Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất baicalin, baicalein trong cao đặc Núc nác bằng phương pháp thay đổi 1 yếu tố.. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến qu
TỔNG QUAN
Tổng quan về dược liệu Núc nác
1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố
Núc nác còn có tên khác là Hoàng bá nam [8] Tên khoa học: Oroxylum indicum (L.) Kurz, thuộc họ Núc nác (Bignoniaceae); Chi Oroxylum [4], [5]
Tên đồng nghĩa: Bignonia indica L.; B pentandra Lour.; Calosanthes indica (L.)
Cây cao 7 – 12 m, có thể cao tới 20 – 25 m, thân nhẵn, ít phân nhánh Vỏ cây màu xám tro, mặt trong màu vàng Lá xẻ 2 – 3 tầng lông chim Lá chét hình bầu dục, nguyên, đầu nhọn, dài 7,5 – 15 cm, rộng 5 – 6,5 cm Hoa màu nâu đỏ sẫm mọc thành chùm dài ở đầu cành, dài khoảng 10 cm, 5 nhị trong đó có một nhị nhỏ hơn Quả nang to, dài tới
50 – 80 cm, rộng 5 – 7 cm, bên trong chứa hạt, bao quanh có một màng mỏng, bóng và trong, hình chữ nhật [8]
Cây Núc nác mọc hoang và được trồng ở khắp Việt Nam Ngoài ra, Núc nác còn được trồng ở Trung Quốc, Malaysia, Ấn Độ, Lào, Campuchia [8]
Lá: Lá Núc nác chứa các thành phần: phlobatannin, flavonoid, phenol, tannin và glycosid [83] Trong lá Núc nác tìm thấy các flavonoid: chrysin-7-O-glucuronid; oroxylin A; scutellarin; baicalein-6-O-glucuronid [90] Từ dịch chiết methanol của lá Núc nác, các flavonoid đã được tách ra bằng sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao: chrysin; baicalein; baicalein-7-O-glucosid; baicalein-7-O-diglucosid; baicalein-7-O- glucuronid, chrysin – diglucosid [113] Phân tích bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS) tinh dầu chưng cất từ lá Núc nác cho thấy sự hiện diện của artumeron, methyl hexadecanoat, aurenan-2-on và isopropyl butanoat [114]
Vỏ thân: Vỏ thân Núc nác có chứa các flavonoid, tanin, sterol với nồng độ trung bình, alcaloid, saponin, lignin, chất béo và tinh dầu với nồng độ thấp [82] Vỏ thân Núc nác được tìm thấy chứa acid ellagic [40], các flavonoid chính baicalin; baicalein; chrysin; oroxylin A; scutellarin; 8,8''-bisbaicalein; 5,7-dihydroxyflavon; hispidulin; chrysin-7-O-β-D-glucuronid [32], [67], [92]
Hạt: Hạt Núc nác chứa các thành phần: alcaloid, flavonoid, tannin, glycosid, sterol, phenol, saponin, chất béo, tinh dầu [82]; flavonoid là nhóm hoạt chất chính có trong hạt
3 Núc nác bao gồm: chrysin; baicalein; baicalein-7-O-glucosid; oroxylin B [27], scutellarein 7-O-β-D- glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosid [107]; oroxin C và oroxin D [103]
Các thành phần chính chiết xuất từ Núc nác là flavonoid và hợp chất phenolic, đóng vai trò quan trọng trong các tác dụng dược lý của cây Vỏ thân của Núc nác đặc biệt giàu flavonoid, được coi là thành phần hoạt động chính Baicalin và baicalein là hai flavonoid quan trọng với các tác dụng sinh học nổi bật và tiềm năng điều trị.
Oroxylum indicum đã được sử dụng trong y học cổ truyền trong nhiều thế kỷ, đặc biệt là ở các nước Đông Nam Á và Nam Á Rễ của Oroxylum indicum hoạt động như một loại thuốc trị đái tháo đường, chống viêm khớp, ra mồ hôi, táo bón, trị giun sán, hạ sốt, lợi tiểu, tiêu hóa và long đờm [33], [54], [101] Thuốc đắp làm từ vỏ cây Núc nác được sử dụng để điều trị các chứng viêm, bệnh ngoài da, bong gân và thấp khớp, trong khi bột vỏ và bột nhão được dùng để chữa vết bỏng và vết thương [39], [57] Vỏ thân còn được dùng để điều trị rối loạn dạ dày [81] Lá được dùng trị rắn cắn và chữa loét, nhức đầu Quả Oroxylum indicum có vị ngọt, chát, được dùng để tẩy giun, nhuận tràng, tiêu đờm, cải thiện cảm giác thèm ăn, điều trị viêm họng, viêm phế quản, rối loạn tim, bệnh bạch cầu và bệnh trĩ [52] Ở Malaysia, Oroxylum indicum được dùng để giảm đau răng, điều trị bệnh tả, kiết lỵ, sốt, đau dạ dày, vết thương, lách to và chán ăn Nước sắc được chế biến từ bất kỳ bộ phận nào của Oroxylum indicum được sử dụng dùng ngoài khi sinh con [37] Vỏ cây
Oroxylum indicum được sử dụng trong điều trị bệnh thấp khớp và bệnh lỵ ở Myanmar,
Philippines và Việt Nam [31] Trong y học Trung Quốc, hạt Oroxylum indicum được dùng để điều trị các vết loét, mụn nhọt, các vấn đề về gan và dạ dày Ở nước ta, vỏ thân Núc nác thường được dùng để điều trị hoàng đản, viêm họng, đái buốt, đái đục, đái đỏ do bàng quang thấp nhiệt, chữa đi ngoài, đi lỵ, thuốc bổ chát; ho hen, ho khàn tiếng ở trẻ em, viêm phế quản, viêm khí quản, ho lâu ngày, ho gà, yết hầu sưng đau; trị vết thương lở loét mụn nhọt, mẩn ngứa dị ứng [2], [8]
Oroxylum indicum đã được nghiên cứu rộng rãi về các hợp chất có hoạt tính sinh học và tiềm năng chữa bệnh Các hợp chất flavonoid, bao gồm baicalin, baicalein, oroxylin
A và chrysin, đã cho thấy nhiều hứa hẹn trong các lĩnh vực khác nhau như hoạt động chống ung thư [22], [50], [95], [111], chống viêm, chống oxy hóa [86], chống tăng đường huyết [48], kháng khuẩn, kháng virus [88], chống béo phì [41], [42], bảo vệ tim mạch [69] Các chất chiết xuất từ vỏ cây Oroxylum indicum đã được phát hiện có đặc tính chống oxy hóa, gây độc tế bào và bảo vệ DNA, cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc [55] Hơn nữa, cây đã chứng minh hoạt động làm tan huyết khối và gây độc tế bào, cho thấy tác dụng của nó như một tác nhân chống ung thư tự nhiên, làm nổi bật tiềm năng của nó trong lĩnh vực y học [45], [79].
Tổng quan về baicalin, baicalein
1.2.1 Công thức hóa học, đặc điểm vật lý, hóa học
Tên khoa học: 5,6-dihydroxy-4-oxo-2-phenyl-4H-
Tên khác: Baicalein-7-O-glucuronid Trọng lượng phân tử: 446,36 g/mol Độ tan: tan trong ethanol, methanol, ether, acid acetic đặc, aceton, ethylacetat
Tên khoa học: 5,6,7-trihydroxy-2-phenyl-(4H)-1- benzopyran-4-on
Trọng lượng phân tử: 270,24 g/mol Độ tan: tan trong ethanol, methanol, ether, acid acetic đặc, aceton, ethylacetat
1.2.2 Dược động học baicalin, baicalein
Các nghiên cứu đã chứng minh các đặc tính dược động học phức tạp của baicalin và sự thủy phân của nó trong đường tiêu hóa [74]; chuyển hóa qua gan ruột [104]; vận chuyển qua trung gian chất mang qua màng tế bào [49], các con đường trao đổi chất khác nhau trong tuần hoàn [116]; và bài tiết qua mật và nước tiểu [56]
Trong cơ thể, baicalin và baicalein có thể chuyển hóa lẫn nhau Sau khi baicalin được hấp thu và bị thủy phân bởi β-glucuronidase trong ruột thành baicalein, baicalein lại được chuyển hóa bởi UDP-glucuronosyltransferase trở lại thành baicalin trong hệ tuần hoàn [74] Do đó, baicalin là thành phần chính hiện diện trong hệ tuần hoàn hơn là baicalein [60]
1.2.3 Tác dụng sinh học của baicalin, baicalein
Baicalin và baicalein có vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình chuyển hóa lipid và ngăn chặn tích tụ mỡ cơ thể Baicalin ức chế sự biệt hóa của tế bào mỡ thành tế bào mỡ trưởng thành, giảm tích tụ mỡ [58] Baicalein tăng tiêu hao năng lượng và ngăn chặn hình thành tế bào mỡ mới [19] Cả baicalin và baicalein đều có tính chất chống oxy hóa và chống viêm, giúp chống lại stress oxy hóa và viêm mãn tính (biến chứng thường gặp trong béo phì) Hơn nữa, chúng cải thiện độ nhạy insulin và điều chỉnh chuyển hóa glucose, hỗ trợ kiểm soát bệnh béo phì và các rối loạn chuyển hóa [36] Dưới đây là một số nghiên cứu về tác dụng chống béo phì của baicalin, baicalein:
Baicalin đã được chứng minh có tác dụng chống béo phì bằng cách ức chế quá trình tạo mỡ và hạn chế tích tụ mỡ trong tế bào Baicalin điều hòa các gen liên quan đến quá trình tạo mỡ, giảm lượng triglycerid và giọt lipid trong tế bào Ngoài ra, baicalin còn điều chỉnh biểu hiện của các protein quan trọng như SLC2A1, TNF, NFκB1, SREBF1, PPARγ và CASP3, ảnh hưởng đến viêm, quá trình tạo mỡ và chết theo chương trình có liên quan đến bệnh béo phì Baicalin cũng kích hoạt CPT1 ở gan, tăng cường thoái hóa axit béo, giảm béo phì và gan nhiễm mỡ do chế độ ăn.
