phạm thanh mai nghiên cứu phương pháp sàng lọc và định lượng một số chất nhóm sulfonylure trong tpbvsk hỗ trợ điều trị tiểu đường bằng lc hrms

Ví dụ thư viện phổ khối phân giải cao được sử dụng để phân tích sàng lọc và định lượng các chất Sulfonylure .... Để góp phần vào công tác kiểm nghiệm chất trộn trái phép trong thực phẩm

TỔNG QUAN

Tình hình trộn trái phép tân dược trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.1.1 Tình hình sử dụng thực phẩm bảo vệ sức khỏe hiện nay

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe là một loại thực phẩm chức năng [6]

Trong thế kỷ trước, Trung Quốc đã bắt đầu chú ý đến ngành công nghiệp thực phẩm chức năng (TPCN), và từ những năm 80, TPCN thực sự gây được sự chú ý ở Nhật Bản Ngành công nghiệp thực phẩm chức năng có doanh thu ước tính hơn 30 tỷ USD ở Mỹ và hơn 100 tỷ USD trên toàn cầu Nhiều người tiêu dùng tin rằng thực phẩm chức năng an toàn hơn và có thể hiệu quả hơn các thuốc điều trị [19]

Việc sử dụng TPCN đã tăng lên trong những thập kỷ gần đây Hơn 30% trẻ em ở Hoa Kỳ sử dụng TPCN thường xuyên [19] Các quốc gia khác như Úc và Trung Quốc cũng có mức tiêu thụ cao, với tỷ lệ lần lượt là 22,6% và 32,4% trẻ em sử dụng TPCN [34] Tại Tanzania, tỷ lệ sử dụng TPCN ở người trưởng thành là 46,5%, trong đó 36,9% cho biết sử dụng TPCN thường xuyên và 63,1% không thường xuyên [32] TPCN đứng ở ranh giới giữa thuốc và thực phẩm, thường có dạng bào chế giống như thuốc (như viên hoàn, viên nén, viên sủi bọt, viên nang, siro ) và được bán tại các cơ sở bán thuốc Điều này dễ gây nhầm lẫn cho người tiêu dùng, đặc biệt khi một số người bán hàng cũng không phân biệt được đâu là TPCN, đâu là thuốc

Thời gian qua, xu hướng sản xuất, buôn bán hàng giả, gian lận thương mại nói chung, trong đó có các mặt hàng là thuốc tân dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe không ngừng gia tăng, với mức độ vi phạm ngày càng nghiêm trọng Một số sản phẩm không có số đăng ký, được sản xuất thủ công, nhỏ lẻ, thậm chí không có bảng thành phần, được bày bán với cái mác gia truyền, độc quyền

Các chế phẩm thảo dược, thực phẩm bổ sung và thực phẩm thông thường bị pha trộn với các loại thuốc và hóa chất ngày càng gia tăng Đặc biệt là những sản phẩm hỗ trợ giảm cân, hạ đường huyết, tăng cường sinh lý nam

1.1.2 Thực trạng trộn trái phép thuốc tân dược trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) có thành phần chủ yếu là các vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzyme, probiotic và các chất có hoạt tính sinh học khác; hoặc các chất có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm động vật, khoáng vật và thực vật dưới dạng chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa [6] Nếu muốn tình trạng bệnh được cải thiện, bệnh nhân phải sử dụng TPBVSK trong thời gian khá dài

Tuy nhiên, một số đối tượng đã trộn lẫn một lượng nhỏ tân dược vào TPBVSK để sản phẩm có tác dụng nhanh chóng Điều này rất nguy hiểm, đặc biệt đối với những bệnh nhân mắc bệnh mãn tính đang phải điều trị bằng thuốc như đái tháo đường Chưa kể liều dùng của các thuốc nhóm sulfonylure khá thấp, chỉ cần một lượng nhỏ cũng có thể có tác dụng sinh học Do đó nguy cơ dẫn đến quá liều thuốc là rất cao

4 Tân dược có thể được nghiền thành bột mịn, trộn cùng với các thành phần khác rồi đóng thành nang, chế biến thành kẹo, để dễ dàng trà trộn vào những sản phẩm chất lượng khác, khiến người tiêu dùng không phát hiện

Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Dược liệu và Y học Truyền thống Zayed (ZCHRTM) dưới sự quản lý của Bộ Y tế (DOH) tại Abu Dhabi đã mua các mẫu TPBVSK hỗ trợ điều trị tiểu đường từ thị trường cũng như các mẫu được cung cấp bởi DOH, MOHAP và các tổ chức chính phủ, VIP và các nguồn khác Sau khi phân tích đã chỉ ra có sự pha trộn trong nhiều sản phẩm dược liệu [31]

Một số nghiên cứu ở Trung Quốc [22], [25], Nhật Bản [27] và Việt Nam [2], [5], [7], [8], [9], [10], [12], [13], [15], [24] đã phát hiện thuốc tân dược đái tháo đường trộn trái phép trong các sản phẩm TPCN Trong các nghiên cứu đó, phát hiện thuốc tân dược điều trị đái tháo đường thường được trộn trái phép là Metformin và nhóm Sulfonylure Có thể, do 2 nhóm thuốc này được sử dụng phổ biến, rộng rãi, tác dụng mạnh; giá thành rẻ và ít tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa hơn các nhóm tân dược điều trị đái tháo đường còn lại nên thường được trộn trái phép

