Từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu chiết xuất dầu cám gạo từ cây Bèo Ông thu hái tại Sa Pa, Lào Cai và xác định hàm lượng γ-oryzanol, tác dụng chống oxy hóa của dầu cám gạo” được
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Bèo Ông
Bèo Ông là một giống lúa nếp bản địa, có tên khoa học chung là Oryza sativa L., thuộc chi Lúa (Oryza), phân họ Tre (Bambusoideae), họ Lúa (Poaceae), bộ Lúa (Poales), phân lớp Loa kèn (Liliidae), lớp Hành (Liliopsida) [1], [5] Đặc điểm thực vật: Cây cỏ mọc hàng năm, cao 130 đến 140 cm Thân rạ, rỗng ở các gióng, đặc ở các mấu màu tím Lá mọc so le; phiến lá dài 68 đến 75 cm; gân lá song song; có bẹ lá và lưỡi nhỏ màu tím nhạt; không có cuống lá Cụm hoa bông gồm nhiều bông nhỏ, mỗi bông nhỏ chỉ có một hoa Hoa có ba cấp mày: 2 mày xếp đối diện ở gốc mỗi bông nhỏ tương ứng với hai lá bắc, dài 1,6 mm; 2 mày nhỏ (là 2 vỏ trấu) có hai gân ở gốc mỗi hoa tương ứng với đài hoa, 2 mày cực nhỏ phía trong cùng là hai phiến mỏng màu trắng tương ứng với cánh hoa dài 0,9 mm Hoa lưỡng tính Bộ nhị 6; chỉ nhị dài 0,7 mm, mành dính vào giữa trung đới cong xuống lay động theo gió; bao phấn dài 2,1 mm
Bầu nhụy cấu trúc 2 lá noãn dính liền với đường kính 0,3mm, chứa 1 ô và 1 noãn Bầu nhụy mang 2 vòi nhụy với núm nhụy nhiều lông màu tím Quả thóc có kích thước 0,8mm x 3mm, sở hữu nhiều râu ngắn màu đỏ tía Hạt thóc có vỏ màu tím đen, bảo vệ bên trong là nội nhũ bột.
Bèo Ông sở hữu những đặc điểm riêng biệt: thân rạ dài; lưỡi nhỏ màu tím nhạt; mắt lóng màu tím; vòi nhụy có lông đỏ tía; hạt gạo có râu đỏ tía rất ngắn; hạt gạo màu tím đen.
Hình 1.1 Bông lúa Bèo ông củ trước khi thu hoạch (bên trái) và Mẫu gạo Bèo Ông xát 1 lần (bên phải)
1.1.2 Công dụng của cây Bèo ông
Một đề tài điều tra đã thống kê được 07 công dụng chính có lợi cho sức khỏe của Bèo Ông mà người dân địa phương biết đến và sử dụng, phù hợp với nhiều đối tượng bao gồm từ trẻ em cho đến người già, từ phụ nữ cho đến nam giới như Bảng 1.1 [5] Một trong những đặc sản của đồng bào Dao đỏ tại Sa Pa, Lào Cai là “đìa nhặn” - phối hợp Bèo Ông với rau ăn làm thuốc giúp tăng sinh lực cho người ốm yếu, mệt mỏi, mất máu và hồi phục sức khỏe, lợi sữa cho phụ nữ sau sinh
Bảng 1.1 Công dụng tốt cho sức khỏe của Bèo Ông [5]
STT Công dụng Hệ số tin cậy (%)
4 Tăng cường chức năng sinh dục 68,3
1.1.3 Một số vấn đề thị trường và hoạt động trồng trọt cây Bèo Ông tại địa phương
Tình hình sản xuất nông nghiệp năm 2023 trên địa bàn xã Tả Phìn diễn ra trong điều kiện thời tiết khá thuận lợi nên các loại cây trồng đều sinh trưởng và phát triển tốt Diện tích gieo trồng đạt 300/300 ha bằng 100% so với cùng kỳ, đạt 100% kế hoạch được giao Sản lượng cây lương thực đạt 1.436,8/1.436,8 tấn, bằng 101,2% so với cùng kỳ, đạt 100% so với kế hoạch Trong đó, cây lúa có diện tích gieo cấy năm 2023 là 190/190ha, bằng 100% kế hoạch và 100% cùng kỳ; năng suất đạt 49,6/49,6 tạ/ha bằng 100% kế hoạch, 100% cùng kỳ; sản lượng đạt 942/941,8 tấn, đạt 100,8% so với kế hoạch và 100,8% so với cùng kỳ Tiếp tục thực hiện cơ cấu lại ngành nông nghiệp theo hướng sản xuất ứng dụng công nghệ cao, nông nghiệp hữu cơ, diện tích các loại cây trồng cơ bản ổn định, nhất là các loại cây trồng có thế mạnh của xã như dược liệu, rau hoa ứng dụng công nghệ cao, [8]
Bèo Ông là một giống lúa truyền thống còn được lưu giữ của đồng bào Dao đỏ tại xã Tả Phìn, Sa Pa, Lào Cai Do điều kiện khí hậu đặc biệt, ánh sáng ít nên người dân chỉ trồng lúa một vụ, hơn nữa thời gian sinh trưởng kéo dài hơn so với vùng thấp, khoảng
Ngày nay, người dân chuyển sang trồng các giống lúa năng suất cao để thay thế nên Bèo Ông không còn được trồng phổ biến như trước nữa.
2023, công ty cổ phần Kinh doanh các sản phẩm bản địa Sapa (Sapanapro) đã và đang trồng khôi phục giống lúa “Bèo Ông” cùng ba hộ dân có diện tích khoảng 01 ha, sản lượng đã thu được 2 tấn/vụ
Về giá trị kinh tế, Bèo Ông có giá trị khá cao do sản lượng thấp, khoảng 40.000VNĐ/kg Bèo Ông được người Dao đỏ ở Sa Pa trồng trọt và thu hoạch vào mùa vụ Thu Hè mỗi năm Sau đó, lúa được xay xát thành gạo và thu mua bởi các thương lái Còn các phụ phẩm trong quá trình xay xát như cám gạo sẽ bị bỏ đi hay làm thức ăn chăn nuôi mà không được thương mại hóa, rất lãng phí Trong khi thị trường cám gạo gần đây giao dịch ảm đạm do nhiều bên thương mại và xuất khẩu cám gạo ngưng mua Giá cả không có nhiều biến động, với mức giá cám khô khoảng 7.200-7.250VNĐ/kg, cám ướt ở quanh mức 7.300VNĐ/kg tại kho Nguồn cung cám mới ra thị trường cũng khá hạn chế khi nhiều nhà máy xay xát đang ngừng hoạt động hoặc hoạt động yếu Các nhà máy xay xát chỉ đang chào ra cám tồn kho do lo ngại tình hình giao dịch khó khăn dẫn tới cám giảm chất lượng khi lưu kho lâu Cám gạo Bèo ông khác với cám gạo thông thường ở chỗ có màu sắc cám tím thẫm và có mùi thơm đặc biệt Chưa có nghiên cứu nào về hàm lượng và thành phần dầu của cám gạo Bèo Ông
Thị trường Sa Pa đang có nhiều ưu thế khi được quan tâm và chú trọng phát triển kinh tế, cải thiện cơ sở hạ tầng, hấp dẫn nhiều khách du lịch trong và ngoài nước Bèo Ông cũng là một đặc sản gắn liền với văn hóa địa phương - văn hóa cộng đồng người Dao đỏ hứa hẹn sẽ thu hút sự quan tâm của nhiều người, từ đó tiếp cận nhanh với nhu cầu sử dụng trong nước và lan tỏa đến quốc tế Do đó, Bèo Ông nói chung và cám gạo Bèo Ông nói riêng rất có tiềm năng để nghiên cứu và phát triển thành các dạng sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ những giá trị của nó.