Baicalein: baicalein có tác dụng ức chế với hoạt động của lipase tụy được xác định bằng xét nghiệm lipase tụy Baicalein ngăn chặn sự tích tụ lipid ở khoảng nồng độ 3,125 – 12,500 μM và ức chế hoạt động lipase tuyến tụy với giá trị IC50 là 159,71 ± 7,15 μM
Sự ức chế của baicalein đối với tích tụ lipid cũng được xác nhận bằng phổ biến đổi Fourier hồng ngoại trong các tế bào 3T3-L1 Cường độ tín hiệu và vùng tích hợp glycogen và carbohydrat của các tế bào mỡ 3T3 - L1 được xử lý bằng baicalein thấp hơn đáng kể so với các tế bào mỡ 3T3-L1 không được xử lý Kết quả này cho thấy rằng baicalein có thể được sử dụng như một liệu pháp bổ sung đầy hứa hẹn để kiểm soát tình trạng thừa cân hoặc béo phì [19] Baicalein cũng ức chế sự tích tụ lipid bằng cách kiểm soát chu kỳ tế bào và tín hiệu m-TOR trong các tế bào 3T3-L1 [85]
Baicalin, baicalein là hợp chất flavonoid đã được nghiên cứu rộng rãi về tác dụng
6 chống ung thư của nó Cơ chế chống ung thư tiềm năng của baicalin và baicalein bao gồm gây ra apoptosis, bắt đầu ngừng chu kỳ tế bào, ức chế di căn và điều hòa miễn dịch Baicalein cho thấy tác dụng ức chế nhiều loại ung thư nhanh hơn và mạnh hơn so với baicalin, có thể do kích thước nhỏ hơn và tính thân lipid góp phần hấp thụ nhanh và cải thiện khả năng thâm nhập vào tế bào Khi kết hợp với nhau, cả baicalin và baicalein có hiệu quả vượt trội trong điều trị ung thư [97]
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng baicalin và baicalein có tác dụng chống ung thư đối với nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư buồng trứng, cổ tử cung, vú, bàng quang, xương, phổi, đại tràng, tuyến tiền liệt, da và gan Các nghiên cứu cụ thể đã chứng minh tác dụng ức chế khả năng sống, di cư và xâm lấn tế bào ung thư của baicalin và baicalein thông qua các cơ chế như ức chế hoạt động YAP và đường truyền tín hiệu PKC/STAT3.
Tổng hợp các nghiên cứu này đã thể hiện tiềm năng của baicalin và baicalein trong điều trị và ngăn ngừa ung thư, mở ra cơ hội cho việc phát triển các phương pháp điều trị mới và hiệu quả
Baicalin đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ chống lại các bệnh gan khác nhau, bao gồm viêm gan do virus và bệnh gan nhiễm mỡ, thông qua đặc tính chống viêm và bảo vệ gan [108] Hơn nữa, baicalin đã được phát hiện có khả năng điều chỉnh tăng hemoxyase-1, một loại enzym chủ chốt trong phản ứng chống viêm, trong mô hình chuột bị tổn thương gan [96]
Tương tự, baicalein cũng đã được chứng minh là có tác dụng ức chế sự kích hoạt và tăng sinh tế bào hình sao, ngăn ngừa sự phát triển của bệnh xơ gan [43] Ngoài ra, baicalein có tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương do thiếu máu cục bộ/tái tưới máu gan bằng cách giảm sản xuất cytokin tiền viêm và tăng mức độ chống oxy hóa [66]
Trong mô hình loét dạ dày ở chuột, điều trị bằng dịch chiết cồn 50% của vỏ rễ
Oroxylum indicum cho thấy hoạt tính chống oxy hóa đáng kể, được thể hiện qua mức
7 độ giảm peroxy hóa lipid Cơ chế hoạt động chống loét có thể là do giảm tiết acid dạ dày và các hoạt động chống oxy hóa dẫn đến bảo vệ tế bào dạ dày Hoạt động này có thể liên quan đến sự hiện diện của baicalein trong vỏ rễ của cây [51]
Baicalin và baicalein là hai hợp chất có đặc tính kháng khuẩn, kháng virus với các cơ chế hoạt động đa dạng Một số nghiên cứu cho thấy, baicalin có tác dụng chống virus cụ thể như ức chế sự sao chép và xâm nhập của virus cúm A (H1N1) [29] và virus Zika (ZIKV) [75] Trong khi đó, baicalein đã được chứng minh là có hiệu quả chống lại virus herpes simplex typ 1 (HSV-1) [64], virus dengue typ 2 (DENV-2) [115], và cả SARS- CoV-2 [63] Ngoài ra, baicalein còn có tác dụng hiệp đồng với kháng sinh chống lại mầm bệnh đường miệng [46] và đảo ngược tình trạng kháng ciprofloxacin ở tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) [18] Một nghiên cứu khác cho thấy baicalin, baicalein đều có hoạt tính kháng klebsiella pneumoniae đa kháng thuốc (MDR KP), trong đó baicalein có khả năng mạnh nhất và có tác dụng hiệp đồng khi kết hợp với meropenem hoặc polymyxin E [77] Điều này cho thấy tiềm năng của baicalin và baicalein trong việc điều trị các bệnh lý gây ra bởi virus và vi khuẩn đa kháng thuốc
Baicalin và baicalein đều có tác dụng chống viêm và điều hòa miễn dịch Baicalin hoạt động chủ yếu thông qua ức chế sự kích hoạt của yếu tố NF-κB và miền oligome hóa liên kết với nucleotid như thụ thể protein miền pyrin 3 (NLRP3), cũng như ức chế biểu hiện của các yếu tố gây viêm như IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, COX-2, và iNOS [34], [62] Baicalein thể hiện tác dụng giảm viêm khớp bằng cách cải thiện quá trình tái tạo xương dưới sụn, ức chế sự tăng sinh của tiền nguyên bào xương và thúc đẩy quá trình chết của chúng Nó cũng làm suy yếu sự hình thành mạch của các tế bào nội mô và ức chế sự tăng sinh của các tế bào hoạt dịch Các kết quả này cho thấy baicalein có tiềm năng là một phương pháp điều trị hiệu quả cho viêm khớp [59].
Tổng quan về chiết xuất Núc nác
Phương pháp chiết xuất chủ yếu của dược liệu Núc nác là chiết xuất cao toàn phần, cho ra sản phẩm đa dạng về thành phần hóa học Các phương pháp chiết xuất khác nhau đã được áp dụng để chiết xuất dược liệu Núc nác, bao gồm nhiều phương pháp và kỹ thuật trong phòng thí nghiệm và sản xuất công nghiệp Hiệu quả và chất lượng sản phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó phương pháp chiết xuất và dung môi sử dụng đóng vai trò quan trọng.
1.3.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu Núc nác
Các phương pháp chiết, dung môi chiết, điều kiện chiết xuất khác nhau thì sản phẩm
8 chiết sẽ có đặc điểm và hoạt tính sinh học khác nhau Việc lựa chọn quy trình chiết xuất flavonoid từ nguyên liệu thực vật là rất quan trọng và phụ thuộc vào mục tiêu của nghiên cứu [84] Có nhiều phương pháp khác nhau để chiết xuất baicalin, baicalein trong Núc nác đã được thực hiện; có thể được chia thành hai nhóm là các phương pháp chiết xuất thông thường: chiết Soxhlet [105]; chiết hồi lưu [11], [13], [109]; chiết ngâm [87], [88]; phương pháp sắc [88] và các phương pháp chiết xuất hiện đại: chiết siêu âm [11], [15], [105]; chiết dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction – PLE) [105]; chiết chất lỏng siêu tới hạn (super critical fluid extraction – SFE) [21],
Bảng 1.1 Bảng tổng hợp các phương pháp chiết xuất baicalin, baicalein
Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Hiệu suất chiết baicalin Hiệu suất chiết baicalein
Chiết hồi lưu Đơn giản, dễ thao tác
Rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất chiết
Có thể tái sử dụng dung môi thu hồi [7]
Tốn dung môi, năng lượng [7]
Nhiệt độ cao ảnh hưởng đến độ bền của chất
Chiết ngâm Đơn giản nhất; không cần thiết bị đặc biệt [93]
Các điều kiện ngâm đồng nhất ở các quy mô nghiên cứu
Thao tác thủ công, tốn thời gian Dịch chiết chứa nhiều thành phần phức tạp và thường phải tiến hành tinh chế thêm [93]
Tăng độ tan của hoạt chất ít tan trong nước
Rút ngắn thời gian chiết so với ngâm lạnh
Tiết kiệm dung môi, dịch chiết
Dịch lẫn nhiều tạp tan trong nước
Quá trình sắc tạo nhiều phản ứng chuyển dạng hóa học của hoạt chất
Dễ chiết kiệt, tiết kiệm dung môi, dịch chiết đặc
Hiệu suất chiết tăng, rút ngắn thời gian chiết [7]
Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến độ bền của hoạt chất
Cải thiện độ tan của hoạt chất
Rút ngắn thời gian chiết [7]
Chiết dưới áp suất cao
Dễ vận hành và tự động hóa
Tiết kiệm dung môi, giảm thời gian chiết xuất
Nhiệt độ và áp suất cao có thể gây phân hủy, biến đổi chất
Chiết chất lỏng siêu tới hạn
An toàn, không độc, có khả năng thu hồi tái sử dụng
Hiệu suất cao, không để lại dư lượng dung môi trong cao chiết
Nhiệt độ thấp nên không làm biến đổi những thành phần kém bền nhiệt
Làm việc ở điều kiện áp suất cao [7]
Các phương pháp chiết xuất thông thường dễ thực hiện, không cần thiết bị đặc biệt, có thể áp dụng để chiết một số lượng lớn mẫu và mang lại hiệu suất chiết cao Tuy nhiên,
10 chúng không có tính chọn lọc, một số độ chọn lọc có thể đạt được với dung môi phù hợp, tùy theo độ phân cực của phần flavonoid mục tiêu [93] Các phương pháp chiết hiện đại như chiết siêu âm, chiết dưới áp suất cao, chiết bằng dung môi siêu tới hạn cho hiệu suất chiết cao với thời gian chiết xuất ngắn, giảm lượng dung môi tiêu thụ và có khả năng tự động hóa [24], [93] Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, điều kiện chiết xuất khó khăn hơn dẫn đến khó ứng dụng trong quy mô công nghiệp Do đó, trong thực tế sản xuất vẫn ưu tiên các phương pháp chiết truyền thống như chiết hồi lưu vì tính kinh tế và trang thiết bị sẵn có
Các flavonoid thường được chiết xuất bằng nhiều dung môi khác nhau như: ethanol, methanol, ethyl acetat, aceton,… Đặc tính của dung môi chiết xuất ảnh hưởng đáng kể đến tính chất và hoạt tính sinh học của các flavonoid được chiết xuất Dưới đây là bảng tổng hợp một số dung môi được sử dụng chiết xuất baicalin, baicalein từ cây Núc nác:
Bảng 1.2 Bảng tổng hợp các dung môi chiết xuất Núc nác
Dung môi Ưu điểm Nhược điểm Hiệu suất chiết Baicalin Hiệu suất chiết Baicalein
