Nghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan BNghiên cứu tính đa hình và methyl hóa gen SOCS6 trên người bệnh viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nhiễm vi rút viêm gan B
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Gồm 02 nhóm phục vụ phân tích 02 mục tiêu nghiên cứu:
- Nhóm bệnh 1 - Tổng số 335 người bệnh bao gồm: 120 người bệnh chẩn đoán xác định viêm gan vi rút B mạn tính đã và đang điều trị tại Bệnh viện Đống Đa Hà Nội; 100 người bệnh được chẩn đoán xác định xơ gan và 115 người bệnh được chẩn đoán xác định UTBMTBG điều trị nội trú tại Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ Ký hiệu lần lượt: nhóm VGBM, XG, UTG1.
- Nhóm bệnh 2: 41 người bệnh chẩn đoán xác định UTBMTBG nhiễm HBV được phẫu thuật tại Bệnh viện Ung bướu trung ương cơ sở Tân Triều (có kết quả mô bệnh học kèm theo) Ký hiệu: Nhóm UTG2
- Tuổi > 18 tuổi - Người bệnh có xét nghiệm HBsAg (+)
* Tiêu chuẩn chẩn đoán viêm gan vi rút B mạn tính
Người bệnh lựa chọn vào nghiên cứu tuân theo Hướng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam năm 2014 [76]:
- HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc IgG (+)
- AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục trên 6 tháng.
* Tiêu chuẩn chẩn đoán xơ gan do HBV
Người bệnh đã được chẩn đoán xác định xơ gan trên lâm sàng với đầy đủ 3 hội chứng [77]:
- Hội chứng suy chức năng gan: thể hiện trên lâm sàng (mệt mỏi thường xuyên, rối loạn tiêu hóa, phù mềm 2 chi dưới, vàng da xuất huyết dưới da) và/ hoặc cận lâm sàng (albumin máu giảm 17 àmol/l, tỷ lệ prothrombin giảm 13mm, đường kính dọc lách >12cm, dịch tự do ổ bụng) và hoặc nội soi dạ dày có giãn TMTQ, phình vị.
- Hội chứng thay đổi hình thái gan: lâm sàng có gan to chắc hoặc gan teo kết hợp với siêu âm hoặc cắt lớp vi tính cho hình ảnh nhu mô thô tăng âm dạng nốt, bờ không đều.
* Tiêu chuẩn chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan
Chẩn đoán xác định UTBMTBG theo hướng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam năm 2012 [78]:
- Có bằng chứng giải phẫu bệnh.
- Hình ảnh điển hình của UTBMTBG trên chụp cắt lớp vi tính ổ bụng có cản quang hoặc cộng hưởng từ có thuốc cản từ + AFP tăng cao hơn bình thường.
* Tiêu chuẩn phân định nhóm UTBMTBG phẫu thuật
Nhóm ung thư biểu mô tế bào gan phẫu thuật: là nhóm bệnh nhân được chuẩn đoán xác định UTBMTBG có chỉ định phẫu thuật cắt phần gan theo khối u, theo hướng hướng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam năm 2012 [78], bao gồm:
Dự kiến cắt bỏ khối u gan với thể tích gan còn lại sau cắt bỏ lớn hơn hoặc bằng 50% thể tích gan ban đầu; giai đoạn Child Pugh A hoặc B, không có di căn xa, không có tăng áp lực tĩnh mạch cửa.
- Người bệnh được chẩn đoán xác định viêm gan, xơ gan, UTBMTBG nhưng có xét nghiệm Anti-HCV dương tính hoặc tổn thương gan do các nguyên nhân khác như do rượu, nhiễm độc, gan nhiễm mỡ, bệnh lý gan tự miễn,…
- Ung thư ung thư gan thứ phát do di căn từ cơ quan khác.
- Người bệnh không đồng ý tham gia nghiên cứu.
Gồm 120 người khỏe mạnh hiến máu tình nguyện tại khoa Huyết học Bệnh viện Quân y 103.
- Người cho máu không có triệu chứng lâm sàng hay tiền sử bị viêm gan, xơ gan hoặc ung thư gan.