Do đó, nghiên cứu này được thực hiện để sàng lọc và định lượng 4 chất thuộc nhóm thuốc Sulfonylure là Glibenclamid, Gliclazid, Glimepirid, Glipizid

1.2 Tổng quan các hợp chất nghiên cứu

- Cơ chế tác dụng: kích thích trực tiếp tế bào beta đảo Langerhan của tuyến tuỵ tăng sản xuất insulin làm giảm nồng độ glucose trong máu Làm tăng số lượng receptor của insulin ở các tế bào, đặc biệt là các tế bào mỡ, hồng cầu, bạch cầu đơn nhân, do đó làm tăng tác dụng của insulin Ức chế nhẹ tác dụng của glucagon Thuốc không có tác dụng khi cơ thể không còn khả năng tiết insulin [16]

- Tác dụng không mong muốn: Hạ glucose huyết , rối loạn tiêu hoá, vàng da ứ mật, mỏi cơ, viêm mạch dị ứng, chóng mặt, rối loạn tâm thần, ban da, rối loạn tạo máu….[16]

1.2.1 Cấu trúc, tính chất hóa lý

- Công thức hóa học: C 23 H 28 ClN 3 O 5 S

- Tên khoa học: 1-[[4-[2-[(5-Chloro-2 methoxybenzoyl)amido]ethyl]sulfonyl]- 3- cyclohexylure

- Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước và ether, hơi tan trong dicloromethan, khó tan trong methanol và ethanol 96%, tan trong các dung dịch kiềm loãng Nóng chảy ở 169 o C đến 174 o C

- Tên khoa học: 1-(azabicyclo [3,3,0] oct-3-yl)-3-p-tolylsulfonylure

- Tính chất: Bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong dicloromethan, hơi tan trong aceton, khó tan trong ethanol

- Khối lượng phân tử: MI0,6

- Tên khoa học: 1-[[4-[2-(3-Ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrroline-1-carboxamido)- ethyl] phenyl] sulphonyl]-3-trans-(4-methylcyclohexyl)urea

- Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng, không tan trong nước, tan trong dimethylformamid, ít tan trong dicloromethan, rất ít tan trong methanol

- Tên khoa học:1-cyclohexyl-3-[[4-[2-[[(5-methylpyrazin-2-yl)carbonyl]amino] ethyl] phenyl] sulphonyl] urea

- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, gần như không tan trong nước, tan ít trong methylclorid, aceton Thực tế không tan trong ethanol 96% Hòa tan tốt trong dung dịch kiềm

1.2.2 Các phương pháp phân tích nhóm sulfonylure trộn trái phép trong TPBVSK 1.2.1.1 Các phương pháp phân tích ở Việt Nam

Hiện tại ở Việt Nam đã có các nghiên cứu xác định các chất giảm glucose máu trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng như TLC- SERS[24], HPTLC[2][7][12], HPLC [5][15], LC-MS/MS[2][8]

Nghiên cứu của PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh và cộng sự [2] đã sử dụng LC- MS/MS để 4 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp Glibenclamid, Gliclazid, Glimepirid, Glipzid trong 184 mẫu trộn trái phép trong chế phẩm đông dược Các mẫu ở các dạng viên nén, viên nang cứng, bột, viên hoàn và cao Kết quả có 8/41 mẫu trộn dược chất hạ đường huyết nhóm sulfunylure chỉ dương tính với glibenclamid LOD của các chất trong khoảng từ 0,001 đến 0,033 ng/ml LOQ của các chất trong khoảng từ 0,003 đến 0,01 ng/ml

1.2.1.2 Phương pháp phân tích trên thế giới

Tổng quan kỹ thuật phân tích

1.3.1 Kỹ thuật chiết pha rắn phân tán d-SPE

Chiết pha rắn phân tán (d-SPE) đã được sử dụng như một kỹ thuật tiền xử lý để phân tích một số hợp chất Kỹ thuật này dựa trên sự phân tán chất hấp phụ rắn trong các mẫu lỏng trong quá trình tách chiết và làm sạch các chất phân tích khác nhau khỏi nền mẫu phức tạp d-SPE đã tìm thấy nhiều ứng dụng trong một số lĩnh vực và được coi là một kỹ thuật chọn lọc, mạnh mẽ và linh hoạt Các kỹ thuật dựa trên d-SPE cho phép giảm thiểu các bước bổ sung như kết tủa, ly tâm và lọc, làm giảm thao tác trên mẫu

Kỹ thuật d-SPE thường được kết hợp với phương pháp Nhanh, Dễ, Rẻ, Hiệu quả, Chắc chắn và An toàn (QuEChERS) để tăng hiệu quả làm sạch Tính hữu ích của d-SPE được chứng minh sau khi được Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (AOAC) công nhận là phương pháp quốc tế để xác định nhiều loại thuốc trừ sâu trong trái cây và rau quả Mục tiêu chính của chất hấp phụ là giữ lại các thành phần nền trong khi chất phân tích vẫn ở pha lỏng

