Hiện nay, việc kết hợp sắc ký lỏng và khối phổ đã cải thiện tính chọn lọc, cho độ nhạy và độ chính xác cao, đơn giản hóa quá trình xử lý mẫu của phương pháp phân tích định lượng levodopa
TỔNG QUAN
Tổng quan về levodopa
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Levodopa acid (2S)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl) propanoic 1.1.2 Tính chất lý hóa
Khối lượng phân tử: 197,19 g/mol
Hình thức: bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà Độ tan: ít tan trong nước, thực tế không tan trong ethanol 96% Dễ tan trong dung dịch acid hydrocloric 1 M và hơi tan trong dung dịch acid hydrocloric 0,1 M [2], [32] pH: 5-7
Góc quay cực: từ -1,27° đến -1,34°
1.1.3 Cơ chế tác dụng Ở bệnh nhân Parkinson, sự giảm sụt tế bào sản xuất dopamin dẫn đến lượng dopamin được sản xuất giảm, gây rối loạn vận động ở người bệnh Do đó việc bổ sung dopamin ở giai đoạn tiến triển của bệnh là cần thiết để cải thiện triệu chứng và giảm biến chứng của bệnh Tuy nhiên dopamin không qua được hàng rào máu- não nên việc bổ sung dopamin trực tiếp không có tác dụng trong điều trị ở bệnh nhân mắc Parkinson
Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của levodopa
Levodopa (L-dopa, hay L-3,4-dihydroxyphenylalanin) được biết đến là tiền chất chuyển hóa của dopamin- là thuốc thay thế dopaminergic lâu đời nhất, dùng cho bệnh nhân mắc bệnh Parkinson LD qua được hàng rào máu - não và chuyển thành dopamin trong não nhờ enzym dopa decarboxylase, làm tăng nồng độ dopamin trong não, giảm
3 các triệu chứng của bệnh Parkinson [1] Tuy nhiên các enzym dopa decarboxylase có nhiều ở niêm mạc ruột và ở các vị trí ngoại biên khác nên phần lớn thuốc bị khử carboxyl trước khi đến hàng rào máu, do đó thuốc chưa bị biến đổi tới được tuần hoàn não tương đối ít và có lẽ chỉ có dưới 1% thuốc vào được hệ TKTW [1], [7], [25]
Khi dùng đường uống, LD nhanh chóng bị khử carboxyl thành dopamin trong các mô ngoài não chỉ để một phần nhỏ của liều dùng vận chuyển không thay đổi đến hệ thần kinh trung ương Do đó, cần một liều lượng lớn LD để đạt hiệu quả điều trị đầy đủ, và có thể đi kèm với buồn nôn và các phản ứng bất lợi khác, một số trong số đó là do dopamin được hình thành trong các mô ngoài não [17], [23]
Vì LD cạnh tranh với một số acid amin để vận chuyển qua thành ruột, nên sự hấp thu
LD có thể bị suy giảm ở một số bệnh nhân có chế độ ăn giàu protein
1.1.5 Dược động học a Hấp thu và phân bố
Levodopa được hấp thu nhanh tại ruột non nhờ hệ thống vận chuyển tích cực Vì vậy các yếu tố tác động lên ruột non sẽ ảnh hưởng đến thời điểm và mức độ hấp thu vào hệ tuần hoàn chung của LD như thức ăn, pH, thời gian vận chuyển trong ruột, và các enzym trong ruột Một vài nghiên cứu trên huyết tương chó đã nhịn ăn trước khi dùng thuốc cho thấy nồng độ thuốc LD đạt đỉnh nhanh sau khoảng 25- 40 phút LD hấp thu chủ yếu tại ruột non, hấp thu tốt khoảng 80% liều dùng, tuy nhiên nồng độ cũng giảm đi nhanh chóng, chỉ khoảng 20-30% đi vào tuần hoàn chung [11], [30]
Ngoài ra bữa ăn có hàm lượng chất béo và protein cao hoặc do thuốc làm chậm nhu động dạ dày có thể dẫn đến việc LD chậm đi đến ruột non và làm chậm hấp thu vào máu [25] Sự hấp thu LD bị ảnh hưởng bởi hai yếu tố chính: cạnh tranh hấp thu và bị chuyển hóa bởi enzym AAAD Đầu tiên, sự cạnh tranh vận chuyển giữa LD và các LNAAs khác có thể xảy ra trong quá trình hấp thụ ở ruột Thứ hai, ruột có nồng độ AAAD cao và quá trình khử carboxyl của LD tạo ra dopamin ở ngoại vi và nó không thể tăng nồng độ dopamin trong não [7], [14], [25] b Chuyển hóa
Quá trình chuyển hóa của levodopa và dopamin có thể trải qua bốn quá trình: khử carboxyl, O-methyl hóa, chuyển hóa và khử hóa [25]
Quá trình khử carboxyl của L-dopa (LD) là phản ứng chuyển hóa quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị của thuốc Enzym aromatic L-amino acid decarboxylase (AAAD) đóng vai trò chính trong quá trình khử carboxyl, chuyển đổi LD thành dopamine Quy trình khử carboxyl này diễn ra chủ yếu ở ruột, gan và thận Khi LD được uống, ít nhất một nửa lượng thuốc bị khử carboxyl trong quá trình hấp thu và chuyển hóa bước một qua gan, tạo thành dopamine Sự chuyển hóa này dẫn đến giảm nồng độ LD đến não, do đó làm giảm hiệu quả điều trị.
Hình 1.3 Quá trình chuyển hóa của levodopa
Quá trình O-methyl hóa: Chuyển đổi LD thành 3- O -methyldopa và dopamin thành 3- O -methyldopamin bởi catechol- O -methyltransferase (COMT) là một con đường chuyển hóa quan trọng, đặc biệt khi quá trình khử carboxyl bị ức chế O -Methyl hóa
LD tạo ra một chất chuyển hóa không thể chuyển hóa thành dopamin trong não O - Methyl hóa dopamin là một cách để vô hiệu hóa chất dẫn truyền thần kinh COMT có mặt trong nhiều mô ngoại vi cũng như trong não và chuyển hóa khoảng 10% LD khi LD được sử dụng mà không có chất ức chế AAD, và có thể có ý nghĩa hơn khi sử dụng đồng thời với chất ức chế AAD làm tăng nồng độ LD [25]
Monoamine oxidase (MAO) có hai dạng dị hình là MAO-A và MAO-B MAO-B chủ yếu có trong não người, trong khi MAO-A tập trung ở ruột và chịu trách nhiệm phân hủy catecholamin và chất vận mạch ngoại vi Ức chế MAO không chọn lọc có thể gây ra nhiều tác dụng, bao gồm gia tăng nồng độ serotonin, norepinephrine và dopamin trong não.
“hiệu ứng phô mai” với nhịp tim nhanh và tăng huyết áp Do đó ức chế chọn lọc MAO-
B có vai trò trong điều trị PD vì nó có thể làm chậm quá trình chuyển hóa dopamin trong não và kéo dài tác dụng của dopamin [7]
Enzym decarboxylase được phân bố rộng rãi ở đường ruột chó, hoạt động mạnh nhất ở hỗng tràng, và ít hoạt động ở tá tràng, hoạt động COMT ở ruột cũng đóng vai trò quan trọng nhưng ít quan trọng hơn nhiều so với enzym decarboxylase Kết quả nghiên cứu trên chó cho thấy sự giảm LD đường uống do sự có mặt của enzym decarboxylase trong ruột, khoảng 60% chuyển hóa của LD diễn ra ở ruột và một phần nhỏ qua gan [11], [29] c Thải trừ
5 Ở chó thời gian bán thải trong khoảng 8-9 giờ, dưới dạng acid dihydroxyphenylacetic, acid homovanilic, acid phenylpyruvic và các dẫn xuất O- methyl hóa… Khả dụng thấp của LD sau khi uống và tốc độ thải trừ nhanh dẫn đến nhu cầu dùng liều lớn để đạt được hiệu quả lâm sàng [11].
