TỔNG QUAN
Tổng quan về sibutramin và dẫn xuất của sibutramin
1.1.1 Cấu trúc một số hợp chất từ sibutramin
Bảng 1.1 Cấu trúc và tính chất của sibutramin và dẫn xuất
STT Hợp chất Một số đặc điểm TLTK
Sibutramin Tên IUPAC: 1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-
- Chất rắn, nhiệt độ nóng chảy 191 - 192°C, độ hòa tan trong nước 0,00094g/L, logP = 5,2
Didesmethylsibutramin Tên IUPAC: 1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-3- methylbutan-1-amin
- Trọng lượng phân tử: 251,79 g/mol
Desisobutyl-benzylsibutramin Tên IUPAC: 1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-
Desmethylsibutramin Tên IPPAC: 1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-
1.1.2 Dược động học, dược lực học sibutramin
Cơ chế tác dụng: Đầu tiên, tác dụng rõ nhất là ức chế chọn lọc tái hấp thu trước synap của các chất dẫn truyền thần kinh monoaminrgic serotonin (5-hydroxytryptamin; 5-HT), noradrenalin (NA) và ở mức độ thấp hơn là dopamin tăng cường cảm giác thèm ăn, ức chế hoạt động của các chất dẫn truyền thần kinh này[28] Khả năng giảm trọng lượng cơ thể của sibutramin cũng có thể là do tăng tiêu hao năng lượng Sibutramin tăng tiêu hao năng lượng cơ bản bằng cách kích hoạt MCR-4 [16] Ngoài ra, sibutramin có thể làm tăng sinh nhiệt thông qua hoạt hóa thụ thể β 3 -adrenergic, một tác dụng qua trung gian NA, trong mô mỡ trắng ngoại vi [13] Tác dụng giảm cân của sibutramin phần lớn
4 là do các chất chuyển hóa amin chính (N-desmethylsibutramin) và thứ cấp (N- didesmethylsibutramin) chứ không phải do hợp chất gốc [22]
Tuy nhiên, việc sử dụng sibutramin cũng tiềm ẩn nhiều tác dụng gây hại cho người dùng Từ năm 2002, một số tác dụng phụ về tim mạch (tăng huyết áp, nhịp tim nhanh, rối loạn nhịp tim, nhồi máu cơ tim) đã được báo cáo ở những bệnh nhân điều trị bằng sibutramin [29] Điều này dẫn đến chống chỉ định sử dụng thuốc chống béo phì này ở những bệnh nhân mắc bệnh tim mạch vành, đột quỵ trước đó, suy tim hoặc rối loạn nhịp tim Thử nghiệm kết quả tim mạch Sibutramin (SCOUT) gần đây đã xác nhận rằng những đối tượng mắc bệnh tim mạch từ trước (CVD) điều trị lâu dài (5 năm) bằng sibutramin (10 - 15 mg/ngày) có nguy cơ mắc bệnh nhồi máu cơ tim không tử vong và đột quỵ không tử vong tăng lên đáng kể Cuộc đánh giá của Ủy ban Sản phẩm Thuốc dùng cho Con người kết luận rằng lợi ích của sibutramin như một chất hỗ trợ giảm cân không lớn hơn nguy cơ tim mạch và khuyến nghị đình chỉ cấp phép tiếp thị sibutramin trên toàn EU [28]
1.1.3 Tình hình trộn trái phép và các quy định hiện hành
Tại châu Âu 2.559 hồ sơ thực phẩm bổ sung có vấn đề về chất lượng đã được xác định trong RASFF, một số trong đó [319 (12,5%)] đã được bán trên thị trường để hỗ trợ giảm cân Sibutramin là hoạt chất xếp thứ hai (69 sản phẩm, 21,6%) từ năm 1988 đến năm 2019 [20] Từ tháng 10/2010, FDA (Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ) đã ban hành quyết định cấm lưu hành tất cả sản phẩm có Sibutramin vì dữ liệu thử nghiệm lâm sàng cho thấy nguy cơ đau tim và đột quỵ tăng lên [33] Một nghiên cứu đã báo cáo mối liên quan giữa lượng sibutramin sử dụng và đột tử do tim ở bệnh nhân không có tiền sử bệnh tim mạch vành trước đó [18] Bệnh nhân đã dùng thực phẩm bổ sung thảo dược giảm cân, sibutramin và các chất chuyển hóa của nó (desmethylsibutramin và didesmethylsibutramin) được tìm thấy trong huyết thanh