Hơn 50 chất hấp thụ đã được thử nghiệm, nhưng có bốn loại chất hấp thụ thường được sử dụng trong d-SPE, đó là: amin bậc một (PSA), than đen than chì hóa (GCB), RP-C18 và alumina Việc lựa chọn chất hấp phụ thường được thực hiện có tính đến bản chất của các chất gây cản trở cần loại bỏ Do đó, PSA được sử dụng cho các acid hữu cơ phân cực, đường, chất màu và acid béo trong khi GCB thích hợp hơn để giữ lại các hợp chất thơm và phân cực; RP-C18 thuận tiện hơn cho tinh bột, đường và các hợp chất lipophilic, alumina giữ lại vitamin, glycosid và sterol thực vật PSA kết hợp với GCB mang lại kết quả tuyệt vời cho các mẫu có hàm lượng carotenoids hoặc diệp lục cao

Nhìn chung, kỹ thuật chiết d-SPE tốn ít thời gian, dung môi, các bước xử lý đơn

8 giản hơn so với kỹ thuật chiết SPE thông thường Sự khác nhau giữa quy trình chiết của 2 kỹ thuật SPE và d-SPE được thể hiện trong hình 1.1 Ngoài ra kỹ thuật d-SPE hiện nay cũng đã được cải thiện về mặt ổn định Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, việc chiết bằng kỹ thuật d-SPE không mang lại hiệu quả làm sạch cao, độ thu hồi kém do chất phân tích bị hao hụt bởi các chất hấp phụ

Hình 1 1 Sự khác nhau trong quy trình chiết giữa SPE và d-SPE

1.3.2 Sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao (LC-HRMS)

Hình 1 2 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao Máy khối phổ tứ cực Q-Exactive Orbitrap [30]

Máy khối phổ Thermo Scientific Exactive Orbitrap™ thế hệ đầu tiên được ra mắt vào năm 2008 và lần đầu tiên được sử dụng chủ yếu để nhận dạng hợp chất nhỏ và protein Công nghệ này cũng được áp dụng rộng rãi cho các ứng dụng thông thường, bao gồm phân tích thực phẩm và môi trường, độc tính pháp y và phân tích thuốc Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là khả năng quét toàn bộ không mục tiêu (non-targeted), có thể định tính các chất chỉ cần dựa vào ngân hàng phổ (tỷ số khối m/z) mà không cần đến chất chuẩn đối chiếu Do đó đây là phương pháp phù hợp để sàng lọc các chất có hàm lượng nhỏ được trộn trái phép trong mẫu phân tích

Sự khác biệt lớn nhất giữa máy quang phổ khối dòng Q Exactive và bất kỳ thiết bị có độ phân giải cao nào khác hiện có trên thị trường, chẳng hạn như thiết bị khối phổ tứ cực thời gian bay (Q-TOF) là độ phân giải khối lượng cao và cực cao nhờ có bộ phân tích khối lượng Orbitrap Yếu tố khác biệt chính này đặc biệt có giá trị để phân biệt giữa các ion quan tâm và các ion gây nhiễu trong phạm vi tỷ số khối (m/z) rất thấp (khoảng m/z 50–300 và m/z 300–1000)

Một ví dụ khác về tiện ích của Orbitrap là khả năng phân biệt các hợp chất quan tâm với đồng vị hay các chất gây nhiễu ở tỷ số khối rất thấp, được thể hiện trong hình 1.3

Hình 1 3 Khả năng phân biệt đồng vị của Orbitrap [30]

Cấu tạo chung máy khối phổ tứ cực Q-Exactive Orbitrap được mô tả trong hình 1.4 và sơ đồ đường dẫn ion được mô tả trong hình 1.5

Hình 1 4 Cấu tạo chung của máy khối phổ tứ cực Q-Exactive Orbitrap [30]

Hình 1 5 Sơ đồ đường dẫn ion [30]

Bộ nguồn ion hóa : Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao Q Exactive sử dụng nguồn ion hóa áp suất khí quyển (API) gồm ba kiểu hình thành ion : : Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI)

Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi đến bộ phận phát hiện

Bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực

C-trap : tiêu tán động năng của ion để đưa các ion vào bộ phận orbitrap

Orbitrap : Trung tâm bộ phận là 1 trục được tích điện ngược với điện tích của các ion Các ion sẽ chuyển động theo một quỹ đạo quanh trục Tần số của dao động này sẽ phụ thuộc vào tỷ số khối m/z của ion Phổ khối thu được thông qua phép biến đổi Faurier

HCD : Các ion có thể qua khỏi C-trap vào và va chạm với khí Nito trong HCD tạo thành các phân ion nhỏ hơn Sau đó chúng được chuyển trở lại C-trap và đưa vào bộ phận Orbitrap để phát hiện phổ khối

NGUYÊN LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, chất chuẩn

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ

- Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HR/MS gồm sắc ký lỏng siêu hiệu năng Ultimate 3000 kết nối với khối phổ Q-exactive Plus (Thermo Scientific, Mỹ)

- Cột sắc ký pha đảo BEH C18 (100 mm x 1,7 àm x 2,1 mm) và tiền cột, Waters (Mỹ)

- Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)

- Cân kỹ thuật, chính xác 0,01 g (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)