Tổng quan về cám gạo và dầu cám gạo
1.2.1 Thành phần hóa học của cám gạo, dầu cám gạo
Cám gạo là hỗn hợp của cám (lớp vỏ ngoài màu nâu của hạt thóc) và mầm, được tạo ra như một sản phẩm phụ thu được trong quá trình xay xát từ hạt thóc Quá trình xay xát lúa gạo thu được gạo (nội nhũ) là thành phần chính và phụ phẩm gồm vỏ trấu, cám, mầm [48]
Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc của hạt thóc
Cám gạo là nguồn cung cấp dinh dưỡng dồi dào, chứa tới 50% carbohydrate, 20% chất béo, 15% protein và 15% chất xơ Ngoài ra, cám gạo còn giàu vitamin nhóm B (B1, B2, B3, B6), vitamin E, các khoáng chất thiết yếu (Fe, P, K, Mg, Ca, ) và các nguyên tố vi lượng Đặc biệt, cám gạo còn chứa các chất có hoạt tính sinh học như γ-oryzanol, acid ferulic, tocotrienols, tocopherols, tricin, β-sitosterol và acid phytic.
Trong nhiều loại cám gạo khác nhau, đặc biệt là cám gạo tím còn có thể tìm thấy anthocyanin - một trong những phân lớp của flavonoid với hàm lượng cao nhất [31] Các hợp chất anthocyanin có hoạt tính trong cám gạo là monome, dime và polyme anthocyanin; apigenin; cyanidin glucoside; epicatechin; hesperetin; luteolin; [19] Cám gạo chứa phần lớn dầu trong nhân Hàm lượng dầu trong cám gạo sạch khoảng 15-20% Ngoài ra, trong cám gạo còn có một số yếu tố kháng dinh dưỡng, điển hình như lipase Ở mỗi lần xay xát, một số loại lipase tiếp xúc với dầu cám gạo dẫn đến sự thủy phân dầu nhanh chóng thành acid béo tự do (FFA) Sự gia tăng đáng kể acid béo tự do (FFA) xảy ra trong vòng vài giờ và đạt khoảng 7-8% trong vòng 24 giờ, cám gạo sẽ bị biến đổi rất lớn về chất lượng Sau đó có thể tăng khoảng 56% mỗi ngày làm ảnh hưởng đến thời hạn và độ ổn định của cám gạo [41] Đây là lý do vì sao cám gạo ở nước ta vẫn được coi là phụ phẩm, dùng làm thức ăn gia súc, không có giá trị cao Enzym này có hoạt tính lên tới 40 0 C, hoạt tính giảm mạnh xuống 65% ở 60 0 C và sau đó giảm dần [22] Để tránh thất thoát những thành phần dinh dưỡng có giá trị, cám gạo cần được xử lý ổn định bằng cách bất hoạt enzym lipase càng sớm càng tốt Quá trình ổn định cám gạo có thể áp dụng nhiều kỹ thuật khác nhau như xử lý nhiệt [30], làm nóng bằng vi sóng, nấu ép đùn [47], gia nhiệt bằng Ohmic [16],
Bảng 1.2 Các kỹ thuật khác nhau để ổn định cám gạo
Trong các phương pháp trên, sấy bằng khí nóng là phương pháp phổ biến nhất để ổn định cám gạo Nhiệt độ cao trên 120 0 C làm biến tính enzyme chịu trách nhiệm phân hủy lipid trong RBO mà không làm mất đi giá trị dinh dưỡng của cám gạo Nhiệt độ được sử dụng để ổn định dao động từ 100-140 0 C [36]
Thành phần hóa học của dầu cám gạo chứa các acid béo không no (acid oleic, acid linoleic, acid linolenic), acid béo no (acid palmitic, acid stearic), các chất không xà phòng hóa (γ-oryzanol, vitamin E, squalen, tocopherol, tocotrienol và các dẫn chất) Hàm lượng của một số thành phần được nêu trong bảng 1.3
Bảng 1.3 Hàm lượng một số thành phần trong dầu cám gạo
STT Kỹ thuật ổn định Điều kiện
1 Sấy bằng khí nóng 120 0 C trong 30 phút
4 Phơi nắng 47 0 C (tối đa) 7 giờ/ngày, trong 2 ngày
5 Sấy tầng sôi 84 0 C trong 1 giờ
Phun dung dịch HCl 1000 ppm
7 Sưởi ấm bằng lò vi sóng 2450MHz trong 2 phút
9 Gia nhiệt bằng Ohmic 20-40% độ ẩm, điện áp 44-72V/cm
Thành phần Hàm lượng (%kl/kl)
Nguồn cung dinh dưỡng dồi dào trong cám gạo như carbohydrate, protein, vitamin B, khoáng chất và chất xơ đang bị lãng phí khi chủ yếu dùng làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam Tuy nhiên, các thành phần này lại vô cùng có lợi cho sức khỏe con người.
Cám gạo chứa nhiều hoạt chất quý giá, có giá trị dược liệu cao trong ngành dược phẩm, dùng để phòng và trị bệnh Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng sử dụng cám gạo hoặc dầu cám gạo mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư, cân bằng cholesterol máu, giảm rối loạn lipid máu, tốt cho tim mạch, ổn định đường huyết, tăng sức đề kháng, ngăn ngừa dị ứng và chống viêm Tỷ lệ giữa acid béo no, acid béo không no đơn và acid béo không no đa trong dầu cám gạo gần với tỷ lệ 10:15:10 được Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ khuyến nghị sử dụng cho bệnh nhân tim mạch để phòng ngừa xơ vữa động mạch, tăng huyết áp và cholesterol máu cao.
Cám gạo cũng được sử dụng trong thực phẩm dưới dạng cám nguyên chất béo, cám đã khử chất béo, dầu cám gạo và chất cô đặc protein Cám gạo hay các thành phần dinh dưỡng của nó trở thành nguyên liệu trong nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau như bánh mì, bánh quy, pizza hay đồ uống, Với các thành phần acid béo, oryzanol , omega-3, omega-6, dầu cám gạo được biết đến như một loại “dầu tốt cho sức khỏe” đang ngày càng được quan tâm và sử dụng thay thế cho dầu thực vật [20]
Ngoài ra, cám gạo còn được xem là "bí quyết" làm đẹp của phụ nữ Nhật Bản Cám gạo có mặt trong các sản phẩm như sữa rửa mặt giúp cấp ẩm; kem dưỡng có tác dụng chống oxy hóa, chống lão hóa, hấp thụ tia UV và cấp ẩm; dầu gội xả kích thích mọc tóc.