Tổng quan về carbidopa
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Carbidopa acid (2S)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydrazino-2-methylpropanoic monohydrat 1.2.2 Tính chất hóa lý
Khối lượng phân tử: 226,23 g/mol
Hình thức: Bột trắng hoặc trắng ngà Độ tan: Hơi tan trong methanol, ít tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96 %, thực tế không tan trong dicloromethan và diethyl ether, tan trong các dung dịch acid vô cơ loãng [2], [32]
Góc quay cực riêng: Từ -22,5° đến -26,5°, tính theo chế phẩm đã làm khô
Carbidopa không có tác dụng điều trị trực tiếp, nó chỉ dược dùng phối hợp để bảo vệ
LD không chuyển thành dopamin ở ngoại vi
CD là chất ức chế enzym decarboxylase (enzym khử carboxyl) ngăn cản khử carboxyl của LD ở ngoại vi, làm tăng lượng LD trong máu, tăng lượng LD vào não CD không ảnh hưởng tới chuyển hóa của LD trong não vì không qua được hàng rào máu – não [1]
CD có tác dụng không thuận nghịch với PLP, ngăn chặn hoạt động của AADC khi AADC chuyển hóa 5-HTP thành serotonin và L-dopa thành dopamine Trong khi LD có thể đi qua hàng rào máu não, CD thì không Do đó, CD chỉ ức chế AADC ở ngoại vi, không tác động đến hệ thần kinh trung ương.
Hoạt động ức chế decarboxylase của CD chỉ giới hạn ở các mô ngoại vi nên nó ức chế quá trình khử carboxyl của LD ở ngoại vi, không ảnh hưởng đến quá trình chuyển
6 hóa LD trong hệ thần kinh trung ương Do dó việc sử dụng CD cùng với LD tăng LD được vận chuyển đến não, và giảm tỉ lệ nôn, buồn nôn khi dùng đơn độc LD [1]
1.2.5 Dược động học a Hấp thu, phân bố
CD được hấp thu nhanh nhưng không hoàn toàn qua đường tiêu hóa, CD hấp thu chậm hơn LD Sau một liều uống, khoảng 40- 70% thuốc được hấp thu vào cơ thể người với tmax khoảng 2 giờ CD không đi qua hàng rào máu não ngay cả ở liều cao nên sau khi uống hoặc tiêm tĩnh mạch CD phân bố chủ yếu ở ngoại vi ngăn cản quá trình khử carboxyl của LD ở ngoại vi CD liên kết không đáng kể với protein huyết tương với tỉ lệ khoảng 30% [17] Ở chó việc hấp thu CD tốt hơn khoảng 80% CD được hấp thu vào với tmax từ 2-5 giờ [24] b Chuyển hóa và thải trừ
Các nghiên cứu đã phát hiện ra các chất chuyển hóa 2-methyl-3-methoxy-4-hydroxy-phenylpropionic acid, 2-methyl-3,4-dihydroxy-phenylpropionic acid, 3-hydroxy-α-methyl- phenylpropionic acid trong nước tiểu của tình nguyện viên và bệnh nhân mắc bệnh Parkinson sau khi dùng Carbidopa Mất nhóm hydrazin là con đường chuyển hóa chính của Carbidopa Thời gian bán thải của Carbidopa trong huyết tương khoảng 2 giờ khi dùng cùng Levodopa và 2,08 giờ khi dùng riêng Quá trình chuyển hóa và bài tiết ở chó tương tự như ở người, với các sản phẩm chuyển hóa bổ sung là 2-methyl-3-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl) lactic acid và 2-methyl-3-(3',4'- dihydroxyphenyl) lactic acid.
Đặc điểm dược lý và tác dụng không mong muốn
Việc kết hợp LD và CD đã làm giảm đáng kể lượng LD cần thiết và giảm thiểu được những tác dụng phụ của LD Dạng kết hợp LD và CD được chỉ định trong điều trị bệnh Parkinson, bệnh Parkinson sau bệnh não và bệnh Parkinson có triệu chứng có thể xảy ra sau nhiễm độc carbon monoxid hoặc nhiễm độc mangan CD cho phép bệnh nhân sử dụng liều LD thấp hơn nhiều Cải thiện đáp ứng với một số bệnh nhân đáp ứng kém với
LD CD cũng có thể làm giảm buồn nôn và nôn và cho phép hiệu chỉnh liều LD nhanh hơn do ức chế hình thành dopamin ở ngoại vi [1]
1.3.2 Tác dụng không mong muốn
Dạng kết hợp LD và CD làm giảm tác dụng phụ ngoại biện ( buồn nôn, nôn) do khử carboxyl LD ở ngoại biên, tuy nhiên CD không qua được hàng rào máu não nên không làm giảm tác dụng bất lợi của LD tác động lên thần kinh trung ương Vì CD cho phép
7 nhiều LD đến não hơn và hình thành nhiều dopamin hơn nên một số tác động bất lợi trên thần kinh trung ương như rối loạn vận động xuất hiện ở liều thấp hơn và sớm hơn so với dùng đơn độc LD [1].
Sơ lược về các phương pháp định lượng đồng thời Levodopa-Carbidopa
1.4.1 Phương pháp xử lý mẫu
Chuẩn bị mẫu là bước tối quan trọng trong phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học Phương pháp chuẩn bị mẫu phổ biến gồm: kết tủa protein, chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn, vi chiết pha rắn Phương pháp kết tủa protein được dùng để loại bỏ protein nền mẫu, giúp cải thiện độ chọn lọc và độ nhạy của phép đo.
Kết tủa protein là phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích dịch sinh học được thực hiện bằng cách bổ sung acid hoặc dung môi hữu cơ thích hợp như acid tricloracetic, acid percloric hay dung môi hữu cơ như methanol, acetonitril,… Hỗn hợp được ly tâm lấy dịch lọc, dịch lọc thu được đem tiến hành phân tích [3], [28] Kết tủa protein được sử dụng làm biến tính protein, phá vỡ liên kết thuốc- protein, có thể chiết xuất được tổng lượng thuốc để phân tích Ngoài các kỹ thuật tủa protein bằng các dung môi khác nhau, còn có thể sử dụng muối và các ion kim loại Độ tan của protein dựa vào tương tác phân cực của nó với dung môi nước, tương tác ion với muối và lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử tích điện tích cùng loại Tại điểm đẳng điện pI, protein có độ hòa tan tối thiểu trong dung môi nước Các tác nhân kết tủa là dung môi hữu cơ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch protein huyết tương, làm tăng lực hút giữa các phân tử tích điện, tạo điều kiện cho các tương tác protein tĩnh điện Dung môi hữu cơ thay thế các phân tử nước bao quanh vùng kỵ nước trên bề mặt protein, tương tác kỵ nước giữa các protein giảm, tăng tương tác tĩnh điện làm kết tụ protein Các dung môi acid tạo muối không tan với các nhóm amino trên phân tử protein ở độ pH dưới điểm pI Protein cũng được tủa từ dung dịch có nồng độ muối cao khi các ion muối bị hydrat hóa và các phân tử nước giảm đi, hút nước ra khỏi bề mặt kỵ nước dẫn đến sự kết tụ protein thông qua tương tác kỵ nước protein-protein Hay sự liên kết của ion kim loại làm giảm khả năng hòa tan của protein bằng cách thay đổi điểm đẳng điện pI Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng dung môi MeCN và TCA cho kết quả kết tủa protein tốt [27] b Phương pháp chiết lỏng- lỏng
Chiết lỏng-lỏng (LLE) là phương pháp trích ly được sử dụng phổ biến nhất trong quá trình nghiên cứu hợp chất dược phẩm Nguyên tắc của LLE là chuyển chất phân tích tan trong dung môi hữu cơ này sang dung môi hữu cơ khác, thường là có độ phân cực khác nhau.
8 môi sang một dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất Trong thực tế thường dùng cân bằng nước-dung môi hữu cơ và pH của pha nước thường được điều chỉnh để các phân tử thuốc được trung hòa để chiết hiệu quả sang pha hữu cơ [3], [28] c Phương pháp chiết pha rắn
Chiết pha rắn (SPE) sử dụng chất rắn để tách chất phân tích từ mẫu thông qua hấp phụ, sau đó rửa giải bằng dung môi phù hợp SPE có ưu điểm xử lý nhanh, hiệu quả và giảm lượng dung môi so với phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) Lựa chọn pha rắn trong SPE đa dạng, bao gồm pha liên kết và pha không liên kết, đáp ứng tính chọn lọc phù hợp với từng chất phân tích hơn LLE Các yếu tố như loại pha rắn, dung môi rửa giải, pH và tốc độ dòng chảy ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Đối với chất phân cực và có nhóm acid (-COOH) như LD-CD, có thể sử dụng cột chiết pha rắn SPE SAX Cột SAX có khả năng trao đổi anion mạnh nhờ phối tử amoni bậc bốn gắn trên hạt silicagel, tạo tương tác trao đổi anion hiệu quả với các hợp chất có tính acid.
