịch do lượng Chitosan trong dung dịch khá nhỏ Do đó, trong quá trình Coaxial electrospraying, việc lựa chon dung môi đóng vai trò rất quan trọng trong việc tạo được hệ dung môi có sức căng bề mặt thấp để thuận tiện cho quá trình tạo hạt diễn ra dễ dàng hơn.

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TẠO THÀNH CHẾ ĐỘ PHUN

Trong quá trình Coaxial electrospraying, chế độ phun đóng vai trò rất quan trọng đến sự hình thành cấu trúc lõi – vỏ của hạt thu được Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hạt thu được có hình dạng tốt và có cấu trúc lõi – vỏ rõ ràng khi được tạo thành với chế độ phun là “cone-jet” Ngoài ra, một số nghiên cứu gần đây về phương pháp Coaxial electrospraying cũng cho thấy chế độ phun bị ảnh hưởng chủ yếu bởi hiệu điện thế đưa vào hệ Do đó, phần này tập trung vào việc khảo sát việc hình thành các chế độ phun trên đầu kim bằng cách thay đổi hiệu điện thế áp vào hệ và giữ nguyên các thông số khác của quá trình phun như khoảng cách phun và lưu lượng phun Hiệu điện thế với giá trị từ 5 kV đến 25 kV, với độ tăng hiệu điện thế là 2,5 kV, được sử dụng để khảo sát việc hình thành các chế độ phun trên đầu kim của hệ

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 53

Hình 3.2: Năm chế độ phun tương ứng: (a) droplet, (b) micro-dripping, (c) stable cone-jet, (d) pulsed con-jet and (e) multi-jet, đạt được tương ứng với các hiệu điện thế tăng dần: 5, 10, 12,5, 20 và 25 kV Thông số Coaxial electrospraying: L = 10 cm,

Q core / Q shell = 0,1/ 0,2 ml/h Nồng độ Chitosan: 5 wt%

Hình 3.2 trình bày các chế độ phun thu được khi thay đổi hiệu điện thế áp vào Khi hiệu điện thế áp vào khá nhỏ, U = 5 kV, lực điện trường không đủ lớn để có thể thắng được sức căng bề mặt và lực nhớt của dung dịch, dẫn đến việc hình thành một giọt lớn trên đầu kim (Hình 3.2 (a)), chế độ phun này được gọi là “droplet” Theo thời gian, giọt polymer này phát triển ngày càng lớn Khi kích thước của giọt polymer này đủ lớn, trọng lực và lực tĩnh điện đủ lớn để thắng được sức căng bề mặt và lực nhớt của dung dịch, giọt polymer này sẽ rơi xuống màng thu và tạo thành một lớp phim mỏng Chế độ phun này tiếp tục được ghi nhận khi hiệu điện thế tăng lên U = 7,5 kV Tuy nhiên, các hạt polymer rơi xuống có kích thước nhỏ hơn với tốc độ lớn hơn trong trường hợp hiệu điện thế sử dụng U = 5 kV

Chế độ phun “micro-dripping” thu được khi tăng hiệu điện thế lên 10 kV (Hình 3.2 (b)) Hiện tượng này xảy ra là do tác động của chế độ phun của đầu kim trong lên chế độ phun của đầu kim ngoài Với hiệu điện thế này, lực điện trường chỉ đủ lớn để hình thành chế độ cone-jet ở dòng polymer phía bên ngoài Trong khi đó, chế độ phun của dòng polymer phía bên trong vẫn đang tồn tại ở dạng giọt (droplet) Do đó cản trở sự phân tán

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 54 thành các hạt nhỏ của dòng polymer phía bên ngoài Kết quả là hình thành các giọt có kích thước micromet – nên gọi là chế độ micro – dripping

Khi tiếp tục tăng hiệu điện thế lên đến 12,5 kV, giọt polymer ở đầu kim đã được định thình thành nón Taylor có hình côn, chế độ phun đạt được là chế độ “cone – jet” Ở hiệu điện thế này, lực điện trường đã đủ lớn để có thể thắng được sức căng bề mặt của dung dịch polymer trong cả 2 pha, tạo thành chế độ phun “cone – jet” cho cả hai dòng polymer, hình 3.2 (c) Đây là chế độ thích hợp để tiến hành chế tạo hạt có cấu trúc lõi – vỏ Ngoài ra, chế độ này được duy trì khi tiếp tục tăng hiệu điện thế lên 15 kV và 17,5 kV