- Máy đồng nhất mẫu (Phillips, Hà Lan)

- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 vòng/phút đối với ống ly tâm 50 mL, Mikro 200R (Hettich, Đức)

- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 13000 vòng/phút đối với ống ly tâm 2 mL, Mikro 220R (Hettich, Đức)

- Máy lắc xoáy vortex (IKA, Đức)

- Máy rung siêu âm (Elma, Đức)

- Bình định mức các loại: 5 mL, 10 mL, 50 mL và 100 mL

- Ống ly tâm nhựa 15 mL có nắp kín

- Ống ly tâm nhựa 2 mL có nắp kín

- Lọ đựng mẫu 1,8 mL có nắp kín

- Màng lọc mẫu, kớch thước lỗ 0,2 àm

- Màng lọc dung mụi, kớch thước lỗ 0,45 àm

❖ Chất chuẩn nhóm hỗ trợ điều trị tiểu đường

- Glimepirid (hãng: Viện KN thuốc TW, số lô : 115320.1, độ tinh khiết: 99,49%)

- Glipizid (hãng: Viện KN thuốc TW, số lô : 107207, độ tinh khiết: 99,17%)

- Glibenclamid (hãng: LGC, số lô : G159147, độ tinh khiết: 98,6%)

- Gliclazid (hãng: Sigma Aldrich, số lô : LRAC3531, độ tinh khiết: 99,1%)

❖ Pha dung dịch chuẩn nhóm hỗ trợ tiểu đường

- Dung dịch chất chuẩn gốc 1000 àg/mL: Cõn chớnh xỏc khoảng 10 mg cỏc chất chuẩn vào cốc có mỏ 25 ml trên cân phân tích có độ chính xác đến 0,01 mg Hòa tan bằng MeOH và chuyển vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch và lắc đều Bảo quản các dung dịch ở -20 º C

- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 àg/mL: Dựng micropipet hỳt chớnh xỏc 100 àL cỏc dung dịch chuẩn gốc cho vào bỡnh định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng MeOH và lắc đều Bảo quản dung dịch ở 2 ÷ 8 º C

- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 àg/mL: Dựng micropipet hỳt chớnh xỏc 1000 àL dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 àg/mL vào bỡnh định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng MeOH lắc đều Bảo quản dung dịch ở 2 ÷ 8 º C

❖ Hóa chất dung môi khác

- Nước được sử dụng cho thiết bị là nước đề ion, sử dụng cho quá trình chuẩn bị mẫu là loại tinh khiết LC-MS và hóa chất tinh khiết được mua từ Merck, Đức: methanol, acetonitril, acid formic, acid acetic, ammoni format, natri acetat, chloroform, n- hexan, diethyl ether, ethyl acetat

- Muối được mua từ Merck, Đức : muối magie sulfat, muối natri clorua, bột làm sạch C18, cỡ hạt 40 àm, bột carbon graphit (GCB)

❖ Cách pha các dung dịch dùng trong thực nghiệm

- Dung dịch 10 mM amoni format và 0,1 % acid formic trong nước: Hòa tan 0,63 g amoni format và 1 mL acid formic vào bình định mức 1000 mL, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần

- Dung dịch 10 mM amoni format và 0,1 % acid formic trong acetonitril: Hòa tan 0,63 g amoni format và 1 mL acid formic vào bình định mức 1000 mL, định mức tới vạch bằng acetonitril

- Dung dịch acid acetic 0,1% trong acetonitril: Hút 1 mL acid acetic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, lắc đều

- Dung dịch acetonitril: Nước (50:50, v/v): Đong 500 mL acetonitril và 500 mL nước vào bình 1000 mL, đậy nắp và lắc đều

- Dung dịch acetonitril: Nước (30:70, v/v): Đong 300 mL acetonitril và 700 mL nước vào bình 1000 mL, đậy nắp và lắc đều

- Dung dịch acid formic 0,1%: Hút 1 mL acid formic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, đậy nắp và lắc đều.

Đối tượng phân tích

- Các mẫu TPBVSK được mua tại các cửa hàng thuốc trên địa bàn thành phố Hà Nội

- Đối tượng mẫu được lựa chọn để thẩm định phương pháp: 3 mẫu TPBVSK có tác dụng hỗ trợ tiểu đường dạng viên nang cứng, nang mềm, dạng lỏng.

Đối tượng nghiên cứu

4 chất thuộc nhóm sulfonylure : gliclazid, glimepirid, glipizid, glibenclamid

Thẩm định Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thẩm định phương pháp nghiên cứu Đối với phương pháp định lượng, tiến hành thẩm định, đánh giá các thông số sau: độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại, độ thu hồi Đánh giá kết quả thẩm định với quy định của AOAC và các quy định khác của châu Âu [17]

2.4.1.1 Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống được đánh giá bằng cách tiêm 6 mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 100ppb trong dung môi MeOH Phương pháp có độ phù hợp khi thời gian lưu của 6 mẫu chuẩn không lệch quá 5% và diện tích pic của 6 mẫu chênh lệch không quá 15%

Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Phương pháp có tính chọn lọc cao đối với chất phân tích khi không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu trắng, thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn không lệch quá 5%

