phạm minh quân nghiên cứu phương pháp sàng lọc và định lượng sibutramin và các dẫn xuất của sibutramin trong tpbvsk hỗ trợ giảm cân bằng lc hrms

TRONG TPBVSK HỖ TRỢ GIẢM CÂN

BẰNG LC-HRMS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM MINH QUÂN

Mã sinh viên: 1901571

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH LƯỢNG SIBUTRAMIN VÀ CÁC DẪN XUẤT CỦA SIBUTRAMIN

TRONG TPBVSK HỖ TRỢ GIẢM CÂN

BẰNG LC-HRMS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS TS Phạm Thị Thanh Hà 2 NCS ThS Cao Công Khánh

Nơi thực hiện:

Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2024

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Thị Thanh Hà và NCS Cao Công Khánh đã giúp đỡ, tạo điều kiện giúp em được thực hiện khóa luận này Em chân thành cảm ơn quý thầy, quý cô trong khoa Hóa phân tích và kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm em học tập Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học tập không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quý báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin

Em trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập tại công ty Em xin cảm ơn ThS Mạc Thị Thanh Hoa, DS Trần Trung Thành cũng như các anh chị tại Khoa Nghiên cứu phát triển Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu tại Khoa

Cuối cùng em kính chúc quý thầy cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý Đồng kính chúc các cô, chú, anh, chị trong viện luôn dồi dào sức khỏe

và đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2024

Sinh viên

Phạm Minh Quân

1.1.2 Dược động học, dược lực học sibutramin 3

1.1.3 Tình hình trộn trái phép và các quy định hiện hành 4

1.2 Các nghiên cứu xác định sibutramin và dẫn xuất 6

1.3 Tổng quan khối phổ phân giải cao 9

1.3.1 Nguyên tắc 9

1.3.2 Máy khối phổ Thermo Fisher Scientific 10

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, chất chuẩn 12

2.1.1 Thiết bị 12

2.1.2 Dụng cụ 12

2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn 12

2.1.4 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 14

2.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích sàng lọc 15

2.3.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký khối phổ 16

2.3.4 Thẩm định phương pháp 16

2.3.5 Phân tích mẫu thực 19

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 19

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 20

3.1.1 Lựa chọn điều kiện định lượng để khảo sát 20

3.1.2 Lựa chọn dung môi 20

3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện loại béo 21

3.1.4 Khảo sát và lựa chọn bột làm sạch 21

3.2 Xây dựng điều kiện phân tích sàng lọc 22

3.2.1 Điều kiện MS 22

3.2.2 Điều kiện LC 25

3.3 Xây dựng điều kiện phân tích định lượng 26

3.3.1 Khảo sát điều kiện LC 26

3.3.2 Lựa chọn điều kiện khối phổ 27

3.3.3 Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng nền mẫu 28

3.4 Thẩm định phương pháp phân tích định lượng 29

3.4.1 Độ phù hợp của hệ thống 29

3.4.2 Độ đặc hiệu 30

3.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 33

3.4.4 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 33

3.4.5 Độ lặp lại và độ thu hồi 36

3.5 Phân tích các mẫu trên thị trường 37

GCB Graphitized carbon black Carbon hoạt hóa

HESI Heated Electrospray Ionisation Nguồn ion hóa phun điện tử gia

nhiệt

HPLC High Performacnce Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC High Perfromance Thin Layer

Chromatography Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

HR-MS High resolution - Mass

spectrometry Khối phổ phân giải cao

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn

UPLC Ultra Performacnce Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

DANH MỤC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HR/MS Dionex Ultimate

UHPLC + Q-Exactive Orbitrap MS của hãng Thermo Scientific 10

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo bộ phận khối phổ 10

Hình 1.3 Cấu tạo orbitrap 11

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chung chiết mẫu TPBVSK 15

Hình 3.1 Sơ đồ khảo sát dung môi loại béo 21

Hình 3.2 Sơ đồ khảo sát chất hấp phụ 22

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình chiết mẫu TPBVSK nhóm SB 22

Hình 3.4 Phổ khối và mảnh phổ của mẫu chuẩn nhóm SB 25

Hình 3.5 Gradient pha động chạy sàng lọc 25

Hình 3.11 Đường chuẩn các chất phân tích SB, DDSB, DIBS, DSB 35

Hình 3.12 Sắc ký đồ và phổ khối chạy sàng lọc mẫu dương tính 39

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc và tính chất của sibutramin và dẫn xuất 2

Bảng 1.2 Danh mục các chất cấm thuộc dẫn chất sibutramin 5

Bảng 1.3 Tóm tắt một số nghiên cứu về nhóm SB sử dụng khối phổ 6

Bảng 2.1 Độ lặp lại và độ thu hồi được chấp nhận theo AOAC 2016 18

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát mảnh phổ ion mẹ và ion con của chất chuẩn nhóm SB 23