Hòa tan nhiều loại hoạt chất
Dung môi xanh, an toàn
Tốn chi phí hơn so với dung môi là nước
Methanol Khả năng hòa tan tốt Độc, hạn chế dùng
Dung môi phổ biến nhất, sẵn có, rẻ, không độc
Hòa tan không chọn lọc
Ethyl acetat Ít độc, mùi dễ chịu
Chủ yếu chiết xuất hợp chất ít phân cực
Khả năng hòa tan tốt các chất béo và một số nhóm hợp chất tự nhiên
11 Ít độc, dễ bay hơi
DMSO Ít độc Chi phí cao 13,883 mg/g
DMF Độc, hạn chế dùng
Tổng quan về nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất baicalin, baicalein
1.4.1 Trong dược liệu Núc nác
Trong nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất baicalin từ vỏ thân cây Oroxylum indicum của Adin Syeda Nashvia và các cộng sự (2022) đã so sánh hiệu quả của các phương pháp chiết xuất baicalin như phương pháp chiết siêu âm, phương pháp hồi lưu, phương pháp Soxhlet và phương pháp ngâm sử dụng các dung môi ethanol, aceton, DMSO, DMF; với quy mô chiết xuất 3 g/mẻ; tỷ lệ DM/DL là 10/1 mL/g; kết quả khảo sát đơn yếu tố cho thấy phương pháp siêu âm cho hàm lượng của baicalin cao nhất và dung môi là ethanol được coi là dung môi chiết xuất hiệu quả nhất Họ tiếp tục sử dụng thiết kế Box- Behnken (BBD) để tối ưu hóa các thông số quy trình chiết xuất baicalin bằng phương pháp siêu âm với các thông số khảo sát là thời gian chiết, tỷ lệ DM/DL, nhiệt độ chiết Kết quả thu được các điều kiện chiết xuất tối ưu là thời gian chiết 29,058 phút; tỷ lệ DM/DL 21,124 mL/g và nhiệt độ chiết 67,963°C; hàm lượng baicalin thu được là 26,572 mg/g [14]
Trong luận văn thạc sĩ của tác giả Lê Thị Bảo Ngọc là “Nghiên cứu quy trình điều chế cao chiết giàu baicalin từ vỏ thân cây Núc nác quy mô phòng thí nghiệm” đã khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất và làm giàu baicalin từ dịch chiết vỏ thân Núc nác bằng phương pháp thay đổi một yếu tố và phương pháp bề mặt đáp ứng Kết quả chỉ ra phương pháp chiết hồi lưu bằng dung môi ethanol 70%; thời gian chiết 2 giờ 10 phút; tỷ lệ dung môi/dược liệu 8/1 và quy trình làm giàu baicalin từ dịch chiết sử dụng nhựa D101; nồng độ baicalin trong dịch nạp 1mg/mL; tốc độ nạp dịch chiết 2 BV/h; thời gian nạp dịch chiết 8 giờ, dung môi giải hấp phụ ethanol 50%; thời gian giải hấp phụ 3 giờ cho hiệu suất chiết baicalin là 61,60% [9]
Để tối ưu hóa quá trình chiết xuất baicalein từ vỏ thân Núc nác, tác giả Nguyễn Bá Cường đã lựa chọn phương pháp chiết siêu âm với nồng độ ethanol 70%, thời gian chiết 1 giờ, số lần chiết 2 lần và tỷ lệ dung môi/dược liệu 8/1 Bằng phương pháp này, hiệu suất chiết xuất baicalein đạt 67,35%, đáp ứng yêu cầu về chất lượng cao của dược liệu.
Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết baicalin từ Scutellaria baicalensis sử dụng
Thiết kế thí nghiệm trực giao để phân tích tối ưu hóa quy trình chiết baicalin bằng phương pháp ngâm kết hợp với sắc, sử dụng dung môi là nước với các thông số khảo sát là tỷ lệ DM/DL; thời gian ngâm; thời gian sắc Quy mô ban đầu là 10 g/mẻ Kết quả thu được các điều kiện chiết xuất tối ưu là tỷ lệ DM/DL 12 mL/g; thời gian ngâm 1 giờ; thời gian sắc 30 phút Họ tiếp tục nâng cấp lên quy mô 500 g/mẻ với các điều kiện chiết xuất tối ưu ở trên thu được hàm lượng baicalin là 60,76 mg/g; hiệu suất tạo cao là 33,06%
Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất baicalein và pinostrobin từ Scutellaria violacea sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng [89]: Đã tiến hành khảo sát sơ bộ với phương pháp chiết ngâm kết hợp với khuấy trộn để tìm ra dung môi chiết xuất hiệu quả nhất Các dung môi như: hexan, cloroform, ethyl acetat, aceton, ethanol, methanol, được lựa chọn để khảo sát; cùng với các dung môi nhị phân như ethanol 70%, methanol 70% Kết quả thử nghiệm đơn yếu tố cho thấy methanol 70% cho hiệu suất tối đa; trong khi hiệu suất các chất chuyển hóa (baicalein, pinostrobin) tương đối thấp khi sử dụng các dung môi nguyên chất Tiếp đó, các nhà nghiên cứu sử dụng thiết kế Box-Behnken (BBD) để tối ưu hóa các yếu tố chiết xuất bao gồm: nồng độ methanol, tỷ lệ DM/DL, tốc độ khuấy, thời gian chiết xuất Kết quả cho thấy điều kiện chiết xuất tối ưu là methanol 53,3%; tỷ lệ DM/DL 12,46/1 mL/g; tốc độ khuấy 285 vòng/phút; thời gian chiết 6,07 giờ Với điều kiện này, hàm lượng baicalein, pinostrobin thu được lần lượt là 2,89 mg/g; 3,99 mg/g
Hiện nay, ở Việt Nam và trên thế giới những nghiên cứu về tối ưu hóa chiết xuất baicalin, baicalein từ dược liệu, đặc biệt là từ dược liệu Núc nác vẫn còn hạn chế Mặc dù có một số nghiên cứu về việc chiết xuất các flavonoid từ cây Núc nác, nhưng chưa có nghiên cứu nào tập trung mạnh mẽ vào việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất baicalin và baicalein từ vỏ thân Núc nác Do đó, việc tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình chiết xuất baicalin và baicalein từ vỏ thân Núc nác là rất cần thiết Với mục tiêu góp phần tạo ra sản phẩm chiết xuất có hàm lượng hoạt chất cao, có thể ứng dụng trong điều trị bệnh một cách hiệu quả và an toàn.
Tổng quan về phương pháp định lượng baicalin, baicalein
Phương pháp định lượng đồng thời baicalin, baicalein trong dược liệu Hoàng cầm
Sử dụng cột C18 (đường kính 250 mm × 4 mm, cỡ hạt 5 μm) Pha động bao gồm acetonitril (dung môi A) và acid phosphoric 0,1% (dung môi B), với chương trình gradient: 0 – 8 phút: 22% (dung môi A); 8 – 25 phút: 22 – 23% (dung môi A); 25 – 50 phút: 23 – 43% (dung môi A) Tốc độ dòng chảy theo chương trình: 0–25 phút: 1,0 –
13 1,5 mL/phút; 25 – 32 phút: 1,5–1,0 mL/phút; 32 – 50 phút: 1,0 mL/phút Cột được cân bằng trong 20 phút trước mỗi lần phân tích Thể tích tiêm là 20 μL và nhiệt độ của cột được duy trì ở 40℃ và bước sóng phát hiện 280 nm [110]
Trong nghiên cứu “Định lượng đồng thời baicalin, baicalein và chrysin trong dược liệu Hoàng bá nam bằng HPLC – UV” sử dụng hệ dung môi acetonitril/acid formic 0,1% trong nước, chế độ rửa giải gradient: 0 – 20 phút: 30/70; 20 – 40 phút: 50/50 với tốc độ dòng là 0,5 mL/phút, lượng acetonitril cần dùng chạy cho một mẫu là 8 mL, bước sóng phát hiện của baicalein 280 nm với độ tuyến tính tốt R 2 = 0,9997, trong một khoảng nồng độ rộng Phương pháp đảm bảo độ đúng (96% - 98,33%), độ lặp lại tốt, LOD của baicalin = 0,16 μg/mL, LOQ của baicalin = 0,53 μg/mL ; LOD của baicalein = 0,11 μg/mL, LOQ của baicalein = 0,35 μg/mL [11]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, thiết bị
Nguyên liệu nghiên cứu là vỏ thân Núc nác được thu hái vào tháng 4 năm 2024 tại thị trấn Ba Hàng Đồi, huyện Lạc Thủy, tỉnh Hòa Bình Mẫu được giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược
Hà Nội (Phụ lục I, mã số tiêu bản HNIP/18825/24)
Xử lý mẫu sau khi thu hái: thái thành phiến dày khoảng 0,6 - 1,3 cm; dài khoảng 5 –
Xử lý dược liệu trước khi chiết: dược liệu được xay nhỏ và rây qua rây 1400 (không dưới 97% lượng bột qua rây), đồng nhất mẫu, bảo quản trong túi PE kín, để nơi khô ráo (bình hút ẩm)
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng
Danh mục Tên hóa chất Nguồn gốc
Lô MUST-23042513 Chengdu Must Bio- chnology
Dung môi pha chế, chiết xuất, tráng rửa
Nước cất Phòng cung cấp nước cất của trường Đại học Dược Hà Nội
EtOH 96% Công ty cổ phần Tập đoàn
Hóa chất Đức Giang Methanol
Dung môi khai triển sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Nước (HPLC) Phòng cung cấp nước cất của trường Đại học Dược Hà Nội Các hóa chất, thuốc thử định tính khác Trung Quốc
2.1.2.2 Dụng cụ, trang thiết bị
Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ và thiết bị sử dụng
STT Dụng cụ và Thiết bị Tiêu chuẩn
1 Tủ sấy Shellab, tủ sấy Memmert Đức
2 Bếp cô cách thủy Memmert Đức
3 Bếp bảo ôn model WHM12014 Hàn Quốc, Daihan
4 Tủ hốt hóa chất Fume hood Việt Nam, Ati
5 Máy li tâm Hermle Z207A Đức
6 Bể siêu âm Elmasonic S 100H Đức, Elma
Hệ thống cô quay chân không (gồm bể điều nhiệt, bộ phận điểu chỉnh tốc độ quay, sinh hàn, máy bơm chân không) Đức, IKA
8 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC –
9 Máy xay Dược liệu DQF - 200 Trung Quốc
10 Máy đo độ ẩm Ohaus Trung Quốc
11 Cột sắc ký lỏng Kromasil Hãng Kromasil
12 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S Thụy Sĩ
13 Cân kĩ thuật AND EK – 410i Japan
14 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S Thụy Sĩ
Tủ lạnh bảo quản mẫu, bếp từ, các dụng cụ bằng thủy tinh (bình nón, đũa thủy tinh, phễu lọc, bình cầu, mao quản, vial,…), các dụng cụ đo lường (cồn kế, nhiệt kế, pipet, ống đong, bình định mức, thước mét), bông lọc, giấy lọc, giấy dán dầu, các dụng cụ lưu mẫu và lấy mẫu khác
Phần mềm Design Expert 13.0.5 và phần mềm SPSS 26.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng baicalin, baicalein trong cao đặc Núc nác
Phương pháp định lượng baicalin, baicalein trong cao đặc Núc nác được xây dựng theo Phụ lục 5.3 của Dược điển Việt Nam V, sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp đã được thẩm định về các thông số chất lượng như tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ chụm, độ đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, đáp ứng yêu cầu của tiêu chuẩn.