- Xét nghiệm HBsAg, Anti-HCV và Anti-HIV âm tính.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang, có đối chứng Cỡ mẫu nghiên cứu:
* Cỡ mẫu phân tích đa hình gen SOCS6
Tính cỡ mẫu dựa trên công thức ước lượng một tỷ lệ trên một quần thể [79]: n = Z 2 (1-α/2) p( 1− p ) d 2
Z(1-α/2): là giá trị từ phân bố chuẩn ở mức α/2, được tính dựa trên mức ý nghĩa thống kê; Z(1-α/2) = 1,96 với mức ý nghĩa thống kê p < 0,05 p: là tần suất xuất alen lặn Trong các điểm đa hình trên gen SOCS6, trên quần thể người Việt Nam, tần suất các alen lặn xuất hiện với tỷ lệ 0,3. d: độ chính xác tuyệt đối mong muốn với d = 0,1Thay vào công thức tính được n = 81 Trong nghiên cứu này, chúng tôi lấy cỡ mẫu phân tích đa hình gen SOCS6 là 335 mẫu bệnh (120 VGBM, 100XG và 115 UTG1) và 120 mẫu chứng
* Cỡ mẫu phân tích methyl hóa gen SOCS6
Tính cỡ mẫu dựa trên công thức so sánh sự khác biệt giữa hai tỷ lệ [79]: n = (Zα/2+ Zβ) 2 p 1 ( 1− p 1)+ p 2( 1− p 2)
Trong đó - Zα/2: là giá trị từ phân bố chuẩn ở mức α/2, được tính dựa trên mức ý nghĩa thống kê; Z(α/2) = 1,96 với mức ý nghĩa thống kê p < 0,05
- Zβ: là giá trị từ phân phối chuẩn tại β, đối với β = 0,2, giá trị Zβ = 0,84.
- p1, p2 là tỷ lệ phần trăm mẫu methyl dương tính ở mẫu mô ung thư gan và mẫu mô cận ung thư.
Theo nghiên cứu của tác giả Nghiêm Xuân Hoàn năm 2017, tỷ lệ methyl hóa promoter gen SOCS3 trên mẫu mô ung thư gan và mẫu mô cận u lần lượt là 70,3% và 29,7% [74].
Thay vào công thức, cỡ mẫu nghiên cứu n = 21 cặp mẫu Trong nghiên cứu này, chúng tôi lấy cỡ mẫu phân tích methyl hóa gen SOCS6 là 41 cặp mẫu (41 mẫu mô ung thư gan và 41 mẫu mô cận u).
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12 năm 2018 đến tháng 12 năm 2023.
2.2.2 Địa điểm, trang thiết bị, hóa chất dùng trong nghiên cứu 2.2.2.1 Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm lấy mẫu nghiên cứu:
+ Khoa Nội tiêu hóa, Khoa Huyết học, Bệnh viện Quân y 103 + Viện nghiên cứu các bệnh tiêu hóa, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108.
+ Khoa Giải Phẫu bệnh, Bệnh viện Ung bướu trung ương cơ sở Tân Triều + Khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện Đống Đa Hà Nội
+ Khoa Nội tiêu hóa, Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ- Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phòng An toàn Sinh học, Viện nghiên cứu Y dược học quân sự, Học viện Quân y (YDHQS-HVQY).
2.2.2.2 Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Máy hấp và máy sấy vô trùng dụng cụ - Tủ lạnh sâu (-30ºC; - 80ºC)
- Tủ lạnh -20ºC và 4ºC - Máy li tâm lạnh Mikro 22r (Hettch, Cộng hòa liên bang Đức) có thể ly tâm tối đa 14.000 vòng/phút
- Máy vortex và ủ nhiệt Eppendorf ThemoMier C - Buồng hút đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp I - Máy spindown eppendorf loại 1,5ml và 0,2ml - Máy ổn nhiệt cho eppendorf loại 1,5ml
Hình 2.1 Máy PCR Mastercycler nexus GX2
*Nguồn: chụp tại phòng an toàn sinh học, Viện nghiên cứu YDHQS-HVQY
- Máy quang phổ định lượng DNA/RNA SpectraMax Quickdrop - Hệ thống điện di ENDURO Labnet E1010
- Lò vi sóng- Máy chụp ảnh điện di Quantum CX5, hãng Vilber - Pipette loại 1000 àl, 100 àl, 10 àl, 2,5 àl.