Khi hiệu điện thế sử dụng tăng lên 20 kV, chế độ phun chuyển thành “pulsed cone – jet” Ở chế độ phun này, hiệu điện thế lớn làm mất ổn định chế độ phun Với hiệu điện thế tương đối lớn, giọt polymer ở đầu kim bị chia ra thành hai hoặc ba tia, mỗi tia là 1

“cone – jet” nhỏ, nhưng những tia này xuất hiện theo từng đợt (theo xung) theo thời gian, hình 3.2 (d)

Khi hiệu điện thế tăng lên đến 25 kV, nón Taylor ở trên đầu kim đã biến mất, thay vào đó là hàng loạt các tia polymer có kích thước rất nhỏ xuất hiện trên đầu kim, chế độ phun này được gọi là “multi jet”, hình 3.2 (e) Khi hiệu điện thế quá lớn so với sức căng và lực nhớt của dung dịch, giọt polymer bị phân tách thành các tia nhỏ Ở chế độ phun này, pha lõi và pha vỏ tách bị biệt hoàn toàn Do đó không phù hợp để có thể tạo được cấu trúc lõi – vỏ như mong muốn

Qua quá trình khảo sát ảnh hưởng của hiệu điện thế đến chế độ phun, kết quả cho thấy chế độ phun “cone – jet”, chế độ thích hợp để tạo được hạt có cấu trúc lõi – vỏ, đạt được khi hiệu điện thế nằm trong khoảng 12,5 kv đến 17,5 kV Do đó hiệu điện thế sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo sẽ nằm trong khoảng từ 12,5 kV đến 17,5 kV

3.3.2 Ảnh hưởng của lưu lượng đến quá trình hình thành chế độ phun

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 55 Một yếu tố thông số cũng ảnh hưởng đến quá trình hình thành chế độ phun là lưu lượng (Q) Do đó phần này của luận văn sẽ tập trung đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng phun đến sự hình thành chế độ phun Các thông số Coaxial electrospraying khác được giữ nguyên: Khoảng cách phun L = 10 cm, hiệu điện thế U = 12,5 kV, nồng độ Chitosan:

Nhiều nghiên cứu chỉ ra cấu trúc lõi – vỏ chỉ đạt được khi lưu lượng pha vỏ > lưu lượng lõi Ngoài ra, do lưu lượng thấp nhất của hai máy bơm là 0,1 ml/h và độ chia nhỏ nhất là 0,1 ml/h nên quá trình khảo sát sẽ bắt đầu với lưu lượng pha lõi và pha vỏ lần lượt là 0,1 ml/h và 0,2 ml/h (Qcore/ Qshell= 0,1/ 0,2 ml/h) Kết quả đạt được với lưu lượng này là chế độ “cone – jet”, tương tự như kết quả của phần 3.3 Tuy nhiên, khi lưu lượng pha vỏ được tăng lên Qshell = 0,3 ml/h (Qtổng = 0,4 ml/h), chế độ “cone – jet” trở nên không ổn định, dẫn đến sự hình thành các tia polymer lớn bắn đến màng thu, tạo thành chế độ phun “unstabel cone – jet” Kết quả là trên màng thu xuất hiện các đốm lớn Các đốm này ảnh hưởng rất lớn đến kết quả thu mẫu, nếu kéo dài quá trình, các đốm này xuất hiện càng nhiều và có thể tạo thành một màng phim dày trên màng thu do không thể bay hơi hết dung môi Do đó không thể thu được mẫu có dạng hạt như mong muốn Khi tiếp tục tăng lưu lượng lớn hơn, sự hình thành các tia polymer trở nên thường xuyên hơn và chế độ phun trở nên bất ổn định hơn

Với kết quả nêu trên, lưu lượng sử dụng trong các thí nghiệm còn lại của luận văn sẽ được cố định ở giá trị Qcore/ Qshell= 0,1/ 0,2 ml/h

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 56

Hình 3.3: Chế độ phun unstable cone-jet khi tổng lưu lượng Qtổng ≥ 0,4 ml/h Thông số Coaxial electrospraying: L = 10 cm, U = 12,5 kV Nồng độ Chitosan: 5 wt%.

