Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần trong lá Sen .... Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất tạo cao
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Sen và lá Sen
Sen còn có tên khác là liên, quỳ Tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn., thuộc họ Sen (Nelumbonaceae) [1], [3]
Tên đồng nghĩa: Nelumbium speciosum Willd [3], [5]
1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái cây Sen
Cây thảo, sống dưới nước, to khỏe, cao hơn 1 m Thân rễ (ngó Sen) mập, mọc bò dài trong bùn, bén rễ ở những mấu, từ đó mọc lên thân và lá Lá hình tròn, vượt lên khỏi mặt nước, đường kính 30 – 40 cm, màu lục xám, mép nguyên lượn sóng, giữa lá thường trùng xuống, mặt sau đôi khi điểm những đốm màu tía, gân hình khiên, hằn rõ, cuống lá đính vào giữa lá, dài 1 m hay hơn, có nhiều gai cứng nhọn
Hoa to, mọc riêng lẻ trên cuống dài và thẳng, phủ đầy gai nhọn, đường kính 8 –
12 cm, màu hồng, hồng đỏ hoặc trắng; 3 – 5 lá đài, màu lục nhạt, rụng sớm; cánh hoa nhiều, những cánh phía ngoài to, khum lòng máng, những cánh giữa và ở trong nhỏ hẹp dần, giữa cánh hoa và nhị có những dạng chuyển tiếp, nhị rất nhiều, màu vàng, chỉ nhị mảnh, có phần phụ (gạo Sen) màu trắng và thơm; bộ nhụy gồm nhiều lá noãn rời nằm trên một đế hoa hình nón ngược (gương Sen)
Quả bế có núm nhọn, thường gọi là hạt Sen, phần ngoài mỏng và cứng có màu lục tía, phần giữa mềm chứa tinh bột màu trắng ngà và phần trong là lá mầm dày, màu lục sẫm
Mùa hoa: tháng 5 – 6; mùa quả: tháng 7 – 9 [5]
Sen là cây trồng quen thuộc ở các tỉnh đồng bằng và trung du, suốt từ Nam đến Bắc nước ta Cây được trồng ở các vùng ao hồ nước nông và trung bình Do ưa khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới, nên Sen cũng được trồng nhiều ở hầu hết các nước khu vực Đông Nam Á đến Nam Á, như Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ và một số tỉnh phía Nam Trung Quốc [5]
Lá Sen có chứa các nhóm hợp chất như alcaloid, flavonoid, tanin, acid phenolic, saponin, đường tự do, sterol, terpenoid, acid béo, polysaccharid, protein, khoáng chất và nhóm chất màu [3], [6], [21], [29], [30] Trong đó, alcaloid và flavonoid là hai thành phần chính và quan trọng nhất [5], [29], [36]
3 Flavonoid là một trong số những nhóm chất chính quan trọng trong lá Sen Theo các tài liệu thu thập được, cho đến nay đã phát hiện được nhiều hợp chất flavonoid trong lá Sen, trong đó, quercetin-3-glucuronid và isoquercitrin là những flavonoid chính trong lá Sen [11], [12], [20], [36]
Hình 1.1 Khung cấu trúc chung của các flavonol trong lá Sen
Các hợp chất flavonol trong lá Sen được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1
Bảng 1.1 Các hợp chất flavonol trong lá Sen
TT Tên hợp chất R1 R2 R3 R4 TLTK
(Qc-3-Gln) H OH O-Gln OH [11],
7 Quercetin 3-O-arabinosid H OH O-Ara OH [36]
(Myr-3-Glu) OH OH O-Glu OH [11], [12]
14 Myricetin 3-O-hexose OH OH O-Hex OH [36]
(Iso-3-Glu) H OCH3 O-Glu OH [11], [12]
(Iso-3-Gln) H OCH3 O-Gln OH [12], [36]
17 Isorhamnetin 3-O-hexose H OCH3 O-Hex OH [12], [36]
Luteolin Diosmetin 7-O-hexose (Dio-7-Hex) Flavanon [6]:
Lá Sen chứa alcaloid 0,77 – 0,84%, trong đó có nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, 2-hydroxy-1-methoxyaporphin, anonain, liriodenin, pronuciferin, O – nornuciferin, armepavin, N – norarmepavin, methylcoclaurin, dehydroroemerin, dehyodronuciferin, dehyroanonain, N – methylisococlaurin [3], [5], [6], [24]
1 số alcaloid đã được phân lập [3], [6], [24]:
CH 3 trans-N-feruloyltyramin cis-N-feruloyltyramin
1.1.2.3 Một số nhóm chất khác
Một số thành phần hóa học cũng được tìm thấy [6], [21], [29], [30]:
- Nhóm acid phenolic: acid gallic, acid protocatechuic, acid caffeic,
- Nhóm sterol: β-sitostenon, stigmasta-4,22-dien-3-on, stigmast-7-en-3-ol,
- Nhóm chất màu clorophyl: pheophytin-a, aristophyll-c,
1.1.3 Tác dụng của lá Sen trong Y học Cổ truyền
Lá Sen có vị đắng, tính mát, quy vào 3 kinh can, tỳ, vị [3], [5] có tác dụng thăng thanh tán thử, thanh thử hành thủy Dùng chữa thử thấp tiết tả, thủy chí phù thũng, nôn ra máu, máu cam, băng trung huyết lỵ [1], [3]
Lá Sen chữa chảy máu (đại tiểu tiện ra máu, chảy máu chân răng, xuất huyết dưới da) Ngày dùng 15 – 20 g dưới dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán [5] Ở Trung Quốc, lá Sen được dùng như sau: chủ trị tức ngực có nóng sốt, tiểu tiện ít, đỏ, ho ra máu, kinh nguyệt nhiều Dùng ngoài chữa dị ứng với sơn (sắc nước rửa) [5] Ở Ấn Độ, dịch ép từ lá Sen được dùng trong trường hợp ỉa chảy [5]
1.1.4 Tác dụng dược lý của lá Sen
Alcaloid và flavonoid là hai thành phần chính đóng vai trò quan trọng trong các tác dụng dược lý của lá Sen Đặc biệt, flavonoid trong lá Sen đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học Trong những năm gần đây, các hoạt động chống oxy hóa [18],
7 chống ung thư [34], chống HIV [17], kháng virus [17], giảm cân, chống béo phì [27] và phân giải mỡ [26], bảo vệ gan [35], chống viêm [18], của lá Sen đã được báo cáo và thu hút ngày càng nhiều sự quan tâm, trong đó phải kể đến tiềm năng chống béo phì, chống oxy hóa và chống viêm của flavonoid trong lá Sen
1.1.4.1 Tác dụng chống béo phì
Khả năng giảm cân, chống béo phì của lá Sen đang được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi Cơ chế dược lý về tác dụng chống béo phì của dịch chiết lá Sen đã được nghiên cứu thông qua mô hình sử dụng chuột của Yuka Ono và các cộng sự năm 2006 Kết quả cho thấy dịch chiết lá Sen ngăn chặn sự gia tăng trọng lượng cơ thể, trọng lượng mô mỡ quanh tử cung và nồng độ triacylglycerol trong gan ở chuột mắc bệnh béo phì do chế độ ăn nhiều chất béo Cơ chế liên quan đến việc giảm trọng lượng cơ thể là làm suy giảm khả năng tiêu hóa, ức chế hấp thu lipid và carbohydrat, đẩy nhanh quá trình chuyển hóa lipid và tăng tiêu hao năng lượng [27]
Tác dụng chống béo phì của dịch chiết lá Sen được tiếp tục làm sáng tỏ thông qua nghiên cứu của Emika Ohkoshi và các cộng sự năm 2007 Họ phát hiện ra rằng dịch chiết ethanol từ lá Sen đã kích thích quá trình phân giải mỡ trong mô mỡ của chuột thông qua con đường thụ thể β-adrenergic Các flavonoid trong lá Sen như quercetin 3-O-arabinopyranosyl-(1→2)-galactopyranosid, catechin, hyperosid, isoquercitrin và astragalin thể hiện hoạt tính phân giải mỡ, đặc biệt là ở mô mỡ nội tạng [26]
Năm 2021, Enuo Liu và cộng sự đã phân tích khả năng ngăn ngừa béo phì của lá Sen trong in vitro và in vivo Kết quả cho thấy lá Sen có chức năng ngăn ngừa sự tích tụ chất béo trung tính và thúc đẩy quá trình phân giải mỡ Các thí nghiệm in vitro đã xác nhận rằng quercetin và quercetin-3-O-𝛽-glucuronid có chức năng chuyển hóa lipid bằng cách thúc đẩy sự thoái hóa chất béo trung tính thông qua việc ức chế con đường cAMP Các thí nghiệm in vivo cho thấy rằng việc dùng dịch chiết lá Sen đã ức chế sự tích tụ chất béo trung tính ở chuột ICR và giúp tế bào gan giảm rối loạn dự trữ glycogen ở chuột KK-Ay mắc bệnh tiểu đường loại II Những kết quả này đã nêu bật khả năng của dịch chiết lá Sen trong việc kiểm soát quá trình trao đổi chất bằng cách điều chỉnh sự hấp thụ chất béo và đường, đồng thời có thể cung cấp một phương pháp điều trị mới cho bệnh béo phì và các bệnh liên quan đến lối sống như bệnh tiểu đường loại II [22]
1.1.4.2 Tác dụng chống viêm và chống oxy hóa
Năm 2014, nghiên cứu của Shing-Hwa Liu và các cộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết lá Sen làm giảm nồng độ các cytokin gây viêm IL-1β, TNF-α, IFN-γ và IL-6, làm