Thành phần Hàm lượng (%kl/kl)
Thành phần không xà phòng hóa
Những năm gần đây, cám gạo được chứng minh là nguồn cung cấp anthocyanin tự nhiên dồi dào và kinh tế nhất Cám gạo có thể được sử dụng làm chất tạo màu tự nhiên, đặc biệt là cám gạo tím và làm thành phần tăng cường sức khỏe như thực phẩm dinh dưỡng và thực phẩm chức năng [31]
1.2.3 Tổng quan về các phương pháp chiết xuất dầu cám gạo
1.2.3.1 Phương pháp chiết xuất bằng dung môi hữu cơ
Những dung môi để chiết xuất dầu cần phải có một điểm sôi tương đối thấp và không dễ cháy, ít độc hại Một số dung môi được sử dụng chiết xuất dầu cám gạo: n- hexan, iso-propanol, ethanol, methanol, dichloromethan, etyl acetat
- Hexan: là dung môi không phân cực, thường được sử dụng nhất trong chiết xuất dầu cám gạo Tuy nhiên, dung môi hexan là một dung môi dễ bay hơi, dễ cháy, độc hại, ảnh hưởng đến người sản xuất cũng như môi trường và hàm lượng γ-oryzanol thu được trong dầu không cao
- Iso-propanol, acetone: Là các dung môi phân cực, ít độc hại hơn so với dung môi hexan Tuy nhiên, hiệu suất chiết sử dụng dung môi này kém hơn so với hexan đồng thời giá thành cao hơn
Trong các nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất để thu hàm lượng cao, thường sử dụng kết hợp dung môi hữu cơ với một dung môi khá phân cực như ethanol, iso- propanol, methanol
• Điều kiện chiết xuất tối ưu dầu cám gạo:
Sử dụng phương pháp ngâm: Cám gạo được ngâm ngập trong dung môi hexan ở nhiệt độ thường, trong thời gian là 2 giờ, bước nhảy là 0,5 giờ [3]
Sử dụng phương pháp siêu âm: Cám gạo được chiết siêu âm với dung môi hữu cơ n-hexan (độ tinh khiết 95%) thu được hiệu suất cao nhất ở nhiệt độ 60 0 C, tỷ lệ cám gạo:dung môi là 1:5 trong 2 giờ [17]
Sử dụng phương pháp chiết xuất hồi lưu: 10g cám gạo được chiết bằng thiết bị
Soxhlet với 200ml dung môi thích hợp nhất là n-hexan trong 8 giờ [4]
• Chưng cất, thu hồi dung môi:
Tổng quan về hoạt chất γ-oryzanol
1.3.1 Nguồn gốc, cấu trúc và tính chất lý hóa γ-oryzanol là thành phần có mặt chủ yếu trong cám gạo, dầu cám gạo Bất kể là loại gạo nào, hàm lượng γ-oryzanol trong gạo có giá trị cao nhất ở cám, sau đó là ngũ cốc nguyên hạt, đến trấu và cuối cùng là nội nhũ [21] Nồng độ γ-oryzanol trong cám gạo dao động từ 3861,93 đến 5911,12μg/g [31] Dầu cám gạo thô chứa khoảng từ 0,9- 2,1% γ-oryzanol hay 10-20mg/g [2]
Công thức phân tử của γ-oryzanol là C40H58O4, trọng lượng phân tử 602,89g/mol
Là một hỗn hợp ester của acid trans-ferulic với các phytosterols và triterpen alcol Có ít nhất 10 chất phytosteryl ferulat của γ-oryzanol đã được tìm thấy: 24-methylen cycloartanyl ferulat, cycloartenyl ferulat, campesteryl ferulate, sitosteryl ferulat, Δ- campestenyl ferulat, campestanyl ferulat, sitostanyl ferulat, Δ-stigmastenyl ferulat, stigamsteryl ferulat, Δ-sitosteryl ferulat [27] Trong đó, 3 thành phần chính chiếm 80% là 24-methylen cycloartanyl ferulat, cycloartenyl ferulat, campesteryl ferulat tùy thuộc vào các giống lúa [51] Và hoạt tính chống oxy hóa cao nhất được tìm thấy ở 24- methylen cycloartanyl trans-ferulat [50]
Loại acid béo tự do
Dầu tinh chế Nước nóng
1.6.a) Cycloartenyl ferulat 1.6.b) 24-methylen cycloartanyl ferulat
1.6.c) Campesteryl ferulat Hình 1.6 Công thức cấu tạo của các cấu tử chính γ-oryzanol
Tính chất lý hóa của γ-oryzanol:
- Bột tinh thể màu trắng hoặc hơi vàng, không có mùi [54]
- Nhiệt độ nóng chảy từ 135–137 0 C [54]
- Tan trong aceton, n-hexan, ete, chloroform, benzen, ethanol (tan nhẹ) và nước
- Bị thủy phân trong môi trường kiềm ở 80 0 C, tạo muối của acid ferulic [52]
- Tạo kết tủa với ion canxi sau khi thủy phân trong môi trường kiềm và pha loãng với nước [14]
Trên thị trường γ-oryzanol với độ tinh khiết 99% có giá thành từ 74.000VNĐ đến 5.000.000VNĐ/gam
Nhiều công trình nghiên cứu đã xác định thuộc tính sinh học của γ-oryzanol như sau:
- Tác dụng giảm nồng độ cholesterol trong máu: γ-oryzanol ức chế sự hấp thu cholesterol trong chế độ ăn uống và đồng thời cũng ức chế sự tái hấp thu của cholesterol nội sinh từ đường tiêu hóa [12], [24], [26], [49]
- γ-oryzanol có lợi cho bệnh nhân tiểu đường giúp cải thiện lượng đường bằng cách cải thiện chức năng và sự tồn tại của tế bào β tuyến tụy Nhiều bằng chứng cho rằng đặc tính hạ đường huyết liên quan chặt chẽ đến hoạt tính chống oxy hóa của γ- oryzanol [28], [45]
- Tác dụng chống viêm: Tác dụng chống viêm của γ-oryzanol liên quan với các đặc tính chống oxy hóa, đã được báo cáo trong các mô hình in vitro và in vivo Ví dụ, các đại thực bào RAW 264,7 của chuột đã được tiêm γ-oryzanol ức chế đáng kể quá trình sản xuất các gốc tự do do lipopolysaccharid gây ra và biểu hiện viêm qua trung gian NF-κB, dẫn đến cản trở các phản ứng viêm [45]
γ-oryzanol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, có tác dụng vô hiệu hóa các gốc tự do gây hại cho tế bào Nghiên cứu in vitro đã chứng minh rằng γ-oryzanol có hiệu quả chống oxy hóa cao hơn gấp bốn lần so với vitamin E, giúp bảo vệ mô khỏi quá trình oxy hóa.
γ-oryzanol có tác dụng làm giảm các triệu chứng bốc hỏa, đổ mồ hôi đêm và mất ngủ ở phụ nữ tiền mãn kinh Ngoài ra, sự kết hợp giữa γ-oryzanol và sterol thực vật còn được sử dụng trong điều trị chứng mất trí nhớ do tuổi già, xơ cứng động mạch và tiểu não.
1.3.3 Các phương pháp định lượng γ- oryzanol
• Định lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Theo tác giả Apirak Sakunpak và cộng sự [46], γ-oryzanol có thể được định lượng bằng phương pháp HPTLC như sau:
- Dung dịch chuẩn: γ-oryzanol được pha trong ethyl acetat (EtOAc) và sau đó pha loãng để thu được dãy nồng độ nằm trong khoảng 0,2-0,7μg/mL
- Dung dịch thử: dầu cám gạo pha trong ethyl acetat
- Dung môi triển khai: n-hexan - ethyl acetat (9:1 hoặc 8:2 hoặc 7:3)
- Triển khai sắc ký: Lờn bản mỏng 10àl dung dịch chuẩn Cỏc vết dung dịch chuẩn có nồng độ 200ng/vết, 300ng/vết, 400ng/vết, 500ng/vết, 600ng/vết Hiện màu bằng bước sóng 365nm Sử dụng phần mềm CAT 4, TLC Scanner xác định mật độ điểm, tính diện tích pic Xây dựng đường chuẩn, từ đó xác định nồng độ mẫu thử
• Định lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo bằng phương pháp quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS)
Theo TCVN 7597-2013 [2], phụ lục A.5.20, hàm lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo thô được định lượng như sau:
- Trước khi sử dụng, máy quang phổ hấp thụ phổ cần được điều chỉnh đến zero, được đổ đầy trước n-hexan vào cuvet mẫu và cuvet chuẩn
- Mẫu dầu được lọc qua giấy lọc ở nhiệt độ môi trường
- Cân chính xác khoảng 0,02g mẫu đã chuẩn bị cho vào bình định mức 25ml, thêm n-hexan đến vạch
- Đổ đầy dung dịch thu được vào cuvet và đo hệ số tắt ở bước sóng hấp thụ tối đa gần 315nm, sử dụng cùng một dung môi để so sánh
- Hệ số tắt ghi được phải nằm trong dải từ 0,3 đến 0,6 Nếu không, cần lặp lại các phép đo thích hợp sử dụng dung dịch đậm đặc hơn hoặc pha loãng hơn
Tính kết quả: Tính hàm lượng γ-oryzanol như sau:
Trong đó: W là khối lượng mẫu (g);
A là hệ số tắt (độ hấp thụ) của dung dịch;
E là hệ số tất điển hình E 1% 1cm = 359
Renata Heidtmann-Bemvenuti và cộng sự [23] đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo bằng phương pháp quang phổ tại bước sóng cực đại 314nm (trong n-hexan) và 326nm (trong iso-propanol):
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng γ-oryzanol trong n-hexan và iso-propanol
- So sánh phổ hấp thụ của γ-oryzanol chuẩn và γ-oryzanol trong dầu cám gạo trong dung môi n-hexan và iso-propanol, từ đó khẳng định có thể định lượng được γ-oryzanol trong dầu cám bằng phương pháp quang phổ dựa trên đường chuẩn biểu diễn nồng độ γ-oryzanol /dung môi với độ hấp thụ tại bước sóng cực đại
Hình 1.7 Phổ hấp thụ của γ-oryzanol chuẩn và γ-oryzanol từ dầu cám gạo trong
Một báo cáo khoa học tại Việt Nam [6] đã định lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo bằng phương pháp quang phổ hấp thụ như sau:
- Cân chính xác một lượng dầu cám gạo hòa tan trong một lượng n-hexan thích hợp (nồng độ γ-oryzanol nằm trong khoảng từ 4-16àg/ml)
- Lọc bằng giấy lọc thu được dịch lọc, đo độ hấp thụ quang tại bước sóng cực đại λ15nm, với mẫu trắng là dung dịch n-hexan
• Định lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Một nghiên cứu chiết γ-oryzanol trong cám gạo [4] đã phân tích γ-oryzanol bằng máy HPLC (UV-VIS detector, Thermo scientific) với điều kiện như sau:
- Pha tĩnh: Cột C18 (ODS Hypersil, 150 x 4,6mm, 5μm)
- Pha động: hệ dung môi acetonitril và methanol (tỉ lệ 70:30)
- Tốc độ dòng: 1,7ml/phút
- Cách tiến hành: Dầu cám gạo được hòa tan với 4ml hệ dung môi Cuối cùng, dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 μm và phân tích HPLC Mỗi dung môi tiến hành chiết và phân tích HPLC 3 lần
Theo tác giả Phan Van Man và cộng sự [39], γ-oryzanol được định lượng bằng phương pháp HPLC như sau:
- Pha tĩnh: Cột sắc ký Poroshell 120 EC-C18 (150 x 3,0mm, 2,7μm)
- Nhiệt độ cột: 25 0 C và Detector UV: 325nm
- Pha động gradient bao gồm 100:0, 50:50, 40:60 (v/v) methanol:acetonitril trong
- Tốc độ dòng: 1,0ml/phút
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu
Các mẫu cám gạo cây Bèo Ông được thu hoạch tại ba vùng trồng (A, B, C) của Công ty Cổ phần Sapanapro và xay xát tại cơ sở của người dân địa phương tại xã Tả Phìn, thị xã Sa Pa Trong quá trình xay xát, cám gạo được chia làm hai phần: cám xát 1 (thu được sau lần xát đầu tiên) và cám xát 2 (thu được sau lần xát thứ hai).