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC 657/2002 của Châu Âu

2.4.1.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N) Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)

2.4.1.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo 7 điểm chuẩn có nồng độ từ giá trị định lượng Sau đó, lấy tối thiểu 5 điểm nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó, vẽ đường biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ

Các dung dịch chuẩn được pha trên dịch sau khi xử lý của mẫu trắng

2.4.1.5 Độ lặp lại và độ thu hồi Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau là (n = 6) và tính toán kết quả theo các công thức sau:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD(%)

14 Trong đó: xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i” x: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm n : Số lần thử nghiệm

C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

2.4.2.1 Phân tích sàng lọc Áp dụng phương pháp đã xây dựng để sàng lọc các hợp chất nhóm chất cấm hỗ trợ điều trị tiểu đường có thể có mặt trong các sản phẩm TPBVSK Phần lớn các chất đều đã có trong thư viện phổ được xây dựng thông qua nghiên cứu Tuy nhiên, trường hợp phát hiện các chất mới, thực hiện tách chiết và sắc ký điều chế để thu được các chất có độ tinh khiết tương đối, sau đó xác định cấu trúc của chất bằng các phương pháp phổ như UV, MS, IR và NMR

2.4.2.2 Phân tích định lượng Đường chuẩn trên nền mẫu thực được sử dụng để tính kết quả cho các mẫu tương ứng Căn cứ vào đường chuẩn tương quan giữa diện tích pic và nồng độ, căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau:

V: Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy (mL)

C: Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đường chuẩn (ng/mL) k: Hệ số pha loãng m: Khối lượng hoặc thể tích của mẫu phân tích (g)

X: Hàm lượng chất cấm trong mẫu thử (àg/kg)

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả phân tích sàng lọc được xử lý bằng phần mềm Compound discoverer 3.1 và kết quả định lượng được xử lý bằng phần mềm TraceFinder 4.1 của thiết bị LC-HRMS Ultimate 3000 Q-exactive hãng Thermo Scientific

15 Các kết quả phân tích và thẩm định phương pháp được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Điều kiện phân tích định lượng

Sử dụng cột sắc ký pha đảo Trên cơ sở các nghiên cứu đã công bố, cột tách sắc ký được sử dụng là cột C18, phương pháp phân tích được thực hiện trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp nên có thể sử dụng cột có cỡ hạt nhồi nhỏ Đồng thời, kích thước cỡ hạt cột càng nhỏ, hiệu quả phân tách các chất phân tích tốt Vì vậy, nghiên cứu sử dụng cột BEH C18 (100 mm x 1,7 àm x 2,1 mm) và tiền cột tương ứng của hóng Waters a) Lựa chọn điều kiện pha động

Phần lớn các nghiên cứu đã công bố sử dụng hệ dung môi gồm nước và acetonitril hoặc hỗn hợp acetonitril: methanol (1:1) có bổ sung thêm các chất tạo ion như acid formic 0,1% hoặc kết hợp giữa acid formic 0,1% và ammonium format 10 mM Để đánh giá hiệu quả của các hệ dung môi, nghiên cứu tiến hành khảo sát các hệ dung môi khác nhau và lựa chọn được hệ dung môi pha động gồm:

- Kênh A: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong nước

- Kênh B: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong acetonitril: methanol (1:1, v/v)

Chương trình gradient dung môi là cần thiết để tách các chất phân tích hoàn toàn Quy trình sàng lọc các chất nhóm Sulfonylure được xây dựng trên nền mẫu TPBVSK là những nền mẫu phức tạp Chế độ phân tích ở khối phổ là fullscan sẽ quét tất cả các chất phân tích trong dịch chiết dẫn tới các tạp chất sẽ ảnh hưởng đến tín hiệu của chất phân tích Do vậy, sau khi cố định điều kiện cột tách và pha động chương trình gradient pha động được khảo sát để tách các chất nhóm Sulfonylure

Bảng 3.1 Chương trình gradient tối ưu

Thời gian Kênh A (%) Kênh B (%) Tốc độ dòng (mL/phút)

Nhận xét: Các chất Sulfonylure có công thức cấu tạo tương tự nhau và chỉ khác nhau ở các nhóm thế, nên nhóm sulfonylure có nhiều chất trùng nhau ion mẹ và 1 số ion con Để phân biệt các chất phân tích, bên cạnh sự phân tách về phổ MS/MS, phương pháp cần có sự phân tách sắc ký Từ tham khảo các nghiên cứu, đề tài đã công bố, nghiên cứu đã khảo sát các điều kiện gradient khác nhau và lựa chọn điều kiện

17 gradient tối ưu (Bảng 3.1), do có khả năng phân tách các chất trùng mảnh tốt Với điều kiện gradient nêu trên, thời gian lưu các chất Sulfonylure được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Thời gian lưu của các chất phân tích nhóm Sulfonylure

(m/z) RT (phút) Gliclazide 324,1376 23,32 Glimepiride 491,2323 23,72 Glipizide 446, 1860 22,45 Glibenclamide 494,1511 23,34 Kết quả trong bảng cho thấy, có thể tách được các Sulfonylure dựa trên sự khác nhau về khối và thời gian lưu Một số sắc ký đồ phân tích các chất Sulfonylure được đưa ra ở hình 3.1