8 tăng nồng độ các cytokin kháng viêm IL-4 và IL-10, đồng thời ức chế tình trạng viêm gây ra bởi chế độ ăn nhiều chất béo kèm theo béo phì Trong đó, các thành phần trong dịch chiết là quercetin và catechin thể hiện hoạt tính chống viêm bằng cách ức chế đường truyền tín hiệu NF- κB, do đó làm giảm phản ứng viêm của đại thực bào [23] Hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm của dịch chiết flavonoid từ lá Sen đã được phân tích cả trong in vitro và in vivo Năm 2021, nghiên cứu của Chong Li và các cộng sự đã cho thấy dịch chiết flavonoid từ lá Sen làm giảm tổn thương oxy hóa do tế bào 293T gây ra, tăng mức SOD, CAT, GSH, GSH-Px và giảm mức MDA Các nghiên cứu trên động vật cho thấy dịch chiết flavonoid từ lá Sen làm giảm tổn thương do oxy hóa và viêm ở chuột bị thương, ức chế sự gia tăng AST, ALT, MDA và NO, tăng nồng độ SOD, CAT, GSH và GSH-Px, điều hòa tăng các cytokin chống viêm IL-10 và IL-12, các cytokin tiền viêm IL-6, IL-1β, TNF-α và IFN-γ được điều hòa giảm Hơn nữa, sự biểu hiện của mRNA liên quan đến chất chống oxy hóa và chống viêm phù hợp với các kết quả trên Dịch chiết flavonoid từ lá Sen ức chế sự oxy hóa đối với các tế bào 293T do H2O2 gây ra, cũng như giảm tình trạng stress oxy hóa và tổn thương viêm do D-Gal/LPS gây ra ở chuột Nó làm tăng mức độ enzym và hợp chất chống oxy hóa trong các tế bào 293T, giảm nồng độ peroxid và điều chỉnh mức độ của các yếu tố miễn dịch liên quan Dịch chiết flavonoid từ lá Sen đã thể hiện khả năng chống oxy hóa cùng chống viêm mạnh mẽ trong cả in vivo và in vitro [18].
Tổng quan về chiết xuất flavonoid trong lá Sen
Khái niệm về chiết xuất: Chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất khỏi phần không tan trong dược liệu Sản phẩm của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết xuất [2] Hiện nay, có nhiều quy trình chiết xuất flavonoid từ lá Sen khác nhau đã được thực hiện, tuy nhiên chủ yếu dùng để xác định cấu trúc, định lượng một số thành phần flavonoid chính và nghiên cứu về tác dụng sinh học trong lá Sen Các phương pháp chiết xuất được sử dụng có thể kể đến như phương pháp ngâm [11], [12], [33], siêu âm [36], hồi lưu [15], [19], Thành phần chủ yếu trong lá Sen là những flavonoid dạng glycosid có độ phân cực mạnh, do vậy dung môi được sử dụng trong các nghiên cứu chủ yếu là các dung môi hữu cơ phân cực như methanol, ethanol hoặc hỗn hợp các dung môi này với nước để chiết xuất dịch chiết lá Sen [11], [12], [13], [20], [36] Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng với các phương pháp chiết, dung môi chiết, điều kiện chiết xuất khác nhau thì sản phẩm chiết sẽ có đặc điểm và hoạt tính sinh học khác nhau Một số yếu tố thuộc về kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu như: độ mịn dược liệu, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất, áp suất, điều kiện thủy động, tỷ lệ dược liệu và dung môi, pH dung môi Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có
9 nghiên cứu nào đánh giá một cách đầy đủ các yếu tố này để đưa ra được quy trình chiết xuất flavonoid tối ưu từ lá Sen
Một số quy trình chiết xuất flavonoid trong lá Sen:
Lá Sen khô được nghiền thành bột (100 g) và chiết xuất bằng siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 40 phút với 1000 ml ethanol 70% Sau ba lần chiết, các dịch chiết được gộp lại và lọc, dịch lọc sau đó được làm bay hơi dưới áp suất giảm và đông khô để thu được phần cắn màu xanh đậm [36]
0,9 kg bột lá Sen được chiết với 9000 ml ethanol 50% (3 lần, 1 giờ mỗi lần), sử dụng chiết hồi lưu và dịch chiết thu được được cô trong điều kiện chân không một phần để thu được dịch chiết đậm đặc (900 ml) Dịch chiết đậm đặc sau đó được đông khô để thu được cắn thô của lá Sen [19]
1 g bột lá Sen được chiết xuất trong 30 ml hỗn hợp methanol – nước (70:30) trong 36 giờ ở 4℃ trong 1 lần, chiết ba lần Mẫu sau đó được ly tâm trong 10 phút Phần dịch chiết thu được sấy khô ở 35℃ bằng thiết bị cô quay [12].
Các phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong lá Sen
Một số phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong lá Sen đã được thực hiện là:
Cân chính xác 1 lượng dược liệu đã được xác định độ ẩm (10,00 g lá Sen), cho vào túi làm bằng giấy lọc và đặt vào bình Soxhlet Chiết bằng cloroform (để loại clorophyl) cho tới khi dịch cloroform không còn màu xanh Chiết bằng ethanol 90% sau đó tiếp tục chiết bằng ethanol 70% cho tới khi dịch chiết không còn flavonoid (kiểm tra bằng cách rỏ giọt dịch chiết lên giấy lọc, sấy khô và hơ hơi amoniac, không thấy xuất hiện màu vàng) Tập trung dịch chiết, cất thu hồi ethanol, cho thêm nước tiếp tục đun cách thuỷ, lọc nóng để loại hết clorophyl còn sót lại Dịch chiết nước chứa flavonoid toàn phần được lắc nhiều lần với ethyl acetat cho tới khi hết flavonoid trong dịch chiết nước Gộp dịch chiết ethyl acetat vào cốc đã được sấy đến khối lượng không đổi Để bay hơi ethyl acetat ngoài không khí, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 70℃ đến khối lượng không đổi và đem cân
Hàm lượng flavonoid toàn phần ở lá Sen: 3,81% [4]
1.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis
Một số phương pháp định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis đã được tiến hành:
Chuẩn bị dịch chiết: 1 g lá Sen được chiết với 400 ml ethanol hoặc methanol Hỗn hợp được khuấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng bằng máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút Dịch chiết được lọc qua giấy lọc và loại bỏ dung môi bằng máy cô quay chân không ở 45℃ đến cắn Phần cắn đã cân được hòa tan trong dung môi để tạo ra nồng độ cuối cùng là 0,01 mg/ml
Tiến hành: Xác định bằng phương pháp của Woisky và Salatino [31] có sửa đổi Đối với 0,5 ml mỗi dịch chiết dược liệu, thêm vào 0,5 ml dung dịch AlCl3 2% trong ethanol Sau 1 giờ ở nhiệt độ phòng, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 420 nm Hàm lượng flavonoid toàn phần được tính theo kaempferol từ nồng độ xác định được qua đường chuẩn
Kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần thu được:
+ Nếu chiết bằng ethanol: 69,5 ± 0,10 (mg kaempferol đương lượng/g cao khô) + Nếu chiết bằng methanol: 106,9 ± 0,13 (mg kaempferol đương lượng/g cao khô)
Tất cả các giá trị là trung bình ± SD của 6 lần làm lặp lại
Lá Sen khô được nghiền thành bột (100 g) và chiết xuất bằng siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 40 phút với 1000 ml ethanol 70% Sau ba lần chiết, gộp các dịch chiết lại và lọc, dịch lọc được làm bay hơi dưới áp suất giảm và đông khô để thu được phần cắn màu xanh đậm Một lượng 30 μl dung dịch mẫu với nồng độ được pha loãng thích hợp trộn với 180 μl nước cất trong một giếng của đĩa 96 giếng và sau đó thêm 10 μl dung dịch NaNO2 5% Sau 6 phút, 20 μl dung dịch AlCl3 10% được thêm vào và để yên trong 6 phút trước khi thêm 60 μl dung dịch NaOH 4% Độ hấp thụ của hỗn hợp được xác định ở bước sóng 510 nm với mẫu trắng là nước sau 15 phút Isoquercitrin được sử dụng làm chuẩn để định lượng flavonoid toàn phần Tất cả các giá trị được biểu thị bằng miligam đương lượng isoquercitrin trên mỗi gam mẫu
Bột lá Sen khô (20 kg) được chiết ba lần với 50 lít methanol ở 100℃ trong 1 giờ Dịch chiết được gộp lại và cô đến khô dưới áp suất giảm
Thêm 1,25 ml nước khử ion và 75 μl NaNO2 5% vào 200 μl dung dịch mẫu nồng độ 2000 μg/ml trong nước Sau 6 phút, 150 μl dung dịch AlCl3 10% trong nước được thêm vào Sau 5 phút, thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 1 M, sau đó định mức tổng thể tích đến 2,5 ml bằng nước khử ion Sau khi dung dịch được trộn đều, độ hấp thụ được đo trên máy đo quang phổ ở bước sóng 510 nm Tổng hàm lượng flavonoid được xác
11 định bằng cách sử dụng catechin làm chất chuẩn với đường chuẩn từ 0 – 800 μg/ml Các kết quả được biểu thị bằng miligam đương lượng catechin trên mỗi gam mẫu Nhìn chung, tất cả đều sử dụng phản ứng giữa flavonoid với nhôm clorid tạo màu đặc trưng sau đó tiến hành đo quang, chủ yếu sử dụng 1 trong 2 phản ứng (1) chỉ sử dụng AlCl3 tạo màu vàng hấp thụ bước sóng đặc trưng 410-430nm hoặc (2) sử dụng thêm NaNO2 trong môi trường kiềm để tạo phức hồng hấp thụ bước sóng đặc trưng trong khoảng 510nm Ngoài ra, tùy vào từng nghiên cứu mà thời gian phản ứng cũng như nồng độ thuốc thử phản ứng sử dụng khác nhau Do vậy, dựa vào các phương pháp đã tham khảo được, nhóm tiến hành khảo sát thuốc thử, thời gian phản ứng và cực đại hấp thụ để xây dựng phương pháp định lượng flavonoid trong cao đặc lá Sen.
Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
1.4.1 Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time - OFAT) dựa trên nguyên tắc yếu tố cần khảo sát được thay đổi giá trị trong phạm vi thích hợp, trong khi các yếu tố khác được giữ nguyên không đổi [14] So sánh kết quả giữa các thí nghiệm này có thể cho phép xác định trực tiếp ảnh hưởng của yếu tố khảo sát đến quy trình chiết xuất Phương pháp OFAT là một trong những phương pháp thường dùng để xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến quy trình với nhiều ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi xử lý thống kê và phân tích số liệu phức tạp, đặc biệt hữu dụng trong những trường hợp số lượng các yếu tố hay giá trị cần khảo sát không nhiều, các biến hoàn toàn độc lập và không có tương tác, ảnh hưởng của yếu tố gây nhiễu là rất nhỏ so với các yếu tố khảo sát [10]
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một vài hạn chế Phương pháp OFAT không đánh giá được sự tương tác giữa các yếu tố, điều này có thể dẫn đến việc tiến hành phát triển và tối ưu hóa không đầy đủ [14] Ngoài ra, phương pháp này còn làm tăng số lượng thí nghiệm cần thiết để tiến hành nghiên cứu, dẫn đến tăng thời gian và chi phí cũng như tăng lượng thuốc thử và nguyên liệu sử dụng Để khắc phục những nhược điểm trên, một loạt các phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên những nguyên lý thống kê (Design of Experiments – DoE) đã được đưa ra Trong đó, bề mặt đáp ứng là một trong số những phương pháp thường được sử dụng nhất [9]
1.4.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology - RSM) là một tập hợp các kỹ thuật toán học và thống kê ứng dụng cho việc phát triển, cải thiện và tối ưu hóa các quy trình Nó cũng có những ứng dụng quan trọng trong việc thiết kế, phát triển và xây dựng các sản phẩm mới cũng như cải tiến các thiết kế sản phẩm hiện có [25]
* Giải thích một số thuật ngữ:
- Biến đầu ra (Biến phụ thuộc, đáp ứng): Là các kết quả đo được từ các thí nghiệm mà người làm thí nghiệm cần phải đánh giá Ví dụ: hiệu suất tạo cao, hàm lượng hoạt chất
- Biến đầu vào (Biến độc lập, yếu tố): Là các thông số, điều kiện ban đầu khi thay đổi sẽ làm thay đổi biến đầu ra, có thể thay đổi độc lập với nhau Ví dụ: nhiệt độ, nồng độ dung môi, thời gian chiết
- Mức yếu tố: Là các giá trị khác nhau của biến đầu vào mà tại đó các thử nghiệm được thực hiện trong thiết kế thí nghiệm Ví dụ: khảo sát thời gian chiết xuất với 3 mức tương ứng là: 30, 60, 90 phút
- Thiết kế thí nghiệm là một tập hợp các thí nghiệm cụ thể được xác định bởi một ma trận tạo thành bởi sự kết hợp ở các cấp độ khác nhau của các biến được nghiên cứu [9]
* Một số giai đoạn trong quy trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) như sau:
1) Lựa chọn các biến độc lập có ảnh hưởng chính đến biến phụ thuộc thông qua các nghiên cứu sàng lọc và phân định vùng thử nghiệm, theo mục tiêu của nghiên cứu và kinh nghiệm của nhà nghiên cứu
2) Lựa chọn thiết kế thí nghiệm và tiến hành thí nghiệm theo ma trận thí nghiệm đã chọn
3) Xử lý thống kê toán học của dữ liệu thực nghiệm thu được thông qua sự phù hợp của hàm đa thức
4) Đánh giá mức độ phù hợp của mô hình
5) Xác minh sự cần thiết và khả năng thực hiện dịch chuyển theo hướng đến vùng tối ưu
6) Thu được các giá trị tối ưu cho từng biến nghiên cứu [9]
Lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra
Giai đoạn này còn được gọi là giai đoạn sàng lọc (screening experiment) Mục tiêu của bước sàng lọc này là để giảm thiểu số lượng biến đầu vào, chỉ giữ lại những biến độc lập quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến biến phụ thuộc Nhờ đó, giúp làm giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần phải thực hiện
Các biến đầu vào được lựa chọn phải thỏa mãn các điều kiện sau:
- Là biến độc lập, có thể dễ dàng điều chỉnh Sự thay đổi giá trị của từng biến này dẫn đến sự thay đổi của biến đầu ra là hoàn toàn độc lập, không phụ thuộc và kéo theo sự thay đổi của các yếu tố khác
- Là các biến định lượng có trị số xác định cụ thể Tuy nhiên, với sự phát triển của các công cụ toán học hiện nay, nhiều mô hình đã cho phép đánh giá ảnh hưởng của các biến định tính Để lựa chọn các biến độc lập, có thể căn cứ vào: cơ sở lý thuyết, ý kiến chuyên gia, các nghiên cứu tương tự hay trực tiếp tiến hành các thí nghiệm thăm dò và sàng lọc [25]
Thiết kế giai thừa đầy đủ ba cấp, thiết kế phức hợp trung tâm và thiết kế Box- Behnken là những thiết kế tối ưu hóa được sử dụng nhiều nhất vì chúng cho phép mô hình hóa bề mặt đáp ứng phức tạp Một trong những hạn chế quan trọng nhất của thiết kế sàng lọc là chúng chỉ cho phép mô hình hóa bề mặt đáp ứng bậc 1 (tuyến tính), vì chúng chỉ có hai cấp độ cho mỗi yếu tố đầu vào Thiết kế tối ưu hóa sử dụng 3 đến 5 cấp độ của từng yếu tố đầu vào, cho phép mô hình hóa bề mặt đáp ứng bậc 2 (bậc hai) Tuy nhiên, do số lượng thí nghiệm cần thiết tăng lên nên chúng thường được sử dụng để nghiên cứu số lượng yếu tố đầu vào giảm
Trước khi thiết kế thí nghiệm, các biến đầu vào cần được mã hóa, chuyển giá trị khảo sát về khoảng [-1;1] để đảm bảo thiết kế thí nghiệm có tính trực giao và tính xoay cũng như giảm thiểu sai số trong quá trình tính toán, hạn chế sai sót do chênh lệch đơn vị của các biến độc lập Biến thực được mã hóa theo nguyên tắc và công thức sau:
Công thức chuyển đổi giá trị thực xi sang giá trị mã hóa X i như sau:
Ba yếu tố thí nghiệm (X 1 , X 2 , X 3 ) được thiết kế theo 3 mức: -1; 0; 1 tương ứng với phạm vi nghiên cứu
Thiết kế Box-Behnken là loại thiết kế giai thừa phân đoạn ba cấp đặc biệt, cho phép mô hình hóa bậc 1 và bề mặt đáp ứng bậc 2 Những thiết kế này tiết kiệm chi phí hơn so với thiết kế giai thừa đầy đủ ba cấp, đặc biệt đối với số lượng lớn các yếu tố đầu vào Thiết kế thí nghiệm Box-Behken chỉ dùng khi có trên 2 yếu tố Có thể xem cách thiết kế này cho k yếu tố là sự kết hợp giữa cách thiết kế kết hợp đủ cho b yếu tố ở hai mức (b < k) và cách thiết kế khối không hoàn toàn Như vậy, trong mỗi nghiệm
14 thức, sẽ có b yếu tố có giá trị là mức cao (+ 1) hay mức thấp (− 1), các yếu tố còn lại ở mức tâm (0)
Xây dựng và đánh giá mô hình
Sau khi đã có kết quả thực nghiệm, sử dụng các phương pháp toán học khác nhau để xác định giá trị của các hệ số trong mô hình hồi quy đa biến Một trong số những phương pháp hay được sử dụng nhất hiện nay là hồi quy đa biến (dựa trên phương pháp bình phương tối thiểu từng phần)
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu: Lá của cây Sen được thu hái ở Mỹ Đức (Hà Nội) Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen
Nelumbonaceae Mẫu Sen có hoa được ép tiêu bản, lưu trữ tại Phòng Tiêu bản - Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản HNIP/18819/24
Xử lý mẫu sau thu hái: lá Sen sau khi thu hái được cắt nhỏ thành đoạn 3-4 cm, sấy khô ở 55℃
Xử lý dược liệu trước khi chiết: dược liệu được làm nhỏ bằng máy xay, rây qua rây phù hợp, đồng nhất mẫu, bảo quản trong túi PE, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng
Hình 2.1 Lá cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)
2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu
2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất
Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích, gồm có:
- Hóa chất định lượng: AlCl3.6H2O
- Chất chuẩn: isoquercitrin độ tinh khiết 98,2% của công ty Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd
- Dung môi: ethanol 96%, nước cất
2.1.2.2 Phương tiện và máy móc
- Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01 g (Đức)
- Cân phân tích AND GR-202, độ chính xác 0,1 mg (Nhật Bản)
- Cân phân tích XP105, độ chính xác 0,01 mg
- Bể siêu âm Daihan Scientific WUC – A10H (Hàn Quốc)
- Cân xác định hàm ẩm Ohaus MB – 25 (Trung Quốc)
- Bộ dụng cụ cô quay chân không Heidolph Laborota 4000 (Đức)
- Bếp cách thủy Memmert (Đức)
- Dụng cụ thủy tinh: bình nón, bình định mức (10, 25, 50), cốc có mỏ, pipet (1, 2, 5)
- Máy tính với phần mềm Design Expert 13.0.5, MS Excel.
Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
1 Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc lá Sen
2 Nội dung 2: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ lá Sen
3 Nội dung 3: Xây dựng quy trình chiết xuất hoàn chỉnh
Xây dựng quy trình ở quy mô 20 g dược liệu/mẻ
Xây dựng quy trình ở quy mô 200 g dược liệu/mẻ.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Quy trình chiết xuất và điều chế cao đặc lá Sen dự kiến
Cân 20 g bột lá Sen vào bình cầu 500 ml, thêm 200 ml ethanol 70 %, chiết hồi lưu trong 60 phút Lọc dịch chiết qua bông vào bình nón 500 ml Bông lọc được cho vào bình cầu, thêm tiếp 200 ml ethanol 70 % chiết hồi lưu lần 2 trong 60 phút Lọc dịch chiết qua bông, tráng lại bằng ít ethanol Gộp dịch chiết, lọc hút bằng phễu lọc buchner rồi đem đi cất quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở 50 - 60°C đến thể chất lỏng sánh Chuyển dịch chiết đậm đặc ra cốc có mỏ, cô cách thủy ở 80°C sau đó chuyển vào tủ sấy ở 60°C đến thể chất cao đặc (độ ẩm không quá 20 %)
2.3.2 Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc lá Sen bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis
Nguyên tắc: Hàm lượng flavonoid toàn phần được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (Phụ lục 4.1 - Dược điển Việt Nam V) [1], sử dụng phản ứng tạo màu với dung dịch nhôm clorid 2% trong ethanol Hàm lượng flavonoid toàn phần trong sản phẩm được tính theo isoquercitrin từ nồng độ xác định được qua đường chuẩn
2.3.2.1 Khảo sát độ hấp thụ cực đại
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 6 mg chuẩn isoquercitrin
17 hòa tan vào bình định mức 25 ml bằng ethanol 70%, thêm ethanol 70% đến vạch thu được dung dịch chuẩn gốc 240 μg/ml
Hút chính xác 3,0 ml dung dịch trên pha loãng vào bình định mức 10 ml bằng ethanol 70% thu được dung dịch chuẩn nồng độ 72 μg/ml làm khảo sát
Mẫu trắng: Hút 2 ml dung dịch trên vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng ethanol 70%
Mẫu thử: Hút 2 ml dung dịch trên vào bình định mức 10 ml, thêm 2 ml dung dịch
AlCl3 2%, sau đó định mức vừa đủ bằng ethanol 70% Để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Quét phổ để xác định bước sóng cực đại
2.3.2.2 Khảo sát điều kiện phản ứng tạo màu
Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1 g cao đặc lá Sen vào cốc có mỏ 100 ml, thêm 20 ml ethanol 70%, siêu âm bằng máy siêu âm Daihan Scientific WUC – A10H đến khi cao tan hoàn toàn (khoảng 15 phút) Chuyển toàn bộ dịch vào bình định mức 100 ml, bổ sung vừa đủ bằng ethanol đến vạch, lắc đều
Mẫu trắng: Hút 2 ml dung dịch thử vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng ethanol 70%
Mẫu thử: Hút 2ml dung dịch thử vào bình định mức 10 ml, thêm 2 ml dung dịch
AlCl3, sau đó định mức vừa đủ bằng ethanol 70%
- Thời gian phản ứng: 5, 10, 15, 30, 45 và 60 phút
Tiến hành thực hiện 3 lần với mỗi điều kiện trên cùng 1 mẫu cao lá Sen Đo và so sánh độ hấp thụ của các dung dịch trên, từ đó đưa ra điều kiện phản ứng phù hợp
2.3.2.3 Định lượng flavonoid toàn phần
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 6 mg chuẩn isoquercitrin hòa tan vào bình định mức 25 ml bằng ethanol 70%, thêm ethanol 70% đến vạch thu được dung dịch chuẩn gốc 240 μg/ml
Chuẩn bị dãy chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc, hút lần lượt chính xác 1 ml, 2 ml,
3 ml, 4 ml, 5ml, 6ml cho vào các bình định mức 10 ml, định mức vừa đủ bằng ethanol 70%, thu được dãy chuẩn có nồng độ lần lượt là 24 μg/ml, 48 μg/ml, 72 μg/ml, 96 μg/ml, 120 μg/ml và 144 μg/ml
Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1 g cao đặc lá Sen vào cốc có mỏ 100 ml, thêm 20 ml ethanol 70%, siêu âm đến khi cao tan hoàn toàn Chuyển toàn bộ dịch vào bình định mức 100 ml, bổ sung vừa đủ bằng ethanol 70% đến vạch, lắc đều
Mẫu trắng: Hút 2 ml dung dịch trên vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng ethanol 70%
Tiến hành đo quang: Hút 2 ml dung dịch mẫu cần xác định vào bình định mức 10ml, thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2%, sau đó định mức vừa đủ bằng ethanol 70% Để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Sau đó, đo độ hấp thụ ở bước sóng 415nm
Tính kết quả: Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc lá Sen được tính theo isoquercitrin từ nồng độ thu được thông qua đường chuẩn
Công thức tính hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc lá Sen theo isoquercitrin từ nồng độ xác định được qua đường chuẩn:
C: nồng độ flavonoid toàn phần tính được từ phương trình hồi quy chất chuẩn isoquercitrin (μg/ml)
Vt: thể tích mẫu thử (ml)
D: độ pha loãng dung dịch thử m: khối lượng cao (g)
Hc%: hàm ẩm của cao (%)
2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích
Phương pháp định lượng được thẩm định về độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian theo hướng dẫn của AOAC [7] và ICH [16] a Khoảng tuyến tính
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 6 mg chuẩn isoquercitrin hòa tan vào bình định mức 25 ml bằng ethanol 70%, thêm ethanol 70% đến vạch thu được dung dịch chuẩn gốc 240 μg/ml
Chuẩn bị dãy chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc, hút lần lượt chính xác 1 ml, 2 ml,
3 ml, 4 ml, 5ml, 6ml cho vào các bình định mức 10 ml, định mức vừa đủ bằng ethanol 70%, thu được dãy chuẩn có nồng độ lần lượt là 24 μg/ml, 48 μg/ml, 72 μg/ml, 96 μg/ml, 120 μg/ml và 144 μg/ml
Tiến hành đo quang: Hút 2 ml các dung dịch chuẩn trên vào bình định mức 10 ml, thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2 %, sau đó định mức vừa đủ bằng ethanol 70% Để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, thu được dãy chuẩn có nồng độ 4,8 μg/ml,
19 9,6 μg/ml, 14,4 μg/ml, 19,2 μg/ml, 24 μg/ml và 28,8 μg/ml Sau đó, đo độ hấp thụ ở bước sóng 415 nm
+ Hệ số tương quan tuyến tính (r): ≥ 0,995
Trong đó: b: hệ số chắn của đường chuẩn
Ac: Độ hấp thụ của chuẩn isoquercitrin tại nồng độ 100% b Độ phù hợp hệ thống
Tiến hành: Đo 6 lần độ hấp thụ của dung dịch chuẩn isoquercitrin nồng độ 14,4 μg/ml, trong cùng điều kiện đo quang, ghi lại độ hấp thụ ở các lần đo
Yêu cầu: RSD của độ hấp thụ các lần đo không vượt quá 2,0% c Độ lặp lại
Tiến hành: Chuẩn bị 6 dung dịch thử của cùng một mẫu cao Sen theo quy trình đã xây dựng, đo độ hấp thụ trong cùng điều kiện và tính hàm lượng flavonoid toàn phần