Bảng 3.2 Chương trình gradient tối ưu phân tích chất nhóm SB 26

Bảng 3.3 Thời gian lưu các chất 27

Bảng 3.4 Phương trình đường chuẩn của các chất trong nền 28

Bảng 3.5 Độ phù hợp hệ thống 29

Bảng 3.6 Giá trị LOD, LOQ các chất phân tích 33

Bảng 3.7 Độ chệch của các điểm chuẩn 35

Bảng 3.8 Độ lặp lại, độ thu hồi 36

Bảng 3.9 Kết quả sàng lọc nhóm SB 38

Bảng 3.10 Mảnh ion mẫu không có chuẩn phát hiện được 39

Bảng 3.11 Kết quả định lượng nhóm SB 40

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) hỗ trợ giảm cân được sử dụng phổ biến khi số người mắc béo phì ngày càng tăng cao Nhiều người hy vọng giải quyết vấn đề này bằng cách sử dụng thực phẩm bổ sung, vì không cần kê đơn, đặc biệt là các TPBVSK có nguồn gốc tự nhiên vì được coi là không gây tổn hại cho sức khỏe Các thực phẩm này kiểm soát quá trình chuyển hóa lipid và carbohydrat, giảm cảm giác thèm ăn (tương tác với hệ thần kinh trung ương) và quá trình tạo mỡ, ảnh hưởng đến

hoạt động của hệ vi sinh vật đường ruột và tăng tiêu hao năng lượng

Bên cạnh đó thực phẩm hỗ trợ giảm cân cũng lại có những tác dụng phụ đáng lo ngại cho người dùng như gây mất ngủ, bệnh tiểu đường tuyp II, các vấn đề về tim mạch, do tiểm ẩn nguy cơ trộn trái phép các thuốc hóa dược trong đó có sibutramin và các dẫn xuất của nó [3, 4, 7, 8] Sibutramin là một trong số ít thuốc điều trị béo phì đã được công nhận và chứng minh rõ ràng [25]

Nhằm đáp ứng yêu cầu quản lý an toàn đối với các sản phẩm TPBVSK, ngày 30/6/2021, Bộ Y tế đã ban hành Thông tư số 10/2021/TT-BYT ngày quy định Danh mục chất cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe trong đó có sibutramin và các dẫn xuất của sibutramin [3] Hiện nay ở Việt Nam các nghiên cứu về phương pháp định lượng các chất cấm trong nhóm giảm cân nói chung và các chất thuộc nhóm SB nói riêng đã có rất nhiều Các phương pháp nghiên cứu đa dạng như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [4], [6], [9], [12], sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [21] hay sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS) [7], [26] Nghiên cứu này sử dụng phương pháp sắc ký lỏng phân giải cao (LC -HRMS) có detector là khối phổ với độ phân giải cao, độ đặc hiệu cao nên phù hợp trong công tác sàng lọc các chất, đặc biệt trong thực phẩm, dược liệu là những mẫu phân tích có nền mẫu phức tạp Ưu điểm vượt trội của HRMS là xác định danh tính chất phân tích mà không cần chất chuẩn nhờ kết nối thư viện phổ trên toàn thế giới, đồng thời vẫn có thể định lượng đối với các chất đã có chuẩn đối chiếu Nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp sàng lọc và định lượng sibutramin và các dẫn xuất của sibutramin trong TPBVSK hỗ trợ giảm cân bằng LC-HRMS” với mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp sàng lọc sibutramin và các dẫn xuất của sibutramin trong TPBVSK hỗ trợ giảm cân bằng LC-HRMS

2 Xây dựng phương pháp định lượng SB và 3 dẫn xuất của SB (DSB, DDSB, DIBS) trong TPBVSK hỗ trợ giảm cân bằng LC-HRMS

3 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích một số chế phẩm trên thị trường

2

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về sibutramin và dẫn xuất của sibutramin

N,N,3-trimethylbutan-1-amin

- Trọng lượng phân tử: 279,8 g/mol

- Chất rắn, nhiệt độ nóng

chảy 191 - 192°C, độ hòa tan trong nước 0,00094g/L,

logP = 5,2

[34]

2

Didesmethylsibutramin Tên IUPAC: 1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-3-

methylbutan-1-amin

- Trọng lượng phân tử: 251,79

g/mol

[35]

3 3

Desisobutyl-benzylsibutramin Tên IUPAC: 1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-

N,N-dimethyl-2-phenylethanamin

- Trọng lượng phân tử: 313,9 g/mol

[37]

4

Desmethylsibutramin Tên IPPAC: 1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-

N,3-dimethylbutan-1-amin

- Trọng lượng phân tử: 265,82 g/mol

4 là do các chất chuyển hóa amin chính (N-desmethylsibutramin) và thứ cấp (N-didesmethylsibutramin) chứ không phải do hợp chất gốc [22]

