lê quỳnh hương góp phần xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng dược liệu đỏ ngọn

Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.. Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiê

TỔNG QUAN

Tổng quan về chi Cratoxylum

1.1.1 Vị trí phân loại chi Cratoxylum

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan 2009: chi Cratoxylum thuộc họ Ban, bộ Ban, ngành Ngọc lan

Theo tài liệu Thực vật Chí Trung Quốc: chi Cratoxylum được xếp vào họ Măng cụt (Clusiaceae) [49]

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Cratoxylum

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật của chi Cratoxylum

Cây gỗ hay cây bụi Lá nguyên, có cuống hoặc gần như không cuống Cụm hoa ở nách lá hay ở ngọn thành chùy Lá đài 5, dai, và tồn tại trên quả nang Cánh hoa 5, màu trắng, hồng hoặc đỏ kèm theo vẩy gốc hay không, ở bên trong, và dính với cánh Tuyến 3-5, áp trên lưng của các lá noãn, nạc Nhị nhiều, thành 3-5 bó có cuống, cuống hình dải, dài bằng hoặc ngắn hơn chỉ nhị rời, chỉ nhị xếp trên một hoặc nhiều dãy, bao phấn nhỏ, hướng ngoài Bầu có 3 ô, với 3 vòi nhụy rời, dạng sợi Quả nang có 3 van mang theo vách, hạt 4 hoặc nhiều trong mỗi ô, đính trên những giá noãn, mọc đứng, có cánh [8]

1.1.2.2 Phân bố của chi Cratoxylum

Chi Cratoxylum được biết là có nguồn gốc từ Đông Nam Á, với sáu loài được chấp nhận: C arborescens, C cochinchinense, C.formosum, C glaucum, C maingayi và

C.sumatranum Chúng được phổ biến rộng rãi ở khu vực Đông Nam Á, bao gồm các nước như Malaysia, Singapore, Indonesia, Việt Nam và Thái Lan Chúng cũng được tìm thấy ở các nước châu Á như Ấn Độ và Trung Quốc [19] Ở Việt Nam: Chi Cratoxylum có 5 loài phân bố khắp nước ta từ Bắc vào Nam, nhưng phân bố chủ yếu ở các tỉnh Trung Bộ và Tây Nguyên [13]

1.1.3 Tình hình nghiên cứu hóa thực vật của chi Cratoxylum

Các nghiên cứu đã chỉ ra một số hợp chất được phân lập từ chi Cratoxylum có khung

3 xanthone (α-mangostin, formoxanthon A, ), khung flavonoid, khung anthraquinon, khung terpen [20],[21], [27],[29].

Tổng quan về loài Cratoxylum formosum (Jack) Benth & Hook.f ex Dyer

1.2.1 Đặc điểm thực vật, phân bố

Loài Cratoxylum formosum chia thành hai dưới loài gồm Cratoxylum formosum subsp pruniflorum (Kurz) Gogelein) và Cratoxylum formosum subsp formosum [49],[50] Tại Việt Nam, loài được gọi với các tên như : Đỏ ngọn, Thành ngạnh, Lành ngạnh, Vàng la, Cúc lương, Hoàng ngưu trà, Voòng a mộc, Mạy tiên (Tày), Co kín lang (Thái) [4]

Cây Đỏ ngọn là loại cây nhỏ, phần gốc có gai (trong rừng lâu năm cây có thể cao và to), cành non có lông tơ, màu đỏ nên gọi là đỏ ngọn Lá hình mác dài 12–13 cm, rộng 3,5–4 cm, mọc đối xứng, cuống ngắn 3–5 mm, gốc tròn, đỉnh tù hoặc nhọn Mặt gân chính màu đỏ đến 1/3 lá non, gân lá và lá có màu đỏ đến quá nửa Hoa mọc trên những cành ở kẽ lá màu trắng hoặc hồng có lông màu tía Quả nang dài 15 mm, rộng 7–8 mm Hạt hình trứng dài 6 mm, rộng 3 mm [16], [49]