Yêu cầu: RSD hàm lượng flavonoid toàn phần giữa các mẫu không vượt quá
2,0% d Độ chính xác trung gian
Tiến hành: Chuẩn bị 6 dung dịch thử khác ngày của cùng 1 mẫu cao Sen theo quy trình đã xây dựng, đo độ hấp thụ trong cùng điều kiện và tính hàm lượng flavonoid toàn phần
Giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng flavonoid của mỗi ngày (n = 6) ≤ 2,0% và của cả hai ngày (n = 12) ≤ 4,0% e Độ đúng
Phương pháp thêm chuẩn: Chuẩn isoquercitrin được thêm vào cao và tiến hành theo quy trình định lượng Tạo các mẫu thử thêm chuẩn có nồng độ tương ứng 80%, 100%, 120% lượng flavonoid toàn phần có trong mẫu thử Tại mỗi mức nồng độ thực hiện 3 mẫu độc lập
Tính tỷ lệ thu hồi (%) của mỗi lượng chất chuẩn thêm vào các mẫu thêm chuẩn theo công thức:
20 Độ đúng hay tỷ lệ thu hồi (%) = 𝐿ượ𝑛𝑔 ℎ𝑜ạ𝑡 𝑐ℎấ𝑡 𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖
Tỷ lệ thu hồi (%) ở mỗi mức nồng độ: từ 92 - 105%
RSD (%) tỷ lệ thu hồi: ≤ 2,0% ở mỗi mức nồng độ
2.3.3 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ lá Sen
2.3.3.1 Lựa chọn các yếu tố khảo sát và thông số đánh giá a Kích thước dược liệu
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc lá
3.1.1 Khảo sát cực đại hấp thụ
Tiến hành như mục 2.3.2.1, khảo sát cực đại hấp thụ mẫu chuẩn cho thấy độ hấp thụ quang đạt giá trị cực đại tại bước sóng 212nm, 276nm và 415nm Bước sóng 415nm được chọn để tiến hành định lượng, do đây là bước sóng nằm trong vùng khả kiến đặc trưng của phức Al(III)-flavonoid màu vàng tạo thành từ phản ứng
Hình 3.1 Khảo sát cực đại hấp thụ chuẩn isoquercitrin (tạo phức màu với nhôm clorid)
3.1.2 Khảo sát điều kiện phản ứng tạo màu
Tiến hành khảo sát nồng độ AlCl3, cố định thời gian phản ứng là 15 phút, thu được kết quả như sau:
Hình 3.2 Kết quả khảo sát nồng độ thuốc thử AlCl 3
Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, độ hấp thụ tăng dần khi tăng nồng độ AlCl3 từ 0,5% đến 1%, sau đó gần như không thay đổi khi tăng nồng độ AlCl3 lên 10% Do vậy, để đảm bảo lượng thuốc thử AlCl3 đủ dùng để phản ứng hết lượng flavonoid có
25 trong mẫu thử cũng như tránh dư quá nhiều gây lãng phí, lựa chọn nồng độ AlCl3 2% để tiến hành phản ứng các thí nghiệm sau
Tiến hành khảo sát thời gian phản ứng của mẫu thử với 2 ml dung dịch AlCl3 2%, thu được kết quả sau:
Hình 3.3 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo phức màu
Nhận xét: Kết quả cho thấy độ hấp thụ của dung dịch thử tăng dần khi thời gian tăng dần từ 5 đến 10 phút, sau đó thay đổi không đáng kể khi thời gian tăng dần đến 60 phút Thời gian phản ứng 10 phút trở lên độ hấp thụ đo được ổn định hơn so với thời gian phản ứng ngắn hơn Do vậy, để đảm bảo đủ thời gian cho AlCl3 tạo phức hết với các flavonoid và ổn định để đo quang, lựa chọn 15 phút làm thời gian để yên phản ứng sau khi thêm thuốc thử AlCl3 vào dung dịch cao lá Sen
Quy trình định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc lá Sen được trình bày như trong mục 2.3.2.3
Tiến hành đo độ hấp thụ của dóy dung dịch chuẩn từ 4,8 đến 28,8 àg/ml thu được kết quả như sau:
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng
STT Nồng độ isoquercitrin (àg/ml) Độ hấp thụ
Thời gian phản ứng (phút)
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ isoquercitrin
Nhận xột: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ từ 4,8 đến 28,8 àg/ml cú sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và độ hấp thụ của isoquercitrin với hệ số tương quan là 0,9998 ( > 0,995) và % hệ số chắn Y% là 0,4% (-2,0% < Y% < 2,0%)
3.1.3.2 Độ phù hợp hệ thống
Tiến hành đo 6 lần độ hấp thụ của dung dịch chuẩn isoquercitrin nồng độ 14,4 àg/ml Kết quả được trỡnh bày ở Bảng 3.2 như sau:
Bảng 3.2 Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống của phương pháp định lượng
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Độ hấp thụ 0,379 0,380 0,380 0,379 0,379 0,379
Trung bình 0,379 Độ lệch chuẩn (SD) 0,0005 Độ lệch chuẩn tương đối
Nhận xét: Kết quả khảo sát ở Bảng 3.2 cho thấy phương pháp định lượng flavonoid toàn phần đảm bảo yêu cầu về độ phù hợp hệ thống với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa các lần đo 0,1% (< 2,0%)
3.1.3.3 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian y = 0,0265x + 0,0014 R² = 0,9997
Nồng độ isoquercitrin (àg/ml)
27 Tiến hành định lượng một mẫu cao lá Sen trong 2 ngày, mỗi ngày 6 lần để đánh giá độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng được xây dựng Kết quả độ chính xác được trình bày ở Bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng
Khối lượng cân chuẩn: 6,11 mg Đường chuẩn: y = 0,0265x + 0,0014
Khối lượng cân chuẩn: 6,31 mg Đường chuẩn: y = 0,0259x – 0,0013 STT Khối lượng cao (g) Độ hấp thụ
Hàm lượng flavonoid toàn phần (%)
Khối lượng cao (g) Độ hấp thụ
Hàm lượng flavonoid toàn phần (%)
Hàm lượng flavonoid toàn phần trung bình 2 ngày (%)
Nhận xét: Kết quả khảo sát ở Bảng 3.3 cho thấy, giá trị độ lệch chuẩn tương đối
RSD của mỗi ngày đều < 2,0% (Ngày 1: 0,5%; ngày 2: 0,7%) và RSD% của cả hai ngày là 0,7% (< 4,0%) Như vậy phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại và độ chính xác trung gian
Tiến hành đo độ hấp thụ các mẫu thêm chuẩn có nồng độ tương ứng với 80%, 100%, 120% lượng flavonoid toàn phần trong mẫu thử Kết quả được trình bày trong Bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp định lượng
Lượng chuẩn có thực (mg) Độ hấp thụ
Lượng chuẩn tìm lại (mg) Độ thu hồi (%)
Nhận xét: Quy trình định lượng đạt yêu cầu độ đúng với các giá trị của độ thu hồi đều nằm trong khoảng 92 -105% và RSD% tỉ lệ thu hồi mỗi mức nồng độ đều < 2,0%
Kết luận: Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao lá Sen đã xây dựng đạt yêu cầu về độ phù hợp, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng Do đó có thể áp dụng phương pháp này để định lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu cao lá Sen.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất
3.2.1 Khảo sát nồng độ ethanol
Tiến hành khảo sát bốn mức nồng độ ethanol: 30%, 50%, 70%, 90%, các điều kiện còn lại không đổi, thu được kết quả sau:
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát nồng độ ethanol
Nồng độ ethanol (%) Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao (%)
Hình 3.5 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc lá Sen
Nhận xét: Hiệu suất tạo cao tăng dần khi tăng nồng độ ethanol từ 30% lên 50% sau đó giảm dần trong khi hàm lượng flavonoid toàn phần tăng dần từ ethanol 30 – 70% sau đó giảm dần Ethanol 50% cho hiệu suất tạo cao cao nhất, tuy nhiên hàm lượng flavonoid toàn phần lại giảm đi đáng kể so với ethanol 70% Trong khi đó, ethanol 70% vừa tạo nhiều cao, vừa cho hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất Do vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn ethanol 70% để làm dung môi chiết cao cho các khảo sát tiếp theo và khoảng nồng độ 50 – 90% để tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng
3.2.2 Khảo sát phương pháp chiết
Kết quả khảo sát phương pháp chiết được trình bày như sau:
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát phương pháp chiết