- Tiêu bản của mẫu cây Bèo Ông được thu tại vùng trồng xã Tả Phìn, thị xã Sa Pa, tỉnh Lào Cai thu hoạch vụ mùa năm 2023 Mẫu tiêu bản được giám định tên khoa học là Oryza sativa var japonica Postiglione Và được lưu trữ tại phòng tiêu bản cây thuốc, Khoa Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội với mã số tiêu bản HNIP/18852/24
Bảng 2.1 Thông tin các mẫu nghiên cứu Mẫu
Cám xát Bèo Ông A lần 1
Cám xát Bèo Ông A lần 2
Cám xát Bèo Ông B lần 1
Cám xát Bèo Ông B lần 2
Cám xát Bèo Ông C lần 2*
Ký hiệu BO23.1 BO23.2 BO23.3 BO23.4 BO23.5
*: Cám xát Bèo Ông C lần 1 rất ít nên không thu mẫu
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất
• Hoá chất, dung môi, thuốc thử:
- γ-oryzanol chuẩn >99% (Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LTD; CAS: 11042-64-1, Lot: J2212301)
- Dung môi, hóa chất dùng để chiết xuất, định lượng: n-hexan, ethanol 96%
(EtOH), iso-propanol, acetonitril (ACN), methanol (MeOH), ethyl acetat, nước cất, đạt tiêu chuẩn tinh khiết Dược điển Việt Nam V hoặc đạt chất lượng phân tích (PA)
- Hóa chất, thuốc thử dùng để thử nghiệm đánh giá tác dụng chống oxy hóa: 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), quercetin được mua từ công ty Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA) Các dung môi và hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích (PA)
• Dụng cụ, thiết bị, máy móc nghiên cứu:
- Kính hiển vi (Nikon eclipse)
- Kính lúp soi nổi (Nikon H550S)
- Máy xác định hàm ẩm nhanh
- Cân kỹ thuật Sartorius (TE3102S)
- Cân phân tích Shimadzu (AY220)
- Hệ thống máy cô quay chân không Buchi
- Bản mỏng sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC-Silica gel 60 F254, Merck)
- Đèn tử ngoại soi hai bước sóng 254nm và 366nm
- Máy quang phổ Shimazhu UV-1800 Nhật Bản
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC tại Bộ môn Dược cổ truyền, Khoa Dược liệu – Dược cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội
- Máy Elisa (Biotek, Mỹ) và đĩa elisa 96 giếng (Aptaca- Italia) tại Bộ môn Dược lực, Khoa Dược lý – Dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội
Các dụng cụ thí nghiệm thường quy bao gồm: bình định mức, cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, pipet, micropipette, đầu côn, ống đong, đũa thủy tinh, bình cầu, phễu lọc, giấy lọc, rõy 1400àm, rõy 710àm và nhiều dụng cụ khác Những dụng cụ này đóng vai trò quan trọng trong các thí nghiệm khoa học, giúp đo lường, trộn, chiết, lọc và xử lý các mẫu vật một cách chính xác và hiệu quả.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân loại và xử lý nguyên liệu cám gạo Bèo Ông thu hái tại Sa Pa,
Nội dung 2: Nghiên cứu chiết xuất dầu cám gạo từ cây Bèo Ông bằng phương pháp dung môi hữu cơ
Nội dung 3: Định lượng γ-oryzanol trong các mẫu dầu cám gạo bằng hai phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Nội dung 4: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của một số mẫu dầu cám gạo bằng phương pháp bắt giữ gốc tự do DPPH Đề tài được thực hiện theo sơ đồ nghiên cứu sau đây:
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phân loại và xử lý nguyên liệu
- Phân bố kích thước: Mẫu cám gạo sau khi thu tại cơ sở xay xát được phân loại, gỏn mó số, sau đú lần lượt được sàng qua cỏc rõy 1400àm (cỡ lỗ 1400àm) và rõy 710àm (cỡ lỗ 710àm) Mỗi lần rõy cho một lượng cỏm vừa đủ (khoảng 100g), lắc rõy theo chiều ngang quay tròn ít nhất 10 phút, đôi lúc dùng mica đảo nhẹ phần bột trên rây, và rây tới khi xong Cân số lượng còn lại ở trên rây và dưới khay hứng Cám gạo sau khi sàng được bảo quản trong túi nilon ở nhiệt độ thường dưới 250C Xác định tỉ lệ % lượng cám gạo phân bố kích thước trên tổng số cám (trên rây 1400, giữa 1400 và 710, dưới rây 710)
- Ổn định mẫu: Trong vòng 24 giờ sau khi xay xát, cám gạo được sấy ở nhiệt độ
120 0 C trong vòng 20 phút (FAN 20%, FLAP 50%) Lưu trữ và bảo quản trong túi PE kéo mép chống ẩm, trong điều kiện nơi khô ráo dưới 25 0 C, tránh ánh sáng
- Xác định độ ẩm: Độ ẩm được xác định bằng cách sấy 1g mẫu cám gạo trước khi sấy và sau khi sấy trong máy đo hàm ẩm, duy trì nhiệt độ ở 105 0 C, theo quy trình được đưa ra trong AOAC [11]
Cám gạo Bèo Ông Độ ẩm mẫu
Khối lượng mẫu sử dụng
Chiết xuất dầu Hiệu suất chiết
Dung môi chiết xuất Phương pháp chiết xuất
Dầu cám gạo Xây dựng và thẩm định phương pháp Hàm lượng γ-oryzanol
Hoạt tính chống oxy hóa
2.3.2 Nghiên cứu chiết xuất dầu cám gạo Bèo Ông bằng phương pháp dung môi hữu cơ
2.3.2.1 Khảo sát sơ bộ hàm lượng dầu, γ-oryzanol trong cám gạo Bèo Ông
Xác định hàm lượng dầu bằng phương pháp Soxhlet với dung môi n-hexan: 20g cám gạo với 300ml dung môi, thời gian 4h
- Làm túi bằng giấy lọc: cắt một miếng giấy lọc vuông, cuộn tròn, gập đáy, dùng ghim để ghim mép giấy
- Cân chính xác khoảng 20g dược liệu thô cho vào trong túi đã chuẩn bị sẵn, gập miệng túi và đặt vào dụng cụ chiết Soxhlet
- Lắp dụng cụ, đặt lên nồi đun cách thuỷ Ðặt phễu lên miệng ống sinh hàn Rót 100ml dung môi n-hexan qua phễu
- Chiết hồi lưu nhiều lần cho đến khi dầu được chiết kiệt
- Gộp dịch chiết lọc qua giấy lọc rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khi bay hơi hết dung môi
- Cân lượng dầu còn lại trong bình (trừ bì) và xác định hàm lượng dầu trong cám
- Xác định hàm lượng γ-oryzanol theo phương pháp quang phổ hấp thụ được xây dựng ở mục 2.3.3
Các thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình
2.3.2.2 Khảo sát một số phương pháp chiết xuất dầu cám gạo từ cây Bèo Ông
Dựa trên thông tin đã tổng quan (mục 1.2.4), khảo sát một số phương pháp chiết xuất dầu cám gạo từ cây Bèo Ông thu hái tại Sa Pa, Lào Cai theo hai nhóm biến số sau đây:
(X1) Khảo sát Dung môi chiết xuất: Khảo sát các dung môi chiết xuất: n-hexan, ethanol 96%, iso-propanol, hỗn hợp n-hexan:ethanol (9:1); cố định các yếu tố: thời gian chiết xuất (2 giờ), tỷ lệ dung môi – dược liệu (5ml/g), phương pháp chiết
(X2) Khảo sát Phương pháp chiết xuất: Khảo sát 02 phương pháp chiết xuất:
Ngâm, khuấy ở nhiệt độ phòng và Siêu âm ở nhiệt độ 60 0 C; cố định các yếu tố: Dung môi chiết xuất, thời gian chiết xuất (2 giờ), tỷ lệ dung môi - dược liệu (5ml/g)
Theo thí nghiệm, 500g cám gạo được ngâm tẩm với lượng dung môi đủ ẩm dược liệu, sau đó thêm dung môi cho tỷ lệ dung môi - dược liệu đạt 5ml/g, tương đương 2,5L dung môi Quá trình chiết xuất được thực hiện dựa trên các yếu tố khảo sát trong các thí nghiệm khác nhau.
- Thu dịch chiết cám gạo bằng phương pháp lọc
- Sau khi chiết lần 1, thêm khoảng 200ml dung môi vào ngập dược liệu và tiếp tục chiết xuất ở điều kiện khảo sát Lọc dịch chiết lần 2 và thêm dung môi, lặp lại quy trình một lần nữa
- Gộp dịch lọc và cô quay áp suất giảm loại dung môi ở nhiệt độ 60 0 C đến khối lượng không đổi Dung môi thu hồi có thể sử dụng cho lần chiết xuất tiếp theo
- Cân khối lượng dầu cám gạo thu được sau khi cô quay, tính hiệu suất chiết xuất dầu cám gạo Các thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình
- Loại tạp sơ bộ bằng cách để lắng dầu cám gạo trong 24 giờ, gạn lấy dịch loại bỏ tạp chất lắng phía dưới
Thông số đánh giá: Hiệu suất chiết dầu từ cám gạo Bèo Ông (%) là tỷ lệ khối lượng dầu chiết được chia cho tổng khối lượng dược liệu sử dụng (đã trừ hàm ẩm), được tính theo công thức:
Hiệu suất chiết xuất dầu cám gạo (H) là tỷ lệ giữa khối lượng dầu thu được (m dầu) và khối lượng cám gạo sử dụng (m DL) đã trừ đi hàm ẩm.
Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2021, phần mềm R và phương pháp Post-hoc One-way Anova để xử lý số liệu
2.3.3 Đánh giá hàm lượng γ-oryzanol trong các mẫu dầu cám gạo
2.3.3.1 Khảo sát, định tính thành phần γ-oryzanol trong dầu cám gạo bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Thành phần γ-oryzanol trong các mẫu dầu cám gạo chiết xuất được theo các phương pháp tại mục 2.3.2.2 được định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4, Dược điển Việt Nam V) Các điều kiện sắc ký như sau:
+ Mẫu chuẩn: Chuẩn γ-oryzanol (0,02g) được pha trong bình định mức 10ml với dung môi n-hexan
+ Mẫu thử: Cân 2,5g các mẫu dầu cám gạo, pha trong bình định mức 10ml với dung môi n-hexan
+ Mẫu thử thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử một lượng chính xác chất chuẩn sao cho nồng độ mẫu bằng với lượng có trong mẫu thử
- Bản mỏng: Bản mỏng Silicagel GF254, Merck, kích thước 3-4cm x 10cm Bản mỏng được hoạt hóa ở 110 0 C trong 30 phút trước khi chạy sắc ký
- Chấm sắc ký: Chấm sắc ký bằng ống mao quản 5μl, chấm khoảng 10àl mỗi mẫu lên bản mỏng
Triển khai sắc ký đòi hỏi đặt thẳng bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi Sau khi đậy kín bình, để yên và quan sát quá trình tách cho đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng một khoảng vừa phải.
2 cm thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên Quan sát và chụp ảnh bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm
2.3.3.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng γ-oryzanol trong dầu của cám gạo Bèo Ông bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS
Dựa trên nghiên cứu của Đào Anh Hoàng [6], tiến hành xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng γ-oryzanol trong dầu của cám gạo Bèo Ông bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS: a) Chuẩn bị mẫu thử
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc γ-oryzanol chuẩn nồng độ 1mg/ml: Cân chính xác khoảng 100mg γ-oryzanol chuẩn cho vào bình định mức dung tích 100,0ml, thêm khoảng 40ml n-hexan vào bình định mức, siêu âm để hòa tan chuẩn, thêm tiếp n-hexan đến vạch vừa đủ 100ml
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
Kết quả phân loại và xử lý nguyên liệu
Những bao thóc thu hoạch tại 03 vùng trồng của công ty CP Sapanapro: Bèo Ông
A, Bèo Ông B, Bèo Ông C vào tháng 09 năm 2023, được vận chuyển đến cơ sở xay xát của người dân địa phương Sau khi xay xát, lần lượt thu được các mẫu gạo, cám gạo của cây Bèo Ông A, B, C riêng biệt
Cám gạo trong quy trình xay xát được chia làm 2 phần: cám xát 1 (cám thu được sau lần xát thứ nhất), cám xát 2 (cám thu được sau lần xát thứ hai)
Các mẫu nghiên cứu được phân loại và ký hiệu như Bảng 3.1
Bảng 3.1 Thông tin chi tiết các mẫu nghiên cứu Mẫu
Cám xát Bèo Ông A lần 1
Cám xát Bèo Ông A lần 2
Cám xát Bèo Ông B lần 1
Cám xát Bèo Ông B lần 2
Cám xát Bèo Ông C lần 2*
Ký hiệu BO23.1 BO23.2 BO23.3 BO23.4 BO23.5
Tỷ lệ cám gạo 37,34% 42,86% 51,35% Độ ẩm trước khi sấy
*: Cám xát Bèo Ông C lần 1 rất ít nên không thu mẫu
Nhận xét: Tỉ lệ cám gạo xát có trong Bèo Ông là khoảng từ 37,34-51,35%
Cỏc mẫu cỏm gạo được sàng lần lượt qua 2 loại rõy kớch thước 1400àm và 710àm Phân bố kích thước với tỷ lệ tương ứng trên Bảng 3.2
Bảng 3.2 Phân bố kích thước của 5 mẫu cám gạo
STT Mẫu Tỉ lệ % lượng cám gạo phân bố kích thước trên tổng số cám
Nhận xét: Độ mịn của cám gạo giữa các mẫu và giữa 2 lần xay xát là khác nhau Phần lớn cỏm gạo trờn rõy 1400àm là hạt thúc, hạt vỡ, mảnh vỏ, trấu và tạp chất được loại bỏ Cám xát lần 1 dễ rây, cám thô to, còn cám xát lần 2 rây dễ nát, vụn Cám xát lần
1 mịn và ít trấu hơn cám xát lần 2
Trong vòng 24 giờ sau khi xay xát, cám gạo được ổn định bằng cách sấy ở nhiệt độ 120 0 C trong vòng 20 phút Độ ẩm của các mẫu cám gạo trước khi sấy theo Bảng 3.1 nằm trong khoảng từ 10-13% Sau khi sấy các mẫu cám gạo có hàm ẩm trong khoảng từ 0,62 đến 2,72%, đều nhỏ hơn 5% Lưu trữ và bảo quản cám gạo trong túi PE kéo mép chống ẩm ở nhiệt độ thường.