“Biến chứng ngộ độc Sibutramin cấp tính” được xác định là nguyên nhân gây tử vong Nồng độ sibutramin trong các thực phẩm chức năng giảm cân khác nhau được thu thập ở các nước châu Á thay đổi đáng kể, từ 0,14 đến 781.200 mg/kg Hàm lượng sibutramin cao (5400–781.200 mg/kg) được tìm thấy trong 9 viên nang giảm béo mua từ các cửa hàng trái phép ở Iran Những thực phẩm bổ sung này được sản xuất ở các nước châu Á, bao gồm Trung Quốc, Iran và các nước Đông Nam Á [24]
Các báo cáo về ảnh hưởng sức khỏe nghiêm trọng liên quan đến các chất bổ sung thảo dược đã góp phần nâng cao hiểu biết về tầm quan trọng của việc phát triển một hệ thống kiểm tra phần sản phẩm Trung Quốc đã thông qua Luật An toàn Thực phẩm vào năm 2015, với một hệ thống mới để quản lý các chất bổ sung trong chế độ ăn uống Các sản phẩm “Được phân loại là thực phẩm bổ sung” phải trải qua quá trình thử nghiệm
5 rộng rãi, phê duyệt trước khi đưa ra thị trường và thử nghiệm độc tính trước khi bán [27] Mặc dù việc xây dựng tiêu chuẩn hóa cho các sản phẩm thảo dược đang được phát triển trên toàn thế giới nhưng hiện tại vẫn chưa có các quy định chung Cần phải kiểm soát chặt chẽ các quy định về các sản phẩm giảm béo, bao gồm việc cấp phép, hướng dẫn ghi nhãn và xác minh thành phần để chống lại các hành vi gian lận [19]
Hiện nay, tại Việt Nam, cục Quản lý Dược, bộ Y tế đã ngưng cấp phép nhập khẩu nguyên liệu sibutramin và tiến hành thu hồi các sản phẩm chứa chất này từ năm 2011 [5] Nhưng vẫn phát hiện tình trạng TPBVSK có trộn trái phép nhóm chất này:
➢ Năm 2021, Ban Quản lý An toàn thực phẩm tỉnh Bắc Ninh đã tiến hành triển khai giám sát ô nhiễm thực phẩm theo kế hoạch, trong đó thực hiện giám sát đối với nhóm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, kết quả kiểm nghiệm do Viện Kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia thực hiện phát hiện 06 mẫu sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa chất cấm Sibutramin [31]
➢ Cục An toàn thực phẩm đã ban hành Quyết định số 97/QĐ-ATTP, ngày 04/4/2022, về việc thu hồi sản phẩm không bảo đảm an toàn thực phẩm đối với sản phẩm thực phẩm bổ sung cafe Hoàng Gia [32]
Danh mục chất cấm thực phẩm bảo vệ sức khỏe quy định tại Thông tư số 10/2021/TT- BYT, hiện nay đang có 4 dẫn xuất của sibutramin [3] (Bảng 1.2)
Bảng 1.2 Danh mục các chất cấm thuộc dẫn chất sibutramin
STT Tên chất Tên khoa học
8 Benzyl sibutramin 1-(1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl)-N,N- dimethyl-2-phenylethan-1- amin
25 Desmethylsibutramin 1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-N,3- dimethylbutan-1-amin
30 Didesmethylsibutramin 1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-3- methylbutan-1-amin
Các nghiên cứu xác định sibutramin và dẫn xuất
Trên thế giới đã có rất nhiều phương pháp được phát triển nhằm sàng lọc và định lượng sibutramin và dẫn xuất Từ những phương pháp rất phổ biến như HPLC [4], [9], [6], [12] tới phương pháp ít phổ biến hơn như HPTLC [21] Và cả những phương pháp có độ đặc hiệu cao như sắc ký- khối phổ (Bảng 1.3)
Nghiên cứu của Lê Đình Chi và cộng sự xác định sibutramin bằng HPLC [4] xây dựng giới hạn phỏt hiện là 10 àg/g, giới hạn định lượng là 25 àg/g Trong 34 mẫu phõn tích phát hiện 11 mẫu (32%) chứa chất cấm sibutramin với hàm lượng từ 22,0- 69,2 mg/g
Nghiên cứu của Nguyễn Thái Ngọc Mai và cộng sự xây dựng phương pháp định lượng sibutramin bằng HPLC [9] Kết quả giá trị LOD và LOQ lần lượt là 0,33 mg/kg và 1 mg/kg, phát hiện sibutramin trong 8/10 mẫu với khoảng nồng độ từ 17,51 - 16349,46 mg/kg
Một nhà nghiên cứu ở Thổ Nhĩ Kỳ [12] tiến hành xây dựng 2 phương pháp phân tích HPLC và HPTLC thực hiện so sánh sơ bộ về hàm lượng sibutramine trong các sản phẩm giảm béo Kết quả SB được phát hiện trong ba sản phẩm dưới dạng sản phẩm giảm béo tự nhiên