2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất baicalin, baicalein trong cao đặc Núc nác và xây dựng quy trình chiết xuất hoàn chỉnh
Dự kiến các giai đoạn chính của quy trình chiết xuất cao đặc Núc nác
Khảo sát các yếu tố: dung môi chiết xuất, phương pháp chiết xuất, thời gian chiết xuất, số lần chiết, tỷ lệ DM/DL các thông số đánh giá bao gồm: hiệu suất tạo cao, hàm lượng baicalin, hàm lượng baicalein và tổng hàm lượng baicalin, baicalein trong cao đặc Núc nác Trên cơ sở đó lựa chọn các điều kiện thích hợp để xây dựng quy trình chiết xuất ở quy mô 20 g dược liệu/mẻ.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng baicalin, baicalein trong cao đặc Núc nác
2.3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
Nhóm nghiên cứu tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shidzuma, LC – 10Adxr; sử dụng cột pha đảo: Kromasil® 100 – 5 C18 Column 250 × 4 mm; phân tích bằng detector UV-VIS (D2&W); phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC Tiến hành khảo sát trên mẫu trắng, mẫu chuẩn hỗn hợp baicalin (50 μg/mL) và baicalein (25 μg/mL); mẫu thử cao chiết bằng ethanol 70% (theo quy trình dự kiến ở mục 2.3.2) Với các thông số và điều kiện khảo sát như sau: tốc độ dòng: 1,0 mL/phút; nhiệt độ cột: 40ºC; thể tích tiêm mẫu: 10 μL
- Quét phổ lựa chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ của chất chuẩn đơn baicalin
(50 μg/mL); baicalein (50 μg/mL) từ bước sóng 190 nm đến 800 nm
- Khảo sát chương trình rửa giải: với pha động gồm acetonitril (kênh C) phối hợp với acid phosphoric 0,1% trong nước (kênh D) theo các tỷ lệ khác nhau:
Bảng 2.3 Các chương trình rửa giải
Tỷ lệ pha động C/D Thời gian
Tỷ lệ pha động C/D Thời gian
Thông số đánh giá: thời gian lưu, hệ số kéo đuôi (Tailing factor) hay hệ số đối xứng
(AS) của pic sắc ký phải trong khoảng từ 0,8 đến 1,5 (theo yêu cầu của Dược điển Việt
Nam V – phụ lục 5 [2]), 2 pic baicalin và baicalein tách hoàn toàn khỏi nền mẫu và các pic tạp khác; độ phân giải của baicalin, baicalein và các pic tạp phải lớn hơn 1,5 (RS ≥ 1,5) theo yêu cầu của AOAC [16]
2.3.1.2 Cách tiến hành và đánh giá kết quả Định lượng baicalin, baicalein trong cao Núc nác bằng phương pháp đường chuẩn Xây dựng đường chuẩn: nồng độ baicalin trong khoảng từ 6,25 μg/mL đến 250 μg/mL và nồng độ baicalein trong khoảng từ 3,125 μg/mL đến 125 μg/mL
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc baicalin: cân chính xác khoảng 10,00 mg baicalin chuẩn vào bình định mức 10 mL, thêm ethanol hòa tan và định mức đến vạch
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc baicalein: cân chính xác khoảng 5,00 mg baicalein chuẩn vào bình định mức 10 mL, thêm ethanol hòa tan và định mức đến vạch
Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc tính theo công thức:
Trong đó: m: khối lượng chất chuẩn đã cân (μg); V: thể tích dung dịch chuẩn (mL);
P: độ tinh khiết của chất chuẩn (PBaicalin = 98,53%; PBaicalein = 98,19%); h: hàm ẩm trong chất chuẩn (hBaicalin = 1,8%; hBaicalein = 1,5%)
Dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc: Hút chính xác 5,0 mL dung dịch chuẩn gốc baicalin và 5,0 mL dung dịch chuẩn gốc baicalein (ở trên), lắc đều
Từ dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc tiến hành pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ baicalin trong khoảng từ 6,25 μg/mL đến 250 μg/mL và nồng độ baicalein trong khoảng từ 3,125 μg/mL đến 125 μg/mL
Cân chính xác 0,1000 g cao, hòa tan bằng ethanol sau đó định mức vào bình 50 mL Pha loãng nếu cần Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm để thu được dung dịch tiêm sắc ký.
* Tiến hành và công thức tính kết quả:
Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn hỗn hợp đã chuẩn bị ở trên, thu được các diện tích pic Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mỗi tương quan giữa diện tích pic với nồng độ baicalin, baicalein: y = ax + b với hệ số tương quan 0,995 ≤ R ≤ 1,000
18 Tiến hành chạy sắc ký các mẫu thử, thu được diện tích pic và thời gian lưu
Hàm lượng baicalin, baicalein tính theo các công thức sau:
Hàm lượng baicalin (%) trong mẫu thử được tính theo công thức
Hàm lượng baicalein (%) trong mẫu thử được tính theo công thức
Trong đó: Ct là nồng độ baicalin (hoặc baicalein) trong dung dịch mẫu thử (μg/mL) tính từ đường chuẩn; Dt là hệ số pha loãng của mẫu thử; mt là khối lượng mẫu thử (g); h là hàm ẩm của mẫu thử (%)
2.3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng baicalin, baicalein trong cao Núc nác
Quy trình định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [16] về tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ chụm, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được tiến hành trên mẫu cao đặc Núc nác bất kỳ a Độ đặc hiệu:
Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích: Dung dịch mẫu trắng; dung dịch chuẩn đơn baicalin; dung dịch chuẩn đơn baicalein; dung dịch chuẩn hỗn hợp baicalin, baicalein; dung dịch mẫu thử cao; dung dịch mẫu thử cao thêm chuẩn
- Dung dịch phân giải: chất chuẩn baicalin, baicalein tách hoàn toàn khỏi nhau với độ phân giải Rs ≥ 1,5
- Sắc ký đồ của mẫu trắng: không được xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu ứng với thời gian lưu của chất chuẩn baicalin, baicalein Nếu có xuất hiện pic tại vị trí tương ứng thì ảnh hưởng %AH ≤ 1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn
- Sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn hỗn hợp: Thời gian lưu của baicalin, baicalein trong sắc ký đồ của dung dịch thử so với dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch chuẩn đơn là khác nhau không có ý nghĩa thống kê Trên sắc ký đồ dung dịch thử nếu xuất hiện thêm các pic khác (pic tạp) không phải pic của baicalin, baicalein thì pic baicalin, baicalein phải tách hoàn toàn khỏi các pic tạp và đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng được quy định trong Dược điển Việt Nam V [2]
- Dung dịch chuẩn đơn: chồng phổ của baicalin, baicalein trong dung dịch thử so với chất chuẩn baicalin, baicalein trong dung dịch chuẩn đơn cho hệ số match xấp xỉ 1
19 b Độ thích hợp của hệ thống:
Tính thích hợp của hệ thống sắc ký được khảo sát dựa vào việc phân tích theo quy trình 6 lần một mẫu chuẩn, được đánh giá dựa vào sai số tương đối của 6 phép thử song song đối với thời gian lưu, diện tích pic Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp baicalin (nồng độ 100 μg/mL), baicalein (nồng độ 50 μg/mL) 6 lần, ghi lại các sắc ký đồ và xác định thời gian lưu, diện tích pic của baicalin, baicalein
Yêu cầu: %RSD của thời gian lưu và diện tích pic baicalin, baicalein ≤ 2,0% [16] Hệ số kéo đuôi (Tf) nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5 (theo yêu cầu chung của phương pháp định lượng trong Dược điển Việt Nam V [2]) c Độ tuyến tính: Để khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp, tiến hành pha một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ: baicalin: 6,25 – 25 – 50 – 100 – 150 – 200 – 250 μg/mL; baicalein: 3,125 - 12,5 – 25 – 50 – 75 – 100 – 125 μg/mL và chạy sắc ký theo quy trình phân tích Xây dựng đường chuẩn y = ax + b với y là diện tích pic và x là nồng độ (μg/mL)
- Hệ số tương quan tuyến tính (R) của baicalin, baicalein ≥ 0,995
- % Hệ số chắn tại điểm giữa đường chuẩn (Baicalin nồng độ 100 μg/mL; baicalein nồng độ 50 μg/mL): Y% ≤ 2,0%
- Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ
Trong đó: ∆ 𝑖 : Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn; 𝐶 𝑡 : Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn; 𝐶 𝐶 : Nồng độ của các điểm chuẩn d Độ chụm:
- Độ lặp lại của phương pháp được tiến hành bằng cách định lượng với 6 thí nghiệm riêng biệt thực hiện trong ngày bằng phương pháp đã chọn
Yêu cầu: %RSDr ≤ 2% (với cả baicalin và baicalein) (với mức hàm lượng trên 1% đến dưới 10%) theo AOAC [16]
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng baicalin, baicalein trong
3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng baicalin, baicalein trong cao đặc Núc nác
3.1.1.1 Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký a Khảo sát bước sóng phát hiện
Chuẩn bị mẫu chuẩn như mô tả ở mục phương pháp, tiến hành khảo sát và phân tích mẫu chuẩn baicalin, baicalein ghi phổ trong khoảng 190 - 800 nm
Hình 3.1 Phổ UV của Baicalin và Baicalein
Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hợp chất baicalin có định hấp thụ cực đại tại
214 nm, 276 nm, 316 nm và hợp chất baicalein có định hấp thụ cực đại tại 215 nm, 275 nm, 322 nm Bước sóng 214 nm và 215 nm có độ hấp thụ lớn hơn bước sóng 276 nm và
Để định lượng đồng thời baicalin và baicalein trong dung dịch chiết từ mẫu thực vật, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn bước sóng phù hợp Bước sóng lựa chọn phải cân bằng giữa độ hấp thụ của hai hợp chất này và hạn chế ảnh hưởng của dung môi chiết xuất Mặc dù bước sóng 275 nm cho độ hấp thụ cao, nhưng để giảm thiểu tác động của dung môi, nhóm nghiên cứu đã sử dụng bước sóng khác với độ hấp thụ nhỏ hơn đáng kể đối với baicalin so với baicalein Bước sóng này cho phép định lượng đồng thời chính xác cả hai hợp chất trong mẫu.