Tuy nhiên, việc sử dụng sibutramin cũng tiềm ẩn nhiều tác dụng gây hại cho người dùng Từ năm 2002, một số tác dụng phụ về tim mạch (tăng huyết áp, nhịp tim nhanh, rối loạn nhịp tim, nhồi máu cơ tim) đã được báo cáo ở những bệnh nhân điều trị bằng sibutramin [29] Điều này dẫn đến chống chỉ định sử dụng thuốc chống béo phì này ở những bệnh nhân mắc bệnh tim mạch vành, đột quỵ trước đó, suy tim hoặc rối loạn nhịp tim Thử nghiệm kết quả tim mạch Sibutramin (SCOUT) gần đây đã xác nhận rằng những đối tượng mắc bệnh tim mạch từ trước (CVD) điều trị lâu dài (5 năm) bằng sibutramin (10 - 15 mg/ngày) có nguy cơ mắc bệnh nhồi máu cơ tim không tử vong và đột quỵ không tử vong tăng lên đáng kể Cuộc đánh giá của Ủy ban Sản phẩm Thuốc dùng cho Con người kết luận rằng lợi ích của sibutramin như một chất hỗ trợ giảm cân không lớn hơn nguy cơ tim mạch và khuyến nghị đình chỉ cấp phép tiếp thị sibutramin trên toàn EU [28]

1.1.3 Tình hình trộn trái phép và các quy định hiện hành

Tại châu Âu 2.559 hồ sơ thực phẩm bổ sung có vấn đề về chất lượng đã được xác định trong RASFF, một số trong đó [319 (12,5%)] đã được bán trên thị trường để hỗ trợ giảm cân Sibutramin là hoạt chất xếp thứ hai (69 sản phẩm, 21,6%) từ năm 1988 đến năm 2019 [20] Từ tháng 10/2010, FDA (Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ) đã ban hành quyết định cấm lưu hành tất cả sản phẩm có Sibutramin vì dữ liệu thử nghiệm lâm sàng cho thấy nguy cơ đau tim và đột quỵ tăng lên [33] Một nghiên cứu đã báo cáo mối liên quan giữa lượng sibutramin sử dụng và đột tử do tim ở bệnh nhân không có tiền sử bệnh tim mạch vành trước đó [18] Bệnh nhân đã dùng thực phẩm bổ sung thảo dược giảm cân, sibutramin và các chất chuyển hóa của nó (desmethylsibutramin và didesmethylsibutramin) được tìm thấy trong huyết thanh “Biến chứng ngộ độc Sibutramin cấp tính” được xác định là nguyên nhân gây tử vong Nồng độ sibutramin trong các thực phẩm chức năng giảm cân khác nhau được thu thập ở các nước châu Á thay đổi đáng kể, từ 0,14 đến 781.200 mg/kg Hàm lượng sibutramin cao (5400–781.200 mg/kg) được tìm thấy trong 9 viên nang giảm béo mua từ các cửa hàng trái phép ở Iran Những thực phẩm bổ sung này được sản xuất ở các nước châu Á, bao gồm Trung Quốc, Iran và các nước Đông Nam Á [24]

Các báo cáo về ảnh hưởng sức khỏe nghiêm trọng liên quan đến các chất bổ sung thảo dược đã góp phần nâng cao hiểu biết về tầm quan trọng của việc phát triển một hệ thống kiểm tra phần sản phẩm Trung Quốc đã thông qua Luật An toàn Thực phẩm vào năm 2015, với một hệ thống mới để quản lý các chất bổ sung trong chế độ ăn uống Các sản phẩm “Được phân loại là thực phẩm bổ sung” phải trải qua quá trình thử nghiệm

5 rộng rãi, phê duyệt trước khi đưa ra thị trường và thử nghiệm độc tính trước khi bán [27] Mặc dù việc xây dựng tiêu chuẩn hóa cho các sản phẩm thảo dược đang được phát triển trên toàn thế giới nhưng hiện tại vẫn chưa có các quy định chung Cần phải kiểm soát chặt chẽ các quy định về các sản phẩm giảm béo, bao gồm việc cấp phép, hướng dẫn ghi nhãn và xác minh thành phần để chống lại các hành vi gian lận [19]

Hiện nay, tại Việt Nam, cục Quản lý Dược, bộ Y tế đã ngưng cấp phép nhập khẩu nguyên liệu sibutramin và tiến hành thu hồi các sản phẩm chứa chất này từ năm 2011 [5] Nhưng vẫn phát hiện tình trạng TPBVSK có trộn trái phép nhóm chất này:

➢ Năm 2021, Ban Quản lý An toàn thực phẩm tỉnh Bắc Ninh đã tiến hành triển khai giám sát ô nhiễm thực phẩm theo kế hoạch, trong đó thực hiện giám sát đối với nhóm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, kết quả kiểm nghiệm do Viện Kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia thực hiện phát hiện 06 mẫu sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa chất cấm Sibutramin [31]

➢ Cục An toàn thực phẩm đã ban hành Quyết định số 97/QĐ-ATTP, ngày 04/4/2022, về việc thu hồi sản phẩm không bảo đảm an toàn thực phẩm đối với sản phẩm thực phẩm bổ sung cafe Hoàng Gia [32]

Danh mục chất cấm thực phẩm bảo vệ sức khỏe quy định tại Thông tư số BYT, hiện nay đang có 4 dẫn xuất của sibutramin [3] (Bảng 1.2)

10/2021/TT-Bảng 1.2 Danh mục các chất cấm thuộc dẫn chất sibutramin

8 Benzyl sibutramin

1-(1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl)-N,N-dimethyl-2-phenylethan-1- amin