Hình 3.1 Sắc ký đồ 4 chất chuẩn nhóm sulfunylure ở nồng độ 100 ng/ml

Như vậy, lựa chọn điều kiện phân tích định lương 4 chất nhóm sulfonylure như sau :

Các điều kiện phân tích định lượng được thiết lập như sau:

- Cột sắc ký pha đảo BEH C18 (100 mm x 1,7 àm x 2,1 mm) và tiền cột, Waters

- Nguồn ion hóa: ESI dương, chế độ theo dõi chọn lọc ion (MRM)

- Tham khảo các tài liệu và dựa trên điều kiện của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát pha động gồm

+ Kênh A : acid formic 0,1% và amoni format 10mM trong nước

+ Kênh B : Hỗn hợp acid formic 0,1% và ammonium format 10mM trong acetonitrile : methanol (1:1,v/v)

- Chế độ khối phổ: Với MS sử dụng chế độ quét toàn dải (full scan) và với MS/MS sử dụng chế độ dd-MS 2 (data-dependent) với 3 giá trị năng lượng va chạm tương đối là 40%, 70%, 100% (NCE)

- Độ phân giải: MS 70.000 (FWHM) và MS/MS 17.500 (FWHM)

- Độ chính xác khối: Cài đặt ở 5 ppm

- Giá trị m/z (phân giải cao) của các chất được lấy từ kết quả phân tích sàng lọc và đưa vào phân mảnh để tạo thành các ion phân mảnh Bảng thời gian lưu tương đối và các ion phân mảnh được lựa chọn dựa vào kết quả khảo sát thực tế trên chuẩn tại phòng thí nghiệm.

Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

3.2.1 Chuẩn bị mẫu sơ bộ

- Mẫu viên nang cứng được xay nghiền và trộn đều bằng máy đồng nhất mẫu

- Mẫu viên nang mềm được tách bỏ phần vỏ nang, lấy phần ruột trộn đều

3.2.2 Quy trình xử lý mẫu trong phương pháp sắc ký

Trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trước đây về kỹ thuật xử lý mẫu chiết các chất cấm trong nền mẫu TPBVSK:

Tiến hành khảo sát phương pháp chiết lỏng - rắn với các hệ dung môi chiết (dung môi A) khác nhau gồm methanol, acetonitril và nước, kết hợp quá trình rung siêu âm Đồng thời, tiến hành khảo sát quá trình làm sạch mẫu với lượng GCB khác nhau Nghiên cứu tiến hành khảo sát các hệ dung môi khác nhau gồm acetonitril, methanol, methanol: nước (50:50), methanol: nước (70:30) Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu trắng thêm chuẩn chất phân tích Sulfonylure tại nồng độ 3,2 mg/kg trên mẫu (tương ứng trên dịch cuối là 80 ng/mL) Kết quả khảo sát hiệu suất chiết của một số chất được thể hiện trong hình 3.2

Hình 3.2 Hiệu suất chiết (%) của các dung môi với các chất nhóm sulfonylure

Từ kết quả cho thấy, dung môi MeOH đạt hiệu suất thu hồi lớn nhất cho 4 chất nhóm sulfonylure Ngoài ra, methanol cũng là một dung môi rẻ tiền, phổ biến, ít độc

Do đó methanol được lựa chọn để sử dụng trong nghiên cứu

3.2.3 Khảo sát bước loại béo Đối với nền mẫu viên nang mềm (có chứa dầu), quy trình xử lý mẫu được khảo sát thêm bước loại béo Các dung môi loại béo (dung môi B) và hóa chất dùng để khảo sỏt bao gồm: diethyl ether, n-hexan, ethyl acetate, bột làm sạch C18 cỡ hạt 40 àm

Như vậy phương pháp phân tích gồm các quy trình xử lý mẫu sau :

Quy trình 1 : Cân khoảng 1 g mẫu hoặc 1 đơn vị mẫu, thêm chuẩn, chiết bằng dung môi A, lọc, lấy dịch chiết, thêm GCB để làm sạch, tiêm vào LC-HRMS

Quy trình 2 : Cân khoảng 1 g mẫu hoặc 1 đơn vị mẫu, thêm chuẩn, thêm dung môi B để loại béo, chiết bằng dung môi A, lọc, lấy dịch chiết, tiêm vào LC-HRMS

Quy trình 3 : Cân khoảng 1 g mẫu hoặc 1 đơn vị mẫu, thêm chuẩn, chiết bằng dung môi A, lọc, lấy dịch chiết, thêm C18 để loại béo, tiêm vào LC-HRMS

Kết quả được so sánh với dịch chiết ban đầu (không thêm GCB, C18 và dung môi B)

Hình 3.3 Quy trình xử lý mẫu

Kết quả khảo sát làm sạch bằng GCB trên nền mẫu nang cứng và nang mềm được thể hiện ở hình 3.4