276 nm để theo dõi, định lượng các hợp chất trên trong mẫu cao Núc nác b Khảo sát chương trình rửa giải
Kết quả khảo sát chương trình rửa giải gradient với pha động gồm acetonitril (kênh C) phối hợp với acid phosphoric 0,1% trong nước (kênh D) theo các tỷ lệ khác nhau được trình bày trong hình dưới đây:
Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát chương trình rửa giải Nhận xét:
Hệ số 1: Khi tỷ lệ pha động acetonitril (kênh C)/acid phosphoric 0,1% trong nước
(kênh D) là 25/75 (tt/tt); pic baicalin vẫn chưa tách hoàn toàn khỏi các chất khác, nhưng pic baicalein đã tách hoàn toàn khỏi nền mẫu, pic đẹp, cân đối với hệ số kéo đuôi (Tailing factor) là 0,915
Hệ số 2: Nhóm nghiên cứu tiếp tục giảm tỷ lệ acetonitril xuống (acetonitril/acid phosphoric 0,1% trong nước là 20/80) để khảo sát tách baicalin; tăng tỷ lệ pha động acetonitril/acid phosphoric 0,1% trong nước lên 30/70 để tách baicalein mục đích muốn giảm thời gian phân tích Khi chạy tỷ lệ 20/80 trong 25 phút đầu tiên và chạy tỷ lệ 30/70 (C/D) từ phút 30 đến phút 45, nhận thấy pic baicalin đã tách hoàn toàn khỏi các pic tạp khác với độ phân giải RS = 1,79 > 1,5; pic đẹp, cân đối với hệ số kéo đuôi (Tailing factor) là 0,944 vì vậy nhóm nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ pha động là 20/80 (C/D) để tách baicalin; nhưng với tỷ lệ 30/70 (C/D) pic baicalein chưa tách khỏi nền mẫu, nên nhóm nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ 25/75 (C/D) để tách baicalein
Hệ số 3: Khi tỷ lệ pha động là 20/80 (C/D) trong 23 phút đầu tiên và 25/75 (C/D) từ phút 25 đến phút 55, pic baicalin và baicalein đều đã tách hoàn toàn khỏi các pic tạp
30 khác và tách khỏi nền mẫu, pic đẹp, cân đối; hệ số kéo đuôi (Tailing factor) của baicalin, baicalein lần lượt là 0,912 và 0,936 đều nằm trong khoảng 0,8 đến 1,5 (theo yêu cầu của
Dược điển Việt Nam V – phụ lục 5 [2])
Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn Hệ số 3 để phân tích định lượng baicalin, baicalein trong cao Núc nác
3.1.2 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng baicalin, baicalein trong cao đặc Núc nác
Tiến hành thẩm định trên mẫu cao đặc Núc nác bất kỳ
Kết quả thẩm định các tiêu chuẩn về tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chụm, độ đúng và giới hạn phát hiện (LOD); giới hạn định lượng (LOQ) được trình bày chi tiết ở Phụ lục III và được trình bày tóm tắt ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng baicalin, baicalein Độ đặc hiệu
Tín hiệu pic baicalin xuất hiện tại khoảng thời gian lưu khoảng 20 phút, pic baicalein xuất hiện tại khoảng thời gian lưu khoảng 50 phút Thời gian lưu baicalin, baicalein trong mẫu chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn khác nhau không có ý nghĩa thống kê
Trên sắc ký đồ mẫu trắng không thấy xuất hiện tín hiệu pic tại thời gian lưu này Mặt khác, phổ của mẫu chuẩn và mẫu thử thêm chuẩn; mẫu chuẩn và mẫu thử đều cho kết quả hệ số chồng phổ xấp xỉ 1,0 Độ thích hợp của hệ thống
RSD (%) lần lượt của diện tích đỉnh và thời gian lưu của baicalin là 0,85% và 0,23%; của baicalein là 0,73% và 0,13%, đều nhỏ hơn 2% Giá trị hệ số kéo đuôi của đỉnh pic baicalin xấp xỉ 1 Số đĩa lý thuyết lớn hơn 5000 đối với cả baicalin và baicalein, cho thấy hiệu suất tách chất của cột sắc ký là tốt Độ phân giải giữa hai đỉnh của baicalin và baicalein lớn hơn 21.
Hệ số tương quan R của đường chuẩn baicalin và baicalein đều bằng 0,9999
≥ 0,995 % hệ số chắn tại nồng độ chuẩn C4 của baicalin là 1,5% và của baicalein là 1,1% đều nhỏ hơn 2,0% Độ chệch của tất cả các nồng độ của đường chuẩn đều nằm trong khoảng từ -15% đến 15% Độ chụm
Ngày 1: RSDr = 1,1% (Baicalin); RSDr = 1,3% (Baicalein)
Ngày 2: RSDr = 1,3% (Baicalin); RSDr = 1,0% (Baicalein)
Giữa các ngày: RSDR = 1,2% (Baicalin); RSDR = 1,1% (Baicalein)
Phân tích ANOVA trên phần mềm SPSS cho kết quả: sig > 0,05; trung bình hàm lượng Baicalin, Baicalein trong 2 ngày khác nhau không có ý nghĩa
Baicalin: tỷ lệ thu hồi 98,2% đến 99,0% nằm trong khoảng từ 92,0 -
Baicalein: tỷ lệ thu hồi 97,1% đến 99,7% nằm trong khoảng từ 92,0 -
Baicalin: LOD = 0,12 μg/mL; LOQ = 0,396 μg/mL
Baicalein: LOD = 0,11 μg/mL; LOQ = 0,363 μg/mL
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất baicalin,
3.2.1 Khảo sát dung môi chiết
Tiến hành khảo sát dung môi chiết lần lượt là ethanol 30%; ethanol 50%; ethanol 70%; ethanol 90% Các thông số được cố định bao gồm: dược liệu kích thước bột thô; phương pháp chiết hồi lưu; thời gian chiết 60 phút/lần; số lần chiết 2 lần; tỷ lệ DM/DL 8/1 mL/g Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết được thể hiện ở hình 3.3
Hình 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết
Nhận xét: Khi tăng nồng độ ethanol từ 30% lên 90% thì hàm lượng baicalin tăng từ
1,12% lên 11,90% Tuy nhiên, hàm lượng baicalein lại có xu hướng ngược lại, khi giảm nồng độ ethanol từ 90% xuống 50% thì hàm lượng baicalein tăng lên (2,35% → 6,27%); nhưng khi tiếp tục giảm nồng độ ethanol từ 50% xuống 30% thì hàm lượng baicalein lại giảm xuống 3,67% Tổng hàm lượng baicalin, baicalein có xu hướng tăng dần (tăng từ 4,79% lên 14,25%) khi tăng nồng độ ethanol từ 30% lên 90% Hiệu suất tạo cao dao
Kết quả khảo sát dung môi chiết
Hàm lượng baicalin Hàm lượng baicalein
Tổng hàm lượng baicalin, baicalein Hiệu suất tạo cao
32 động trong khoảng từ 24,86% đến 28,22% và cao nhất ở nồng độ ethanol 70% và 50%
Do đó, khoảng nồng độ 50 – 90% được lựa chọn để đưa vào mô hình tối ưu hóa RSM và EtOH 90% được chọn làm dung môi chiết cao cho các thí nghiệm tiếp theo
3.2.2 Khảo sát phương pháp chiết
Tiến hành khảo sát một số phương pháp chiết theo quy trình ở mục 2.3.2.2 phần a Các thông số được cố định bao gồm: dược liệu kích thước bột thô; dung môi chiết EtOH 90%; thời gian chiết 60 phút/lần; số lần chiết 2 lần; tỷ lệ DM/DL 8/1 mL/g thu được kết quả như sau:
Hình 3.4 Kết quả khảo sát phương pháp chiết
Nhận xét: Kết quả cho thấy phương pháp chiết xuất ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng baicalin và hiệu suất tạo cao Khả năng chiết xuất baicalin giảm dần theo thứ tự: phương pháp hồi lưu > phương pháp siêu âm ở 55℃ > phương pháp ngâm ở 55℃ > phương pháp siêu âm ở nhiệt độ phòng > phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng (11,90% > 10,70%
> 10,15% > 9,56% > 7,59%) Tuy nhiên, khả năng chiết xuất baicalein không bị ảnh hưởng nhiều bởi phương pháp chiết Kết quả cho thấy hàm lượng baicalin khi chiết bằng các phương pháp siêu âm ở nhiệt độ thường và ở 55℃; phương pháp ngâm ở 55℃ và steđến 2,64%) và lớn hơn phương pháp ngâm ở nhiệt độ thường (1,72%) Phương pháp chiết hồi lưu cho hiệu suất tạo cao là 24,86%; và tổng hàm lượng baicalin, baicalein là
Siêu âm - Nhiệt độ thường
Siêu âm 55℃ Hồi lưu Ngâm - Nhiệt độ phòng Ngâm 55℃
Kết quả khảo sát phương pháp chiết
Hàm lượng baicalin Hàm lượng baicalein
Tổng hàm lượng baicalin, baicalein Hiệu suất tạo cao
33 14,25%, cao hơn phương pháp siêu âm và phương pháp ngâm Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết hồi lưu để chiết xuất cao đặc Núc nác
3.2.3 Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành khảo sát tỷ thời gian chiết với các giá trị khảo sát lần lượt là 30 phút; 60 phút; 90 phút; 120 phút; 180 phút Các thông số được cố định bao gồm: dược liệu kích thước bột thô; dung môi chiết Ethanol 90; phương pháp chiết hồi lưu; số lần chiết 2 lần; tỷ lệ DM/DL 8/1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết như sau:
Hình 3.5 Kết quả khảo sát thời gian chiết
Nhận xét: Thời gian chiết xuất thay đổi từ 30 phút đến 60 phút, hàm lượng baicalin tăng từ 11,01% lên 11,90%, baicalein tăng từ 2,16% lên 2,35% Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian chiết từ 60 phút đến 120 phút, hàm lượng baicalin giảm xuống 10,66%, hàm lượng baicalein tăng lên 2,53% Kết quả này cho thấy khi thời gian chiết kéo dài hơn 60 phút, hàm lượng baicalin bắt đầu giảm, có thể do sự phân hủy hoặc phản ứng phụ; tuy nhiên hàm lượng baicalein vẫn tiếp tục tăng, có thể do baicalin bị thủy phân thành baicalein Khi thời gian chiết kéo dài đến 180 phút, cả baicalin và baicalein đều giảm, có thể do sự phân hủy của các hợp chất này ở thời gian chiết quá dài hoặc do sự hấp thụ ngược trở lại của các chất đã hòa tan vào bã dược liệu Về hiệu suất tạo cao, giai đoạn ban đầu (30 phút đến 60 phút) quá trình chiết xuất diễn ra mạnh mẽ, các hoạt chất hòa tan tối đa vào dung môi, dẫn đến hiệu suất tạo cao tăng lên Khi thời gian chiết tiếp tục tăng (60 phút đến 90 phút) quá trình hòa tan đạt trạng thái cân bằng, dẫn đến hiệu
30 phút 60 phút 90 phút 120 phút 180 phút
Khảo sát thời gian chiết
Hàm lượng baicalin Hàm lượng baicalein
Tổng hàm lượng baicalin, baicalein Hiệu suất tạo cao
34 suất tạo cao duy trì ở mức cao nhưng không tăng thêm nhiều Do vậy, khoảng thời gian chiết từ 30 phút đến 90 phút được lựa chọn để đưa vào mô hình tối ưu hóa sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng, và thời gian chiết 60 phút được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo
3.2.4 Khảo sát số lần chiết
Tiến hành khảo sát số lần chiết với các giá trị khảo sát lần lượt là 1 lần, 2 lần, 3 lần,
4 lần Các thông số được cố định bao gồm: dược liệu kích thước bột thô; dung môi chiết ethanol 90%; phương pháp chiết hồi lưu; thời gian chiết 60 phút/lần; tỷ lệ DM/DL 8/1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết được thể hiện ở hình 3.6
Hình 3.6 Kết quả khảo sát số lần chiết
Nhận xét: Khi tăng số lần chiết xuất từ 1 lần lên 2 lần, hàm lượng baicalin, hàm lượng baicalein, hiệu suất tạo cao cũng tăng lên (hàm lượng baicalin tăng từ 9,55% lên 11,90%; hàm lượng baicalein tăng từ 2,15% lên 2,35%; hiệu suất tạo cao tăng từ 16,84% lên 24,86%) Tuy nhiên, khi tăng số lần chiết từ 2 lần lên 3 lần, 4 lần; hàm lượng baicalin, baicalein đều giảm đi; hiệu suất tạo cao tăng lên 25,85% (3 lần); 26,14% (4 lần) Mặt khác, số lần chiết càng nhiều, lượng dịch chiết thu được càng lớn, gây tiêu tốn dung môi, năng lượng trong quá trình xử lý thành cao; đồng thời cao chiết được cũng chứa nhiều tạp Do đó, số lần chiết được lựa chọn trong các thí nghiệm tiếp theo là 2 lần
3.2.5 Khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu
Tiến hành khảo sát tỷ lệ DM/DL với các giá trị khảo sát lần lượt là 6/1; 8/1; 10/1;
Khảo sát số lần chiết
Hàm lượng baicalin Hàm lượng baicalein
Tổng hàm lượng baicalin, baicalein Hiệu suất tạo cao
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết/dược liệu đến năng suất chiết xuất alkaloid toàn phần của lá hàm ếch cho thấy: Năng suất chiết xuất alkaloid toàn phần có xu hướng tăng khi tỷ lệ dịch chiết/dược liệu tăng Cụ thể, năng suất chiết xuất alkaloid toàn phần tăng từ 3,35 mg/g (tỷ lệ dịch chiết/dược liệu 10 mL/g) lên 4,53 mg/g (tỷ lệ dịch chiết/dược liệu 15 mL/g) Tuy nhiên, khi tỷ lệ dịch chiết/dược liệu tiếp tục tăng lên 20 mL/g, năng suất chiết xuất alkaloid toàn phần lại giảm xuống còn 4,23 mg/g.
Hình 3.7 Kết quả khảo sát tỷ lệ DM/DL
Nhận xét: Khi tăng tỷ lệ DM/DL từ 6/1 đến 12/1 hàm lượng baicalin và baicalein đều tăng (hàm lượng baicalin tăng từ 10,61% đến 12,56%, baicalein tăng từ 2,34% đến 2,80%) Khi tiếp tục tăng tỷ lệ DM/DL lên 12/1 thì hàm lượng baicalin, baicalein tăng lên không đáng kể Kết quả này cho thấy việc tăng tỷ lệ DM/DL từ 6/1 đến 12/1 cải thiện hàm lượng baicalin và baicalein, cũng như hiệu suất tạo cao Tuy nhiên, khi tỷ lệ DM/DL vượt quá 10/1, lợi ích chiết xuất trở nên không đáng kể Tỷ lệ DM/DL cao hơn không chỉ làm lãng phí dung môi mà còn kéo dài quá trình xử lý (thời gian cô đặc, bay hơi), làm tăng chi phí và lãng phí dung môi [106] Do đó nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ DM/DL từ 6/1 đến 10/1 để đưa vào mô hình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng.
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất baicalin,
Thiết kế thí nghiệm theo mô hình Box-Behnken sử dụng phần mềm Design Expert 13.0.5 gồm 15 thí nghiệm với 3 thí nghiệm tại tâm (Thí nghiệm số 13, 14, 15) Tiến hành các thí nghiệm theo thứ tự ngẫu nhiên; kết quả được trình bày ở bảng 3.2
Tỷ lệ dung môi/dược liệu (mL/g)
Khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu
Hàm lượng baicalin Hàm lượng baicalein
Tổng hàm lượng baicalin, baicalein Hiệu suất tạo cao
Bảng 3.2 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm
TN TT Biến đầu vào mang giá trị thực
Trong đó: TN: thí nghiệm; TT: thứ tự thực hiện thí nghiệm X 1 : Nồng độ ethanol (%); X 2 : Thời gian chiết (phút); X 3 : Tỷ lệ DM/DL (mL/g) Y 1 : Hiệu suất tạo cao (%);
Y 2 : Hàm lượng baicalin (%); Y 3 : Hàm lượng baicalein (%); Y 4 : Tổng hàm lượng baicalin, baicalein (%)
3.3.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất
3.3.2.1 Kết quả xây dựng và đánh giá mô hình
Mô hình dự báo hiệu suất tạo cao, hàm lượng baicalin, baicalein và tổng hàm lượng hai hoạt chất này trong cao chiết xuất từ cây hoàng cầm dựa trên các biến đầu vào được xây dựng dưới dạng phương trình toán học bậc 2 Theo đó, hàm lượng baicalin, baicalein, tổng hàm lượng hai hoạt chất và hiệu suất tạo cao phụ thuộc vào các biến đầu vào theo các phương trình bậc 2 cụ thể.
Phương trình với biến đầu vào đã được mã hóa:
(2) Hàm lượng baicalin trong cao (Y 2 ) = 8,72 + 5,33X 1 – 0,0425X 2 + 0,7150X 3 + 0,4700X 1 X 3 – 0,5550X 2 X 3 – 0,9950X 1 2 – 2,03X 2 2 – 1,55X 3 2
(3) Hàm lượng baicalein trong cao (Y 3 ) = 4,16 – 1,38X 1 + 1,01X 2 + 0,1063X 3 – 0,5875X 1 X 2 – 0,9883X 1 2 + 0,6192X 2 2 + 0,5942X 3 2
(4) Tổng hàm lượng baicalin và baicalein trong cao (Y 4 ) = 12,88 + 3,95X 1 + 0,9688X 2
Phương trình với biến đầu vào mang giá trị thực:
(6) Hàm lượng baicalin trong cao (Y 2 ) = – 55,69875 + 0,520750X 1 + 0,343917X 2 + 6,29X 3 + 0,011750X 1 X 3 – 0,009250X 2 X 3 – 24,88.10 -4 X 1 2 – 22,61.10 -4 X 2 2 – 0,3875X 3 2
(7) Hàm lượng baicalein trong cao (Y 3 ) = 2,30292 + 0,335667X 1 + 0,019694X 2 – 2,32354X 3 – 9,79.10 -4 X 1 X 2 – 24,71.10 -4 X 1 2 + 6,88.10 -4 X 2 2 + 0,148542X 3 2
(8) Tổng hàm lượng baicalin và baicalein trong cao (Y 4 ) = – 53,51083 + 0,868917X 1
Kết quả phân tích phương sai ANOVA của các mô hình được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Hệ số hồi quy của các mô hình đa thức bậc hai được dự đoán
Giá trị F Giá trị p Giá trị F Giá trị p Giá trị F Giá trị p Giá trị F Giá trị p
Lack of fit 4,47 0,1942 NS 1,47 0,4434 NS 1,16 0,5228 NS 1,03 0,5276 NS
Hiệu suất tạo cao (Y1) và tổng hàm lượng baicalin, baicalein (Y4) có mối quan hệ tỷ lệ thuận Tỷ lệ này cho thấy khi hiệu suất tạo cao tăng thì hàm lượng baicalin và baicalein cũng tăng theo Hàm lượng baicalin (Y2) và baicalein (Y3) không có mối quan hệ thống kê đáng kể với hiệu suất tạo cao, do đó không có ảnh hưởng đến mô hình.