Hà m lư ợn g flav on oid to àn p hầ n (% )
H iệ u su ất tạ o ca o (% )
Khảo sát nồng độ ethanol
Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần (%)
Phương pháp chiết Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao (%)
Hình 3.6 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao
Nhận xét: Kết quả cho thấy, phương pháp hồi lưu cho hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất so với các phương pháp khác đã được khảo sát So với phương pháp hồi lưu, phương pháp ngâm tốn nhiều thời gian, tăng tạo tạp, hiệu suất tạo cao cũng như hàm lượng flavonoid toàn phần thu được thấp Phương pháp siêu âm có hàm lượng hoạt chất thu được giảm không đáng kể so với hồi lưu, tuy nhiên hiệu suất tạo cao không cao, đồng thời khó triển khai quy mô công nghiệp Do vậy, phương pháp hồi lưu được lựa chọn cho các lần khảo sát tiếp theo
3.2.3 Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành khảo sát thời gian chiết mỗi lần là 30 phút, 60 phút, 90 phút thu được kết quả như sau:
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát thời gian chiết
Thời gian chiết (phút) Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao (%)
Siêu âm Ngâm nóng Ngâm nhiệt độ phòng Hồi lưu Hàm lượn g flav on oid to àn p hần ( %)
Khảo sát phương pháp chiết
Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần (%)
Hình 3.7 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao
Nhận xét: Hiệu suất tạo cao tăng dần từ 25,07% lên 26,84% khi tăng thời gian chiết từ 30 đến 90 phút, trong khi đó hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao đạt giá trị lớn nhất khi chiết 60 phút mỗi lần Từ 60 – 90 phút, mặc dù hiệu suất tạo cao có tăng song hàm lượng flavonoid toàn phần lại bị giảm, đồng thời gây tốn kém thời gian chiết xuất, năng lượng và chi phí Do đó, nhóm lựa chọn 60 phút làm thời gian chiết cho các khảo sát tiếp theo
3.2.4 Khảo sát số lần chiết
Khảo sát số lần chiết xuất bằng cách tiến hành chiết các mẫu cao tương ứng với số lần chiết là 1 lần, 2 lần và 3 lần Tính hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu cao Kết quả được trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.8
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát số lần chiết
Số lần chiết xuất Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao (%)
Hàm lượn g flav on oid to àn p hần ( %)
Khảo sát thời gian chiết
Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần (%)
Hình 3.8 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao
Nhận xét: Khi tăng số lần chiết xuất từ 1 lần đến 3 lần, hiệu suất tạo cao tăng dần, hàm lượng flavonoid toàn phần giảm dần Đối với số lần chiết là 2, hàm lượng flavonoid toàn phần giảm không quá nhiều so với chiết 1 lần, hiệu suất tạo cao lại tăng lên đáng kể Mặt khác, khi chiết 3 lần, mặc dù hiệu suất tạo cao tăng lên nhưng hàm lượng flavonoid toàn phần lại giảm đi, đồng thời gây tốn kém về dung môi, thời gian chiết xuất và xử lý sau đó, năng lượng, chi phí sản xuất, so với chiết 2 lần Do đó, số lần chiết được chọn cho các khảo sát tiếp theo là 2 lần
3.2.5 Khảo sát tỷ lệ dung môi : dược liệu
Tiến hành khảo sát các tỷ lệ dung môi : dược liệu 6, 8, 10, 12 (ml/g) thu được kết quả như sau:
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi : dược liệu
Tỷ lệ dung môi : dược liệu (ml/g) Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao (%)
1 2 3 Hàm lượn g flav on oid to àn p hần ( %)
Khảo sát số lần chiết
Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần (%)
Hình 3.9 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi : dược liệu đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao
Nhận xét: Khi tăng tỷ lệ dung môi : dược liệu, lượng chất hòa tan tăng, do đó làm tăng hiệu suất tạo cao từ 22,69% lên 27,18% Tuy nhiên, hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao tăng dần khi tỷ lệ dung môi : dược liệu tăng từ 6 (ml/g) lên 8 (ml/g) sau đó giảm dần khi tỷ lệ tăng từ 8 – 12 (ml/g) Do ở tỷ lệ 12 (ml/g) hiệu suất tạo cao tăng lên không đáng kể, hàm lượng flavonoid toàn phần lại giảm, đồng thời, để tiết kiệm dung môi, thời gian, năng lượng để cô tạo cao, Do vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn khoảng tỷ lệ dung môi : dược liệu là 6, 8, 10 (ml/g) để đưa vào mô hình RSM.
Tối ưu hóa quá trình chiết xuất flavonoid từ lá Sen
Sau khi khảo sát các yếu tố và lựa chọn được phương pháp chiết, số lần chiết phù hợp, các yếu tố nồng độ ethanol, thời gian chiết xuất và tỷ lệ dung môi : dược liệu được lựa chọn để tiếp tục đưa vào mô hình RSM với khoảng khảo sát lần lượt là: 50 –
90 %, 30 – 90 phút, 6 – 10 (ml/g) Các yếu tố này được mã hóa thành các biến đầu vào tương ứng X 1 , X 2 , X 3 với khoảng khảo sát được mã hóa thành khoảng [-1;1] Giá trị nồng độ ethanol 70%, thời gian chiết xuất 60 phút và tỷ lệ dung môi : dược liệu 8 (ml/g) (ứng với giá trị của các biến mã hóa tương ứng bằng 0) được gọi là các giá trị tại tâm Thí nghiệm mà tại đó, tất cả các biến đầu vào đều nhận giá trị tại tâm được gọi là thí nghiệm tại tâm Các thông số đánh giá bao gồm hiệu suất tạo cao (Y 1 ) và hàm lượng flavonoid toàn phần (Y 2 ) được gọi là các biến đầu ra
Hàm lượn g flav on oid to àn p hần ( %)
Tỷ lệ dung môi : dược liệu (ml/g)
Khảo sát tỷ lệ dung môi : dược liệu
Hiệu suất tạo cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần (%)
Bảng 3.10 Các mức thí nghiệm sử dụng trong mô hình RSM
Mã hóa Tên Đơn vị Phạm vi nghiên cứu
Tỷ lệ dung môi : dược liệu ml/g 6 – 10 6 8 10
Sau khi tiến hành thực nghiệm thu được kết quả như sau:
Bảng 3.11 Kết quả hàm mục tiêu quy hoạch thực nghiệm
Biến mã hóa Biến chưa mã hóa
Hàm lượng flavonoid toàn phần
Tỷ lệ dung môi : dược liệu
Sau khi thiết kế thí nghiệm và có kết quả thực nghiệm, tiến hành xây dựng và đánh giá mô hình như sau:
Mô hình được xây dựng ở dạng phương trình toán học biểu thị sự phụ thuộc của hiệu suất tạo cao (Y 1 ) hoặc hàm lượng flavonoid toàn phần (Y 2 ) vào các biến đầu vào Kết quả như sau:
Phương trình với biến đầu vào đã được mã hóa:
Phương trình với biến đầu vào mang giá trị thực:
Y 1 = 0,5627 + 0,2807.nồng độ ethanol + 0,0216.thời gian + 3,5198.tỷ lệ -
0,0027.nồng độ ethanol 2 – 0,1747.tỷ lệ 2
Y 2 = -2,50052 + 0,197042.nồng độ ethanol + 0,038361.thời gian +
0,688958.tỷ lệ - 0,001324.nồng độ ethanol 2 – 0,000263.thời gian 2 –
Kết quả phân tích phương sai ANOVA của các mô hình được trình bày ở bảng 3.12
Bảng 3.12 Kết quả phân tích phương sai ANOVA của các mô hình
Tổng bình phương Bậc tự do Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị p
Hàm lượng flavonoid toàn phần (Y 2 )
Tổng bình phương Bậc tự do Trung bình bình phương Tỷ lệ F Giá trị p
Phép kiểm định sự không phù hợp (Lack of fit) nhằm đánh giá mức độ phù hợp của mô hình Mô hình được coi là phù hợp nếu giá trị p của phép kiểm định lớn hơn 0,05 Ngược lại, nếu giá trị p nhỏ hơn 0,05 mô hình sẽ không được chấp nhận [14]
R 2 là hệ số xác định, đặc trưng cho mối tương quan giữa biến độc lập và biến phụ thuộc Giá trị R 2 càng gần 1, mô hình có độ tuyến tính càng cao và ngược lại [14]
R 2 adj (hay R 2 hiệu chỉnh )là hệ số xác định hiệu chỉnh, đặc trưng cho mức độ bền vững của mô hình Một mô hình được coi là bền vững nếu R 2 adj không quá chênh lệch so với