- Ống EDTA, ống eppendorf loại 1,5ml, 0,2ml, ống falcol, collection tubes 1,5 ml; 2ml, găng tay, giấy thấm đã được vô trùng tuyệt đối,…
2.2.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu.
- Kit tách DNA tổng số từ máu toàn phần GenJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit của hãng Themo Hoa Kỳ, mã số K0782 gồm cột lọc DNA, dung dịch lysis, protein K, cồn tuyệt đối, dung dịch rửa wash buffer I, dung dịch rửa wash buffer II, elution.
- Dung dịch DreamTaq PCR Master Mix (2X) cho kỹ thuật T-AMRS và GoTaq® Green Master Mix cho kỹ thuật MSP.
- Cặp primer (mồi) đặc hiệu gồm mồi xuôi, mồi ngược dùng cho kỹ thuật T-AMRS và kỹ thuật MSP.
- Gel Agarose 1,5%, dung dịch TBE (boric acid EDTA), dung dịch nhuộm RedSafe, thang DNA chuẩn (DNA Ladder) 100bp và 50bp dùng cho kỹ thuật điện di sản phẩm.
- Kĩ thuật tinh sạch sản phẩm PCR: bằng bộ Kit Gen JET PCR purification, mã số K0701 của hãng Themo USA gồm dung dịch gắn kết màng, dung dịch rửa màng, nước cất 2 lần vô trùng.
2.2.3 Thu thập dữ liệu nhóm bệnh, nhóm chứng và mẫu thí nghiệm
Các bước tiến hành nghiên cứu được xây dựng tuần tự theo các bước sau:
2.2.3.1 Thu thập dữ liệu nhóm bệnh và nhóm chứng
Nhóm bệnh nhiễm HBV: 120 người bệnh viêm gan virus B mạn tính
(VGBM), 100 người bệnh xơ gan (XG), 156 người bệnh UTBMTBG trong đó có 115 người bệnh không phẫu thuật (UTG1) thu mẫu máu và 41 người bệnh có phẫu thuật để thu được mẫu mô ung thư và mẫu cận u (UTG2).
Người bệnh được hỏi bệnh, khám bệnh, làm các xét nghiệm cận lâm sàng Các thông tin được thu thập theo tiêu chí đề ra và ghi chép đầy đủ vào bệnh án nghiên cứu.
- Khám lâm sàng: người bệnh đều được khai thác đầy đủ bệnh sử và tiền sử Hỏi bệnh thăm khám các triệu chứng cơ năng và thực thể: mệt mỏi, chán ăn, đau, tức hạ sườn phải, sụt cân, vàng da niêm mạc, gan to, lách to, tuần hoàn bàng hệ, phù, cổ trướng,…
- Cận lâm sàng: tiến hành làm các xét nghiệm và kỹ thuật theo hướng dẫn của Bộ Y tế [76], [78]
- Huyết học: xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi được thực hiện bằng máy huyết học tự động.
- Xác định tỷ lệ prothrombin (%) - Sinh hóa máu: các xét nghiệm ure, creatinin, glucose, AST, ALT, GGT, bilirubin toàn phần (bilirubin TP), bilirubin trực tiếp (bilirubin TT), protein, albumin,…
- Xét nghiệm miễn dịch: AFP, HBsAg, Anti HCV,…
- Siêu âm ổ bụng: đánh giá nhu mô gan, các dấu hiệu đi kèm xơ gan như đường kính TMC, kích thước lách, dịch ổ bụng…Đánh giá các khối u gan, kích thước, vị trí, tính chất khối u.
- Chụp cắt lớp vi tính đối với các trường hợp UTBMTBG: đặc điểm khối u như tỷ trọng, số lượng, kích thước, mức độ ngấm thuốc,…
- Nội soi thực quản dạ dày tá tràng các đối tượng xơ gan đánh giá mức độ giãn tĩnh mạch thực quản.
- Mô bệnh học để chẩn đoán xác định nếu có nghi ngờ trên phim chụp CLVT và các trường hợp UTBMTBG được phẫu thuật.