Các nhà nghiên cứu tại đại học Y Plovdiv đã xây dựng phương pháp phân tích HPTLC để phát hiện SB trong TPBVSK [21] Kết quả xác định LOD, LOQ lần lượt là 0,0765 μg/vết and 0,2318 μg/vết
Bảng 1.3 Tóm tắt một số nghiên cứu về nhóm SB sử dụng khối phổ
Nền mẫu Điều kiện xử lý mẫu Điều kiện sắc ký LOD,
Chiết bằng acetonitril, siêu âm, ly tâm, pha loãng với acetol nitril, lọc với màng PTFE 0,2 àm
- Cột Zorbax C18 (50 mm x 2,1 mm và cỡ hạt 1,8 àm)
- Pha động: pha A (2mM amoni format trong nước chứa 0,05% acid formic) và pha B (2mM amoni format trong methanol chứa 0,05% acid formic) Ban đầu 30% pha B sau tăng lên 90% B ở phút thứ 7
SB, DSB, DDSB lần lượt là 0,3 và 1 ng/mL;
7 và duy trì 2 phút, sau đó chuyển về 30% pha B phút thứ 10
- Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút ng/mL, 0,6 và 2,0 ng/mL
Viên nang, viên nén, trà
Chiết bằng dung môi MeOH:H2O (8 : 1) Siêu âm, ly tâm, lọc qua màng lọc 0,45 àm
- Cột: C18 Phenomenex (100 × 2,1 mm cỡ hạt 1,7μm)
HCOOH; Tốc độ dòng: 0,15 mL/phút
- Chương trình gradient pha động:
LOD của dạng bào chế rắn là
Chiết siêu âm bằng methanol, pha loãng, lọc
- Cột ODS-3 Inertsil (150mm x 2,1 mm; 5 àm)
- Rửa giải đẳng dòng pha động gồm 33%
ACN, 67% dung dịch nước acid trifluoroacetic 0,1% trong 15 phút
- Tốc độ dòng 0,4 mL/ phút, thể tích tiêm 20 àL
Nang cứng, nang mềm, trà túi lọc
Chiết bởi dung môi methanol, sau đó tạp chất được loại bằng carbon hoạt tính (GCB)
- Cột sắc ký C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,5 àm)
- Pha động là gradient của 2 kênh: Kênh A là Acetonitril, kênh B là hỗn hợp ammoni acetate 2 mM + acid formic 0,1%
- Thể tớch tiờm là 10 àL
Mẫu được đưa vào nguồn ESI với tốc độ dòng là 0,4 mL/phút
80% ACN trong nước, lọc qua màng lọc 0,45 àm và dịch lọc được pha loãng 100 lần với 50% ACN /50% nước
- Chương trình gradient : 50% pha A/ 50% pha B
- Tốc độ dũng: 600 àL/ phút
Nghiền mịn, chiết bằng methanol, siêu âm, ly tâm, lọc màng 0,22 àm
- Cột sắc ký: Hypersil Gold (100 mm× 2,1 mm,
- Pha động A là dung dịch nước- acid formic
9 0,15%, B là methanol, chương trình rửa giải gradient: 0 - 2 phút, 70% A giảm còn 5% A;
2 - 6 phút, 5% A; 6 - 6,2 phút, 5% A tăng đến 70% A; 6,2 đến 8 phút, 70% A Tốc độ dòng:
Lí do lựa chọn phương pháp LC-HRMS: Các phương pháp HPLC, HPTLC không phù hợp với nền mẫu phức tạp như trong TPBVSK (khó khăn trong việc loại tạp và nghiên cứu chất phân tích) Về độ đặc hiệu, cả HPLC và HPTLC đều không phải là kĩ thuật có thể dùng để định tính khẳng định, vì UV-Vis không phải là kỹ thuật quang phổ có độ đặc hiệu cao Sự kết hợp sắc ký lỏng – khối phổ là kỹ thuật đặc biệt hữu ích trong việc phân tích các hợp chất kém phân cực, là những chất ít bay hơi hay rất dễ phân hủy bởi nhiệt, không phân tích được bằng sắc ký khí – khối phổ [2, 1] Các mẫu phân tích theo phương pháp có LOD, LOQ tới vài ppb, nhạy hơn nhiều detector khác hàng nghìn lần Trong đó, LC-HRMS có thể sàng lọc cả những chất chưa có chuẩn đối chiếu nhờ so sánh dữ liệu với ngân hàng phổ LC-MS/MS có thể coi là phương pháp đối chứng vì có độ nhạy và độ đặc hiệu đều cao Tuy nhiên vẫn phải có chất chuẩn đối chiếu Mà với các chất cấm, dẫn xuất mới luôn được phát triển thêm nên việc có đầy đủ chất đối chiếu có thể chưa kịp thời Vì vậy, trong nghiên cứu này dùng phương pháp LC-HRMS để sàng lọc và định lượng sibutramin và các dẫn xuất của sibutramin trong TPBVSK hỗ trợ giảm cân.