R 2 dự đoán là hệ số xác định dự đoán, đặc trưng cho khả năng dự đoán của mô hình
R 2 dự đoán càng gần R 2 adj , mô hình dự đoán càng tốt [14]
Nhận xét: Từ kết quả trình bày ở bảng 3.12 cho thấy:
Phân tích sự phù hợp của mô hình và sự có ý nghĩa của mô hình được đánh giá qua các chỉ số tương quan Sự có ý nghĩa của các hệ số hồi quy được kiểm định bởi chuẩn F, với các giá trị p < 0,05 cho biết các hệ số hồi quy có ý nghĩa
Mô hình biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất tạo cao vào nồng độ ethanol, thời gian chiết xuất, tỷ lệ dung môi : dược liệu có ý nghĩa với p < 0,0001, các yếu tố riêng lẻ gồm nồng độ ethanol (X 1 ), thời gian chiết (X 2 ), tỷ lệ dung môi : dược liệu (X 3 ), bình phương của biến nồng độ ethanol (X 1 2) và bình phương của biến tỷ lệ dung môi : dược liệu (X 3 2) là các yếu tố quan trọng (p < 0,05) Trong khi đó, các yếu tố còn lại ảnh hưởng không có ý nghĩa đến hàm mục tiêu (p > 0,05), việc loại các yếu tố này có thể cải thiện được mô hình Các cặp tương tác ảnh hưởng không có ý nghĩa đến hàm mục tiêu (p > 0,05) chứng tỏ các yếu tố đầu vào độc lập với nhau Ngoài ra, mô hình còn đảm bảo tính bền vững và có độ tuyến tính cao với hệ số xác định R 2 = 0,9532, hệ số xác định hiệu chỉnh R 2 adj = 0,9272 và hệ số R 2 dự đoán = 0,8606 Giá trị p trong phép
37 kiểm định sự không phù hợp (Lack of fit) là 0,1089 > 0,05 cho thấy sự không phù hợp không có ý nghĩa thống kê Nói cách khác, mô hình có tính phù hợp và đáng tin cậy Đối với hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao, giá trị F của mô hình bằng 86,69, giá trị p của mô hình < 0,0001 chứng tỏ mô hình có ý nghĩa Các yếu tố X 1 , X 2 ,
X 3 , X 1 2, X 2 2, X 3 2 có giá trị p < 0,05 cho thấy các yếu tố này có ý nghĩa Các cặp tương tác X 1 X 2 , X 1 X 3 , X 2 X 3 ảnh hưởng không có ý nghĩa đến hàm mục tiêu (p > 0,05) chứng tỏ các yếu tố đầu vào độc lập với nhau Mô hình này có độ tuyến tính cao với giá trị R 2
= 0,9849, cho thấy có tới 98,49% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu tiên đoán của mô hình Mô hình đảm bảo tính bền vững với hệ số xác định hiệu chỉnh R 2 adj 0,9735 Hệ số R 2 dự đoán = 0,9405 gần với R 2 adj cho thấy mô hình dự đoán tốt Phép kiểm định sự không phù hợp (Lack of fit) với giá trị p là 0,1139 > 0,05 cũng cho thấy có thể sử dụng mô hình để đánh giá ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao
* Xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ ethanol, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi : dược liệu đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần
Tác động của các yếu tố và sự tương tác lẫn nhau giữa các biến ảnh hưởng đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần được mô tả bởi các điểm đáp ứng bề mặt 3D và các điểm viền 2D Hai trục X và Y biểu thị 2 trong 3 yếu tố ảnh hưởng, yếu tố còn lại được giữ ở mức trung bình (mức 0) của nó, trục Z biểu thị biến đầu ra (hiệu suất tạo cao/ hàm lượng flavonoid toàn phần) Dựa vào các mô hình đáp ứng này có thể xác định được giá trị tối ưu của từng yếu tố ảnh hưởng làm cho hàm đáp ứng đạt giá trị cực đại Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần vào các yếu tố nồng độ ethanol, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi : dược liệu được trình bày ở hình 3.10 như sau:
Hình 3.10 Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao lá Sen
A1, B1, C1: Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tạo cao A2, B2, C2: Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Theo đồ thị hình 3.10 cho thấy, khi tăng dần nồng độ ethanol thì hiệu suất tạo cao sẽ giảm dần Trái lại, khi càng tăng thời gian chiết và tỷ lệ dung môi : dược liệu thì hiệu suất tạo cao càng tăng Khác với hiệu suất tạo cao, hàm lượng flavonoid toàn phần lại tăng dần khi tăng các yếu tố nồng độ ethanol, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi : dược liệu Tuy nhiên, khi tăng đến một giá trị cực đại nào đó tương ứng với từng yếu tố, nếu vượt qua giá trị này, hàm lượng flavonoid toàn phần sẽ giảm Các kết quả này phù hợp với kết quả khảo sát đơn yếu tố ở các mục 3.2.1, 3.2.3 và 3.2.5 Ngoài ra, dựa vào hệ số phương trình (1) và (2) đồng thời quan sát các mô hình trong hình 3.10 có thể thấy nồng độ ethanol là yếu tố có tác động lớn nhất tới hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần
* Xác định các giá trị tối ưu của biến đầu vào
Bàn luận
3.4.1 Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao lá Sen bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và khá phổ biến để định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu với độ chính xác tương đối cao Các chuyên luận trong Dược điển Châu Âu đã sử dụng phương pháp trên để định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu Dựa trên các tài liệu tham khảo được, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn phương pháp đo quang dựa trên phản ứng tạo phức màu với thuốc thử AlCl3 để định lượng flavonoid toàn phần trong lá Sen
Như đã trình bày ở mục 1.3, mỗi nghiên cứu lại sử dụng một quy trình phản ứng với dung môi và thuốc thử khác nhau để tạo phức đo quang Tuy nhiên, theo tài liệu tìm được, việc thêm muối acetat vào phản ứng không đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng flavonoid toàn phần, đồng thời còn khiến quy trình trở nên phức tạp hơn so với việc chỉ dùng thuốc thử AlCl3 [8], [28] Quy trình với sự có mặt của NaNO2 trong môi trường kiềm dường như chỉ đặc hiệu với rutin, luteolin và catechin và cho độ hấp thụ cực đại tại 510nm Tuy nhiên, các acid phenolic khác cũng có độ hấp thụ đáng kể ở bước sóng này Quy trình tiến hành trong môi trường trung tính (không có NaNO2) chỉ có thể được sử dụng để xác định hàm lượng flavonol và luteolin (thuộc họ flavon) [28] Dựa trên các nghiên cứu về thành phần hóa học trong lá Sen (mục 1.1.2) có thể thấy trong lá Sen chứa lượng khá lớn acid phenolic [30], đồng thời các flavonoid được tìm thấy chủ yếu trong lá Sen là các flavonol chiếm hàm lượng cao Bên cạnh đó, trong quá trình thực nghiệm, khi tiến hành phản ứng dịch chiết cao sen với AlCl3 có thêm thuốc thử NaNO2 trong môi trường kiềm NaOH, kết quả tạo ra tủa đỏ Khi giảm nồng độ các thuốc thử và thời gian ủ vẫn không hết hiện tượng tủa, do đó không sử dụng phản ứng này cho quy trình định lượng Vì vậy, quy trình định lượng của phương pháp này chỉ sử dụng AlCl3 để tạo phức Đây là quy trình phù hợp, đơn giản và rẻ tiền nhất
41 Ngoài ra, để đảm bảo lượng thuốc thử cũng như thời gian đủ để phản ứng tạo phức diễn ra hoàn toàn và ổn định, đồng thời tránh gây lãng phí thuốc thử và tiết kiệm thời gian, nhóm đã tiến hành khảo sát sợ bộ và chọn nồng độ AlCl3 2% và thời gian phản ứng là 15 phút là điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng định lượng flavonoid trong cao lá Sen