Kết quả nghiên cứu phương pháp chiết xuất dầu từ cám gạo Bèo Ông
3.2.1 Khảo sát hàm lượng dầu, γ-oryzanol trong cám gạo Bèo Ông
Tiến hành quá trình chiết xuất dầu cám gạo bằng phương pháp chiết Soxhlet như đã trình bày trong mục 2.3.2 và xác định hàm lượng γ-oryzanol bằng phương pháp quang phổ hấp thụ theo mục 2.3.3 Sử dụng mẫu cám xát Bèo Ông A lần 2 có độ ẩm trước khi chiết là 2,7% Kết quả khảo sát hàm lượng dầu và γ-oryzanol trong cám gạo Bèo Ông được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.3 Hàm lượng dầu và γ-oryzanol khảo sát sơ bộ trong cám gạo Bèo Ông
Tên mẫu Tỷ lệ trong tổng lượng cám (%) Độ ẩm
Hàm lượng dầu trong cám (%)
Hàm lượng γ-oryzanol trong cám (%)
Nhận xét: Khảo sát hàm lượng dầu chiết xuất được bằng n-hexan trong cám gạo
Bèo Ông là 6,12% và hàm lượng γ-oryzanol trong cám là 0,3769%
3.2.2 Kết quả khảo sát một số phương pháp chiết xuất dầu cám gạo từ Bèo Ông
Tiến hành quá trình chiết xuất dầu cám gạo bằng các phương pháp như đã trình bày trong mục 2.3.2 Sử dụng mẫu cám xát Bèo Ông B lần 1 - BO23.3 (độ ẩm trước khi chiết là 4,05%) với tỷ lệ dược liệu:dung môi là 1:5 trong thời gian 2 tiếng Kết quả tính hiệu suất chiết dầu cám gạo được trình bày tóm tắt trong bảng 3.4
Bảng 3.4 Hiệu suất chiết dầu cám gạo từ cây Bèo Ông
STT Dung môi chiết xuất Phương pháp chiết xuất Ký hiệu Hiệu suất chiết dầu cám gạo (%)
1 n-hexan Ngâm khuấy, nhiệt độ thường BO23.3.1 5,87±0,07
2 n-hexan Siêu âm, nhiệt độ 60 0 C BO23.3.2 6,64±0,07
3 ethanol 96% Ngâm khuấy, nhiệt độ thường BO23.3.3 6,31±0,23
4 ethanol 96% Siêu âm, nhiệt độ 60 0 C BO23.3.4 5,72±0,15
5 iso-propanol Ngâm khuấy, nhiệt độ thường BO23.3.5 4,83±0,14
6 iso-propanol Siêu âm, nhiệt độ 60 0 C BO23.3.6 5,22±0,12
Siêu âm, nhiệt độ 60 0 C BO23.3.7 5,38±0,11 Nhận xét:
- Dung môi iso-propanol ở cả hai phương pháp cho kết quả hiệu suất chiết dầu thấp nhất giữa các dung môi khảo sát
- Trong khi, dung môi n-hexan và iso-propanol có hiệu suất ở phương pháp siêu âm cao hơn ngâm khuấy thì ethanol cho kết quả ngược lại ở hai phương pháp chiết
- So sánh hai phương pháp trên nhận thấy:
+ Chiết ngâm có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện Tuy nhiên phương pháp này thường có năng suất thấp, thao tác thủ công nếu chiết một lần sẽ khó chiết kiệt hoạt chất, chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi
+ Chiết siêu âm, nhiệt độ 60 0 C cũng là một phương pháp chiết đơn giản, nhanh chóng, có thể rút ngắn thời gian chiết và tiết kiệm dung môi, dịch chiết đặc hơn
- Nhiệt độ có ảnh hưởng tới lượng sáp có trong dầu: Quan sát các dịch chiết ngâm
Kết quả định lượng hàm lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo Bèo Ông
3.3.1 Khảo sát, định tính thành phần γ-oryzanol trong dầu cám gạo bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với ba mẫu (mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu thử) (Hình 3.1) cho thấy sắc ký đồ của cả ba mẫu có xuất hiện vết của chuẩn γ-oryzanol tại giá trị Rf khoảng 0,6
Hình 3.1 Bản mỏng sắc ký định tính γ-oryzanol trong dầu cám gạo
Nhận xét: Kết quả định tính cho thấy trong mẫu dầu cám gạo đã chiết xuất có chứa thành phần γ-oryzanol
3.3.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng γ-oryzanol trong dầu của cám gạo Bèo Ông bằng phương pháp quang phổ hấp thụ (UV-VIS)
3.3.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp a) Khảo sát và tìm điều kiện đo quang
Dựa vào phổ hấp thụ của dung dịch thử trong dải bước sóng 400-260nm, xác định bước sóng hấp thụ cực đại tại 313nm Từ đó, bước sóng định lượng được lựa chọn là 313nm để tiến hành phân tích định lượng chất trong dung dịch.
Hình 3.2 Phổ hấp thụ của γ-oryzanol trong dầu cám gạo BO23.3.3 b) Thẩm định phương pháp
(i) Khảo sỏt tớnh thớch hợp hệ thống: Pha mẫu đối chiếu cú nồng độ 15àg/ml trong n-hexan, quét phổ ở bước sóng 400-260nm, xác định λmax và độ hấp thụ tại λmax
- Kết quả: độ hấp thụ cực đại tại bước sóng khoảng 313nm Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây
Hình 3.3 Phổ hấp thụ của γ-oryzanol chuẩn trong dung môi n-hexan
Bảng 3.5 Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn γ-oryzanol
Nồng độ γ-oryzanol trong dung dịch chuẩn (àg/ml) 15 15 15 15 15 15 λ max (nm) 314 314 314 314 314 314 Độ hấp thụ (Abs) 0,560 0,555 0,548 0,552 0,551 0,557
Dựa trên các thông số đề cập, hệ thống UV-1800 đảm bảo các điều kiện thích hợp và ổn định để tiến hành phân tích định lượng γ-oryzanol và chuẩn γ-oryzanol, đáp ứng các tiêu chuẩn công bố.
- So sánh phổ hấp thụ của γ-oryzanol trong dầu cám gạo và γ-oryzanol chuẩn trong dung môi n-hexan có thể kết luận dầu cám gạo không ảnh hưởng đến độ hấp thụ cực đại của γ-oryzanol ở λmax, do đó định lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo bằng phương pháp đo quang ở bước sóng cực đại 313nm là thích hợp
(ii) Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính:
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng bằng n-hexan dãy dung dịch chuẩn γ-oryzanol có nồng độ lần lượt là 4, 7, 10, 12, 15, 16àg/ml
Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ở bước sóng 313nm Sau đó, lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của dung dịch γ-oryzanol Kết quả khảo sát được trình bày dưới dạng bảng 3.5 và hình 3.3.