Tổng quan khối phổ phân giải cao
Chất phân tích được chuyển sang thể khí và ion hoá, tạo thành các ion dương hoặc âm Phương pháp phổ khối dựa trên việc đo trực tiếp tỷ số khối lượng m và điện tích z của ion chất phân tích (m/z) Tỷ số này được trình bày dưới dạng đơn vị khối lượng nguyên tử hay dalton.Tín hiệu tương ứng với một ion là một nhóm các pic tương ứng với phân bố thống kê của các đồng vị khác nhau của ion đó.Từ phổ khối ta có được những thông tin định tính (xác định khối lượng phân tử và thông tin về cấu trúc có được nhờ các mảnh thu được) hay định lượng (dùng chuẩn nội hay chuẩn ngoại) với giới hạn phát hiện trong khoảng từ picomol ( 10 -12 mol) đến femtomol (10 -15 mol) [2]
1.3.2 Máy khối phổ Thermo Fisher Scientific
Hình 1.1 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HR/MS Dionex Ultimate
UHPLC + Q-Exactive Orbitrap MS của hãng Thermo Scientific
Cấu tạo thiết bị khối phổ tham khảo từ nhà sản xuất và nghiên cứu [15]:
Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo bộ phận khối phổ
- Bộ nguồn ion hóa ESI dương: nguồn ion hóa phun điện tử
- Bộ phận phân tích khối: Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi đến bộ phận phát hiện
- Bộ phân tích khối tứ cực kết nối orbitrap
- C-trap : tiêu tán động năng của ion để đưa các ion vào bộ phận orbitrap
- HCD : Các ion có thể qua khỏi C-trap vào và va chạm với khí Nito trong HCD tạo thành các phân mảnh nhỏ hơn Sau đó chúng được chuyển trở lại C-trap và đưa vào bộ phận Orbitrap để phát hiện phổ khối
Tại bộ phân tích khối, tứ cực sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định đi vào bẫy ion tại orbitrap Có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực
Orbitrap là máy phân tích khối lượng bẫy ion bao gồm hai điện cực bên ngoài và một điện cực trung tâm, cho phép nó hoạt động như một máy phân tích và máy dò Các ion đi vào Orbitrap được giữ lại thông qua "sự ép điện động", sau đó chúng dao động xung quanh điện cực trung tâm và ở giữa hai điện cực bên ngoài Các ion khác nhau dao động ở các tần số khác nhau, dẫn đến sự phân tách của chúng Bằng cách đo tần số dao động do các ion gây ra trên các điện cực bên ngoài, phổ khối của các ion thu được bằng cách sử dụng tính năng phát hiện dòng điện hình ảnh
ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, chất chuẩn
- Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HR/MS gồm sắc ký lỏng siêu hiệu năng Ultimate 3000 kết nối với khối phổ Q-exactive Plus (Thermo Scientific, Mỹ)
- Cột sắc ký pha đảo BEH C18 (100 mm x 1,7 àm x 2,1 mm) và tiền cột, Waters
- Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)
- Cân kỹ thuật, chính xác 0,01 g (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)
- Máy đồng nhất mẫu (Phillips, Hà Lan)
- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 vòng/phút đối với ống ly tâm
- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 13000 vòng/phút đối với ống ly tâm
- Máy lắc xoáy vortex (IKA, Đức)
- Máy rung siêu âm (Elma, Đức)
- Bình định mức các loại: 5 mL, 10 mL, 50 mL và 100 mL
- Ống ly tâm nhựa 15 mL có nắp kín
- Ống ly tâm nhựa 2 mL có nắp kín
- Lọ đựng mẫu 1,8 mL có nắp kín
- Màng lọc mẫu, kớch thước lỗ 0,2àm
- Màng lọc dung mụi,kớch thước lỗ 0,45àm
- Sibutramin (hãng: TRC, số lô: 25-GHZ-42-1, độ tinh khiết:98%)
- Desmethylsibutramin hydroclorid (hãng: LGC, số lô: 119624, độ tinh khiết: 98%)
- Didesmethylsibutramin (hãng: TRC, số lô: 5-AKS-96-2, độ tinh khiết:98%)
- Desisobutyl-benzylsibutramin (hãng: TRC, số lô: 1-THT-94-4 , độ tinh khiết: 98%)
Cách pha dung dịch chuẩn
- Dung dịch chất chuẩn gốc 1000 àg/mL: Cõn chớnh xỏc khoảng 10 mg cỏc chất chuẩn vào cốc cân 25 mL trên cân phân tích có độ chính xác đến 0,01 mg Hòa tan bằng MeOH và chuyển vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch và lắc đều Bảo quản dung dịch ở 2 ÷ 8 º C
- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 àg/mL: Dựng micropipet hỳt chớnh xỏc
250 àL cỏc dung dịch chuẩn gốc cho vào bỡnh định mức 25 mL, định mức đến vạch bằng MeOH và lắc đều Bảo quản dung dịch ở 2 ÷ 8 º C
Hóa chất dung môi khác
Nước được sử dụng cho thiết bị là nước đề ion, sử dụng cho quá trình chuẩn bị mẫu là nước cất 2 lần
- Các dung môi là loại tinh khiết dùng cho phân tích LC-MS mua từ Merck của Đức: Methanol, Acetonitril, Acid formic, Acid acetic, Ammoni format, n- Hexan Diethyl ete, Ethyl acetate
- Bột làm sạch C18, cỡ hạt 40 àm, Merck (Đức)
- Bột carbon graphit (GCB), Merck (Đức)