- 120 người khỏe mạnh hiến máu tự nguyện tại Bệnh viện Quân y 103. Đây là những người không có tiền sử hay triệu chứng lâm sàng bị bệnh gan mạn tính.
- Đối tượng cho máu được xét nghiệm HBsAg, Anti HCV, HIV đều có kết quả âm tính
2.2.3.2 Lấy mẫu bệnh phẩm nghiên cứu
* Mẫu máu phân tích đa hình gen SOCS6
- Mẫu máu: nhóm bệnh nhiễm HBV bao gồm nhóm VGBM, XG, UTG1
(tổng số 335) và nhóm chứng (tổng số 120); 5 ml máu ngoại vi được thu thập từ các đối tượng tham gia nghiên cứu Các mẫu máu của người bệnh được lấy tại một thời điểm đến phòng khám hoặc thời điểm nhập viện Tất cả mẫu máu được ly tâm để phân tách huyết tương và khối tế bào máu riêng biệt Mẫu huyết tương và khối tế bào máu được lưu vào các ống ependoft 1,5ml và được lưu trữ ở tủ âm sâu (-20 hoặc - 80 ºC) cho đến khi tiến hành phân tích mẫu.
* Mẫu mô phân tích methyl hóa gen SOCS6
- Mẫu mô: 41 bệnh nhân UTBMTBG nhiễm HBV được phẫu thuật, thu được mẫu mô gan Thời điểm lấy mẫu, sau phẫu thuật cắt khối ung thư gan, khi các mẫu mô chuyển về Khoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Ung bướu trung ương cơ sở Tân Triều.
Quy trình tiến hành tại Labo xét nghiệm khoa Giải phẫu bệnh lý, tiến hành lấy mẫu mô gan tại 2 vị trí:
- Mẫu mô ung thư gan: Lấy trong khối u, thể tích ≥ 1 cm 3 (1 x 1 x 1 cm) (không lấy tổ chức hoại tử)
- Mẫu mô lân cận khối u: lấy ở khu vực cạnh tổ chức khối u, cách 2 cm, thể tích ≥ 1 cm 3 (1 x 1 x 1 cm).
- Mẫu mô được ngâm bằng dung dịch Trizol cho vào ống Eppendorf,bảo quản trong tủ lạnh âm sâu - 80ºC và được chuyển về Viện nghiên cứu Y dược học Quân sự - Học viện Quân Y để phục vụ nghiên cứu.
Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Tuổi: chia thành các nhóm tuổi < 30 tuổi, 30 - 49 tuổi, 50 - 69 tuổi, ≥ 70 tuổi Tính giá trị trung bình độ lệch chuẩn, nhóm tuổi tính theo số lượng và tỷ lệ phần trăm ở các nhóm.
- Giới: chia thành 2 giới nam, nữ, tỷ lệ nam/nữ.
2.3.2 Đặc điểm cận lâm sàng của các đối tượng nghiên cứu
Các chỉ số huyết học được tính theo giá trị trung bình và trung vị - Số lượng hồng cầu (T/l): giá trị bình thường (nam: 4,5-6,5 T/L; nữ:
- Số lượng bạch cầu (G/L): giá trị bình thường 4 - 10 G/L.
- Số lượng tiểu cầu (G/L): giá trị bình thường 150 - 400 G/L.
- Tỷ lệ prothrombin: giá trị bình thường >70%.
Các chỉ số huyết học được tính theo giá trị trung bình và trung vị - Hoạt độ enzyme AST (U/L): giá trị bình thường < 40 (U/L).
- Hoạt độ enzyme ALT (U/L): giá trị bình thường < 40 (U/L).
- Bilirubin toàn phần (àmol/l): giỏ trị bỡnh thường < 17 (àmol/l).
- Protein toàn phần (g/l): giá trị bình thường 66 - 83 (g/l).
- Albumin (g/l): giá trị bình thường 35 - 50 (g/l).
- Nồng độ AFP huyết thanh (ng/ml) tính theo số lượng người bệnh và giá trị phần trăm, chia thành các khoảng: ≤ 20 ng/ml, > 20 – 399 ng/ml và ≥ 400 ng/ml.