Desisobutyl-benzylsibutramin

dimethyl-2-phenylethanamin

1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-N,N-25 Desmethylsibutramin

1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-N,3-dimethylbutan-1-amin

30 Didesmethylsibutramin

1-[1-(4-chlorophenyl)cyclobutyl]-3-methylbutan-1-amin

6

1.2 Các nghiên cứu xác định sibutramin và dẫn xuất

Trên thế giới đã có rất nhiều phương pháp được phát triển nhằm sàng lọc và định lượng sibutramin và dẫn xuất Từ những phương pháp rất phổ biến như HPLC [4], [9], [6], [12] tới phương pháp ít phổ biến hơn như HPTLC [21] Và cả những phương pháp có độ đặc hiệu cao như sắc ký- khối phổ (Bảng 1.3)

Nghiên cứu của Lê Đình Chi và cộng sự xác định sibutramin bằng HPLC [4] xây dựng giới hạn phát hiện là 10 µg/g, giới hạn định lượng là 25 µg/g Trong 34 mẫu phân tích phát hiện 11 mẫu (32%) chứa chất cấm sibutramin với hàm lượng từ 22,0- 69,2 mg/g

Nghiên cứu của Nguyễn Thái Ngọc Mai và cộng sự xây dựng phương pháp định lượng sibutramin bằng HPLC [9] Kết quả giá trị LOD và LOQ lần lượt là 0,33 mg/kg và 1 mg/kg, phát hiện sibutramin trong 8/10 mẫu với khoảng nồng độ từ 17,51 - 16349,46 mg/kg

Một nhà nghiên cứu ở Thổ Nhĩ Kỳ [12] tiến hành xây dựng 2 phương pháp phân tích HPLC và HPTLC thực hiện so sánh sơ bộ về hàm lượng sibutramine trong các sản phẩm giảm béo Kết quả SB được phát hiện trong ba sản phẩm dưới dạng sản phẩm giảm béo tự nhiên

Các nhà nghiên cứu tại đại học Y Plovdiv đã xây dựng phương pháp phân tích HPTLC để phát hiện SB trong TPBVSK [21] Kết quả xác định LOD, LOQ lần lượt là 0,0765 μg/vết and 0,2318 μg/vết

Bảng 1.3 Tóm tắt một số nghiên cứu về nhóm SB sử dụng khối phổ

Kỹ thuật phân tích

Nền mẫu

Điều kiện xử lý mẫu Điều kiện sắc ký

LOD, LOQ TLTK LC-

MS/MS

Viên nang, viên nén

Chiết bằng acetonitril, siêu âm, ly tâm, pha loãng với acetol nitril, lọc với màng PTFE 0,2 µm

- Cột Zorbax C18 (50 mm x 2,1 mm và cỡ hạt 1,8 µm)

- Pha động: pha A (2mM amoni format trong nước chứa 0,05% acid formic) và pha B (2mM amoni format trong methanol chứa 0,05% acid formic) Ban đầu 30% pha B sau tăng lên 90% B ở phút thứ 7

LOD, LOQ đối với SB, DSB, DDSB lần lượt là 0,3 và 1 ng/mL; 0,3 và 1,0

[26]

7 và duy trì 2 phút, sau đó chuyển về 30% pha B phút thứ 10

- Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút

ng/mL, 0,6 và 2,0 ng/mL

MS/MS

LC-Viên nang, viên nén, trà

Chiết bằng dung môi MeOH:H2O (8 : 1) Siêu âm, ly tâm, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Cột: C18 Phenomenex (100 × 2,1 mm cỡ hạt 1,7μm)

- Pha động A: MeOH 0,01% HCOOH; B: H2O 0,01%

HCOOH; Tốc độ dòng: 0,15 mL/phút - Chương trình

gradient pha động: Từ 0 - 0,5 phút, 5% B; 0,5 - 5 phút, 95% B: 5 - 8phút, 95% B; 8 - 8,1 phút, 5% B; 8,1 - 12 phút 5% B

LOD của dạng bào chế rắn là 750 ppb, dạng lỏng là 75 ppb

[8]

MS/MS

LC-Viên nang

Chiết siêu âm bằng methanol, pha

loãng, lọc

- Cột ODS-3 Inertsil (150mm x 2,1 mm; 5 µm)

- Rửa giải đẳng dòng pha động gồm 33% ACN, 67% dung dịch

trifluoroacetic 0,1% trong 15 phút

- Tốc độ dòng 0,4 mL/ phút, thể tích tiêm 20 µL

- [30]

8 LC-

MS/MS

Nang cứng, nang mềm, trà túi lọc

Chiết bởi dung môi methanol, sau đó tạp chất được loại bằng carbon hoạt tính (GCB)

- Cột sắc ký C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,5 µm)

- Pha động là gradient của 2 kênh: Kênh A là Acetonitril, kênh B là hỗn hợp ammoni acetate 2 mM + acid formic 0,1%

- Thể tích tiêm là 10 µL Mẫu được đưa vào nguồn ESI với tốc độ dòng là 0,4 mL/phút

SB: LOD = 0,5 ng/g, LOQ = 0,15 ng/g

[7]