Hình 3.4 Độ thu hồi của 4 chất nhóm sulfonylure sau khi loại tạp bằng GCB

Nhận xét : Từ hình 3.2 thấy được dùng khoảng 50 mg bột làm sạch GCB thu được độ thu hồi lớn và ổn định nhất Do đó phương pháp phân tích sử dụng 50 mg bột làm sạch GCB để loại tạp màu Với nền mẫu nang cứng có hiện tượng chất phân tích bị hấp phụ bởi GCB, tuy nhiên nghiên cứu hướng tới xây dựng một quy trình chung để sàng lọc nhanh với lượng mẫu lớn, do đó GCB vẫn được lựa chọn để làm sạch mẫu Đối với TPBVSK dạng dầu, các chất béo có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chiết và khả năng làm sạch mẫu Nghiên cứu tiến hành khảo sát dung môi loại béo với 3 loại dung môi là n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate và bột làm sạch C18 được thực hiện trên mẫu trắng thêm chuẩn chất phân tích Sulfonylure tại nồng độ 3,2 mg/kg trên mẫu (tương ứng trên dịch cuối là 80 ng/mL) Sau khi rung siêu âm mẫu với dung môi A, thêm 10 mL dung môi loại béo, lắc đều và ly tâm, sau đó loại lớp dung môi lớp trên và tiến hành các bước như trên Kết quả được thể hiện tại hình 3.5

Hình 3.5 Độ thu hồi của sulfonylure sau khi thêm chất loại béo

Nhận xét : Từ hình 3.3 cho thấy dùng chất làm sạch C18 để loại béo trong nền mẫu nang mềm thu được lượng chất phân tích lớn nhất Do đó C18 được lựa chọn để sử dụng trong nghiên cứu.

Điều kiện phân tích sàng lọc

22 Quá trình phân tích được thực hiện trên thiết bị Ultimate 3000 Q-Exactive Orbitrap của hang Thermo Sientific, phù hợp với đối tượng mẫu phân tích là mẫu TPBVSK có nền mẫu phức tạp Tối ưu hóa năng lượng bắn phá (CE) và điện thế đầu ra (CXP) tự động theo phần mềm của thiết bị tìm điều kiện tối ưu để có được các ion định tính, định lượng của chất phân tích

Khảo sát điều kiện khối phổ: Tiến hành tra cứu mảnh phổ lý thuyết dựa vào CTPT của các hợp chất, sau đó, tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn cỏc ion con phự hợp Tiến hành tiờm 10 àL dung dịch cỏc chất chuẩn vào khối phổ Tiến hành đo mảnh phổ thực nghiệm bằng chế độ Fullscan đối với ion mẹ và all ion fragmentation (AIF) để tìm kiếm ion con của chất phân tích

Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: Lựa chọn cột tách, pha động và khảo sát gradient nhằm tách được tối đa các hợp chất

Phân tích sàng lọc được thiết kế gồm:

- Mẫu trắng: Mẫu có nền tương tự như mẫu phân tích Lựa chọn mẫu TPBVSK không có thành phần và tác dụng hỗ trợ điều trị điều trị tiểu đường Phân tích lặp lại 2 lần

- Mẫu thử: Phân tích lặp lại 2 lần

- Mẫu kiểm soát dương tính: Dung dịch chuẩn 0,25 mg/L

Số liệu được phân tích bằng phần mềm Compound discoverer 3.1 với các bước đánh giá tìm các chất cấm hỗ trợ điều trị tiểu đường như ở hình 3.6

Hình 3.6 Quy trình sàng lọc chất cấm nhóm hỗ trợ điều trị tiểu đường bằng phần mềm Compound Discoverer

Tìm theo khối Áp mzLogic

Tìm Chemspider Điểm đồng vị

Chất nghi ngờ Tìm mzVault

3.3.2 Optimize Screening – Tối ưu hóa sàng lọc

- Full MS-dd-MS 2 : Độ phân giải : 70.000 (FWHM)

Khoảng khối: m/z 220 – 1100 Độ phân giải MS 2 : 17.500 (FWHM)

Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 30%

- AIF: Độ phân giải: 70.000 (FWHM)

Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 40%, 70% và 100%

3.3.3 Khảo sát điều kiện HR-MS phân tích các chất nhóm Sulfonylure a) Tìm kiếm mảnh phổ các chất phân tích

Tham khảo các kết quả đã được công bố, cho thấy các chất hỗ trợ điều trị tiểu đường đều có thể phân tích bằng chế độ ion hóa phun điện tử dương Nghiên cứu tiến hành tiờm 10 àL dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 ng/mL vào thiết bị HRMS đo mảnh phổ thực nghiệm bằng chế độ Fullscan đối với ion mẹ và dd-dependent MS 2 đối với ion con Đồng thời, quét chế độ toàn dải ion con với các ion mẹ lựa chọn được (All ion fragmentation - AIF) để tìm kiếm ion con của chất phân tích Các kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3.Bảng phổ thực tế của các chất giảm glucose máu

TT Tên chất Công thức phân tử

Kết quả trong bảng cho thấy, các ion con thu được của từng chất Sulfonylure dao động từ 5-9 ion, do đó phương pháp đảm bảo độ đặc hiệu Đối chiếu với thư viện mzCloud, ion mẹ của các chất Sulfonylure đều có độ chính xác khối so với ion lý thuyết trong khoảng 5 ppm (5 x 10 -6 ), đạt yêu cầu đặt ra của AOAC[17] b) Tìm kiếm mảnh phổ lý thuyết Đối với các chất Sulfonylure chưa có chất chuẩn nhưng đã có các thông tin về phân mảnh đã được công bố, nghiên cứu tiến hành tra cứu mảnh phổ lý thuyết theo thư viện Mzcloud Sau đó, tiến hành xây dựng bảng phổ lý thuyết của một số chất phân tích để ứng dụng phân tích sàng lọc được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Các mảnh phổ lý thuyết của ion mẹ và ion con của chất chống tiểu đường