Các đặc điểm khối u tính theo số lượng người bệnh và giá trị phần trăm:
- Số lượng khối u được chia thành các nhóm: 1 khối, 2 -3 khối, > 3 khối - Kích thước lấy kích thước lớn nhất 1 chiều khối u và chọn khối u lớn nhất nếu người bệnh có nhiều khối u và được chia thành các nhóm: < 3 cm, 3-
- Vị trí khối u được chia theo giải phẫu gan xác định trên chụp CLVT hoặc siêu âm: thùy gan P, thùy gan T, cả hai thùy gan
- Các miêu tả khác: huyết khối tĩnh mạch cửa (TMC), hạch ổ bụng hoặc hạch di căn xa, dịch ổ bụng,…
* Đặc điểm mô bệnh học ung thư gan Độ biệt hóa tế bào ung thư chia thành 4 mức độ theo WHO năm 2010 [80]:
- Độ I - Biệt hoá cao: mô u và tế bào u gần giống với tế bào gan bình thường Tăng nhẹ các tế bào không điển hình tối thiểu, tỷ lệ nhân/bào tương tăng nhẹ, bè tế bào mỏng, thường có cấu trúc giả tuyến hay tuyến nang và thường có thay đổi mỡ (nhiễm mỡ).
- Độ II - Biệt hoá vừa: mô u và tế bào u có sự khác biệt tương đối rõ rệt so với mô và tế bào gan bình thường Các tế bào u sắp xếp thành bè thường có 03 hàng tế bào hoặc hơn Tế bào u có bào tương rộng ưa toan, nhân tròn và hạt nhân rõ Tỷ lệ nhân/bào tương tương đương như tế bào gan bình thường hoặc lớn hơn vừa phải Mô u có thể thấy kiểu giả tuyến và các tuyến này thường chứa mật hay dịch protein.
+ Độ III - Biệt hoá kém: mô u và tế bào u có sự khác biệt rõ rệt so với bình thường Tế bào u phát triển dày đặc không thể phân biệt được các mạch máu dạng xoang và chỉ thấy các mạch dạng khe trong các ổ u lớn Các tế bào u có tỷ lệ nhân/bào tương tăng rõ, đa hình thái tế bào và có cả các tế bào khổng lồ kỳ quái Loại biệt hoá kém cực kỳ hiếm trong các u ở giai đoạn sớm.
+ Độ IV - Không biệt hoá: các tế bào u không biệt hoá có bào tương ít, nhân tròn hoặc hình thoi ngắn, tăng sinh trong vùng đặc hoặc vùng tuỷ
2.3.3 Phân tích đa hình gen SOCS6
- Điểm SNP rs2062345 gồm 3 kiểu gen GG; AA và GA, alen G và A tính theo số lượng và tỷ lệ phần trăm.
- Điểm SNP rs7228049 gồm 3 kiểu gen GG; AA và GA, alen G và A tính theo số lượng và tỷ lệ phần trăm.
- Điểm SNP rs11151580 gồm 3 kiểu gen CC; TT và TC, alen T và
C tính theo số lượng và tỷ lệ phần trăm.
- Xác định kiểu haplotype từ kết quả phân tích các điểm SNP
- Liên quan đa hình gen SOCS6 (kiểu gen, alen và kiểu haplotype) với một số thể bệnh nhiễm HBV: viêm gan vi rút B mạn tính, xơ gan, UTBMTBG, nhóm nhiễm HBV so với nhóm chứng.
- Liên quan đa hình gen SOCS6 (kiểu gen và kiểu haplotype) với đặc điểm cận lâm sàng một số thể bệnh nhiễm HBV.
2.3.4 Phân tích methyl hóa gen SOCS6
Tỷ lệ methyl hóa promoter gen SOCS6: mẫu mô ung thư và mẫu mô cận u Kết quả:
- Methyl: Có hoặc không- Không methyl (Unmethyl): Có hoặc khôngCác mẫu mô ung thư và mẫu mô cận u có tình trạng methyl hóa sẽ được mã hóa để đưa vào phân tích thống kê số liệu, nhằm đánh mối liên quan giữa methyl hóa promoter gen SOCS6 với một số đặc điểm cận lâm sàng trên người bệnh UTBMTBG.