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CHITOSAN ĐẾN HÌNH THÁI VÀ KÍCH THƯỚC HẠT THU ĐƯỢC

Trong phần này, sự ảnh hưởng của nồng độ Chitosan trong dung dịch đến hình thái và kích thước hạt sẽ được khảo sát và đánh giá Dung dịch với nồng độ Chitosan từ 2 wt% đến 5 wt% được sử dụng để tiến hành tạo hạt Các thông số Coaxial electrosraying khác được giữ nguyên trong quá trình khảo sát: L = 10 cm, Q core / Q shell = 0,1/ 0,2 ml/h, U = 12,5 kV Hình 3.4 biểu diễn hình ảnh SEM của các mẫu hạt thu được với các nồng độ Chitosan khác nhau

Kết quả ảnh SEM cho thấy ở nồng độ 2 wt%, kết quả thu được không phải ở dạng hạt mà ở dạng màng mỏng, hình 3.4 (a) Ở nồng độ 2 wt%, số lượng chuỗi polymer trong dung dịch không đủ lớn để hình thành nên các chuỗi rối, dung dịch nằm trong khoảng

“dilute regime”, kết quả là các giọt polymer tạo thành trong quá trình Coaxial electrospraying khi di chuyển đến bảng cực thu trong quá trình bay hơi dung môi thì bị xẹp lại do các chuỗi polymer kết hợp lại với nhau không đủ để hình thành bộ xương nâng đỡ.

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 57

Hình 3.4: Ảnh SEM của hạt nanocapsules Chitosan chứa Curcumin thu được với nồng độ Chitosan khác nhau: (a): 2 wt%, (b): 3 wt%, (c): 4 wt%, (d): 5 wt% Thông số

Coaxial electrospraying: L = 10 cm, Q core / Q shell = 0,1/ 0,2 ml/h, U = 12,5 kV

Khi nồng độ Chitosan trong dung dịch tăng lên 3 wt%, mẫu thu được đã có hình dạng hình cầu rõ ràng, bề mặt các hạt khá trơn nhẵn tuy có một phần nhỏ bị dính vào nhau Kết quả này cho thấy, với nồng độ Chitosan là 3 wt%, dung dịch đã đạt được lượng chuỗi rối nhất định, dung dịch đã nằm trong vùng “semi-dilute moderately entangled regime”, bộ xương nâng đỡ là các chuỗi polymer liên kết với nhau đã hình thành đủ, giúp cho hạt trong quá trình bốc bay dung môi không bị thay đổi hình dạng

Kết quả không có nhiều sự khác biệt khi tăng nồng độ Chitosan từ 3 wt% lên đến 4 wt%

Tuy nhiên, khi nồng độ tăng lên đến 5 wt%, hạt thu được có xu hướng bị dính chùm vào nhau, trên bề mặt hạt lớn xuất hiện nhiều những hạt nhỏ vệ tinh bám trên bề mặt khi

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 58 nồng độ tăng lên đến 5 wt%, tuy sức căng bề mặt không thay đổi nhiều, nhưng lực nhớt của dung dịch polymer lại tăng lên, khiến cho lực tĩnh điện không còn có khả năng tách các hạt này phân tán rời ra Kết quả là các hạt bị dính vào nhau trong quá trình bay đến màng thu

Sự thay đổi nồng độ cũng ảnh hưởng đến kích thước hạt thu được Biểu đồ phân bố kích thước hạt và sự thay đổi kích thước hạt được trình bày ở hình 3.5 Như được trình bày ở hình 3,5, đường kính trung bình của các hạt tăng nhẹ từ 126,87 (± 90,85) nm lên 135,25 (± 90,42) nm khi nồng độ Chitosan thay đổi từ 3 wt% lên 4 wt% Tuy nhiên, khi nồng độ tăng lên 5 wt%, có một sự thay đổi mạnh về kích thước hạt thu được, đường kính trung bình hạt tăng lên 191,55 nm (± 86,61) nm Sự thay đổi về độ nhớt của dung dịch polymer được cho là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi kích thước hạt thu được khi thay đổi nồng độ Chitosan Khi dung dịch có độ nhớt lớn hơn, sự tác động của điện trường lên giọt dung dịch bị giảm đi do lực nhớt của dung dịch lớn hơn, khiến cho khả năng phân tách giọt polymer bị giảm đi, kết quả là hình thành các hạt cầu polymer có kích thước lớn hơn