TT Tên chất Công thức phân tử

Trên cơ sở đó, tiến hành xây dựng nguồn dữ liệu đối chiếu (thư viện) để phân tích các chất Sulfonylure gồm một số thông tin trong thư viện ở bảng 3.3 – 3.4 Hình 3.7 thể hiện ví dụ về thư viện phổ đã xây dựng được

Hình 3.7 Ví dụ thư viện phổ khối phân giải cao được sử dụng để phân tích sàng lọc và định lượng các chất Sulfonylure

3.4 Thẩm định phương pháp phân tích các chất nhóm Sulfonylure bằng LC-

3.4.1 Thẩm định phương pháp phân tích sàng lọc

Thẩm định độ chọn lọc của phương pháp : phân tích dung dịch chuẩn, dung dịch thêm chuẩn trên nền mẫu thử và dung dịch mẫu trắng Dưới đây là hình ảnh sàng lọc mẫu trắng nền mẫu nang cứng, nang mềm và chất lỏng

Hình 3.8 Hình ảnh sàng lọc mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn

3.4.2 Thẩm định phương pháp phân tích định lượng

Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng ở trên, tiến hành thẩm định phương pháp với các thông số cơ bản sau:

- Độ phù hợp hệ thống

- Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện

3.4.2.1 Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống được đánh giá bằng cách phân tích 6 mẫu chuẩn hỗn hợp trên nền dung môi có nồng độ 100 ng/ml

Kết quả : Cả 4 chất có độ chênh lệch thời gian lưu không quá 5% và chênh lệch diện tích pic không quá 15%, được trình bày trong bảng Sắc ký đồ được thể hiện trong phụ lục

Bảng 3.5 Thời gian lưu các mẫu chuẩn 4 chất nhóm sulfonylure

Mẫu Thời gian lưu (phút)

Glibenclamid Gliclazid Glimepirid Glipizid std_100ppb_01 24,32 23,32 24,74 22,45 std_100ppb_02 23,32 23,32 24,73 22,45 std_100ppb_03 23,32 23,32 24,74 22,45 std_100ppb_04 24,33 23,33 24,74 22,45 std_100ppb_05 24,32 23,32 24,74 22,45 std_100ppb_06 24,33 23,33 24,75 22,45

Bảng 3.6 Diện tích pic các mẫu chuẩn 4 chất nhóm sulfonylure

Diện tích pic Glibenclamid Gliclazid Glimepirid Glipizid std_100ppb_01 26391844,19 12312398,85 17097244,66 23348456,43 std_100ppb_02 26491100,28 13087299,24 17808562,43 22578208,88 std_100ppb_03 26631806,7 12619168,81 17112638,85 22360793,89 std_100ppb_04 31111884,69 15408225,05 20206836,56 27208602,71 std_100ppb_05 27115506,96 13458749,46 17284266,37 23430788,94 std_100ppb_06 29185993,74 14102831,96 18411116,9 25251944,43

Dựa vào bảng 3.2 cho thấy, các chất nhóm Sulfonylure đều có một ion mẹ và 2 ion con trở lên nên số điểm IP > 5 đạt yêu cầu đối với phân tích trên khối phổ phân giải cao Độ chọn lọc của phương pháp phân tích còn được xác định khi phân tích dung dịch chuẩn, dung dịch thêm chuẩn trên nền mẫu thử và dung dịch mẫu trắng Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thêm chuẩn trên nền mẫu thử và dung dịch mẫu trắng của gliclazid được trình bày lần lượt trong hình 3.9, hình 3.10 và hình 3.11

Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn gliclazid 100 ng/ml

Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại nồng độ 100 ng/ml của gliclazid

Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu trắng

Kết quả phân tích cho thấy, mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu chất phân tích, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn có tín hiệu với cùng thời gian lưu 23,32 phút đối với gliclazide

Ngoài ra, khi so sánh phổ đồ của mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn cho thấy đều có ion mẹ và các ion con với tỷ lệ tương đương nhau Hình 3.12 thể hiện phổ khối của mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn tại nồng độ 100 ng/mL của gliclzide

Hình 3.12 Phổ khối của gliclazide của mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn tại nồng độ 100 ng/mL

Vì vậy, phương pháp có độ đặc hiệu cao khi phân tích các chất nhóm sulfonylure

3.4.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Dãy chuẩn làm việc được pha trong dung dịch chiết mẫu TPBVSK trắng Tiến hành pha dãy chuẩn làm việc nồng độ 10, 20, 100, 200, 500 ng/mL và phân tích trên LC-HR/MS Xây dựng đường phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ tương ứng

Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ từ 10 – 500 ng/mL tín hiệu của chất phân tích tỷ lệ tuyến tính với nồng độ với R 2 > 0,99 với độ chệch