UPLC/HRMS

Viên nang

Chiết bằng

trong nước, lọc qua màng lọc 0,45 µm và dịch lọc được pha loãng 100 lần với 50% ACN /50% nước

- Cột EVO C18 (100 x 3 mm; 2,6 µm)

- Pha động A: 95%

(pH=4.3; 10 mmol ammonium format) - Pha động B: 95%

(pH=4.3; 10 mmol ammonium format) - Chương trình gradient : 50% pha A/ 50% pha B - Tốc độ dòng: 600 µL/ phút

- [23]

HPLC HRMS

Viên nang/ cốm

Nghiền mịn, chiết bằng methanol, siêu âm, ly tâm, lọc màng 0,22 µm

- Cột sắc ký: Hypersil Gold (100 mm× 2,1 mm, 3 μm,

Thermo Fisher, USA), - Pha động A là dung dịch nước- acid formic

LOD = 10 ng/g LOQ = 25 ng/g

[17]

9 0,15%, B là methanol, chương trình rửa giải

gradient: 0 - 2 phút, 70% A giảm còn 5% A; 2 - 6 phút, 5% A; 6 - 6,2 phút, 5% A tăng đến 70% A; 6,2 đến 8 phút, 70% A Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút

- Thể tích tiêm: 5 µL - Nhiệt độ cột: 25°C

Lí do lựa chọn phương pháp LC-HRMS: Các phương pháp HPLC, HPTLC không

phù hợp với nền mẫu phức tạp như trong TPBVSK (khó khăn trong việc loại tạp và nghiên cứu chất phân tích) Về độ đặc hiệu, cả HPLC và HPTLC đều không phải là kĩ thuật có thể dùng để định tính khẳng định, vì UV-Vis không phải là kỹ thuật quang phổ có độ đặc hiệu cao Sự kết hợp sắc ký lỏng – khối phổ là kỹ thuật đặc biệt hữu ích trong việc phân tích các hợp chất kém phân cực, là những chất ít bay hơi hay rất dễ phân hủy bởi nhiệt, không phân tích được bằng sắc ký khí – khối phổ [2, 1] Các mẫu phân tích theo phương pháp có LOD, LOQ tới vài ppb, nhạy hơn nhiều detector khác hàng nghìn lần Trong đó, LC-HRMS có thể sàng lọc cả những chất chưa có chuẩn đối chiếu nhờ so sánh dữ liệu với ngân hàng phổ LC-MS/MS có thể coi là phương pháp đối chứng vì có độ nhạy và độ đặc hiệu đều cao Tuy nhiên vẫn phải có chất chuẩn đối chiếu Mà với các chất cấm, dẫn xuất mới luôn được phát triển thêm nên việc có đầy đủ chất đối chiếu có thể chưa kịp thời Vì vậy, trong nghiên cứu này dùng phương pháp LC-HRMS để sàng lọc và định lượng sibutramin và các dẫn xuất của sibutramin trong TPBVSK hỗ trợ giảm cân

1.3 Tổng quan khối phổ phân giải cao

1.3.1 Nguyên tắc

Chất phân tích được chuyển sang thể khí và ion hoá, tạo thành các ion dương hoặc âm Phương pháp phổ khối dựa trên việc đo trực tiếp tỷ số khối lượng m và điện tích z của ion chất phân tích (m/z) Tỷ số này được trình bày dưới dạng đơn vị khối lượng nguyên tử hay dalton.Tín hiệu tương ứng với một ion là một nhóm các pic tương ứng với phân bố thống kê của các đồng vị khác nhau của ion đó.Từ phổ khối ta có được những thông tin định tính (xác định khối lượng phân tử và thông tin về cấu trúc có được nhờ các mảnh thu được) hay định lượng (dùng chuẩn nội hay chuẩn ngoại) với giới hạn phát hiện trong khoảng từ picomol ( 10-12 mol) đến femtomol (10-15 mol) [2]

10

1.3.2 Máy khối phổ Thermo Fisher Scientific

Hình 1.1 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HR/MS Dionex Ultimate

UHPLC + Q-Exactive Orbitrap MS của hãng Thermo Scientific

Cấu tạo thiết bị khối phổ tham khảo từ nhà sản xuất và nghiên cứu [15]:

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo bộ phận khối phổ

- Bộ nguồn ion hóa ESI dương: nguồn ion hóa phun điện tử - Bộ phận phân tích khối: Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ được gia tốc và

tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi đến bộ phận phát hiện

- Bộ phân tích khối tứ cực kết nối orbitrap - C-trap : tiêu tán động năng của ion để đưa các ion vào bộ phận orbitrap - HCD : Các ion có thể qua khỏi C-trap vào và va chạm với khí Nito trong HCD

tạo thành các phân mảnh nhỏ hơn Sau đó chúng được chuyển trở lại C-trap và đưa vào bộ phận Orbitrap để phát hiện phổ khối

11 1.3.2.1 Bộ phận tứ cực

Tại bộ phân tích khối, tứ cực sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định đi vào bẫy ion tại orbitrap Có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực

1.3.2.2 Q-Exactive Orbitrap

Hình 1.3 Cấu tạo orbitrap

Orbitrap là máy phân tích khối lượng bẫy ion bao gồm hai điện cực bên ngoài và một điện cực trung tâm, cho phép nó hoạt động như một máy phân tích và máy dò Các ion đi vào Orbitrap được giữ lại thông qua "sự ép điện động", sau đó chúng dao động xung quanh điện cực trung tâm và ở giữa hai điện cực bên ngoài Các ion khác nhau dao động ở các tần số khác nhau, dẫn đến sự phân tách của chúng Bằng cách đo tần số dao động do các ion gây ra trên các điện cực bên ngoài, phổ khối của các ion thu được bằng cách sử dụng tính năng phát hiện dòng điện hình ảnh

- Cột sắc ký pha đảo BEH C18 (100 mm x 1,7 µm x 2,1 mm) và tiền cột, Waters - Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg (Mettler Toledo, Thụy Sĩ) - Cân kỹ thuật, chính xác 0,01 g (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)

- Máy đồng nhất mẫu (Phillips, Hà Lan) - Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 vòng/phút đối với ống ly tâm

50 mL, Mikro 200R (Hettich, Đức) - Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 13000 vòng/phút đối với ống ly tâm

2 mL, Mikro 220R (Hettich, Đức) - Máy lắc xoáy vortex (IKA, Đức) - Máy rung siêu âm (Elma, Đức)

2.1.2 Dụng cụ

- Micropipet 10-100, 20-200, 100-1000, 500- 5000 µL - Bình định mức các loại: 5 mL, 10 mL, 50 mL và 100 mL - Ống ly tâm nhựa 15 mL có nắp kín

- Ống ly tâm nhựa 2 mL có nắp kín - Ống đong 50, 100 mL

- Lọ đựng mẫu 1,8 mL có nắp kín - Pipet pasteur

- Màng lọc mẫu, kích thước lỗ 0,2µm - Màng lọc dung môi,kích thước lỗ 0,45µm - Giấy lọc

2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn

- Sibutramin (hãng: TRC, số lô: 25-GHZ-42-1, độ tinh khiết:98%) - Desmethylsibutramin hydroclorid (hãng: LGC, số lô: 119624, độ tinh khiết:

98%) - Didesmethylsibutramin (hãng: TRC, số lô: 5-AKS-96-2, độ tinh khiết:98%) - Desisobutyl-benzylsibutramin (hãng: TRC, số lô: 1-THT-94-4 , độ tinh khiết:

98%)

Cách pha dung dịch chuẩn

13 - Dung dịch chất chuẩn gốc 1000 µg/mL: Cân chính xác khoảng 10 mg các chất

chuẩn vào cốc cân 25 mL trên cân phân tích có độ chính xác đến 0,01 mg Hòa tan bằng MeOH và chuyển vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch và lắc đều Bảo quản dung dịch ở 2 ÷ 8 º C

- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL: Dùng micropipet hút chính xác

250 µL các dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 25 mL, định mức đến vạch bằng MeOH và lắc đều Bảo quản dung dịch ở 2 ÷ 8 º C

Hóa chất dung môi khác

Nước được sử dụng cho thiết bị là nước đề ion, sử dụng cho quá trình chuẩn bị mẫu là nước cất 2 lần

- Các dung môi là loại tinh khiết dùng cho phân tích LC-MS mua từ Merck của Đức: Methanol, Acetonitril, Acid formic, Acid acetic, Ammoni format, n- Hexan Diethyl ete, Ethyl acetate

- Bột làm sạch C18, cỡ hạt 40 µm, Merck (Đức) - Bột carbon graphit (GCB), Merck (Đức)

Cách pha các dung dịch dùng trong thí nghiệm:

- Dung dịch 10 mM amoniformat và 0,1 % acid formic trong nước: Hòa tan 0,63 g amoniformat và 1 mL acid formic vào bình định mức 1000 mL, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần

- Dung dịch 10 mM amoniformat và 0,1 % acid formic trong acetonitril: Hòa tan 0,63 g amoniformat và 1 mL acid formic vào bình định mức 1000 mL, định mức tới vạch bằng acetonitril

- Dung dịch acid acetic 0,1% trong acetonitril: Hút 1 mL acid acetic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, lắc đều

- Dung dịch acetonitril: Nước (50:50, v/v): Đong 500 mL acetonitril và 500 mL nước vào bình 1000 mL, đậy nắp và lắc đều

- Dung dịch acetonitril: Nước (30:70, v/v): Đong 300 mL acetonitril và 700 mL nước vào bình 1000 mL, đậy nắp và lắc đều

- Dung dịch acid formic 0,1%: Hút 1 mL acid formic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, đậy nắp và lắc đều

- Chất làm sạch: Bột C18, bột GCB

2.1.4 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu phân tích: Các mẫu TPBVSK có tác dụng hỗ trợ giảm cân được mua tại các cửa hàng thuốc trên địa bàn thành phố Hà Nội hoặc các mẫu gửi xét nghiệm tại Viện vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia bao gồm dạng nang cứng, nang mềm

14 Mẫu nền là mẫu TPBVSK được mua trên thị trường đã được xác định là không chứa SB và dẫn xuất Thông tin về sản phẩm như sau:

- Mẫu nền nang cứng: chứa cao khô lá sen, trạch tả, giảo cổ lam, bứa, thảo quyết minh

- Mẫu nền nang mềm chứa cao khô trà xanh, sơn tra lá sen, cafein, chitosan

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu - Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích sàng lọc - Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích định lượng - Thẩm định quy trình phân tích

- Phân tích mẫu thực tế trên thị trường bằng phương pháp được xây dựng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu Chuẩn bị mẫu sơ bộ

Mẫu viên nang cứng được xay nghiền và trộn đều bằng máy đồng nhất mẫu Mẫu viên nang mềm được tách bỏ phần vỏ nang, lấy phần ruột trộn đều

➢ Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết ➢ Khảo sát và lựa chọn điều kiện làm sạch: loại béo bằng dung môi, làm sạch bằng bột cacbon hoạt tính GCB, làm sạch bằng C18

Quy trình chung xử lý mẫu được trình bày ở hình 2.1

15

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chung chiết mẫu TPBVSK

➢ Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng nền mẫu Pha chuẩn trên dung dịch mẫu nền đã xử lý theo quy trình và đường chuẩn dung môi để đánh giá

Cách tính ảnh hưởng nền mẫu theo công thức:

Matrix effets (ME) = 𝑎 − 𝑎

′𝑎 𝑋 100% Trong đó: a là hệ số góc của đường chuẩn trên nền dung môi, 𝑎′ là hệ số góc của đường chuẩn trên nền mẫu đánh giá ảnh hưởng nền

Yêu cầu: ME < 20% theo quy định AOAC 2016 [11]

2.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích sàng lọc

Khảo sát điều kiện khối phổ: Tiến hành tra cứu mảnh phổ lý thuyết dựa vào CTPT của các hợp chất, sau đó, tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp Tiến hành tiêm 1 µL dung dịch các chất chuẩn vào khối phổ Tiến hành đo mảnh phổ thực nghiệm bằng chế độ Fullscan đối với mảnh mẹ và all ion fragmentation (AIF) để tìm kiếm mảnh con của chất phân tích

16 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: Lựa chọn cột tách, pha động và khảo sát

gradient nhằm tách được tối đa các hợp chất

2.3.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký khối phổ

Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HR/MS Dionex Ultimate UHPLC kết hợp Q-Exactive Orbitrap MS của hãng Thermo Scientific được kết nối với nguồn thư viện chất từ mzCloud, Chemspider, Masslist, … có thể sàng lọc và xác định các hợp chất chưa biết với độ chính xác khối nhỏ hơn 5ppm

Lựa chọn mảnh phổ theo thư viện HRMS hoặc các tài liệu tham khảo Các điều kiện phân tích định lượng được thiết lập như sau:

- Nguồn ion hóa: ESI dương

- Cột phân tích: BEH C18 (100 mm x 1,7 µm x 2,1 mm) và tiền cột của Waters

- Nhiệt độ cột: 30 oC

- Chế độ khối phổ: Với MS sử dụng chế độ quét toàn dải (full scan) và AIF với 3 giá trị năng lượng va chạm tương đối là 40%, 70%, 100% (NCE)

- Độ phân giải: MS 35000 (FWHM) - Độ chính xác khối: Cài đặt ở 5 ppm - Khảo sát gradient pha động gồm 2 thành phần kênh A và kênh B

+ Kênh A: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong nước + Kênh B: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong MeOH, ACN (1:1, v/v)

2.3.4 Thẩm định phương pháp

Đối với phương pháp định lượng, tiến hành thẩm định, đánh giá các thông số sau: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại, độ thu hồi Đánh giá kết quả thẩm định với quy định của AOAC và các quy định khác của châu Âu [11]

2.3.4.1 Độ phù hợp của hệ thống Độ phù hợp của hệ thống là phép thử chứng minh sự ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn tại cùng nồng độ Ghi lại sắc ký đồ, xác định các thông số diện tích pic, thời gian lưu chất phân tích Sự phù hợp hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: RSD của thời gian lưu ≤ 2 %, RSD của diện tích pic ≤ 5%

17 2.3.4.2 Độ đặc hiệu

Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu nền, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn

Phương pháp có tính chọn lọc cao đối với chất phân tích khi: - Không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu nền - Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn phải có tính hiệu chất phân tích - Thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn không lệch

quá 5% - Đạt số điểm nhận dạng IP theo tiêu chuẩn EC 657/2002 của Châu Âu [14] 2.3.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N) Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) Thêm chuẩn với các mức nồng độ giảm dần các chất nhóm SB vào mẫu TPBVSK không chứa chất phân tích Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3) LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10) 2.3.4.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Pha các dung dịch chuẩn trên dịch sau khi xử lý của mẫu nền Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo 7 điểm chuẩn có nồng độ từ giá trị định lượng Sau đó, lấy tối thiểu 5 điểm nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó, vẽ đường biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ

Đánh giá đường chuẩn dựa vào R2≥0.99 và độ chệch các điểm của đường chuẩn không quá 15% theo công thức:

∆i = 𝐶𝑡− 𝐶𝑐

𝐶𝑐 ×100%Trong đó: ∆i : Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct Nồng độ tính ngược lại theo đường chuẩn của các điểm chuẩn Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn

2.3.4.5 Độ lặp lại và độ thu hồi Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu nền thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau là (n = 6) và tính toán kết quả theo các công thức sau:

18 Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD(%)

RSD(%) =

Trong đó:

xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i”: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm.n : Số lần thử nghiệm

Độ thu hồi: R(%) = 𝐶𝑐

𝐶.100 Trong đó:

R: Độ thu hồi (%) C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu nền thêm chuẩn Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Bảng 2.1 Độ lặp lại và độ thu hồi được chấp nhận theo AOAC 2016

=

NxxS

N

ii

x

100.

xS

19

2.3.5 Phân tích mẫu thực

2.3.5.1 Sàng lọc SB và dẫn xuất SB

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để sàng lọc các hợp chất nhóm chất cấm hỗ trợ giảm cân có thể có mặt trong các sản phẩm TPBVSK Phần lớn các chất đều đã có trong thư viện phổ được xây dựng thông qua nghiên cứu

2.3.5.2 Phân tích định lượng mẫu thực Đường chuẩn trên nền mẫu thực được sử dụng để tính kết quả cho các mẫu tương ứng Căn cứ vào đường chuẩn tương quan giữa diện tích pic và nồng độ, căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau:

𝑋 = 𝐶 x V x 𝑘

𝑚 Trong đó:

V: Thể tích dung môi chiết (mL) C: Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đường chuẩn (ng/mL) k: Hệ số pha loãng

m: Khối lượng của mẫu phân tích (g) X: Hàm lượng chất cấm trong mẫu thử (μg/kg)

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả phân tích sàng lọc được xử lý bằng phần mềm Compound discoverer 3.1 và kết quả định lượng được xử lý bằng phần mềm TraceFinder 4.1 của thiết bị LC-HRMS Ultimate 3000 Q-exactive hãng Thermo Scientific Các số liệu phân tích được xử lý bằng phần mềm Microsolf Excel 2016

• Kênh A: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong nước • Kênh B: 10 mM ammonium format và 0,1 % acid formic trong acetonitril:

methanol (1:1, v/v) • Chương trình theo chế độ gradient: nồng độ pha động B được giữ ở mức 5%

trong 15 phút đầu, tăng lên 40% trong 7 phút, tăng lên 60 % trong 4 phút và sau đò giảm xuống 5% trong 3 phút, tổng thời gian là 29 phút

3.1.1.2 Điều kiện khối phổ - Thông số chung:

• Thời gian chạy: 0-29 phút • Chế độ ion hóa dương • Tốc độ khí mang: 30 đơn vị • Tốc độ khí va chạm: 10 đơn vị • Điện áp phun (kV): 3.8

• Nhiệt độ mao quản (oC): 320 - Full MS-dd-MS2:

• Độ phân giải MS: 35.000 (FWHM) • AGC mục tiêu: 1e6

• Khoảng khối: 100 – 1500 m/z • Độ phân giải MS2: 17.500 (FWHM) • Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 30% - AIF:

• Độ phân giải: 17.500 (FWHM) • Khoảng khối: 50-700

• Năng lượng va chạm tương đối (NCE): 40%, 70%, 100%

3.1.2 Lựa chọn dung môi

Khảo sát 4 hệ dung môi: acetonitril, methanol, ethanol, aceton Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu nền thêm hỗn hợp chuẩn chất phân tích nhóm SB

21 Tham khảo nghiên cứu [7]: cùng đối tượng phân tích là các hợp chất SB trên nền mẫu tương tự: viên nang cứng và nang mềm, chọn dung môi methanol cho hiệu suất chiết cao nhất

3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện loại béo

Với các TPBVSK dạng dầu như viên nang mềm, cần thêm bước loại chất béo để tránh ảnh hưởng hiệu suất chiết và khả năng làm sạch mẫu Khảo sát trên nền mẫu nền thêm chuẩn chất phân tích nhóm SB 2mg/kg mẫu (tương ứng dịch cuối là 80 ng/mL) Tiến hành khảo sát 3 loại dung môi loại béo: n-hexan, diethyl ete, ethyl acetat và một mẫu không loại béo Thêm dung môi loại béo vào mẫu, rung siêu âm, ly tâm, gạn bỏ dung môi và tiến hành theo quy trình chiết mẫu Kết quả khảo sát dung môi thu được tại hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ khảo sát dung môi loại béo

Nhận xét: Độ thu hồi của chất phân tích giảm rất nhiều sau khi loại béo bằng dung môi Vì vậy, tiến hành xử lý mẫu không có bước loại béo bằng dung môi

3.1.4 Khảo sát và lựa chọn bột làm sạch

Tiến hành khảo sát GCB và C18, thêm 50 mg chất hấp phụ vào dịch chiết mẫu thêm chuẩn, lắc, ly tâm thu lấy dịch Kết quả độ thu hồi thu được ở hình 3.2

0100000000200000000300000000400000000500000000600000000

Khảo sát loại béo

Không loại béoDiethyl eteEthyl acetatn-hexan