Quy trình thực hiện thí nghiệm phân tích đa hình gen SOCS6
Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích đa hình gen SOCS6 bằng phương pháp Tetra-primer ARMS PCR (T-ARMS) trên mẫu máu ngoại vi thu được từ đối tượng nghiên cứu, thứ tự gồm các bước chính như sau:
*Bước 1: Tách chiết DNA toàn phần từ máu ngoại vi
- Tách DNA toàn phần từ máu ngoại vi bằng bộ Kit Gen JET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo; Hoa Kỳ), quy trình theo hướng dẫn nhà sản xuất (Phụ lục 2)
- Sản phẩm DNA toàn phần được đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang (OD: Optical Density) các bước sóng A260/A280 trên máy Nanodrop 2000 Kết quả OD của mẫu DNA được coi là đạt khi nồng độ từ 20 ng/àl trở lờn Độ tinh sạch của DNA được đo bằng tỷ số A260/ A280 và mẫu DNA tinh sạch khi tỷ số này từ1,7 - 2,0
*Bước 2: Xác định điểm đa hình SNP gen SOCS6 và các thiết kế primer
- Xác định trình tự gen SOCS6 trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI:
Suppressor of cytokine signaling 6; GRCh38.p14 (GCF_000001405.40);
- Lựa chọn các SNP nghiên cứu dựa theo tần suất gặp SNP thường trên người Việt Nam, đã được công bố trên trang NCBI, cụ thể:
Bảng 2.1 Các SNP thường gặp của gen SOCS6 trên người Việt Nam
SNP Alen Trình tự Vị trí Tần suất trên quẩn thể người Việt Nam
*Nguồn: theo https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/SOCS6 gene
Chương trình thiết kế primer cho phương pháp T-ARMS được xây dựng bởi Ye (2001) [81], truy cập http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html
Bảng 2.2 Primer các SNP gen SOCS6 nghiên cứu và các sản phẩm PCR
T SNP Primer Trình tự primer 5’ – 3’
Inner Primer R CATATCATTTTACCTCTTTGCTCAGAAC Outer Primer F ATATCTGCAAGACATCAAAGTGGC Outer Primer R TTCCTCTCCAATCTTCTCTGACAC
*Bước 3: Tối ưu quy trình Tetra-primer ARMS PCR
- Tối ưu điều kiện phản ứng PCR đơn mồi Trước khi chuẩn hóa quy trình cho phản ứng T-AMRS, chúng tôi chuẩn hóa điều kiện PCR cho từng cặp mồi, nhằm xác định nhiệt độ gắn mồi cho từng phản ứng; đồng thời kiểm tra sản phẩm PCR có lên băng đặc hiệu đúng kích thước như tính toán
Sử dụng mẫu DNA nhóm nghiên cứu để tiến hành xác định nhiệt độ gắn mồi (Ta) cho từng phản ứng PCR đơn mồi:
+ Phản ứng 1: Cặp mồi Outer Primer F - Outer Primer R+ Phản ứng 2: Cặp mồi Outer Primer F - Inner Primer R+ Phản ứng 3: Cặp mồi Outer Primer R - Inner Primer FLựa chọn nhiệt độ Ta trong dải nhiệt độ gradient nhiệt: Nhiệt độ Ta tối ưu là các nhiệt độ các băng đích, sản phẩm PCR lên rõ nhất.
Từ các nhiệt độ Ta của từng phản ứng, lựa chọn nhiệt độ Ta chung cho phản ứng Tetra-primer AMRS PCR.
Hình 2.2 Ảnh minh họa xác định điểm SNP rs2062345 gen SOCS6
- Tối ưu điều kiện phản ứng Tetra-primer ARMS PCR Phản ứng T-AMRS sử dụng cả 4 mồi chạy cùng một phản ứng cho phép xác định nhanh kiểu gen một cách thuận tiện và chính xác Tuy nhiên khi sử dụng nhiều mồi trong một phản ứng, các mồi khác nhau có khả năng bám vào DNA khác nhau dẫn đến tình trạng cạnh tranh mồi Chính vì vậy việc xác định tỉ lệ nồng độ các mồi, điều chỉnh các thông số trong phản ứng PCR là điều vô cùng quan trọng
Qua nhiều lần thí nghiệm và điều chỉnh nồng độ mồi, các thông số của chu trình T-AMRS, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích các SNP gen
SOCS6 trong nghiên cứu với các thông số được trình bày ở bảng 2.3, bảng 2.4 và bảng 2.5.