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ và nồng độ γ-oryzanol
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của dung dịch chuẩn γ-oryzanol
Nồng độ γ-oryzanol trong dung dịch chuẩn (àg/ml) 4 7 10 12 15 16 Độ hấp thụ (Abs) 0,162 0,268 0,375 0,439 0,554 0,595
Kết quả Phương trình hồi quy: y = 0,0358x + 0,0166
Hệ số tương quan tuyến tính: r 2 =0,9994
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và độ hấp thụ của chất nghiờn cứu trong khoảng nồng độ (4-16àg/ml) Nồng độ dung dịch thử lựa chọn để định lượng nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát (iii) Khảo sát độ lặp lại của phương pháp: Tiến hành xác định hàm lượng γ- oryzanol của mẫu thử dầu cám gạo chiết xuất siêu âm bằng dung môi EtOH Cách chuẩn bị dung dịch thử để đo quang tiến hành như đã trình bày ở mục 3.3.1 Hàm lượng γ- oryzanol được tính toán bằng công thức đã xây dựng ở mục 2.4.3 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại của phương pháp UV-VIS
STT Khối lượng dầu cám gạo (g) Độ hấp thụ (Abs)
Hàm lượng γ- oryzanol (%) Tính thống kê
Nhận xét: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp cho thấy có độ chính xác cao với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,790% Kết quả này đạt tiêu chuẩn AOAC đề ra: độ lệch chuẩn tương đối phải 1,5 và thời gian lưu ngắn hơn nên được lựa chọn làm tỷ lệ dung môi pha động (Bảng 3.10)
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát các hệ dung môi pha động
Thời gian lưu (phút) Độ phân giải
Nhận xét tR1 tR2 tR3 Rs12 Rs23
Thời gian lưu dài Độ phân giải của hai pic đầu 1,5 Đẳng dòng
35:65 25,343 26,603 33,216 2,229 2,630 Thời gian lưu dài Có nhiều hơn 3 pic chính
Như vậy, quá trình khảo sát đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp để xây dựng phương pháp định lượng γ-oryzanol như sau:
- Dung môi pha mẫu là acetonitril:methanol (tỷ lệ 70:30 v/v)
+ Pha tĩnh: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 àm)
Bảng 3.11 Hệ gradient pha động trong định lượng HPLC
STT Thời gian Tỉ lệ pha động MeOH:ACN
+ Thời gian chạy chương trình: 40 phút
+ Tốc độ dòng 1ml/phút
+ Detector PDA, bước sóng phát hiện 325nm b) Thẩm định phương pháp
(i) Khảo sát tính thích hợp hệ thống:
Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần mẫu chuẩn γ-oryzanol có nồng độ chính xác
250μg/ml theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn, ghi lại sắc ký đồ, xác định tổng diện tích pic S, thời gian lưu tR, số đĩa lý thuyết N và độ phân giải Rs của các pic Kết quả được trình bày ở Bảng 3.12
Bảng 3.12 Kết quả thẩm định tính thích hợp hệ thống sắc ký về diện tích pic, thời gian lưu, độ phân giải và số đĩa lý thuyết
Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dầu từ cám gạo Bèo Ông
3.4.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dầu cám gạo tại Thụy Điển
Tác dụng chống oxy hóa in vitro của mẫu dầu cám gạo chiết siêu âm với n–hexan ở nhiệt độ 60 0 C (BO23.3.2) tương đối mạnh, với IC50 là 28,96àg/ml Song song với mẫu thử, tiến hành tương tự với chứng dương acid ascorbic cho thấy tác dụng bắt giữ gốc tự do DPPH in vitro acid ascorbic thể hiện qua IC50 là 2,1àg/ml (Bảng 3.19., Hỡnh 3.11.)
Bảng 3.19 Tác dụng chống oxy hóa in vitro của dầu cám gạo tại Thụy Điển
Dầu cám gạo Acid ascorbic
Nồng độ Phần trăm ức chế (%) Nồng độ Phần trăm ức chế (%)
IC 50 = 28,96àg/ml IC 50 = 2,1àg/ml
Hình 3.11 Ảnh hưởng của dịch chiết lên khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH
3.4.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dầu cám gạo tại Trường Đại học Dược Hà Nội
Trong đánh giá khả năng chống oxy hóa dựa trên khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH, các mẫu dầu cám chiết xuất bằng siêu âm tại Trường Đại học Dược Hà Nội gồm BO23.3.2 chiết bằng n-hexan, BO23.3.4 chiết bằng ethanol, BO23.3.6 chiết bằng iso-propanol đều có hoạt tính chống oxy hóa yếu hơn so với kết quả đánh giá tại Thụy Điển.
Bảng 3.20 Giá trị IC 50 của các mẫu dầu cám gạo tại Trường Đại học Dược Hà Nội
IC 50 105,20mg/ml 10,82mg/ml 32.47mg/ml 16,4àg/ml
% Bat giu goc tu do DPPH
Hình 3.12 Ảnh hưởng của các dịch chiết lên khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH
Nhận xét: Khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH của các dịch chiết theo thứ tự M2>M3>M1 với giá trị IC50 lần lượt là 10,82; 32,47; 105,20mg/ml Trong đó dịch chiết M2 có tác dụng chống oxy hóa tốt nhất.
Bàn luận
3.5.1 Bàn luận về kích thước và phương pháp xử lý nguyên liệu cám gạo Bèo Ông thu hái tại Sa Pa, Lào Cai
Tỉ lệ cám gạo xát trong Bèo Ông khá cao, vào khoảng 37,34-51,35%, gần bằng sản lượng gạo thu hoạch Cám gạo cũng chứa nhiều thành phần dinh dưỡng nên việc tận dụng và phát triển nguồn cám này có ý nghĩa thiết thực, đồng thời giảm thiểu chất thải ra môi trường.
Qua quá trình điều tra thực địa và thu mẫu tại xã Tả Phìn, thị xã Sa Pa, tỉnh Lào Cai, nhận thấy có hai giống lúa “Bèo Ông” và “Bèo Củ”, thường được người dân địa phương gọi chung là Bèo Ông Củ Bèo Ông Củ được giám định là giống lúa nếp, tuy nhiên màu sắc và độ dẻo của gạo có sự khác nhau Sau khi xay xát 2 lần, gạo Bèo Ông trắng và có độ dẻo hơn Trong khi, gạo Bèo Củ còn lấm tấm màu đen tím, ít dẻo và bị nát hơn (PL.3) Ở lần xát gạo thứ nhất là xát gạo lật, thu được hỗn hợp gạo lẫn cám và cám xát lần
1 Lần xát gạo thứ hai là xát tiếp hỗn hợp gạo lẫn cám, thu được gạo và cám lần 2 Vì vậy, có thể cám xát lần 2 sẽ có hàm lượng hoạt chất cao hơn
3.5.1 Bàn luận về các phương pháp chiết xuất dầu cám gạo từ cây Bèo Ông
Dầu cám gạo được chiết xuất ở quy mô công nghiệp chủ yếu bằng 2 phương pháp: ép trục vít và chiết bằng n-hexan Phương pháp ép trục vít có hạn chế là lượng dầu chiết được thấp hơn so với phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ [32] Các khảo sát của trong đề tài này về phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi hữu cơ thu được các kết quả tương tự như nhiều công bố trước đó, n-hexan được xem như dung môi hữu cơ phù hợp nhất cho việc chiết dầu cám gạo, sử dụng hỗn hợp dung môi n-hexan với ethanol giúp tăng khả năng chiết γ-oryzanol
Sử dụng dung môi ethanol và iso-propanol trong chiết xuất dầu cám gạo cho kết quả hàm lượng γ-oryzanol cao hơn so với n-hexan Tuy nhiên, trong quá trình lưu mẫu dầu cám gạo sau chiết xuất một thời gian thì mẫu dầu chiết bằng dung môi iso-propanol có xuất hiện các tinh thể Hàm lượng γ-oryzanol trong các mẫu dầu cám gạo cũng thay đổi Đề tài không đề cập đến vấn đề tối ưu hóa điều kiện chiết xuất là do cám gạo là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và rất dồi dào ở Việt Nam, hàm lượng dầu cao, kỹ thuật chiết đơn giản nên việc chiết xuất không cần chú trọng đến điều kiện như: nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Sản phẩm của đề tài có tính ứng dụng cao, khả năng tiếp cận thị trường lớn, nên việc xem xét đến các vấn đề như: chi phí chiết xuất, khả năng tập trung nguyên liệu, lựa chọn nguyên liệu đầu vào, công nghệ tinh chế là các khía cạnh quan trọng, cần được làm rõ hơn