Cách pha các dung dịch dùng trong thí nghiệm:
- Dung dịch 10 mM amoniformat và 0,1 % acid formic trong nước: Hòa tan 0,63 g amoniformat và 1 mL acid formic vào bình định mức 1000 mL, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần
- Dung dịch 10 mM amoniformat và 0,1 % acid formic trong acetonitril: Hòa tan 0,63 g amoniformat và 1 mL acid formic vào bình định mức 1000 mL, định mức tới vạch bằng acetonitril
- Dung dịch acid acetic 0,1% trong acetonitril: Hút 1 mL acid acetic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, lắc đều
- Dung dịch acetonitril: Nước (50:50, v/v): Đong 500 mL acetonitril và 500 mL nước vào bình 1000 mL, đậy nắp và lắc đều
- Dung dịch acetonitril: Nước (30:70, v/v): Đong 300 mL acetonitril và 700 mL nước vào bình 1000 mL, đậy nắp và lắc đều
- Dung dịch acid formic 0,1%: Hút 1 mL acid formic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, đậy nắp và lắc đều
- Chất làm sạch: Bột C18, bột GCB
Mẫu phân tích: Các mẫu TPBVSK có tác dụng hỗ trợ giảm cân được mua tại các cửa hàng thuốc trên địa bàn thành phố Hà Nội hoặc các mẫu gửi xét nghiệm tại Viện vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia bao gồm dạng nang cứng, nang mềm
14 Mẫu nền là mẫu TPBVSK được mua trên thị trường đã được xác định là không chứa
SB và dẫn xuất Thông tin về sản phẩm như sau:
- Mẫu nền nang cứng: chứa cao khô lá sen, trạch tả, giảo cổ lam, bứa, thảo quyết minh
- Mẫu nền nang mềm chứa cao khô trà xanh, sơn tra lá sen, cafein, chitosan.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu
- Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích sàng lọc
- Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích định lượng
- Thẩm định quy trình phân tích
- Phân tích mẫu thực tế trên thị trường bằng phương pháp được xây dựng
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu
Chuẩn bị mẫu sơ bộ
Mẫu viên nang cứng được xay nghiền và trộn đều bằng máy đồng nhất mẫu
Mẫu viên nang mềm được tách bỏ phần vỏ nang, lấy phần ruột trộn đều
Quy trình xử lý mẫu
Trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trước đây về kỹ thuật xử lý mẫu chiết các chất cấm trong nền mẫu TPBVSK [10, 6]:
Thực hiện trên nền mẫu nền thêm chuẩn 80 ppb dung dịch chuẩn hỗn hợp, lượng chuẩn thờm: 200 àL x dd chuẩn trung gian 10 ppm Chiết mẫu và định mức 25 mL bằng các loại dung môi khác nhau, đồng thời tiến hành khảo sát 3 quy trình làm sạch mẫu khác nhau
➢ Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết
➢ Khảo sát và lựa chọn điều kiện làm sạch: loại béo bằng dung môi, làm sạch bằng bột cacbon hoạt tính GCB, làm sạch bằng C18
Quy trình chung xử lý mẫu được trình bày ở hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chung chiết mẫu TPBVSK
➢ Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng nền mẫu
Pha chuẩn trên dung dịch mẫu nền đã xử lý theo quy trình và đường chuẩn dung môi để đánh giá
Cách tính ảnh hưởng nền mẫu theo công thức:
Trong đó: a là hệ số góc của đường chuẩn trên nền dung môi, 𝑎 ′ là hệ số góc của đường chuẩn trên nền mẫu đánh giá ảnh hưởng nền
Yêu cầu: ME < 20% theo quy định AOAC 2016 [11]
2.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích sàng lọc
Khảo sát điều kiện khối phổ: Tiến hành tra cứu mảnh phổ lý thuyết dựa vào CTPT của các hợp chất, sau đó, tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn cỏc ion con phự hợp Tiến hành tiờm 1 àL dung dịch cỏc chất chuẩn vào khối phổ Tiến hành đo mảnh phổ thực nghiệm bằng chế độ Fullscan đối với mảnh mẹ và all ion fragmentation (AIF) để tìm kiếm mảnh con của chất phân tích
16 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: Lựa chọn cột tách, pha động và khảo sát gradient nhằm tách được tối đa các hợp chất
2.3.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký khối phổ
Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HR/MS Dionex Ultimate UHPLC kết hợp Q-Exactive Orbitrap MS của hãng Thermo Scientific được kết nối với nguồn thư viện chất từ mzCloud, Chemspider, Masslist, … có thể sàng lọc và xác định các hợp chất chưa biết với độ chính xác khối nhỏ hơn 5ppm
Lựa chọn mảnh phổ theo thư viện HRMS hoặc các tài liệu tham khảo
Các điều kiện phân tích định lượng được thiết lập như sau:
- Nguồn ion hóa: ESI dương
- Cột phõn tớch: BEH C18 (100 mm x 1,7 àm x 2,1 mm) và tiền cột của Waters
- Chế độ khối phổ: Với MS sử dụng chế độ quét toàn dải (full scan) và AIF với 3 giá trị năng lượng va chạm tương đối là 40%, 70%, 100% (NCE).