Hiện nay một số nghiên cứu trên thế giới về định lượng LD-CD trong huyết tương đã xây dựng và áp dụng các phương pháp xử lý mẫu như sau:
Bảng 1.1 Một số phương pháp xử lý mẫu
Phương pháp xử lý mẫu
Kết tủa protein: 250 àL mẫu huyết tương được trộn với 750 àL metanol Lắc vortex trong 1 phút, ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 10 o C Dịch nổi được chuyển vào bình định mức 10 mL và pha loãng đến vạch bằng pha động Dung dịch được lọc qua màng cellulose 0,45 àm và 20 àL được bơm vào hệ thống HPLC
Kết tủa protein: lấy 400 àL huyết tương thờm 50 àL IS nồng độ
2500 ng/mL lắc vortex trong 1p, thờm 1550 àL axetonitril chứa 0,05% axit formic và 3 mmol/L amoni format lắc xoáy trong 3 phút và ly tâm ở 36000 vòng/20 phút ở 5 o C
Kết tủa protein: Khoảng 200 àL huyết tương và 20 àL IS ( và các dung dịch chuẩn chất phân tích thêm vào mẫu trắng) cho vào ống ly tõm với 180 àL TCA 0,6N, hỗn hợp được lắc xoỏy
9 trong vòng 5 phút và ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút ở
Kết tủa protein: 200 μL mẫu huyết tương có natri metabisulfit (mẫu hiệu chuẩn, QC) được trộn với 50 μl dung dịch làm việc
IS Thêm 50 μl axit trichloroacetic 40% trong acetonitril và xoáy trong 1 phút, ly tâm ở tốc độ 15000 vòng/phút ở 4 o C trong
3 phút, dịch trong phía trên được được tiêm vào hệ thống LC– MS/MS
Chiết lỏng-lỏng: Hỗn hợp gồm etyl axetat và rượu n-butyl (1:1, v/v) chứa 1% PFPA được sử dụng làm dung môi lỏng-lỏng tối ưu để chiết xuất carbidopa và levodopa từ huyết tương chuột [15] Huyết tương chuột hoặc khỉ
Kết tủa protein: 50 àL huyết tương chuột hoặc khỉ cho vào ống ly tõm 1,4 mL để trờn đỏ, thờm 25 àL IS của levodopa/carbidopa trong MeCN (500/200 ng/mL) lắc vortex Thờm 150 àL MeCN chứa thuốc thử tạo dẫn xuất flourescamin (5 mg/mL, mới pha) Lắc kỹ bằng vortex, ly tâm ít nhất 5 phút Hút dịch phía trên vào ống sạch, đậy nắp và ủ 37 o C trong 60 phút
Kết tủa protein: 50 àL dung dịch IS (2000 ng/mL methyldopa) và 50 àL axit perchloric 2M được thờm vào 250 àL mẫu huyết tương Lắc vortex trong 20 giây, ly tâm ở 14000 vòng/ phút trong 10 phút ở 5 o C 10 mL dịch phía trên được bơm vào hệ thống sắc ký
Chiết pha rắn SPE: 200 àL mẫu được cho vào cỏc ống polypropylen 5 mL và thờm 50 àL dung dịch IS (MET, 5 àg/mL), tiếp theo là 100 àL nước Lắc vortex hỗn hợp và được thực hiện quy trình SPE sử dụng ống chiết Alumina-A 50 mg/1
CC (Orochem, Hoa Kỳ) trên thiết bị SPE áp suất dương Trước khi nạp mẫu, các cột SPE được hoạt hóa với 1 mL metanol và
1 mL nước Rửa tạp 1 mL nước trong 2 lần Rửa giải với 0,6 mL axit formic 0,1%, 10 μL dung dịch được bơm vào LC- MS/MS
Kết tủa protetin: 1 mL huyết tương trộn với 100àL IS và 100 àL acid perchloric 4M lắc vortex sau đú ly tõm ở 2000 vũng trong 10 phút
Kết tủa protein: 100 àL huyết tương trộn với 300 àL TFA 10%, lắc vortex 10 giây và ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C Dịch phía trên hút vào ống ly tâm 1,5 mL ly tâm tiếp ở tốc độ 13000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4 o C
Nhận xét: Phương pháp kết tủa protein được ưu tiên lựa chọn trên hầu hết các nghiên cứu, ngoài vai trò làm sạch mẫu nhanh, kết tủa protein còn rất hữu ích vì có thể phá vỡ các liên kết thuốc- protein, có thể chiết xuất được tổng lượng thuốc để phân tích Quy trình đơn giản, nhanh, tiết kiệm dung môi và hóa chất Giá thành rẻ hơn các phương pháp khác như chiết lỏng-lỏng hay chiết pha rắn Dùng dung môi MeOH kết tủa không tốt bằng MeCN và các acid nên khi dùng dung môi MeOH cần thêm bước lọc Các dung môi MeCN và các acid được ưu tiên lựa chọn hơn trong phương pháp kết tủa protein
1.4.2 Một số phương pháp phân tích
Một số phương pháp có sẵn để xác định nồng độ levodopa, carbidopa trong huyết tương như phương pháp HPLC-DAD [19], HPLC-ECD [8] , [21], [33] , và các phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Dưới đây là một số phương pháp phân tích:
Bảng 1.2 Một số phương pháp phân tích bằng HPLC-DAD, ECD
TLTK Chương trình phân tích Nền mẫu LOQ
HPLC-DAD kết hợp với hiệu chuẩn bậc hai dựa trên thuật toán ATLD với cột C18 Hypersil-ODS
(125 ì 4,0 mm, 5,0 àm), pha động hỗn hợp methanol (25%) và KH2PO4 0,2mM (25:75, v/v) chế độ đẳng dòng f= 1 mL/phút, λ(0nm
LD: 161 ng/mL CD: 24 ng/mL
HPLC-ECD với cột Partisil-5 ODS-3 (100 x 4,6 mm, 5 àm), pha động bao gồm natri acetat/methanol 0,1M và acid citric 20 mM
Na2EDTA 0,1 mM, dibutylamin 1 mM và được điều chỉnh đến pH 3,0 bằng acid photphoric, f=1 mL/phút, điện thế của máy dò là +0,80 V
Khoảng nồng độ làm việc từ 25-
HPLC-ECD với cột Ultrasphere IP (C18, 250x
4,6 mm, 5 àm), pha động là hỗn hợp natri octanesulfonat 4 mM- acid orthophosphoric 20 mM trộn với methanol 25% (v/v) và được điều
LD:25 ng/mL CD: 25 ng/mL
11 chỉnh đến pH 2,8 bằng NaOH 50%, f= 1 mL/ phút Điện thế 0,75V với cực Ag/AgCl
HPLC-ECD với cột C18 (250 ì 4,6 mm, 5àm), pha động là hỗn hợp của metanol (8%, v/v) và dung dịch nước (92%, v/v) chứa 1,45 g/L kali dihydrogen photphat, 18 mg/L EDTA, 90 mg/L
OSA và 98 mg/L kali clorua, được đệm đến pH
2,88 bằng acid photphoric 14 mM, f=1,5 mL
/phỳt thể tớch tiờm 20 àL Điện thế của pin điện hóa là 800 mV
Dùng catechol làm chuẩn nội
LD: 8 ng/mL CD: 10 ng/mL
Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ 2 lần (LC-MS/MS)
Hệ thống LC-MS/MS gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (LC) và khối phổ (MS), trong đó LC tách mẫu dựa trên tương tác giữa các phân tử mẫu với pha tĩnh và pha động Hợp phần MS sử dụng kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) của ion tạo thành trong pha khí để phát hiện chất phân tích.