Bảng 2.3 Thành phần và chu trình phản ứng T-AMRS SNP rs2062345
Thành phần Thể tớch (àl) Nồng độ (àM) DreamTaq Green Mastermix
Chu trình: 95 0 C - 5 phút, (95 0 C - 45s; 60,3 0 C - 45s; 72 0 C - 25s) x 40 ck, 72 0 C - 5 phút.
Bảng 2.4 Thành phần và chu trình phản ứng T-AMRS SNP rs7228049
Thành phần Thể tớch (àl) Nồng độ (àM)
Chu trình: 95 0 C - 5 phút, (95 0 C - 45s; 60,4 0 C- 45s; 72 0 C - 25s) x 40 ck, 72 0 C - 5 phút.
Bảng 2.5 Thành phần và chu trình phản ứng T-AMRS SNP rs11151580
Thành phần Thể tớch (àl) Nồng độ (àM)
Chu trình: 95 0 C - 5 phút, (95 0 C - 45s; 64,0 0 C- 45s; 72 0 C - 30s) x 40 ck, 72 0 C - 5 phút.
*Bước 4: Điện di sản phẩm Tetra-primer AMRS PCR
Lấy 5àl sản phẩm PCR thu được điện di trờn gel angarose 1,5%
(nhuộm RedSafe) với thang chuẩn là marker 100bp ở 120V trong 30 phút trong dung dịch TBE 0,5X.
Nhận xét kết quả thu được, ghi vào hồ sơ nghiên cứu.
*Bước 5: Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen Sanger mội số mẫu nghiên cứu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kít GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) Quy trình tinh sạch tuân theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Phụ lục 3). Đoạn DNA chứa SNP gen SOCS6 trong nghiên cứu được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp Outer Primer F - Outer Primer R Sản phẩmPCR sau đó được gửi đi giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự tự độngABI 3100 Avant, thực hiện bởi Công ty Cổ phần Phù Sa Genomics.
Quy trình thực hiện thí nghiệm phân tích methyl hóa gen SOCS6
Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích methyl hóa gen SOCS6 bằng phương pháp MSP (Methylation-specific PCR), thứ tự gồm các bước:
*Bước 1: Tách chiết DNA từ mẫu mô ung thư và mẫu mô cận khối u
Tách DNA toàn phần từ mẫu mô ung thư và mẫu mô cận u bằng bộ kit GenJet genomic DNA purification, quy trình theo hướng dẫn nhà sản xuất (Phụ lục 4).
Sản phẩm DNA toàn phần được đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang (OD: Optical Density) các bước sóng A260/A280 trên máy Nanodrop 2000.
*Bước 2: Chuyển bisulfite DNA mẫu mô
Chuyển bisulfite bằng kit EpiJet bisulfite conversion, quy trình theo hướng dẫn nhà sản xuất (Phụ lục 5)
*Bước 3: Xác định promoter gen SOCS6 và các thiết kế primer
Xác định promoter gen SOCS6, chúng tôi tham khảo từ nghiên cứu của tác giả Rai-Hua Lai 2009 [57] Trình tự vùng Promoter được Blast kiểm tra trên trang NCBI Truy cập: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Sau kiểm tra, trình tự promoter SOCS6 của tác giả Rai-Hua Lai được sử dụng để thiết kế Primer cho kỹ thuật MSP (Phụ lục 6).