Những kết quả trên cho thấy, với nồng độ Chitosan là 3 wt%, hạt thu được có dạng hình cầu, bề mặt của hạt trơn nhẵn, kích thước hạt thu được là nhỏ nhất và gần giá trị yêu cầu là 70 ± 20 nm Do đó giá trị nồng độ Chitosan 3 wt% sẽ được lựa chọn để tiếp tục tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của hiệu điện thế đến hình dạng và kích thước hạt trong phần tiếp theo

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 59

Hình 3.5: Sự phân bố kích thước hạt và đường kính trung bình của hạt nanocapsules Chitosan chứa Curcumin tạo thành bởi dung dịch polymer có nồng độ Chitosan khác nhau: (a) 3, (b) 4, và (c) 5 wt% Hình (d) biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ

Chitosan đến kích thước trung bình hạt thu được.

ẢNH HƯỞNG CỦA HIỆU ĐIỆN THẾ SỬ DỤNG ĐẾN HÌNH DẠNG VÀ KÍCH THƯỚC HẠT THU ĐƯỢC

Trong phần này, sự ảnh hưởng của hiệu điện thế đến hình dạng và kích thước hạt của sản phẩm thu được sẽ được tiến hành khảo sát và đánh giá Dung dịch Chitosan với nồng độ 3 wt% sẽ được sử dụng để tiến hành thí nghiệm Giá trị hiệu điện thế sử dụng lần lượt là các hiệu điện thế mà chế độ phun đạt được là chế độ “cone – jet”: 12,5, 15, 17,5 kV Các thông số Coaxial electrospraying khác sẽ được giữ nguyên trong suốt quá trình khảo sát: L = 10 cm, Q core / Q shell = 0,1/ 0,2 ml/h

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 60

Hình 3.6: Ảnh SEM của hạt nanocapsules Chitosan chứa Curcumin thu được với hiệu điện thế sử dụng khác nhau: (a) 12,5, (b) 15, và (c) 17,5 kV

Hình 3.6 trình bày ảnh SEM của mẫu hạt nanocapsule Chitosan chứa Curcumin tạo thành với các hiệu điện thế khác nhau Nhìn chung hình dạng của các hạt thu được ở các hiệu điện thế khác nhau không có nhiều sự khác biệt Các hạt thu được có dạng hình cầu rõ ràng, bề mặt các hạt khá trơn nhẵn Khi tăng hiệu điện thế sử dụng, các hạt thu được có xu hướng tách rời nhau ra hơn Với sự gia tăng hiệu điện thế, lực điện trường trong quá trình Coaxial electrospraying được tăng cường, giúp cho quá trình phân tách giọt polymer được thực hiện dễ dàng hơn, lực đẩy Coulomb trong trường hợp này cũng cao hơn nên các hạt thu được sẽ dễ dàng phân tách trong quá trình bay đến màng thu

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 61

Hình 3.7: Sự phân bố kích thước hạt và đường kính trung bình của hạt nanocapsules Chitosan chứa Curcumin thu được với hiệu điện thế sử dụng khác nhau: (a) 12,5, (b)

15, và (c) 17,5 kV Hình (d) biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ Chitosan đến kích thước trung bình hạt thu được

Hiệu điện thế cũng ảnh hưởng đến kích thước hạt nanocapsule thu được Trên ảnh SEM của 3 mẫu hạt thu ở ba hiệu điện thế khác nhau, hình 3.6, có thế thấy kích thước của các hạt thu được có xu hướng nhỏ hơn khi hiệu điện thế tăng lên Sự thay đổi về kích thước khi hiệu điện thế thay đổi được trình bày chi tiết ở hình 3.7 Khi hiệu điện thế thay đổi từ 12,5 kV lên 15 kV, chỉ có một sự thay đổi nhỏ về đường kính trung bình của hạt thu được, đường kính hạt giảm từ 126,87 (± 90,85) nm xuống 117,42 (± 78,49) nm Tuy nhiên, có một sự thay đổi lớn về kích thước hạt khi hiệu điện thế tăng lên 17,5 kV: đường kính hạt trung bình giảm chỉ còn 57,21 (± 44,32) nm Sự thay đổi về hiệu điện thế dẫn