Từ bảng kết quả, nhận thấy giá trị p của cả 4 mô hình đều < 0,0001 chứng tỏ cả bốn mô hình đều có ý nghĩa Hệ số xác định R 2 gần với 1 (R 2 𝐘 𝟏 =0,9828; R 2 𝐘 𝟐 =0,9999;
R 2 𝐘 𝟑 =0,9974; R 2 𝐘 𝟒 =0,9995); kết quả này cho thấy với hiệu suất tạo cao (Y 1 ) có 98,28% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu dự đoán của mô hình; hàm lượng baicalin (Y 2 ) có 99,99%; hàm lượng baicalein (Y 3 ) có 99,74% và tổng hàm lượng baicalin, baicalein (Y 4 ) có 99,95% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu dự đoán từ mô hình Sự chênh lệch của các hệ số xác định hiệu chỉnh (R 2 adj) và hệ số xác định dự đoán (R 2 pred) trong từng mô hình đều nhỏ hơn 0,2 chứng tỏ cả bốn mô hình đều dự đoán tốt Giá trị p trong phép kiểm định sự không phù hợp (Lack of fit) của bốn mô hình lần lượt là: 0,1942 (với hiệu suất tạo cao Y 1 ); 0,4434 (với hàm lượng baicalin Y 2 ); 0,5228 (với hàm lượng baicalein Y 3 ) và 0,5276 (với tổng hàm lượng baicalin, baicalein Y 4 ) đều > 0,05 cho thấy sự không phù hợp không có ý nghĩa thống kê Nói cách khác, cả 4 mô hình đều phù hợp và đáng tin cậy
Sự tương tác lẫn nhau giữa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tạo cao, hàm lượng baicalin, hàm lượng baicalein và tổng hàm lượng baicalin, baicalein được mô tả bởi các điểm đáp ứng bề mặt 3D trên các đồ thị Hình 3.8 dưới đây Hai trục X và Y biểu thị 2 trong 3 yếu tố ảnh hưởng, yếu tố còn lại được giữ ở mức trung bình (mức 0) của nó, trục
Z biểu thị biến đầu ra (Hiệu suất tạo cao/Hàm lượng baicalin/Hàm lượng baicalein/Tổng hàm lượng baicalin, baicalein) Dựa vào các mô hình đáp ứng này có thể xác định được giá trị tối ưu của từng yếu tố ảnh hưởng làm cho hàm đáp ứng đạt giá trị cực đại
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các cặp tương tác đến các biến đầu ra 1AB Nồng độ ethanol - thời gian chiết → hiệu suất tạo cao (Y 1 )
1AC Nồng độ ethanol - tỷ lệ DM/DL → hiệu suất tạo cao (Y 1 )
1BC Thời gian chiết - tỷ lệ DM/DL → hiệu suất tạo cao (Y 1 )
2AB Nồng độ ethanol - thời gian chiết → hàm lượng baicalin (Y 2 )
2AC Nồng độ ethanol - tỷ lệ DM/DL → hàm lượng baicalin (Y 2 )
2BC Thời gian chiết - tỷ lệ DM/DL → hàm lượng baicalin (Y 2 )
3AB Nồng độ ethanol - thời gian chiết → hàm lượng baicalein (Y 3 )
3AC Nồng độ ethanol - tỷ lệ DM/DL → hàm lượng baicalein (Y 3 )
3BC Thời gian chiết - tỷ lệ DM/DL → hàm lượng baicalein (Y 3 )
4AB Nồng độ ethanol - thời gian chiết → tổng hàm lượng baicalin, baicalein (Y 4 )
4AC Nồng độ ethanol - tỷ lệ DM/DL → tổng hàm lượng baicalin, baicalein (Y 4 ) 4BC Thời gian chiết - tỷ lệ DM/DL → tổng hàm lượng baicalin, baicalein (Y 4 ) Nhận xét:
Hiệu suất tạo cao: Trong các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất tạo cao, dựa vào hệ số từ phương trình (1) và giá trị F (Bảng 3.3) có thể thấy tỷ lệ DM/DL là yếu tố có tác động lớn nhất (giá trị F lớn chứng tỏ đây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng nhiều đến biến đầu ra [28]; F = 49,12 và β 3 = 1,47) Tỷ lệ DM/DL tỷ lệ thuận với hiệu suất tạo cao, khi tăng dần tỷ lệ DM/DL đến giá trị cực đại (X3 = 10 mL/g) thì hiệu suất tạo cao tăng Nồng độ ethanol cũng là yếu tố ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất tạo cao Khi tăng dần nồng độ ethanol đến một giá trị nhất định (60 - 70%) thì hiệu suất tạo cao tăng; tuy nhiên khi vượt qua giá trị này, hiệu suất tạo cao giảm đi Giá trị F nhỏ (F = 6,74) (Bảng 3.3) cho thấy, thay đổi thời gian chiết tác động không nhiều đến hiệu suất tạo cao Ngoài ra, ảnh hưởng tương tác giữa nồng độ ethanol – tỷ lệ DM/DL (X 1 X 3 ) và bậc hai của nồng độ ethanol (X 1 2 ) đến hiệu suất tạo cao cũng phải được kể đến Tích số X 1 X 3 và bình phương
X 1 2 tăng sẽ dẫn đến việc làm giảm hiệu suất tạo cao và ngược lại Theo đồ thị 1AC (Hình
3.8), khi tăng tỷ lệ DM/DL (X 3 = 10 mL/g) và giá trị nồng độ ethanol ở khoảng trung bình (X 1 = 60 - 70%) thu được hiệu suất tạo cao cao nhất; khi giảm tỷ lệ DM/DL và tăng hoặc giảm nồng độ ethanol lên trên hoặc xuống dưới giá trị này thì hiệu suất tạo cao giảm đi
Hàm lượng baicalin: Với hàm lượng baicalin, yếu tố nồng độ ethanol và tỷ lệ DM/DL ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng baicalin thu được, trong đó yếu tố nồng độ ethanol có ảnh hưởng lớn nhất (F = 61842,50) Ở đồ thị 2AC (Hình 3.8) cho thấy khi nồng độ ethanol tăng thì hàm lượng baicalin thu được cũng tăng Tỷ lệ DM/DL cũng tỷ lệ thuận với hàm lượng baicalin; tỷ lệ DM/DL tăng lên thì hàm lượng baicalin thu được cũng tăng Thời gian chiết xuất thay đổi cũng làm thay đổi hàm lượng baicalin, khi thời gian chiết tăng lên đến 60 phút thì hàm lượng baicalin thu được tăng; nhưng khi tiếp tục tăng thời gian chiết thì hàm lượng baicalin có xu hướng giảm đi Sự tương tác giữa nồng độ ethanol - tỷ lệ DM/DL và thời gian chiết - tỷ lệ DM/DL cũng ảnh hưởng đến hàm lượng baicalin, như thể hiện trong sơ đồ 3D (Hình 3.8) Đồ thị 2AC (Hình 3.8) cho thấy ảnh hưởng của sự tương tác giữa nồng độ ethanol và tỷ lệ DM/DL ở thời gian chiết cố định là 60 phút Hàm lượng baicalin thu được tối thiểu ở nồng độ ethanol 50% với tỷ lệ DM/DL là 6 mL/g và tối đa ở nồng độ ethanol 90% với tỷ lệ DM/DL khoảng từ 8 – 9 mL/g Đồ thị 2BC (Hình 3.8) cho thấy sự tương tác giữa thời gian chiết và tỷ lệ DM/DL ảnh hưởng không nhiều đến hàm lượng baicalin
Hàm lượng baicalein: Nồng độ ethanol là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến
41 hàm lượng baicalein Hàm lượng baicalein thu được cao nhất ở nồng độ ethanol trung bình (X1 = 50 – 70%); điều này khá tương đồng với kết quả được báo cáo bởi Subramaniam và cộng sự (2015), trong đó nồng độ methanol 53,3% thu được hàm lượng baicalein cao nhất từ Scutellaria violacea [89] Đồ thị 3AB (Hình 3.8) ta thấy, càng tăng thời gian chiết hàm lượng baicalein thu được càng tăng Sự tương tác giữa nồng độ ethanol và thời gian chiết được thể hiện trong đồ thị 3AB (Hình 3.8) cho thấy hàm lượng baicalein bị ảnh hưởng đáng kể bởi sự tương tác này
Tổng hàm lượng baicalin, baicalein: Các kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến tổng hàm lượng baicalin, baicalein được thể hiện trong bảng 3.3 Giá trị F của các yếu tố đơn lẻ giảm dần như sau: nồng độ ethanol (F = 8058,97) > thời gian chiết (F
Nồng độ ethanol đóng vai trò quan trọng nhất trong việc ảnh hưởng đến hàm lượng baicalin và baicalein (Y4) Tương tác giữa nồng độ ethanol và thời gian chiết; thời gian chiết và tỷ lệ DM/DL có tác động ngược lại lên tổng hàm lượng baicalin, baicalein Ngược lại, tương tác giữa nồng độ ethanol và tỷ lệ DM/DL ảnh hưởng theo chiều thuận Đáng chú ý, tương tác giữa nồng độ ethanol và thời gian chiết có tác động mạnh nhất lên biến đầu ra.