- Độ phân giải: MS 35000 (FWHM)
- Độ chính xác khối: Cài đặt ở 5 ppm
- Khảo sát gradient pha động gồm 2 thành phần kênh A và kênh B
+ Kênh A: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong nước
+ Kênh B: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong MeOH, ACN (1:1, v/v)
2.3.4 Thẩm định phương pháp Đối với phương pháp định lượng, tiến hành thẩm định, đánh giá các thông số sau: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại, độ thu hồi Đánh giá kết quả thẩm định với quy định của AOAC và các quy định khác của châu Âu [11]
2.3.4.1 Độ phù hợp của hệ thống Độ phù hợp của hệ thống là phép thử chứng minh sự ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn tại cùng nồng độ Ghi lại sắc ký đồ, xác định các thông số diện tích pic, thời gian lưu chất phân tích Sự phù hợp hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích
Yêu cầu: RSD của thời gian lưu ≤ 2 %, RSD của diện tích pic ≤ 5%
Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu nền, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn
Phương pháp có tính chọn lọc cao đối với chất phân tích khi:
- Không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu nền
- Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn phải có tính hiệu chất phân tích
- Thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn không lệch quá 5%
- Đạt số điểm nhận dạng IP theo tiêu chuẩn EC 657/2002 của Châu Âu [14] 2.3.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N) Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) Thêm chuẩn với các mức nồng độ giảm dần các chất nhóm SB vào mẫu TPBVSK không chứa chất phân tích Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp
LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)
LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)
2.3.4.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Pha các dung dịch chuẩn trên dịch sau khi xử lý của mẫu nền Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo 7 điểm chuẩn có nồng độ từ giá trị định lượng Sau đó, lấy tối thiểu 5 điểm nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó, vẽ đường biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ Đánh giá đường chuẩn dựa vào R 2 ≥0.99 và độ chệch các điểm của đường chuẩn không quá 15% theo công thức:
Trong đó: ∆i : Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn
Ct Nồng độ tính ngược lại theo đường chuẩn của các điểm chuẩn
Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn 2.3.4.5 Độ lặp lại và độ thu hồi Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu nền thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau là (n = 6) và tính toán kết quả theo các công thức sau:
18 Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD(%)
Trong đó: xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i”
: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm. n : Số lần thử nghiệm Độ thu hồi: R(%) = 𝐶 𝐶 𝑐 100 Trong đó:
R: Độ thu hồi (%) C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu nền thêm chuẩn
Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Bảng 2.1 Độ lặp lại và độ thu hồi được chấp nhận theo AOAC 2016
Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD % Độ thu hồi
2.3.5.1 Sàng lọc SB và dẫn xuất SB Áp dụng phương pháp đã xây dựng để sàng lọc các hợp chất nhóm chất cấm hỗ trợ giảm cân có thể có mặt trong các sản phẩm TPBVSK Phần lớn các chất đều đã có trong thư viện phổ được xây dựng thông qua nghiên cứu
2.3.5.2 Phân tích định lượng mẫu thực Đường chuẩn trên nền mẫu thực được sử dụng để tính kết quả cho các mẫu tương ứng Căn cứ vào đường chuẩn tương quan giữa diện tích pic và nồng độ, căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau:
V: Thể tích dung môi chiết (mL)
C: Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đường chuẩn (ng/mL) k: Hệ số pha loãng m: Khối lượng của mẫu phân tích (g)
X: Hàm lượng chất cấm trong mẫu thử (μg/kg)
2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả phân tích sàng lọc được xử lý bằng phần mềm Compound discoverer 3.1 và kết quả định lượng được xử lý bằng phần mềm TraceFinder 4.1 của thiết bị LC- HRMS Ultimate 3000 Q-exactive hãng Thermo Scientific Các số liệu phân tích được xử lý bằng phần mềm Microsolf Excel 2016
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu
3.1.1 Lựa chọn điều kiện định lượng để khảo sát
- Cột BEH C18 (100 mm x 1,7 àm x 2,1 mm) và tiền cột tương ứng của hóng Waters
• Kênh A: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong nước
• Kênh B: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong acetonitril: methanol (1:1, v/v)
• Chương trình theo chế độ gradient: nồng độ pha động B được giữ ở mức 5% trong 15 phút đầu, tăng lên 40% trong 7 phút, tăng lên 60 % trong 4 phút và sau đò giảm xuống 5% trong 3 phút, tổng thời gian là 29 phút