Sử dụng phần mềm Methprimer, truy cập http://www.urogene.org để xác định vị trí các đảo CpG trên vùng gen khảo sát và thiết kế primer cho kỹ thuật MSP
Bảng 2.6 Primer methyl và không methyl gen SOCS6
Ký hiệu Trình tự mồi 5’ – 3’
*Chú thích M: primer methyl, U: primer unmethyl
*Bước 4: Tối ưu quy trình phản ứng MSP phát hiện methyl và không methyl mẫu mô ung thư gan và mẫu mô cận u
- Xác định nhiệt độ gắn mồi (Ta) tối ưu cho từng cặp primer
Việc xác định nhiệt độ tối ưu được tiến hành riêng rẽ cho từng cặp mồi methyl và không methyl, sử dụng nguồn DNA chứng với chi tiết thành phần phản ứng được trình bày trong Bảng 2.7
Bảng 2.7 Thành phần và chu trình tìm nhiệt độ gắn mồi phản ứng MSP
Thành phần Thể tớch (àl) Nồng độ (àM)
Trong phản ứng gradient nhiệt độ gắn mồi (Ta) cho phản ứng PCR từng cặp primer; chúng tôi xác định nhiệt độ gắm mồi (Ta) tối ưu cho từng cặp mồi như sau:
+ Unmethyl (không methyl) SOCS6: 60,3 0 C + Methyl SOCS6: 61,5 0 C
- Tối ưu quy trình phản ứng MSP trên DNA mẫu mô nghiên cứu Sau khi xác định nhiệt độ Ta tối ưu cho từng cặp mồi methyl và unmethyl, chúng tôi thực hiện tối ưu quy trình phản ứng MSP để phát hiện methyl hóa trên các mẫu bệnh phẩm có so sánh với DNA đã được chuyển bisulfite nhóm chứng.
Kết quả thành phần và chu trình phản ứng MSP sau tối ưu Bảng 2.8
Bảng 2.8 Thành phần và chu trình phản ứng MSP
Thành phần Thể tớch (àl) Nồng độ (àM)
*Điện di sản phẩm phản ứng MSP
Lấy 5àl sản phẩm PCR thu được điện di trờn gel angarose 1,5%
(nhuộm RedSafe) với thang chuẩn là marker 50bp ở 120V trong 30 phút trong dung dịch TBE 0,5X.
Nhận xét kết quả thu được, ghi vào hồ sơ nghiên cứu.
Phân tích kết quả
Các số liệu thực hiện được mã hóa đưa vào máy tính và tất cả các phân tích thống kê y học được sử dụng phần mềm SPSS 20.0 Số liệu thu được quản lý kết quả dựa trên phần mềm Microsoft Excel 2016.
- Giá trị có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
- Tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn đối với biến định lượng tuân theo phân phối chuẩn.
- Tính giá trị trung vị và tứ phân vị, giá trị nhỏ nhất và lớn nhất đối với biến định lượng không tuân theo phân phối chuẩn.
- Một số xét nghiệm cận lâm sàng, tần suất alen, kiểu gen, mô hình di truyền, được tính và trình bày bằng tần số và tỷ lệ phần %.
- Chi-square test hoặc Fisher’s exact test được sử dụng để kiểm tra sự khác nhau giữa các biến định tính.
- Tần số kiểu haplotype của gen SOCS6 dựa trên 3 SNP trong nghiên cứu là được tính toán dựa trên thuật toán kỳ vọng tối đa dựa trên phần mềm Arlequin ver 3.0 [82].
Kiểm định T-test và ANOVA được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa các biến số định lượng phân phối chuẩn Đối với so sánh từng cặp giữa các nhóm khác nhau, kiểm định Dunnett T3 được áp dụng.
- Kiểm định Mann-Whitney U test và kiểm định Kruskal-Wallis để so sánh sự khác nhau giữa các biến số định lượng không tuân theo phân phối chuẩn.
- So sánh tỷ lệ, OR và 95%CI, phân tích nhị phân binary logistic và hồi quy đa biến trong phân tích mối liên quan đa hình gen, methyl hóa gen
SOCS6 với các đặc điểm cận lâm sàng.
Đạo đức nghiên cứu
- Người bệnh tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia nghiên cứu.
- Các thông tin liên quan đến người bệnh được đảm bảo bí mật.
- Các xét nghiệm đa hình gen và methyl hóa gen SOCS6 không làm ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh cũng như tăng gánh nặng về tài chính cho người bệnh Ngược lại kết quả nghiên cứu sẽ giúp ích cho quá trình tiên lượng và điều trị của người bệnh.
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Nhóm bệnh nhiễm HBV (n76) Nhóm chứng
Ung thư gan (n6) Xơ gan
Mẫu mô cận u (nA) Mẫu mô ung thư (nA)
Phân tích methyl hóa gen SOCS6 trên mẫu mô Phân tích đa hình gen SOCS6 trên mẫu máu ngoại vi