Trong khi đó, yếu tố tương tác nồng độ ethanol – thời gian chiết, thời gian chiết – tỷ lệ DM/DL và bình phương của tỷ lệ DM/DL (X 3 2 ) ảnh hưởng không có ý nghĩa đến hàm mục tiêu (Y 1 ); yếu tố thời gian chiết, tương tác nồng độ ethanol – thời gian chiết ảnh hưởng không có ý nghĩa đến hàm mục tiêu (Y 2 ) và yếu tố tương tác nồng độ ethanol – tỷ lệ DM/DL, thời gian chiết – tỷ lệ DM/DL ảnh hưởng không có ý nghĩa đến hàm mục tiêu (Y 3 ) (p > 0,05) nên đã bị loại khỏi mô hình
3.3.2.2 Xác định giá trị tối ưu của biến đầu vào
Sau khi xây dựng được các mô hình trên, tiến hành tối ưu các điều kiện chiết xuất bằng phần mềm Design Expert 13.0.5, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng với mục tiêu thu được hàm lượng baicalin, hàm lượng baicalein cao nhất; tổng hàm lượng baicalin, baicalein tối đa và hiệu suất tạo cao tối đa
Gọi D làm hàm kỳ vọng tổng, sao cho 0 ≤ D ≤ 1 Trong đó D = 1 tương ứng với trường hợp tất cả biến đạt giá trị tối ưu, D = 0 ứng với trường hợp bốn biến nằm ngoài vùng cho phép Khi đó, bài toán tối ưu chuyển về việc tìm giá trị của các biến đầu vào (nồng độ ethanol, thời gian chiết và tỷ lệ DM/DL) sao cho hàm kỳ vọng tổng D đạt giá trị cực đại Kết quả thu được điều kiện chiết xuất tối ưu ứng với giá trị Dmax = 0,597 như
42 sau: nồng độ ethanol: 79,743%; thời gian chiết: 69,629 phút; tỷ lệ DM/DL: 9,588 mL/g
Bàn luận
3.4.1 Về phương pháp định lượng baicalin, baicalein trong cao Núc nác
Trong nghiên cứu của chúng tôi đã khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký với pha động và chương trình rửa giải như sau: acetonitril/acid phosphoric 0,1%: 0 đến 23 phút: 20/80 tt/tt; 23 đến 25 phút: 20/80 tt/tt - 25/75 tt/tt; 25 đến 55 phút: 25/75 tt/tt; 55 đến 57 phút: 25/75 tt/tt - 95/5 tt/tt; 57 đến 65 phút: 95/5 tt/tt; 65 đến 68 phút: 95/5 tt/tt - 20/80 tt/tt; 68 đến 75 phút: 20/80 tt/tt Sử dụng cột pha đảo: Kromasil® 100 – 5 C18 Column
250 × 4,0 mm; phân tích định lượng tại bước sóng 276 nm; tốc độ dòng: 1,0 mL/phút;
43 nhiệt độ cột: 40ºC; thể tích tiêm mẫu: 10 μL để phân tích định lượng baicalin, baicalein trong cao Núc nác Điều kiện sắc ký (chương trình rửa giải pha động) có sự khác biệt so với các nghiên cứu trước đó [11], [110] Sự khác biệt này có thể do sự khác nhau giữa các phòng thí nghiệm và/hoặc thiết bị HPLC của các hãng khác nhau dẫn đến điều kiện sắc ký không đồng nhất giữa các nghiên cứu [1]
Phương pháp xây dựng đã được thẩm định độ đặc hiệu, độ ổn định hệ thống, độ tuyến tính, độ chụm, độ đúng và giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng theo hướng dẫn của AOAC [16] Phương pháp đảm bảo độ đúng, độ lặp lại tốt với khoảng nồng độ định lượng rộng, phù hợp để phân tích định lượng baicalin, baicalein trong mẫu cao Núc nác
3.4.2 Về các quy trình chiết xuất baicalin, baicalein đã tối ưu hóa được công bố
Qua tổng quan tài liệu, ba quy trình chiết xuất baicalin, baicalein từ dược liệu của các tác giả: Adin Syeda Nashvia (vỏ thân Oroxylum indicum) [14], Huilin Ni (Scutellaria baicalensis) [44] và Shankar Subramaniam (Scutellaria violacea) [89] đã được công bố
Mỗi quy trình trích xuất baicalin từ vỏ thân cây hoàng cầm đều có ưu và nhược điểm riêng Nghiên cứu của Adin Syeda Nashvia và cộng sự (2022) đã chỉ ra rằng các phương pháp tối ưu hóa quy trình chiết xuất bao gồm sử dụng dung môi thích hợp, kiểm soát nhiệt độ và thời gian chiết xuất, cũng như áp dụng các kỹ thuật chiết xuất tiên tiến như siêu âm hoặc vi sóng.
Oroxylum indicum với quy mô 3 g dược liệu/mẻ Kết quả chỉ ra dung môi ethanol là lựa chọn tốt nhất nhưng chưa đi vào chi tiết về ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất chiết baicalin [14] Trong luận văn thạc sĩ của tác giả Lê Thị Bảo Ngọc, chỉ ra phương pháp hồi lưu với dung môi ethanol 70%; thời gian chiết 2 giờ 10 phút; tỷ lệ dung môi/dược liệu 8/1 cho hiệu suất chiết baicalin là 61,60% [9] Kết quả nghiên cứu này có sự khác biệt với nghiên cứu của chúng tôi, về dung môi chiết và thời gian chiết Sự khác biệt này có thể do nguồn gốc dược liệu và thông số đánh giá trong nghiên cứu này là hiệu suất chiết hoạt chất (phản ánh cả hiệu suất tạo cao và hàm lượng hoạt chất trong cao) còn trong nghiên cứu của chúng tôi thông số được đánh giá là hiệu suất tạo cao và hàm lượng hoạt chất Bên cạnh đó, trong quá trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng; khoảng giá trị nồng độ ethanol đưa vào khảo sát chỉ từ 50% đến 70% nên có thể đã bỏ qua giá trị tối ưu Trong khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Nguyễn Bá Cường, chỉ ra phương pháp hồi lưu có hiệu suất chiết baicalein tốt hơn phương pháp siêu âm, tuy nhiên do tỷ lệ dung môi/dược liệu nhỏ, gây cháy dược liệu vì vậy nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết siêu âm; tuy nhiên phương pháp này khó khăn trong việc nâng cấp lên quy mô công nghiệp; bên cạnh đó nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) nên kết quả đưa ra chưa hẳn là kết quả tối ưu cuối cùng [6] Trong “Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết baicalin từ Scutellaria baicalensis sử dụng dung môi là nước” [44]; nước là dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, an toàn; sử dụng phương pháp chiết ngâm kết hợp với sắc là phương pháp cổ điển, đơn giản, hàm lượng baicalin và hiệu suất tạo cao cao Tuy nhiên,
44 với phương pháp sắc tại nhiệt độ cao (100℃) trong thời gian dài có thể gây ảnh hưởng đến độ ổn định của hoạt chất (điều này có thể thấy được qua kết quả khảo sát thời gian chiết của nghiên cứu: khi tăng thời gian chiết từ 30 lên 60 phút hàm lượng baicalin tăng mạnh; nhưng khi tăng thời gian chiết từ 60 lên 90 – 120 – 150 phút hàm lượng baicalin giảm mạnh) Còn trong nghiên cứu của Shankar Subramaniam [89] lựa chọn phương pháp chiết ngâm kết hợp với khuấy trộn bởi vì nó mang lại hiệu quả cao hơn so với phương pháp ngâm thông thường Phương pháp ngâm có ưu điểm là đơn giản dễ thực hiện, hạn chế tác động của nhiệt độ so với phương pháp sắc, không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, nhưng cần thời gian ngâm dài Tuy dung môi methanol 53,3% cho hiệu suất chiết baicalein và pinostrobin cao nhất, nhưng đây là dung môi độc, có nguy cơ cháy nổ, hạn chế sử dụng trong chiết xuất
Các nghiên cứu này, mặc dù cung cấp một số kết quả khả quan, nhưng chưa đạt được sự tối ưu hóa cao nhất trong việc chiết xuất cả baicalin và baicalein đồng thời, và có những hạn chế về dung môi và phương pháp Nghiên cứu hiện tại của chúng tôi đã chi tiết hơn về các điều kiện tối ưu, về tính an toàn và khả thi cho ứng dụng thực tiễn
Với phương pháp chiết hồi lưu sử dụng ethanol 80% tỏ ra ưu việt nhất, cho tổng hàm lượng baicalin và baicalein cao nhất và hiệu suất tạo cao, đồng thời dễ dàng nâng cấp lên quy mô công nghiệp
Tính tới thời điểm hiện tại, quy trình chiết xuất trong khóa luận là quy trình đầu tiên tối ưu hóa chiết xuất cả baicalin và baicalein trong dược liệu vỏ thân Núc nác Đã đưa ra phương pháp chiết xuất tối ưu, an toàn và hiệu quả, mở ra hướng phát triển sản phẩm từ dược liệu Núc nác với tiềm năng ứng dụng cao trong ngành dược phẩm
3.4.3 Về sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình chiết xuất baicalin và baicalein từ Núc nác
Phương pháp thay đổi một yếu tố dựa trên nguyên tắc cố định các thông số khác và quan sát sự ảnh hưởng của thông số còn lại đến quá trình chiết xuất [78], phù hợp cho các biến có ít giá trị cụ thể Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện [30], nhưng có nhược điểm là số lượng thí nghiệm lớn và không đánh giá được sự tương tác giữa các yếu tố khi coi các yếu tố cần khảo sát là độc lập với nhau Ngoài ra, khả năng xác định chính xác điều kiện tối ưu bị hạn chế do số lượng quan sát ít và chỉ có thể lựa chọn điều kiện tối ưu trong một tập hữu hạn các giá trị khảo sát nên có thể bỏ sót giá trị tối ưu
Do các hạn chế của phương pháp OFAT, phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) đã được sử dụng để khảo sát các yếu tố có số lượng giá trị cần khảo sát lớn như nồng độ ethanol, thời gian chiết xuất, và tỷ lệ dung môi/dược liệu Nếu xây dựng được một mô hình tốt, có thể đưa ra điều kiện chiết xuất tối ưu với độ chính xác cao mà số lượng thí
45 nghiệm cần tiến hành giảm đi đáng kể, tiết kiệm chi phí và công sức so với phương pháp OFAT
Trong nghiên cứu này, với việc ứng dụng cả hai phương pháp OFAT và RSM, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất baicalin, baicalein từ Núc nác đã được khảo sát một cách toàn diện Ảnh hưởng của các yếu tố này đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng baicalin, baicalein trong sản phẩm có thể được giải thích rõ hơn như sau: Đối với sự ảnh hưởng của phương pháp chiết:
Kết quả nghiên cứu cung cấp cái nhìn rõ ràng về hiệu quả của các phương pháp chiết xuất khác nhau đối với baicalin và baicalein từ Núc nác Phương pháp ngâm và phương pháp siêu âm (ở nhiệt độ thường và ở 55℃) đã được đánh giá và so sánh với phương pháp chiết hồi lưu, và mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng
Phương pháp ngâm nói chung có quy trình lắp đặt đơn giản; nhưng thời gian chiết kéo dài, hàm lượng baicalin thu được cũng nhỏ hơn phương pháp hồi lưu Phương pháp siêu âm, là phương pháp hiện đại, với sự hỗ trợ của sóng siêu âm có thể làm tăng sự hòa tan chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuếch tán chất tan, thời gian chiết xuất có thể rút ngắn hơn so với phương pháp ngâm [7] Bên cạnh đó, sóng siêu âm đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc giải phóng aglycon flavonoid từ thực vật bằng cách phá vỡ liên kết glycosid [20], [112]; nên phương pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm cho hàm lượng baicalein cao nhất Tuy nhiên phương pháp này gặp khó khăn trong việc nâng cấp lên quy mô công nghiệp, do trong chiết xuất quy mô lớn, hiệu suất chiết hoạt chất thường không cao do khả năng xuyên sâu kém của sóng siêu âm [3]; đồng thời hiệu suất tạo cao của phương pháp siêu âm ở nhiệt độ thường và ở 55℃, đều thấp hơn nhiều so với phương pháp hồi lưu