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 62 đến sự thay đổi hình dạng nón Taylor Với sự tăng lên vê hiệu điện thế, nón Taylor có xu hướng trở nên nhọn, tạo điều kiện cho việc phân tách giọt polymer trên đầu nón Taylor trở nên dễ dàng hơn, kết quả là sự thay đổi về kích thước hạt thu được Ở hiệu điện thế 17,5 kV, các hạt thu được có hình dạng cầu và trơn nhẵn, các hạt tách rời nhau hơn Kích thước hạt lớn nhất nằm vào khoảng 200 nm Trong khi đó, ở hai hiệu điện thế còn lại – 12,5 kV và 15 kV – hạt thu được có kích thước lớn hơn so mới mục tiêu ban đầu đề ra, các hạt lớn có kích thước lên đến 400 nm Với mục tiêu ban đầu là chế tạo hạt có kích thước trung bình nằm trong khoảng 70 ± 20 nm, việc lựa chọn hiệu điện thế cho các thí nghiệm tiếp theo sẽ là 17,5 kV

Tổng hợp các kết quả của phần khảo sát, bộ thông số thích hợp để có thể chế tạo hạt có kích thước theo mục tiêu ban đầu đề ra là L = 10 cm, Qcore/ Qshell = 0,1/ 0,2 ml/h, U = 17,5 kV, nồng độ Chitosan: 3 wt% Ở các thí nghiệm tiếp theo, các hạt được sử dụng sẽ được chế tạo bằng bộ thông số này.

CẤU TRÚC CỦA HẠT NANOCAPSULE CHITOSAN CHỨA CURCUMIN

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 63

Hình 3.8 Ảnh TEM của hạt nanocapsule Chitosan chứa Curcumin Thông số Coaxial electrospraying: L = 10 cm, Q core / Q shell = 0,1/ 0,2 ml/h, U = 17,5 kV, nồng độ

Kết quả ảnh TEM cho thấy hạt nanocapsule thu được đã đạt được cấu trúc lõi – vỏ như mong muốn Tuy nhiên, biên giới giữa pha lõi và pha vỏ trong hạt thu được không rõ ràng Hiện tượng này xảy ra là do việc hai dung dịch sử dụng trong pha lõi và pha vỏ là hai dung dịch có khả năng hòa tan vào nhau Do đó, trong quá trình Coaxial electrospraying, hai pha dung dịch này có xu hướng khuếch tán vào nhau Kết quả hạt khi thu được có pha lõi và pha vỏ khuếch tán một phần vào nhau Ngoài ra, do sự khác biệt không nhiều về thành phần pha – chỉ khác biệt một phần nhỏ lượng thuốc đưa vào – nên khả năng phân biệt hai pha bằng phương pháp TEM vẫn còn nhiều hạn chế.

ĐÁNH GIÁ ĐỘ SẠCH DUNG MÔI CỦA HẠT

acid Acetic để hòa tan Chitosan và thuốc Curcumin Do dung môi sử dụng trong quá trình tạo hạt là acid acetic nồng độ cao nên có thể gây hại tới các tế bào Do đó, cần phải đánh giá độ sạch dung môi của hạt sau khi tiến hành tạo hạt Độ sạch dung môi acid Acetic của hạt Chitosan chứa Curcumin thu được sẽ được được đánh giá thông qua hàm lượng acid Acetic còn lại trên hạt sau khi hạt đã được sấy chân không Mẫu hạt sau khi

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 64 được sấy chân không sẽ đem đi phân tích sắc ký khí (GC) để kiểm tra hàm lượng acid acetic Kết quả phân tích sắc ký khí (GC) được trình bày ở Hình 9 và Hình 10

Hình 3 9: Phổ GC chuẩn dung dịch Acid acetic 90 wt%

Hình 3.10: Phổ GC mẫu hạt Chitosan chứa curcumin sau khi sấy chân không

Kết quả phân tích cho thấy, với mẫu dung môi acid acetic, đỉnh peak của Acid acetic xuất hiện ở khoảng thời gian 24 phút, hình 3.9 Tuy nhiên, đối với mẫu hạt

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 65 Chitosan chứa Curcumin sau khi được xử lý sấy chân không để loại bỏ dung môi còn tồn lại sau quá trình tạo hạt, kết quả phổ lại không xuất hiện đỉnh peak của Acid acetic ở vị trí tương tự, hình 3.10 Điều này cho thấy lượng dung môi còn tồn lại trong hạt hạt Chitosan chứa Curcumin sau khi tiến hành Coaxial ectrospraying đã được loại bỏ hoàn toàn bằng phương pháp sấy chân không Kết quả này cho thấy hạt có thể đảm bảo an toàn sinh học về vấn đề dung môi.