Các phép thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần được tiến hành bao gồm: độ đúng, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ phù hợp hệ thống và đều cho kết quả nằm trong giới hạn yêu cầu Do vậy, phương pháp đã xây dựng đảm bảo phù hợp để định lượng được flavonoid toàn phần trong các mẫu cao lá Sen khảo sát Tuy nhiên, phương pháp vẫn còn một số nhược điểm như độ chọn lọc kém, hàm lượng flavonoid toàn phần được tính toán theo một chất đại diện, với giả định các phản ứng bằng nhau từ tất cả các flavonoid, tuy nhiên trong thực tế có sự khác biệt về giá trị độ hấp thụ ở bước sóng định lượng giữa các flavonoid, làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng
3.4.2 Về các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao lá Sen
Trong nghiên cứu này, có hai phương pháp được sử dụng để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao lá Sen là phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) và phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Các yếu tố nồng độ ethanol, phương pháp chiết, thời gian chiết, số lần chiết, tỷ lệ dung môi : dược liệu được khảo sát trước bằng phương pháp thay đổi một yếu tố, sau đó lựa chọn ra các yếu tố nồng độ ethanol, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi : dược liệu với các khoảng giá trị thích hợp để khảo sát bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc lá Sen bằng phương pháp OFAT và cũng là lần đầu tiên mô hình biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần vào nồng độ ethanol, thời gian chiết xuất và tỷ lệ dung môi : dược liệu được xây dựng và phân tích để đưa ra điều kiện chiết xuất tối ưu flavonoid từ lá Sen
Trong nghiên cứu này, với việc ứng dụng cả hai phương pháp OFAT và RSM, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao lá Sen đã được khảo sát một cách toàn diện Ảnh hưởng của các yếu tố này đến hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong sản phẩm có thể được giải thích rõ hơn như sau: Đối với phương pháp chiết, hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần đạt giá trị cao nhất khi sử dụng phương pháp hồi lưu Phương pháp ngâm nóng có hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần lớn hơn so với ngâm ở nhiệt độ phòng Điều này chứng tỏ nhiệt độ cũng ảnh hưởng nhất định đến hiệu suất chiết flavonoid trong lá Sen Phương pháp hồi lưu là phương pháp chiết tại nhiệt độ sôi, do đó có nhiệt
42 độ khi chiết xuất lớn hơn các phương pháp còn lại, làm tăng độ tan và tốc độ khuếch tán hoạt chất, ngoài ra khi sôi dẫn đến sự di chuyển các pha, tạo điều kiện thủy động giúp quá trình khuếch tán đối lưu diễn ra tốt hơn, điều này giúp rút ngắn thời gian chiết, tăng hiệu suất, đồng thời phương pháp này còn hạn chế hao hụt dung môi, ô nhiễm môi trường, thiết bị lại đơn giản và dễ thực hiện Do vậy, việc lựa chọn phương pháp chiết hồi lưu cho quy trình chiết xuất lá Sen là hoàn toàn hợp lý
Khi càng tăng số lần chiết xuất, dược liệu được tiếp xúc với dung mới, tổng lượng hoạt chất chiết ra được càng nhiều, tuy nhiên lượng hoạt chất chiết được trong mỗi lần lại giảm dần, dịch chiết càng loãng, lượng tạp được chiết ra lại càng nhiều dẫn đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao giảm đi mặc dù hiệu suất tạo cao tăng Sau 2 lần chiết, có thể flavonoid đã được chiết gần như kiệt hoàn toàn, khiến cho lần chiết thứ 3 chủ yếu chiết ra tạp chất, do đó làm cho hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao giảm mạnh so với chiết 2 lần Ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ ethanol, thời gian chiết xuất và tỷ lệ dung môi : dược liệu đến quá trình chiết xuất cao lá Sen được khảo sát bằng phương pháp OFAT, sau đó lựa chọn các khoảng giá trị thích hợp để đưa vào bề mặt đáp ứng Dựa vào hệ số từ phương trình (1) và (2), có thể thấy nồng độ ethanol là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất tới hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong sản phẩm Hiệu suất tạo cao giảm dần khi tăng nồng độ ethanol, trong khi đó hàm lượng flavonoid toàn phần lại tăng dần theo nồng độ ethanol đến một giá trị cực đại, sau đó nếu nồng độ ethanol vượt qua giá trị này, hàm lượng flavonoid toàn phần bị giảm Điều này có thể giải thích dựa vào độ phân cực của dung môi và chất tan Dung môi phân cực hòa tan tốt các chất phân cực và ngược lại, dung môi kém phân cực hòa tan các chất kém phân cực Ở nồng độ ethanol khoảng 50%, do nồng độ ethanol thấp dẫn đến hòa tan không chọn lọc nhiều chất, làm hiệu suất tạo cao tăng Tuy nhiên, ethanol thấp độ làm giảm lượng flavonoid toàn phần chiết được do flavonoid tan tốt trong ethanol cao độ, đồng thời lượng tạp chất chiết được tăng lên khiến cho hàm lượng favonoid toàn phần trong cao thu được giảm Trong khi đó, chiết bằng ethanol 70% vừa tạo nhiều cao, vừa cho hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất có thể do độ phân cực của các flavonoid gần với ethanol 70% nên hòa tan được nhiều nhất, đồng thời ethanol cao độ hòa tan chọn lọc hơn, cao ít tạp, từ đó làm tăng hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đó của Sha Chen và cộng sự [12] Đối với yếu tố thời gian chiết, hiệu suất tạo cao tăng dần theo thời gian, trong khi đó hàm lượng flavonoid toàn phần lại tăng lên cực đại sau đó giảm dần Nguyên nhân do càng tăng thời gian chiết, lượng chất chiết được càng tăng lên, làm tăng hiệu suất tạo cao Tuy nhiên hoạt chất thường có kích thước phân tử nhỏ hơn tạp chất, dẫn đến khuếch tán nhanh hơn, đạt cân bằng chiết sớm hơn, khi thời gian chiết quá lâu, tỷ lệ
43 hoạt chất không tăng, tỷ lệ tạp chất tăng, từ đó làm giảm hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao Do đó, sau khoảng 70 – 80 phút, phần lớn lượng flavonoid đã được chiết ra Tiếp tục đun nóng chỉ hòa tan được thêm tạp chất làm giảm hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao
Yếu tố tỷ lệ dung môi : dược liệu cũng ảnh hưởng lớn tới hiệu suất tạo cao và hàm lượng flavonoid toàn phần Khi tăng dần tỷ lệ dung môi : dược liệu, hiệu suất tạo cao cũng tăng dần, tuy nhiên hàm lượng flavonoid toàn phần lại tăng dần đến một giá trị cực đại, sau đó giảm dần Điều này do khi tăng lượng dung môi dùng để chiết xuất mỗi lần, lượng hoạt chất được hòa tan tăng lên, làm tăng hiệu suất Tuy nhiên, khi dùng quá nhiều dung môi khiến cho dịch chiết bị loãng, lượng tạp chiết ra được nhiều hơn trong khi lượng flavonoid tăng không nhiều, dẫn đến hàm lượng flavonoid toàn phần bị giảm
3.4.3 Về kết quả xây dựng quy trình chiết xuất cao lá Sen
Từ kết quả khảo sát và phân tích ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ ethanol, phương pháp chiết, thời gian chiết, số lần chiết, tỷ lệ dung môi : dược liệu tới hiệu suất chiết cao và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao, quy trình chiết xuất tối ưu cao đặc lá Sen ở quy mô 20 g dược liệu/mẻ đã được xây dựng hoàn chỉnh Quy trình đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm thời gian, dung môi, thân thiện môi trường Kết quả hiệu suất tạo cao trung bình của sản phẩm chiết xuất theo quy trình đạt 25,81% và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao đạt 8,74%
Tiến hành nâng cấp quy mô lên 200 g dược liệu/mẻ, kết quả cho thấy quy trình tương đối ổn định với hiệu suất tạo cao trung bình của sản phẩm chiết xuất theo quy trình đạt 25,44% và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao đạt 8,61%