• Chế độ ion hóa dương
• Tốc độ khí mang: 30 đơn vị
• Tốc độ khí va chạm: 10 đơn vị
• Độ phân giải MS: 35.000 (FWHM)
• Độ phân giải MS 2 : 17.500 (FWHM)
• Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 30%
• Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 40%, 70%, 100%
Khảo sát 4 hệ dung môi: acetonitril, methanol, ethanol, aceton Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu nền thêm hỗn hợp chuẩn chất phân tích nhóm SB
21 Tham khảo nghiên cứu [7]: cùng đối tượng phân tích là các hợp chất SB trên nền mẫu tương tự: viên nang cứng và nang mềm, chọn dung môi methanol cho hiệu suất chiết cao nhất
3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện loại béo
Với các TPBVSK dạng dầu như viên nang mềm, cần thêm bước loại chất béo để tránh ảnh hưởng hiệu suất chiết và khả năng làm sạch mẫu Khảo sát trên nền mẫu nền thêm chuẩn chất phân tích nhóm SB 2mg/kg mẫu (tương ứng dịch cuối là 80 ng/mL) Tiến hành khảo sát 3 loại dung môi loại béo: n-hexan, diethyl ete, ethyl acetat và một mẫu không loại béo Thêm dung môi loại béo vào mẫu, rung siêu âm, ly tâm, gạn bỏ dung môi và tiến hành theo quy trình chiết mẫu Kết quả khảo sát dung môi thu được tại hình 3.1
Hình 3.1 Sơ đồ khảo sát dung môi loại béo
Nhận xét: Độ thu hồi của chất phân tích giảm rất nhiều sau khi loại béo bằng dung môi Vì vậy, tiến hành xử lý mẫu không có bước loại béo bằng dung môi
3.1.4 Khảo sát và lựa chọn bột làm sạch
Tiến hành khảo sát GCB và C18, thêm 50 mg chất hấp phụ vào dịch chiết mẫu thêm chuẩn, lắc, ly tâm thu lấy dịch Kết quả độ thu hồi thu được ở hình 3.2
Không loại béo Diethyl ete Ethyl acetat n-hexan
Hình 3.2 Sơ đồ khảo sát chất hấp phụ
Nhận xét: Bột C18 có khả năng làm sạch tốt hơn GCB, GCB dễ hấp phụ chất phân tích làm giảm độ thu hồi Chọn làm sạch bằng bột C18
Quy trình xử lý mẫu được lựa chọn trình bày ở Hình 3.3
Hình 3.3 Sơ đồ quy trình chiết mẫu TPBVSK nhóm SB
Xây dựng điều kiện phân tích sàng lọc
Nghiờn cứu tiến hành tiờm 10 àL dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 ng/mL vào thiết bị HR-
MS đo mảnh phổ thực nghiệm bằng chế độ Fullscan đối với mảnh mẹ và dd-dependent
MS 2 đối với mảnh con Đồng thời, quét chế độ toàn dải ion con với các ion mẹ lựa chọn được (All ion fragmentation - AIF) để tìm kiếm mảnh con của chất phân tích
• Chế độ ion hóa phun điện tử dương
• Tốc độ khí mang: 30 đơn vị
• Tốc độ khí va chạm: 10 đơn vị
• Độ phân giải MS: 35.000 (FWHM)
• Độ phân giải MS 2 : 17.500 (FWHM)
• Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 30%
• Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 40%, 70%, 100%
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát mảnh phổ ion mẹ và ion con của chất chuẩn nhóm SB
Nhận xét: Các mảnh ion của nhóm SB (hình 3.4) thu được đều có độ chính xác khối so với mảnh lý thuyết trên mzCloud nằm trong khoảng 5ppm, các chất còn lại có mảnh với khối m/z gần với các mảnh được công bố trong các bài nghiên cứu về dẫn chất của SB
Hình 3.4 Phổ khối và mảnh phổ của mẫu chuẩn nhóm SB
- Cột BEH C18 (100 mm x 3,5 àm x 2,1 mm)
- Tốc độ dòng: 0,2 mL/phút Hệ dung môi pha động: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong kênh A: dung môi nước, kênh B: acetonitril
Hình 3.5 Gradient pha động chạy sàng lọc
Xây dựng điều kiện phân tích định lượng
3.3.1 Khảo sát điều kiện LC a) Lựa chọn cột tách
Các hợp chất giảm cân là các hợp chất có tính phân cực từ trung bình đến yếu do đó cột sắc ký pha đảo được sử dụng Trên cơ sở các nghiên cứu đã công bố, cột tách sắc ký được sử dụng là cột C18, phương pháp phân tích được thực hiện trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp nên có thể sử dụng cột có cỡ hạt nhồi nhỏ Đồng thời, kích thước cỡ hạt cột càng nhỏ, hiệu quả phân tách các chất phân tích tốt Vì vậy, nghiên cứu sử dụng cột BEH C18 (100 mm x 1,7 àm x 2,1 mm) và tiền cột tương ứng của hóng Waters b) Lựa chọn điều kiện pha động
Phần lớn các nghiên cứu đã công bố [7], [10], [26] sử dụng hệ dung môi gồm nước và acetonitril hoặc hỗn hợp acetonitril: methanol (1:1) có bổ sung thêm các chất tạo ion như acid formic 0,1% hoặc kết hợp giữa acid formic 0,1% và ammonium format
10 mM [7], Để đánh giá hiệu quả của các hệ dung môi, nghiên cứu tiến hành khảo sát các hệ dung môi khác nhau và lựa chọn được hệ dung môi pha động gồm:
- Kênh A: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong nước
- Kênh B: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong acetonitril: methanol (1:1, v/v)
Cần một chương trình gradient để phân tách các chất nhóm SB, đặc biệt với nền mẫu TPBVSK rất phức tạp Chế độ phân tích ở khối phổ là fullscan sẽ quét tất cả các chất phân tích trong dịch chiết dẫn tới các tạp chất sẽ ảnh hưởng đến tín hiệu của chất phân tích Do vậy, sau khi cố định điều kiện cột tách và pha động, chương trình gradient pha động được khảo sát để tách các chất nhóm giảm cân