1.5.2 Bộ phận sắc ký lỏng
Bộ phận sắc ký lỏng bao gồm: hệ thống cấp pha động, bơm sắc ký lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột và pha tĩnh, detector, hệ thu nhận và xử lý mẫu Pha động được qua hệ thống cấp dung môi trộn vào nhau ở áp suất thấp hoặc áp suất cao sau đó dùng bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu Mẫu lỏng được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Sau khi mẫu, dung dịch chứa chất phân tích được đưa lên cột pha tĩnh sẽ được phân tách tại cột pha tĩnh nhờ tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động rồi được rửa giải bằng pha động di chuyển tới bộ phận phân tích khối phổ [3], [4]
Hình 1.5 Mô hình hệ thống LC-MS/MS 1.5.3 Bộ phận khối phổ
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối nguyên tử (amu- Atomic mass unit) hoặc bằng dalton (Da) [3], [4]
Bộ phận khối phổ gồm: bộ nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ phận phân tích khối, detector, bộ xử lý dữ liệu
Các chất sau khi được phân tách sẽ di chuyển đến phần kết nối của bộ phận MS để được loại dung môi thành các phân tử trung hòa điện tích ở thể khí bay hơi, sau đó được nạp vào buồng ion hóa của thiết bị (ion source) hình thành các ion hoặc tiểu phân mang điện tích ở pha khí Hỗn hợp các ion hoặc tiểu phân mang điện được gia tốc và chuyển đến bộ phận phân tích khối (mass analyzer) để chia thành từng loại dưới tác động của điện trường và từ trường Tốc độ, quỹ đạo chuyển động của ion phụ thuộc vào bản chất
15 và cường độ điện trường của bộ phận phân tích, điện tích và khối lượng của ion Quá trình phân tích khối và phát hiện được thực hiện trong môi trường chân không (áp suất khoảng 10-5 đến 10-8 Torr) [3], [4]
Hình 1.6 Sơ đồ cấu trúc máy khối phổ MS 1.5.3.1 Bộ nguồn ion
Giai đoạn ion hóa rất quan trọng trong phân tích khối phổ Có nhiều phương pháp ion hóa khác nhau như ion hóa bằng va chạm điện tử, ion hóa hóa học, ion hóa áp suất khí quyển (API), … Trong đó, API là kĩ thuật ion hóa quan trọng nhất của LC-MS và kiểu ion hóa phun sương điện tử (ESI) được dùng chủ yếu trong phân tích những hợp chất không bền nhiệt, có tính phân cực như dược phẩm [4]
Kỹ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản là tạo thành các giọt mang điện tích, làm giảm kích thước và phân nhỏ các hạt, quá trình hình thành pha hơi các ion Quá trình hóa hơi dung môi nhờ dòng khí N2 liên tục thổi vào và sự bắn phá của các giọt điện tích nhờ lực đẩy liên tục xảy ra, lặp lại nhiều lần để hình thành pha hơi của các ion Nhờ lực hút tĩnh điện mà các ion này được dẫn vào bộ phân tích khối phổ qua một cửa sổ rất nhỏ Dung môi và khí trơ N2 được hút ra ngoài do một dòng khí (Curtain Gas) [4], [6]
Hình 1.7 Sơ đồ mô tả nguyên lý ion hóa bằng kỹ thuật ESI chế độ phân cực ion dương 1.5.3.2 Bộ phân tích khối phổ
Bộ phận phân tích tứ cực kiểu chập ba còn được gọi là khối phổ hai lần (LC-MS/MS) gồm 3 bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3 Các ion chuyển động theo hướng trục trung tâm và dọc theo các tứ cực, đồng thời dao động vuông góc với hướng trục trung tâm dưới ảnh hưởng của một trường điện thế tần số cao Mỗi loại ion có tỷ số m/z khác nhau sẽ dao động xung quanh các trục với biên độ khác nhau, chỉ có ion nhất định có biên độ dao động phù hợp với sự biến thiên tần số điện thế có thể chuyển động qua tứ cực để đến detector Q1 sẽ tách các ion và lựa chọn một hoặc một số ion ban đầu (ion mẹ) đưa vào tứ cực Q2 Trong buồng Q2 với áp suất cao, ion mẹ bị phân mảnh do va chạm với các khí trơ có mặt trong buồng tạo ra các ion nhỏ hơn (ion con) Các ion con mới hình thành được dẫn đến Q3 phân tích khối tách riêng và đến bộ phận phát hiện [4], [20]
Trong phân tích khối phổ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con hình thành từ ion mẹ cho tín hiệu ổn định và bền nhất Đối với MS tứ cực chập ba (LC-MS/MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple
Reaction Monitoring) Thực tế kỹ thuật MRM được sử dụng thông dụng hơn do yêu cầu về phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên [4] Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập ở tứ cực thứ 2 thu được các mảnh ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện
LD-CD là các chất có tính phân cực, có nhóm base (-NH2) nên dễ dàng ion hóa theo nguồn ion hóa ESI (+) và chế độ ghi phổ MRM Hiện nay LC-MS/MS là phương pháp phân tích có độ chọn lọc tốt, độ nhạy, độ chính xác cao, là lựa chọn nhiều nhất của các phương pháp phân tích để định lượng thuốc và chất chuyển hóa của nó trong dịch sinh học
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Chất phân tích: levodopa, carbidopa
- Nền mẫu: huyết tương chó sử dụng chất chống đông EDTA mua từ các phòng khám thú y.
Nguyên vật liệu, thiết bị
- Levodopa, nguyên liệu làm thuốc, số lô C30-20220307, nhà sản xuất: Zhejiang Wild, Trung Quốc
- Carbidopa, nguyên liệu làm thuốc, số lô 2-SZ-1140922, nhà sản xuất: Divis’ Laboratories, Ấn Độ
- Levodopa-d3, số lô SP-M214P3, nhà sản xuất: Simson, Ấn Độ
Cân chính xác khoảng 0,1 mg chất chuẩn levodopa, carbidopa vào bịnh định mức 25 mL, định mức tới vạch bằng MeOH chứa 0,5% HCl, 1% metabisulfit, lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc Levodopa ( 4060 ng/mL), Carbidopa (4052 ng/mL) Bảo quản ở tủ -20 o C
Chuyển toàn bộ chất chuẩn vào bình định mức 20 mL, định mức tới vạch bằng hỗn hợp MeOH chứa 0,5% HCl, lắc đều để thu được dung dịch chuẩn gốc levodopa-d3 có nồng độ 500 ng/mL Sau đó, bảo quản dung dịch chuẩn gốc này ở tủ bảo quản lạnh -20 độ C.
2.2.2.2 Dung dịch chuẩn làm việc
Chuẩn bị chuẩn làm việc hỗn hợp trong H2O có nồng độ 100 ng/mL (S-CC1), 10 ng/mL (S-CC2) và 1 ng/mL (S-CC3) từ chuẩn gốc LD 4060 ng/mL và chuẩn gốc CD
Chuẩn bị dung dịch làm việc LD-d3 trong TFA 10%/ MeCN có nồng độ 20 ng/mL từ dung dịch chuẩn gốc LD- d3 500 ng/mL
- Methanol (Merk- Đức), hóa chất tinh khiết
- Acetonitril (Merk- Đức), hóa chất tinh khiết
- Acid hydrocloric 37% ( Xilong- Trung Quốc)
- Acid trifloure acetic (Merk- Đức), > 99%
- Magie sulfat (Xilong- Trung Quốc)
- Natri clorid (CTCP tập đoàn hoá chất Đức Giang, Việt Nam)
Thiết bị phân tích: sắc ký lỏng HPLC LC20AD-XR của Shimadzu và khối phổ ABSciex Triple Quad 6500, cột Waters acquity BEH C18 (2,1x150 mm, 1,7 àm), cột Waters Xbridge HILIC (4,6x150 mm, 3,5 àm) và cột Waters acquity UPLC BEH Amide (2,1x150 mm, 1,7 àm)
Thiết bị phụ trợ: Cân phân tích (Nhật), máy ly tâm Kubota (Nhật), máy lắc xoáy Vortex 3 (IKA), tủ lạnh (-20 o C), tủ lạnh âm sâu (-80 o C) Panasonic (Nhật)
Dụng cụ khác: Bình định mức 5, 10, 20, 25 mL, pipet pasteur, đũa thuỷ tinh (Trung Quốc), micropipet LABMATE (loại 2-20 μL; 10-100 μL; 20-200 μL và 100-1000 μL) (Ba Lan), đầu côn cho micropipet (Trung Quốc), ống ly tâm (2 mL) (Mỹ), lọ đựng mẫu 1,8 mL.
Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng levodopa, carbidopa
2.3.1.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
Dựa vào các tài liệu tham khảo các quy trình xử lý mẫu ở Bảng 1.1 tiến hành khảo sát phương pháp xử lý mẫu tìm dung môi thích hợp kết tủa protein, tỉ lệ dung môi thích hợp pha loãng giảm ảnh hưởng của tạp chất
Kết tủa protein: MeOH, MeCN, TCA 10%/MeCN, HClO4, TFA 10%/MeCN, TFA 15%/MeCN, TFA 20%/MeCN
Khảo sát khối lượng muối: khối lượng muối MgSO4: NaCl (0,05:0,05), (0,1:0,025), (0,15:0,08), (0,2:0,05), (0,4:0,05)
2.3.1.2 Khảo sát điều kiện xác định levodopa, carbidopa bằng LC-MS/MS
Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ và lựa chọn các ion con phù hợp
Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: Khảo sát lựa chọn cột phù hợp, thành phần pha động và gradient
2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp phân tích được thực hiện theo hướng dẫn của US-FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân tích sinh học Việc thẩm định phương pháp phân tích bắt buộc cần có độ chọn lọc-độ đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng và độ chính xác, độ pha loãng, độ ổn định [12], [34]
2.3.2.1 Độ chọn lọc- độ đặc hiệu Độ chọn lọc là khả năng của một phương pháp phân tích để phân biệt và đo lường chất phân tích khi có mặt các chất gây nhiễu bao gồm các chất liên quan của nó (ví dụ: các chất có cấu trúc tương tự như chất phân tích, chất chuyển hóa, chất đồng phân, tạp chất, sản phẩm phân hủy được hình thành trong quá trình chuẩn bị mẫu hoặc thuốc dùng
19 đồng thời dự kiến sẽ được sử dụng để điều trị những bệnh nhân có chỉ định dự định) trong nền sinh học trắng
Phương pháp được xây dựng dựa trên 6 mẫu huyết thanh tham chiếu có nguồn gốc khác nhau và 6 mẫu chuẩn trong huyết tương chứa levodopa, carbidopa (50 ng/mL), IS (1000 ng/mL) (mẫu LLOQ) So sánh đáp ứng pic của mẫu huyết thanh tham chiếu/LLOQ tại thời gian lưu của levodopa (LD), carbidopa (CD), IS trên sắc ký đồ.
Phương pháp LC-MS/MS được coi là chọn lọc với chất phân tích khi:
+ Trên SKĐ của các mẫu HTT, xác định không xuất hiện các pic có thời gian lưu tương ứng với chất phân tích, IS
+ Tại thời điểm trùng thời gian lưu của chất phân tích, IS, đáp ứng pic của mẫu HTT không vượt quá 20% đáp ứng của chất phân tích tại LLOQ và không đáp ứng quá 5% đáp ứng của IS tại LLOQ
Ngoài ra sử dụng kỹ thuật MS, cần đáp ứng yêu cầu về điểm IP và tỉ lệ ion [5] Theo hội đồng Châu Âu (EU 2021/808) cách tính điểm IP đối với phương pháp LC-MS/MS: kỹ thuật tách LC được tính 1 điểm, mỗi ion mẹ được tính 1 điểm, mỗi ion con được tính 1,5 điểm Tổng số điểm nhận dạng đạt được đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần được tính theo Bảng 1.4
Bảng 1.4 Số điểm IP đạt được đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần
Kỹ thuật Kỹ thuật tách Số ion Số điểm IP
GC hoặc MS 1 ion mẹ, 2 ion con 1+ 1+ 2x1,5= 5
GC hoặc MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con
Tỉ số của 2 mảnh ion con trên mẫu thêm chuẩn và tỉ số ion của 2 mảnh con trên mẫu chuẩn dung môi, phải tương đồng hoặc chệch không quá quy định của hội đồng Châu Âu
Bảng 1.5 Tỉ lệ ion đối với LC-MS/MS
2.3.2.2 Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống là phép thử để chứng minh hệ thống hoạt động theo mục đích sử dụng
20 Tiến hành: Tiến hành tiêm lặp 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích
Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và RSD của diện tích pic ≤ 2%
2.3.2.3 Giới hạn định lượng dưới
Theo các tài liệu tham khảo, đối với viên nén LD/CD liều lượng 100/25 mg, 250/50 mg và 200/50 mg, nồng độ Cmax trong huyết tương người dao động trong khoảng 1-3 µg/mL đối với LD Những nghiên cứu trên người và động vật cũng cho thấy sự tương đồng về dược động học, với nồng độ Cmax ở động vật cũng dao động trong khoảng 1-3 µg/mL đối với LD Khi sử dụng 75 mg CD, nồng độ Cmax ở động vật đạt 3 µg/mL Do đó, đối với các dạng chế phẩm có liều lượng tương tự, nồng độ Cmax của LD và CD có thể dao động trong khoảng 1-3 µg/mL.
Chuẩn bị 6 mẫu có chứ IS và chất phân tích ở nồng độ LLOQ (50 ng/mL)
Chuẩn bị song song đường chuẩn tương ứng Từ đường chuẩn xác định độ đúng ở mỗi mẫu LLOQ và giá trị CV giữa 6 lần phân tích
Thời điểm trùng hợp với thời gian lưu của chất phân tích đáp ứng trung bình mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng mẫu zero (0) Độ đúng trung bình của kết quả đo phải nằm trong khoảng từ 80% đến 120% so với nồng độ thực tế Hệ số biến thiên (CV) của các giá trị đo phải nhỏ hơn hoặc bằng 20%.
2.3.2.4 Ảnh hưởng nền mẫu Ảnh hưởng nền mẫu được định nghĩa là sự thay đổi phản ứng của chất phân tích do các thành phần gây nhiễu và thường không được xác định trong nền mẫu Trong quá trình thẩm định phương pháp, cần đánh giá ảnh hưởng nền giữa các nguồn/lô độc lập khác nhau
Tiến hành: Phân tích ít nhất 3 lần lặp lại của LQC, HQC, mỗi lần được chuẩn bị bằng cách sử dụng nền từ ít nhất 6 nguồn/ lô khác nhau
Yêu cầu: Độ chính xác phải nằm trong khoảng ± 15% nồng độ thực
2.3.2.5 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành trên ít nhất 5 đường chuẩn, chuẩn bị mẫu trắng ( không có chất phân tích, không có IS), mẫu hiệu chuẩn bằng 0 ( mẫu trắng có IS), và ít nhất 6 mức nồng độ khác
0 bao trùm phạm vi định lượng bao gồm LLOQ và ULOQ mỗi lần chạy Các mẫu trắng được thêm chuẩn với lượng đã biết, tiến hành xử lý mẫu như mẫu nghiên cứu
Bảng 2.1 Chuẩn bị đường chuẩn
21 Xác định hệ số trọng số (weighting)
+ Xác định mức độ biến thiên đáp ứng ở 2 nồng độ LLOQ và ULOQ
+ Tính F thực nghiệm = Phương sai của ULOQ/ phương sai của LLOQ
+ Xác định giá trị F bảng bằng cách tra bảng F- distribution table với α= 0,01, dfl n-1; df2= n-1; n là số đường chuẩn thực nghiệm
+ Nếu F thực nghiệm < F- bảng: không sử dụng hệ số trọng số Nếu F thực nghiệm >
F bảng chứng tỏ tập hợp kết quả không đồng nhất Cần sử dụng hệ số trọng số
+ Lựa chọn hệ số trọng số
+ Sau khi có được đường chuẩn với hệ số tương quan được chấp nhận, tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn, từ đó tính độ chệch
+ Từ phương trình hồi quy đã xây dựng, tính lại nồng độ của từng mẫu, xác định giá trị độ chệch tại mỗi nồng độ theo công thức sau:
Trong đó: ∆i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn
Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn
Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn
+ Độ chệch tại LLOQ phải nằm trong khoảng ± 20% nồng độ thực
+ Độ chệch tại các điểm khác phải nằm trong khoảng ± 15% nồng độ lý thực + Ít nhất 75% số điểm chuẩn và tối thiểu 6 điểm chuẩn đáp ứng tiêu chí trên
2.3.2.6 Độ đúng, độ chính xác
Tiến hành đánh giá độ đúng, độ chính xác trong ngày và độ đúng, độ chính xác khác ngày
+ Phân tích ít nhất 5 lần lặp lại ở mỗi mức nồng độ QC trong mỗi lần phân tích Chuẩn bị các mẫu ở 4 mức nồng độ LLOQ, LQC ( trong khoảng 2-3 lần LLOQ), MQC ( 30%- 50% ULOQ), HQC (ít nhất khoảng 75% ULOQ) Các mức QC được chuẩn bị bằng cách thêm lượng chất phân tích đã biết, bảo quản và phân tích như các mẫu nghiên cứu + Chuẩn bị một đường chuẩn, phân tích theo phương pháp đã xây dựng
+ Tính lại nồng độ các mẫu LLOQ, LQC, MQC, HQC theo đường chuẩn
+ So sánh nồng độ phân tích được so với nồng độ đã pha Xác định độ đúng
+ Tính giá trị CV giữa các nồng độ phân tích được Xác định độ lặp lại
+ Độ đúng trung bình các mẫu QC nằm trong khoảng 85%- 115% nồng độ đã pha, tại nồng độ LLOQ độ đúng nằm trong khoảng 80%- 120%
22 + Độ lặp lại giữa các nồng độ phân tích tại mẫu QC có CV không lớn hơn 15%, tại nồng độ LLOQ: CV không lớn hơn 20%
Nhiễm chéo là sự thay đổi nồng độ đo được do chất phân tích còn sót lại từ mẫu trước vẫn còn trong thiết bị phân tích Chuẩn bị 6 mẫu trắng, 6 mẫu LLOQ và ít nhất 1 mẫu ULOQ
+ Tiến hành xử lý mẫu trên theo quy trình
+ Tiêm mẫu trắng sau khi tiêm mẫu ULOQ
+ Xác định đáp ứng pic của mẫu trắng và mẫu LLOQ
Yêu cầu: Đáp ứng không được lớn hơn 20% đáp ứng của chất phân tích ở LLOQ và 5% đáp ứng IS đối với mỗi mẫu trắng
2.3.2.8 Độ pha loãng Độ pha loãng là việc đánh giá quy trình pha loãng mẫu, khi được yêu cầu, để xác nhận rằng quy trình đó không ảnh hưởng đến độ chính xác và độ đúng của nồng độ đo được của chất phân tích Nên sử dụng cùng một nền mẫu từ cùng một loài được sử dụng để chuẩn bị QC để pha loãng
+ Xác định hệ số pha loãng dự định
+ Chuẩn bị QC pha loãng với nồng độ chất phân tích trong nền lớn hơn ULOQ và sau đó được pha loãng với nền mẫu trắng
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
Kết quả xây dựng phương pháp nghiên cứu
3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện khối phổ
Dựa vào tham khảo một số nghiên cứu đã công bố ở trong Bảng 1.3 và trong quá trình thực nghiệm, nhóm nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Levodopa-Carbidopa trên trên hệ thống Sciex 6500+, nguồn ion hóa (ESI) chế độ ion dương, chế độ ghi phổ MRM
Tiờm cỏc dung dịch chuẩn Levodopa và Carbidopa trong MeOH cú nồng độ 1àg/ml vào nguồn ESI của thiết bị Chọn nguồn ion hóa (ESI) chế độ dương, chế độ ghi toàn phổ tại tứ cực thứ nhất Q1 (full scan), khảo sát trên nguồn ion hóa (ESI) chế độ dương Sau khi xác định ion mẹ tune tự động thu được kết quả ở Bảng 3.1 và phụ lục 1
Bảng 3.1 Kết quả tối ưu điều kiện mảnh
Levodopa 198,033 77,082 21,00 55,0 10,0 10846000 Định tính 198,033 107,108 21,00 35,0 12,0 12259000 Định lượng 198,033 135,116 21,00 27,0 6,0 8201000
Lựa chọn các mảnh có tín hiệu cao và ổn định, tiến hành chạy trên mẫu huyết tương thu được kết quả mảnh m/z= 198→152.
Hình 3.1 SKĐ của mẫu chuẩn LD, IS mảnh 152 trên mẫu HTT và mẫu LLOQ
Tại mảnh 198→152, thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chuẩn LD (2,63 phút) trên mẫu huyết tương trắng có xuất hiện pic, đáp ứng tại pic trên mẫu trắng so với mẫu LLOQ lớn hơn 20%, ảnh hưởng của nền mẫu khá cao Do đó, mảnh 198→152 mặc dù có đáp ứng cao nhất nhưng không được lựa chọn để phân tích levodopa do ảnh hưởng của nền mẫu.
Từ kết quả thực nghiệm tối ưu điều kiện mảnh như trên xác định được các cặp đặc trưng trong phân tích Levodopa và Carbidopa như sau:
+ Levodopa: cặp ion đặc trưng có tỉ lệ m/z lần lượt là 198,033 (mảnh ion mẹ) và mảnh 107,108 ( mảnh ion con), DP 21 eV, CE 35 eV, CXP 12 eV
+ Carbidopa: cặp ion đặc trưng có tỉ lệ m/z lần lượt là 226,946 ( mảnh ion mẹ) và 181,198 ( mảnh ion con ), DP 36 eV, CE 19 eV, CXP 8 eV
+ Nội chuẩn Levodopa-D3: cặp ion đặc trưng có tỉ lệ m/z lần lượt là 201 ( mảnh ion mẹ) và 154 ( mảnh ion con), DP 21 eV, CE 19 eV, CXP 14 eV
Tối ưu các thông số thiết bị:
Các thông số áp suất khí quyển (CUR), áp suất khí (CAD), thế ion hóa (IS), nhiệt độ nguồn ion (TEM), áp suất khí quyển nguồn 1 (Gas 1), áp suất khí quyển nguồn 2 (Gas 2) được tối ưu tự động sau khi đã chọn được mảnh ion mẹ và ion con trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 3.2 Thông số tối ưu cho thiết bị MS
Temperature (TEM) 450 o C Ion soure gas (Gas1) 40 psi Ion soure gas (Gas2) 45 psi
3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng
3.1.2.1 Khảo sát cột sắc ký
Khảo sát trên ba cột sắc ký:
- Cột Waters Xbridge HILIC (4,6x150 mm; 3,5 àm)
- Cột Waters acquity BEH C18 (2,1x150 mm; 1,7 àm)
- Cột Waters acquity UPLC BEH Amide (2,1x150 mm; 1,7 àm)
Phân tích hỗn hợp levodopa, carbidopa và chuẩn nội sử dụng cùng điều kiện pha động chứ HCOOH 0,1% trong và HCOOH 0,1% trong MeCN
Kết quả thu được thể hiện ở Hình 3.2:
Hình 3.2 SKĐ của mẫu chuẩn LD, LD-d3, CD trên cột (a) HILIC, (b) Acquity BEH
Từ kết quả cho thấy khi sử dụng cột Xbridge HILIC và cột BEH C18 pic của các chất phân tích ra sớm, thời gian lưu lần lượt là 0,57-0,58 phút với cột HILIC và 1,72-1,73
28 phút với cột BEH C18 Ngoài ra, khi dùng cột BEH C18 pic có hiện tượng kéo đuôi Khi dùng cột C18 và cột HILIC chất phân tích ra sớm khó có khả năng tách chất phân tích và tạp trong nền huyết tương
Dùng cột BEH Amide cho pic gọn hơn, thời gian lưu dài hơn ở 5,14-5,15 phút Do đú lựa chọn cột Waters acquity UPLC BEH Amide (2,1x150 mm; 1,7 àm)
3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động
Phân tích hỗn hợp chất levodopa, carbidopa và chuẩn nội trên cột Waters acquity UPLC BEH Amide (2,1x150 mm; 1,7 àm) và hai pha động a) Hỗn hợp HCOOH 0,25% và HCOOH 0,25% trong MeCN b) Hỗn hợp amoni format 10mM, HCOOH 0,1% và amoni format 10 mM, HCOOH 0,1% trong MeCN
Kết quả thu được thể hiện ở Hình 3.3 và Hình 3.4:
(a) (b) Hình 3.3 SKĐ của mẫu chuẩn LD, LD-d3, CD khi chạy pha động chứa (a) HCOOH
0,25% và (b) pha động đệm amoni format
Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pha động đến đáp ứng của Levodopa,
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, khi dùng pha động chứa HCOOH 0,25% cho pic gọn hơn không bị doãng chân pic và cho đáp ứng cao hơn khi dùng pha động chứa đệm,