KHẢO SÁT NHẢ THUỐC IN VITRO

Phổ hấp thu cực đại của Curcumin trong dung dịch đệm trong dung dịch đệm được xác định trước tiên, để xác định được bước sóng hấp thu cực đại của Curcumin trong dung dịch đệm Từ đó xây dựng được đường chuẩn hấp thu của Curcumin

Từ kết quả phổ UV – VIS, xác định được bước sóng hấp thu cực đại của Curcumin trong dung dịch đệm là ở bước sóng 426 nm

Từ bước sóng hấp thu cực đại của curcumin tại 426 nm, đường chuẩn Curcmin được xây dựng theo các bước ở phần 2.4.3.2

Bảng 3.2 Giá trị độ hấp thu ở bước sóng 426 nm của Curcumin trong dung dịch đệm với các hàm lượng khác nhau

Hàm lượng Curcumin (mol/ l) Độ hấp thu

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 66

Hình 3.11: Phương trình đường chuẩn UV-VIS của Curcumin Đường chuẩn Curcumin trong dung dịch đệm được xây dựng có kết quả 𝑦 85,482𝑥 + 0,209, trong đó y là độ hấp thu và x hàm lượng Curcumin trong dung dịch đệm (mg/ ml)

Từ phương trình đường chuẩn ta tính được hàm lượng Curcumin giải phóng ra trong quá trình In vitro, từ đó dựa vào công thức phần trăm ở phần 2.3.2.2 tính toán được phần trăm Curcumin giải phóng theo thời gian

3.8.2 Khảo sát nhả thuốc In vitro Từ đường chuẩn và kết quả phân tích độ hấp thu UV-VIS, hàm lượng thuốc Curcumin nhả ra trong hạt Chitosan với hai kiểu cấu trúc khác nhau: cấu trúc lõi – vỏ và hạt không có cấu trúc lõi – vỏ được tính toán và trình bày trong bảng 3.3

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 67

Bảng 3.3 Phần trăm Curcumin nhả ra trong dung dịch đệm của hạt Chitosan chứa curcumin với cấu trúc hạt khác nhau

Hạt Chitosan - curcumin có cấu trúc lõi - vỏ

Hạt Chitosan - curcumin không có cấu trúc lõi - vỏ Lượng

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 68

Hình 3.12: Kết quả nhả thuốc In vitro của mẫu hạt Chitosan chứa thuốc Curcumin có cấu trúc lõi – vỏ và không có cấu trúc lõi – vỏ

Hình 3.12 trình bày kết quả thí nghiệm nhả thuốc In vitro của mẫu hạt Chitosan chứa thuốc Curcumin có cấu trúc lõi – vỏ và không có cấu trúc lõi – vỏ Kết quả cho thấy, hạt không có cấu trúc lõi – vỏ xuất hiện hiện tượng nhả thuốc bùng nổ ở giai đoạn đầu, chỉ trong vòng 1 ngày, gần 60 % lượng thuốc đã đi ra khỏi hạt và hòa tan vào đệm PBS Trong khi đó, đối với hạt có cấu trúc lõi – vỏ, chỉ có khoảng 35 % thuốc nhả ra trong 1 ngày đầu tiên Điều này cho thấy, với hạt có cấu trúc lõi vỏ có khả năng kiểm soát vị trí thuốc ở phía ngoài bề mặt hạt, giúp điểu khiển quá trình nhả thuốc tốt hơn

Do Chitosan là một loại polymer có khả năng phân hủy sinh học, nên chỉ sau thời gian 9 ngày lượng thuốc nhả ra trong cả hai loại hạt đã tương đối cao Với hạt không có

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 69 cấu trúc lõi vỏ, gần 90 % lượng thuốc đưa vào hạt đã nhả ra, trong khi đó, lượng thuốc trong hạt có cấu trúc lõi vỏ cũng đã được giải phóng gần 85 %

Qua thời gian tiến hành nhả thuốc, kết quả cho thấy hạt có cấu trúc lõi – vỏ cho thấy sự kiểm soát việc giải phóng thuốc tốt hơn so với hạt không có cấu trúc lõi vỏ.

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA HẠT

Hình 3.13: Hình SEM của mẫu hạt sau khi tiến hành thí nghiệm nhả thuốc In vitro (sau

HVTH: Đoàn Ngọc Hoan Trang 70