Bảng 3.2 Chương trình gradient tối ưu phân tích chất nhóm SB
Tốc độ dòng (mL/phút)
Nhận xét: Các chất nhóm SB có công thức cấu tạo tương tự nhau và chỉ khác nhau ở các nhóm thế, nên nhóm SB có nhiều chất trùng nhau mảnh mẹ và 1 số mảnh con Để phân biệt các chất phân tích, bên cạnh sự phân tách về phổ HRMS, phương pháp cần có sự phân tách sắc ký Từ tham khảo các nghiên cứu, đề tài đã công bố, nghiên cứu đã khảo sát các điều kiện gradient khác nhau và lựa chọn điều kiện gradient tối ưu (Bảng 3.2), do có khả năng phân tách các chất trùng mảnh tốt Với điều kiện gradient nêu trên, thời gian lưu các chất nhóm SB được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Thời gian lưu các chất
STT Tên chất Mảnh mẹ (m/z) Thời gian lưu (phút)
Kết quả: Có thể tách được 4 chất dựa trên sự khác nhau về tỷ số khối và thời gian lưu
Hình 3.6 Sắc ký đồ SB, DSB, DDSB, DIBS
3.3.2 Lựa chọn điều kiện khối phổ
• Chế độ ion hóa dương
• Tốc độ khí mang: 30 đơn vị
• Tốc độ khí va chạm: 10 đơn vị
• Độ phân giải MS: 35.000 (FWHM)
• Độ phân giải MS 2 : 17.500 (FWHM)
• Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 30%
• Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 40%, 70%, 100%
3.3.3 Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng nền mẫu
Pha các đường chuẩn của các chất phân tích trong nền dung môi và nền mẫu từ nồng đồ 30 ppb đến 200ppb, thu được các phương trình đường chuẩn Bảng 3.4
Bảng 3.4 Phương trình đường chuẩn của các chất trong nền nang cứng, nang mềm và dạng lỏng
Dung môi Nền nang cứng Nền nang mềm
Nhận xét: từ kết quả của bảng 3.4, ảnh hưởng nền mẫu đều có giá trị ME < 20% theo quy định AOAC 2016 [11] Do đó có thể dùng đường chuẩn trên nền dung môi để tính toán các kết quả.
Thẩm định phương pháp phân tích định lượng
3.4.1 Độ phù hợp của hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn 4 chất SB, DSB, DDSB, DIBS nồng độ 100ppb vào hệ thống LC-HRMS Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic Kết quả phân tích trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5 Độ phù hợp hệ thống
Chất phân tích SB DSB DDSB DIBS
RSD của thời gian lưu dao động 0,02% - 0,03% (≤ 2%)
RSD của diện tích pic dao động 1,40% - 4,45% (≤ 5%)
Kết luận: Như vậy hệ thống đáp ứng yêu cầu theo AOAC 2016 [11]
Dựa vào bảng 3.1 cho thấy, các chất nhóm SB đều có một mảnh mẹ và ít nhất 2 mảnh con trở lên nên điểm IP đạt theo yêu cầu EC với phương pháp phân tích HR-MS Chuẩn bị mẫu nền và mẫu nền thêm chuẩn trên nền nang cứng và nang mềm, mẫu chuẩn trong dung môi Xử lý mẫu và tiến hành phân tích với điều kiện đã xây dựng Kết quả phân tích mẫu nền, dung dịch chuẩn, dung dịch thêm chuẩn nền nang cứng, dung dịch thêm chuẩn nền nang mềm ở hình 3.7 - 3.10
Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu nền, mẫu chuẩn, mẫu nền nang cứng thêm chuẩn, mẫu nền nang mềm thêm chuẩn của SB
Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu nền, mẫu chuẩn, mẫu nền nang cứng thêm chuẩn, mẫu nền nang mềm thêm chuẩn của DIBS
Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu nền, mẫu chuẩn, mẫu nền nang cứng thêm chuẩn, mẫu nền nang mềm thêm chuẩn của DSB
Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu nền, mẫu chuẩn, mẫu nền nang cứng thêm chuẩn, mẫu nền nang mềm thêm chuẩn của DDSB
Nhận xét: trên sắc ký đồ mẫu nền không xuất hiện tín hiệu chất phân tích, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn có tín hiệu chất phân tích với thời gian lưu lệch nhau không quá 0,1 phút Phương pháp đạt chỉ tiêu độ đặc hiệu theo tiêu chí AOAC 2016 [11]
3.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Thêm chuẩn hỗn hợp SB 100ppb với lượng giảm dần vào 1g mẫu TPBVSK không chứa chất phân tích Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp Sau khi xác nhận được LOD, LOQ sẽ được tính dựa trên công thức: LOQ = 3,3 LOD
Phương pháp có LOD, LOQ các chất được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6 Giá trị LOD, LOQ các chất phân tích
3.4.4 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Do ảnh hưởng của nền mẫu không đáng kể, đường chuẩn làm việc được pha trong dung môi MeOH Tiến hành pha dãy chuẩn làm việc nồng độ 20; 30; 50; 100; 200 ng/mL và phân tích trên LC-HR/MS Xây dựng đường phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ tương ứng trên Excel
Hình 3.11 Đường chuẩn các chất phân tích SB, DDSB, DIBS, DSB
Từ phương trình đường chuẩn, ta tính độ chệch các điểm chuẩn, kết quả trong bảng 3.7
Bảng 3.7 Độ chệch của các điểm chuẩn
C tìm lại (ppb) Độ chệch (%)
C tìm lại (ppb) Độ chệch (%)
C tìm lại (ppb) Độ chệch (%)
Nhận xét: Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích và nồng độ từ 30 - 200 ng/mL với R 2 > 0,99 (Hình 3.9) và độ chệch