Do đó lựa chọn pha động HCOOH 0,25% và HCOOH 0,25% trong MeCN
Khảo sát hai gradient pha động theo bảng sau:
30 Kết quả thu được thể hiện trong Hình 3.5 và 3.6:
Hình 3.5 SKĐ của CD khi chạy với gradient 1
Hình 3.6 SKĐ của CD khi chạy với gradient 2
Từ sắc ký đồ ta thấy khi sử dụng gradient 1, pic CD chẻ, khi sử dụng gradient 2 pic của CD cân xứng hơn Do đó lựa chọn gradient 2
3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Tiến hành khảo sát quy trình xử lý mẫu trên nền huyết tương trắng và huyết tương mẫu tự tạo chứa levodopa và carbidopa nồng độ 1 àg/mL bằng phương phỏp kết tủa protein, kết tủa protein kết hợp với QuECHERS
3.1.3.1 Phương pháp kết tủa protein
- Khảo sát tác nhân kết tủa protein
Khảo sát 5 loại dung môi: MeCN, MeOH, HClO4 10%, TCA 10%/MeCN và TFA 10%/MeCN làm tác nhân gây tủa
Mẫu huyết tương được xử lý như sau:
Hình 3.7 Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương theo phương pháp kết tủa protein
Kết quả thu được thể hiện ở Hình 3.8 và 3.9 dưới đây
(a) (b) Hình 3.8 SKĐ của mẫu chuẩn khi kết tủa bằng (a) MeCN và (b) MeOH
(a) (b) (c) Hình 3.9 SKĐ của mẫu chuẩn khi kết tủa bằng (a) HClO 4 10%, (b) TCA 10%/MeCN,
Kết quả thực nghiệm cho thấy khi xử dụng tác nhân kết tủa protein là dung môi hữu cơ: MeOH và MeCN không thấy xuất hiện pic của các chất (Hình 3.8) Khi dùng acid TFA cho hình dạng pic đẹp hơn, gọn hơn không bị chẻ pic như khi dùng acid TCA và acid HClO4, ảnh hưởng của tạp nhỏ hơn (Hình 3.9) Do đó sử dụng TFA làm tác nhân kết tủa protein
- Khảo sát nồng độ tác nhân TFA/MeCN:
Khảo sát 3 nồng độ của tác nhân kết tủa TFA:10%, 15% và 20%
Kết quả thể hiện ở Hình 3.10
(a) (b) (c) Hình 3.10 SKĐ của mẫu chuẩn hỗn hợp khi tủa bằng (a) TFA 10%, (b) TFA 15%, (c)
Nhận xét: Kết quả cho thấy khi dùng TFA 15%, TFA 20%, pic của LD bị dính tạp, pic không gọn như khi dùng TFA 10% Do đó chọn dung môi TFA 10%/MeCN
- Khảo sát tỉ lệ HTT: TFA 10%
Khảo sát 4 tỷ lệ thể tích HTT : TFA 10%: (1:1), (1:2), (1:3), (1:4)
Kết quả thể hiện trong Hình 3.11
Hình 3.11 SKĐ của mẫu chuẩn LD, LD-d3, CD khi tủa bằng TFA 10% với tỉ lệ (a)
Kết quả Hình 3.11 cho thấy khi sử dụng lượng TFA nhỏ (tỉ lệ 1:1, 1:2) lượng protein chưa kết tủa hết, ảnh hưởng tạp nhiều, sử dụng tỉ lệ càng cao, mẫu càng trong,lượng protein càng được kết tủa nhiều hơn, giảm ảnh hưởng của tạp Tuy nhiên lượng dung môi tủa protein càng nhiều, mẫu càng loãng làm tăng giới hạn phát hiện của chất phân tích Do đó tiến hành khảo sát phương pháp kết tủa protein kết hợp với QuECHERS
3.1.3.2 Phương pháp kết tủa protein kết hợp với QuECHERS
Khảo sát quy trình xử lý mẫu kết tủa protein kết hợp với QuECHERS theo quy trình như Hình 3.12 Mẫu sau khi được kết tủa bằng tác nhân TFA 10%/MeCN với tỷ lệ HTT : TFA = 1:4, tiếp tục được xử lý bằng muối MgSO4 và NaCl
Kết quả được thể hiện trong Hình 3.12
Hình 3.12 SKĐ của các chất khi (a) không kết hợp với QuECHERS và (b) khi kết hợp với QuECHERS
Từ kết quả Hình 3.12 cho thấy khi dùng phương pháp kết tủa protein kết hợp với QuECHERS ảnh hưởng nền mẫu ít hơn, pic đẹp hơn Do đó lựa chọn phương pháp kết tủa protein bằng TFA/MeCN kết hợp với QuECHERS
Hình 3.13 Sơ đồ xử lý mẫu của phương pháp kết tủa protein kết hợp với muối
- Khảo sát khối lượng và tỷ lệ muối
Tiến hành khảo sát tỉ lệ khối lượng muối MgSO4 và muối NaCl 0,05 g: 0,05 g; 0,1 g: 0,025 g; 0,15 g: 0,08 g, 0,2 g: 0,05 g; 0,4 g:0,05 g Kết qủa thu được được biểu diễn trong Hình 3.14
Hình 3.14 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của muối đến diện tích pic của các chất
Kết quả thẩm định phương pháp phân tích
3.2.1 Độ phù hợp hệ thống
Chuẩn mẫu huyết tương thêm chuẩn nồng độ 1000 ng/mL, tiến hành phân tích như quy trình đã xây dựng Tiêm 6 lần mẫu chuẩn Ghi lại sắc ký đồ, ta có kết quả ở bảng sau:
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống
STT Thời gian lưu Diện tích pic
LD CD IS LD CD IS
Nhận xét: RSD của thời gian lưu và diện tích pic < 2% Hệ thống phù hợp để định lượng chế phẩm trong huyết tương
+ Chuẩn bị 6 mẫu HTT từ 6 nguồn huyết tương chó, tiến hành phân tích như phương pháp đã xây dựng
+ Chuẩn bị 6 mẫu có chứa IS ( LD-d3) (1000 ng/mL) và chất chuẩn LD, CD ở nồng độ LLOQ (50 ng/mL), tiến hành phân tích như mẫu đã xây dựng
+ Sắc ký đồ được thể hiện ở Hình 3.15, Hình 3.16, Hình 3.17
Hình 3.15 SKĐ của LD trên mẫu HTT, Zero (0), LLOQ
Hình 3.16 SKĐ của IS (LD-d3) trên mẫu HTT, Zero (0), LLOQ
Hình 3.17 SKĐ của CD trên mẫu HTT, Zero (0), LLOQ
+ Trên SKĐ của các mẫu huyết tương trắng từ các nguồn khác nhau (Hình 3.15; 3.16; 3.17) tại thời điểm 2,62 phút tương ứng với thời gian lưu của IS và LD, không xuất hiện các pic có mảnh phổ m/z= 198→107 của LD, và các pic có mảnh phổ m/z= 201→154 của IS, và tại thời điểm 2,5 phút tương ứng với thời gian lưu của CD không xuất hiện các pic có mảnh phổ m/z= 227→181 của CD
+ Trên SKĐ mẫu 0 có đáp ứng của mảnh phổ m/z= 198→107 của LD tại thời gian lưu của LD, đáp ứng trung bình 0,7% so với điểm LLOQ (≤ 20%)
+ Trên SKĐ của mẫu 0 có đáp ứng của mảnh phổ m/z= 227→181 của CD tại thời gian lưu của CD, đáp ứng trung bình 0,4% so với điểm LLOQ (≤ 20%)
+ Tại thời gian lưu tương ứng của IS, đáp ứng trên mẫu HTT và đáp ứng trên LLOQ là 0% (≤5%)
+ Độ đúng trung bình mẫu LLOQ là 92,6% nằm trong khoảng 80%-120%
Ngoài ra, sử dụng kỹ thuật LC, chất phân tích đều có một ion mẹ và hai ion con, điểm
IP đạt 5 điểm, đáp ứng yêu cầu phân tích theo hội đồng Châu Âu
Tỉ số ion và độ chệch của chất phân tích mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn trong dung môi được thể hiện ở bảng dưới đây:
Bảng 3.6 Bảng so sánh tỉ số ion
Chất phân tích Tỉ lệ ion mẫu thêm chuẩn
Tỉ lệ ion mẫu chuẩn trong dung môi Độ chệch Yêu cầu
Như vậy, phương pháp đã xây dựng đáp ứng yêu cầu độ chọn lọc- độ đặc hiệu đối với chất chuẩn LD, CD và chuẩn nội (LD-d3)
3.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Chuẩn bị mẫu trắng, mẫu 0 (mẫu trắng thêm IS), và ít nhất 6 điểm nồng độ từ LLOQ đến ULOQ Tiến hành trên 5 đường chuẩn
Chuẩn bị đường chuẩn có nồng độ S1 (50 ng/mL), S2 (100 ng/mL), S3 (250 ng/mL), S4 (500 ng/mL), S5 (2500 ng/mL), S6 (5000 ng/mL) theo Bảng 2.1
Phân tích các mẫu giúp thiết lập giá trị đáp ứng đỉnh của các mẫu tại nồng độ LLOQ và ULOQ Từ đó, xác định tỷ lệ diện tích đỉnh của chất phân tích/IS tại hai mức nồng độ này Qua đó, có thể xác định được mức biến thiên đáp ứng tại nồng độ LLOQ và ULOQ.