3.5.2 Bàn luận về hàm lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo từ cây Bèo Ông
Xác định hàm lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo từ cây Bèo Ông bằng phương pháp đo quang có những ưu điểm và một số hạn chế
- Quy trình đơn giản Dụng cụ, hóa chất rẻ tiền, tất cả các phòng thí nghiệm đều có thể thực hiện được
- Thời gian định lượng nhanh chóng
- Việc kết hợp kỹ thuật thêm đường chuẩn được xem là tối ưu nhất trong các kỹ thuật định lượng UV-VIS, do đó loại được tối đa các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả
- Hóa chất đòi hỏi độ tinh khiết cao
- Thao tác cẩn thận, đúng kỹ thuật
Như vậy, quy trình định lượng γ-oryzanol trong dược liệu Bèo Ông bằng phương pháp đo quang được xây dựng hoàn toàn tin cậy, đơn giản và nhanh chóng
So sánh giữa kết quả định lượng γ-oryzanol theo phương pháp UV-VIS và HPLC:
- Có sự chênh lệch đáng kể về mặt hàm lượng γ-oryzanol xác định được bằng hai phương pháp Trong đó, hàm lượng xác định được đối với phương pháp HPLC gấp 3-4 lần so với phương pháp UV-VIS Đối với hai kết quả nghiên cứu, kết quả định lượng bằng HPLC có giá trị tin cậy cao hơn, vì thông qua cột sắc ký, đã tách được γ-oryzanol riêng biệt để định lượng Theo nhóm nghiên cứu nhận thấy, mẫu dầu cám gạo sau khi chiết xuất xong có màu tím đen, sau khi pha loãng với n-hexan cho màu tím nhạt, có thể trong thành phần hoạt chất của dầu cám gạo Bèo Ông có chứa các thành phần hấp thu tốt ánh sáng UV Như vậy, đối tượng nghiên cứu của đề tài khác hoàn toàn với loại dầu cám gạo của gạo trắng (màu vàng nhạt) và gạo huyết rồng (màu đỏ tím) Điều này có nghĩa là khi định lượng bằng UV-VIS có thể yếu tố nền mẫu khiến cho hàm lượng của γ-oryzanol bị thay đổi và không còn chính xác Trong khi đối với quá trình thẩm định phương pháp, nhóm nghiên cứu đã xây dựng đường chuẩn vẫn đạt giá trị (r 2 =0,9994, Hình 3.4, Bảng 3.6) theo yêu cầu, có thể vì đề tài xác định pha mẫu chuẩn trên nền dung môi n-hexan là mẫu trắng Để khắc phục điều này, nhóm nghiên cứu cho rằng có thể khảo sát thêm phương pháp pha dãy nồng độ chất chuẩn dựa trên nền sử dụng là mẫu phân tích (phương pháp thêm chuẩn), và ngoại suy hàm lượng của mẫu Tuy nhiên thực tế tiến hành, giá trị hàm lượng γ-oryzanol không cao Như vậy có thể γ-oryzanol có thể tạo phức tinh vi với các chất trong nền mẫu nghiên cứu
- Xét về ảnh hưởng của các phương pháp chiết xuất đối với hàm lượng γ-oryzanol, kết quả định lượng bằng phương pháp UV-VIS cho thấy, hàm lượng γ-oryzanol trong mẫu dầu cám gạo được chiết xuất bằng dung môi ethanol với điều kiện ngâm khuấy ở nhiệt độ thường (2,7014%), trong khi cùng mẫu nghiên cứu này được xác định bằng phương pháp HPLC thu được giá trị là 7,3062% (xếp thứ 5 về mặt nồng độ) Đối với phương pháp HPLC, mẫu dầu cám gạo được chiết xuất bằng dung môi n-hexan với điều kiện siêu âm ở nhiệt độ 60 0 C là cao nhất (7,7260%), trong khi mẫu này ở phương pháp UV-VIS chỉ có giá trị là 2,3581% (xếp thứ 5 về mặt nồng độ) Ngoài ra, tất cả các mẫu chiết xuất bằng dung môi iso-propanol đều cho hàm lượng thấp nhất đối với cả hai phương pháp định lượng Như vậy, về cơ bản có thể thấy khả năng chiết xuất γ-oryzanol của dung môi ethanol và n-hexan tốt hơn so với iso-propanol Điều này cũng tương đồng với thực tế trong công nghiệp dược sử dụng n-hexan và ethanol để chiết xuất dầu cám gạo [39] Đây cũng là các dung môi rẻ tiền và tương đối an toàn
Theo Dược điển Việt Nam V [2], dầu cám gạo thô chứa khoảng từ 0,9-2,1% γ- oryzanol hay 10-20mg/g Với kết quả nhóm nghiên cứu đã định lượng được hàm lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo từ cây Bèo Ông bằng phương pháp HPLC là 7,3215±0,3612 (%) là cao gấp 3-4 lần so với dầu cám gạo thông thường Vì vậy, đây có thể là một giống lúa tiềm năng cần được bảo tồn và nghiên cứu thêm
3.5.3 Bàn luận về tác dụng và các giá trị dinh dưỡng khác của dầu cám gạo từ cây Bèo Ông
Kết quả đã đánh giá được tác dụng chống oxy hóa của dầu cám gạo từ cây Bèo Ông Việc chiết xuất dầu cám gạo bằng các dung môi và điều kiện khác nhau có ảnh hưởng đến hàm lượng các thành phần dinh dưỡng trong dầu cám gạo Tuy nhiên có sự khác biệt giữa kết quả xác định tác dụng chống oxy hóa in vitro của hai cơ sở nghiên cứu Chúng tôi cho rằng, do sự khác biệt về mặt độ tan nên có thể dẫn đến sự sai lệch về mặt tác dụng của hai đánh giá ức chế DPPH Bởi vì mẫu nghiên cứu có bản chất thân dầu, nên có thể việc để nồng độ cao (lab Trường Đại học Dược Hà Nội) có thể ảnh hưởng một phần đến kết quả gắn với DPPH của các cấu tử hoạt chất, từ đó dẫn đến kết quả thấp hơn so với lab Thụy Điển Mặt khác mẫu nghiên cứu cũng có màu sắc tím đen, đổi màu theo pH khi được pha loãng với nước, do đó có thể có những hợp chất phức tạp hơn trong mẫu không ổn định theo thời gian Chúng tôi sẽ tiếp tục tiếp cận và nghiên cứu thêm tác dụng của các mẫu dầu cám gạo Bèo Ông với các nồng độ khác (thấp hơn), và phương pháp đánh giá in vitro khác trong các nghiên cứu tiếp theo
Nghiên cứu đã mở ra hướng nâng cao giá trị của cám gạo Bèo Ông, đặc biệt là chiết xuất dầu từ cám gạo Những kết quả nổi bật thu được bao gồm: đánh giá hàm lượng dầu và γ-oryzanol; so sánh hiệu suất chiết dầu và hàm lượng γ-oryzanol trong các dung môi chiết xuất; đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các mẫu dầu Từ đó, nghiên cứu đưa ra giả thuyết về sự khác biệt giữa các dung môi đối với thành phần dinh dưỡng trong dầu và sự giảm hàm lượng γ-oryzanol trong quá trình bảo quản dầu cám gạo thô, tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bước đầu khảo sát nguồn dinh dưỡng từ cám gạo Bèo Ông rất tiềm năng, cho nên việc nghiên cứu gia tăng giá trị cho cám gạo này nên được thực hiện một cách toàn diện
Cần tiếp tục nghiên cứu tiêu chuẩn chất lượng dầu của cám gạo Bèo Ông, trích ly hoạt chất γ-oryzanol, các quy trình lên men cám gạo làm mỹ phẩm, thực phẩm để đa dạng hóa sản phẩm, sử dụng và phát triển tối đa nguồn cám gạo của cây Bèo Ông.
![Bảng 1.1. Công dụng tốt cho sức khỏe của Bèo Ông [5] - trần thị ngọc hân nghiên cứu chiết xuất dầu cám gạo từ cây bèo ông thu hái tại sa pa lào cai và xác định hàm lượng γ oryzanol tác dụng chống oxy hóa của dầu cám gạo](https://media.store123doc.com/figures/005/684/bang-cong-dung-tot-suc-khoe-beo-5684757.webp)