F thực nghiệm= Phương sai của ULOQ/phương sai của LLOQ So sánh với giá trị F bảng = FINV (0,01;n-1;n-1) , kiểm tra sự đồng nhất của tập hợp kết quả
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá giá trị F
STT Tỉ lệ S pic CPT/IS tại nồng độ LLOQ
Tỉ lệ S pic CPT/IS tại nồng độ ULOQ
LD CD LD CD LD CD
Nhận xét : F thực nghiệm > F bảng: tập hợp kết quả không đồng nhất, cần sử dụng hệ số trọng số
Khảo sát các hệ trọng số 1, 1/x, 1/x 2 , ln x xác định phương trình hồi quy tuyến tính theo các mô hình trọng số trên để lựa chọn mô hình phù hợp nhất thu được bảng kết quả thể hiện tổng sai số dư của các trọng số Đánh giá mô hình trọng số dựa vào tổng sai số dư của tất cả các điểm chuẩn ở mỗi mô hình khác nhau Kết quả thể hiện dưới bảng sau:
Bảng 3.8 Kết quả tổng hợp xác định hệ số trọng số
Từ bảng kết quả trên, mô hình trọng số 1/x 2 có tổng số dư của các đường chuẩn thực nghiệm nhỏ nhất Từ đó lựa chọn mô hình trọng số 1/x 2 là mô hình đường chuẩn trong phương pháp định lượng LD-CD trong huyết tương chó
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát đường chuẩn LD theo mô hình trọng số 1/x 2
CC1 CC2 CC3 CC4 CC5
Phương trình hồi quy y=ax+b a 0,00187 0,0002 0,00187 0,00199 0,00194 b -0,00708 -0,0148 0,00794 0,00709 0,00155 r 0,9982 0,9976 0,9989 0,9987 0,9980
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát đường chuẩn CD theo mô hình trọng số 1/x 2
CC1 CC2 CC3 CC4 CC5
Phương trình hồi quy y=ax+b a 0,0576 0,0126 0,0128 0,0236 0,0133 b -0,472 -0,381 -0,124 0,111 -0,17 r 0,9984 0,9951 0,9982 0,9956 0,9966
Kết quả thẩm định xác nhận đường chuẩn thực nghiệm trong phạm vi nồng độ từ 50 ng/mL đến 5000 ng/mL, sử dụng mô hình trọng số 1/x2, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn quy định.
+ Độ đúng so với các giá trị thực của các nồng độ đều đạt từ 85%- 115%
+ Có hệ số tương quan r ≥ 0,99
3.2.4 Giới hạn định lượng dưới
Chuẩn bị 6 mẫu HTT có pha chuẩn LD, CD ở nồng độ 50 ng/mL và IS
Chuẩn bị song song một đường chuẩn
Xử lý và phân tích các mẫu trên dựa trên phương pháp đã xây dựng Xác định nồng độ, độ đúng và độ chính xác của các mẫu LLOQ
Tiến hành lặp lại chỉ tiêu này trên ít nhất 3 lô phân tích khác nhau
Kết quả thể hiện ở Bảng 3.11
Bảng 3.11 Độ đúng- độ chính xác mẫu LLOQ
Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%) Nồng độ
LD CD LD CD LD CD LD CD LD CD LD CD
Nhận xét: Tại thời điểm tương ứng với thời gian lưu của LD, CD, đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ lớn hơn 5 lần đáp ứng của mẫu zezo Độ đúng trung bình của từng ngày và độ đúng trung bình của 3 ngày đều từ 92,6%- 104,7 % đối với LD và từ 100,4%-104,3 % đối với CD đều nằm trong khoảng 80%- 120% và giá trị CV mỗi mức nồng độ đều không lớn hơn 20% Phương pháp đạt giới hạn định lượng
Như vậy, phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về giới hạn định lượng dưới LLOQ
3.2.5 Độ đúng, độ chính xác Độ đúng và độ chính xác trong ngày
Chuẩn bị các lô mẫu ở 4 mức độ LLOQ (50 ng/mL, LQC (100 ng/mL), MQC (250 ng/mL), HQC (3750 ng/mL), mỗi mẫu làm 5 lần độc lập
Chuẩn bị một đường chuẩn trong cùng điều kiện
Phân tích các mẫu theo phương pháp đã xây dựng Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic
Bảng 3.12 Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày ở các mức nồng độ
LD CD LD CD LD CD LD CD
Kết quả thực nghiệm cho thấy độ đúng của các mẫu QC nằm trong giới hạn cho phép từ 85%-115% nồng độ đã pha, đảm bảo độ chính xác của phương pháp phân tích Độ lặp lại giữa các nồng độ QC đạt giá trị tốt, thể hiện độ tin cậy của phương pháp xét nghiệm, đảm bảo độ chính xác và ổn định của kết quả phân tích.
CV không lớn hơn 15% Độ đúng và độ chính xác khác ngày Đánh giá độ đúng và độ chính xác trên các mẫu QC trong các ngày khác nhau Xác định độ chính xác khác ngày bằng cách tính toán độ lệch CV % giữa các giá trị độ đúng thu được của mỗi mức QC và LLOQ trong các ngày đã đánh giá
Bảng 3.13 Bảng kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác khác ngày
LD CD LD CD LD CD LD CD
Nhận xét: Có 1/15 giá trị LQC có độ đúng 84,2% nằm ngoài giới hạn 85%-115%
14/15 giá trị LQC đạt độ đúng nằm trong giới hạn cho phép 15/15 giá trị LLOQ, MQC, HQC đều có độ đúng nằm trong giới hạn cho phép (85%-115%) Giá trị CV giữa giá trị độ đúng của các ngày không lớn hơn 15% với tất cả các mẫu Như vậy độ đúng và độ chính xác đạt theo quy định:
+ Ít nhất 2/3 tổng số QC nằm trong giới hạn 85%-115% so với nồng độ thực
+ Ít nhất 50% ở mỗi mức nồng độ nằm trong giới hạn 85%- 115% so với nồng độ thực Độ đúng và độ chính xác khi tiêm lại mẫu
Tiêm lại các mẫu QC ở trên và tính lại nồng độ các mẫu QC dựa vào đường chuẩn ban đầu
Kết quả thể hiện ở Bảng 3.14
Bảng 3.14 Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác khi tiêm lại mẫu
STT LQC (100ng/mL) MQC (250ng/mL) HQC (3750ng/mL)
LD CD LD CD LD CD
Nhận xét: Độ đúng trung bình mỗi mức nồng độ QC nằm trong giới hạn cho phép
85%-115% nồng độ đã pha Độ chính xác không quá 15%
Hệ số pha loãng 10 lần
Tiến hành chuẩn bị các mẫu pha loãng có nồng độ cao gấp 10 lần nồng độ HQC trong HTT để dễ dàng kiểm tra, theo đó tiến hành phân tích độc lập 5 mẫu theo phương pháp đã xây dựng sẵn Sau đó, tiến hành pha loãng lại các mẫu HTT đã phân tích để thu được các mẫu đạt nồng độ HQC mong muốn.
Bảng 3.15 Kết quả thẩm định độ pha loãng
STT Tỉ lệ S pic của
Nồng độ mẫu đã pha loãng (ng/mL)
Nồng độ mẫu ban đầu (ng/mL) Độ đúng (%)
LD CD LD CD LD CD LD CD
Nhận xét: Độ đúng của các mẫu và độ đúng trung bình mẫu nằm trong giới hạn cho phép thừ 85%-115% nồng độ đã pha Độ lặp lại giữa các nồng độ phân tích của mỗi mẫu pha loãng có giá trị CV không lớn hơn 15%
Chuẩn bị 6 mẫu HTT, 6 mẫu LLOQ và 1 mẫu ULOQ Tiến hành xử lý theo phương pháp đã xây dựng Tiêm mẫu LLOQ trước sau đó tiêm xen kẽ từng mẫu trắng sau khi tiêm mẫu ULOQ
Bảng 3.16 Kết quả độ nhiễm chéo
STT Tỉ lệ S pic LD của LLOQ/HTT Tỉ lệ S pic CD của LLOQ/ HTT Tỉ lệ S pic IS của LLOQ/ HTT
Nhận xét: Tại thời điểm trùng thời gian lưu của chất phân tích LD, CD, đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ lớn hơn 5 lần đáp ứng pic trên mẫu trắng
Tại thời điểm trùng thời gian lưu với IS, đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ lớn hơn
20 lần đáp ứng pic trên mẫu trắng
3.2.8 Độ ổn định Độ ổn định của dung dịch gốc
Ngay sau khi pha, lấy một phần dung dịch gốc, pha loãng đến nồng độ thích hợp Phân tích theo phương pháp đã xây dựng Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic Lặp lại 3 lần riêng biệt
Sau 3 tháng, lấy một phần chuẩn gốc, pha loãng tiến hành tương tự để xác định nồng độ trung bình của dung dịch gốc sau bảo quản
Kết quả thể hiện ở Bảng 3.17
Bảng 3.17 Kết quả độ ổn định của chuẩn gốc
STT Dung dịch chuẩn gốc mới pha Dung dịch chuẩn gốc sau 3 tháng