Phân bố: Tại Việt Nam, cây mọc hoang tại các tỉnh miền Bắc, nhất là mọc trên các đồi trọc của vùng trung du Ngoài ra, loài có ở Malaysia, Indonesia, Lào, Thái Lan, Campuchia, [16], [49]

1.2.2 Nghiên cứu hóa thực vật

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu hóa thực vật của loài

STT Các hợp chất được phân lập TLTK

- Flavonol và flavonol glycosid: quercetin (2), quercitrin (3), hyperin (quercetin-3-O-β-galactopyranoside) (4) , afzelin (kaempferol-3-O-rhamnoside) (5), isoquercetin (quercetin-3- O -β-glucopyranoside) (6)

Kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranoside (7), Kaempferol 3-O- α-L-rhamnopyranoside (8), Quercetin 3-O-α-L- arabinofuranoside (9)

Epicatechin (10), isorhamnetin-3-O-glucoside (11), quercetin- 3-O-α-L-arabinoside (gujaverin) (12), quercetin-3-O-α-L- rhamnoside (13)

Các prunifloron được đánh số từ 1 đến 10 Công thức của chúng có cấu trúc:

R1≠ R2 và đều là gốc ankyl hoặc dẫn xuất của nó; R: H hoặc CH3

Tên của chúng lần lượt là: 1 Pruniflorone A; 2 Pruniflorone B;

1.2.3 Bộ phận dùng và tác dụng dược lý

Lá, vỏ thân, rễ, hoa, thân, quả, cành đều có thể sử dụng Đỏ ngọn được thu hái quanh năm, dùng tươi hay ủ rồi phơi khô Tại Việt Nam, bộ phận được nghiên cứu và sử dụng

1.2.3.2 Tác dụng dược lý a Tác dụng chống oxy hóa

Dịch chiết lá Đỏ ngọn (1/16) có tác dụng chống oxy hóa mạnh, hoạt tính chống oxy hóa đạt 69% [16]

Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được đánh giá bằng cách đo hoạt tính bắt gốc tự do DPPH Các xanthon cho thấy hơn 50% hoạt tính nhặt gốc tự do DPPH ở

50 μM Xem xét cấu trúc, các nhóm dihydroxy rất quan trọng đối với hoạt động chống oxy hóa của xanthon Đối với flavonoid, các flavonoid cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tốt.Dịch chiết lá, rễ, thân Đỏ ngọn đều có tác dụng chống oxy hóa, trong đó lá thể hiện rừ ràng nhất với hoạt tớnh chống oxy húa (IC50) là 14,9 àg/ml [17]

Choi cùng các cộng sự (2014), nghiên cứu in vitro dịch chiết Đỏ ngọn trên các flavonoid đã được phân lập: quercitrin và glycosid của quercitrin (quercitrin, hyperin, isoquercitrin, afzelin), cho thấy khả năng chống oxy hóa của chúng rất rõ ràng Trong đú, tỏc dụng loại bỏ gốc tự do mạnh nhất là hợp chất isoquercitrin tại nồng độ 1 àl [38] Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết Đỏ ngọn được báo cáo bởi Sripanidkulchai cựng cỏc cộng sự (2010) trờn chuột nhắt trắng Cú nồng độ hiệu quả ở mức 10,5 àg/ml, gấp khoảng 3 lần so với acid ascorbic và α-tocopherol (chất chống oxy hóa tiêu chuẩn) Tuy dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn chất chống oxy hóa tiêu chuẩn nhưng nó chứa hàm lượng phenolic cao với nồng độ đương lượng acid gallic là 161,7 ± 2,7 mg/g [42] b Tác dụng chống viêm

Choi cùng các cộng sự (2014), nghiên cứu in vitro dịch chiết Đỏ ngọn trên các flavonoid đã được phân lập: quercitrin và glycosid của quercitrin (quercitrin, hyperin, isoquercitrin, afzelin), đồng thời cho thấy khả năng chống viêm bởi khả năng ngăn chặn sản sinh NO của đại thực bào được kích thích bằng LPS đã được phân tích bằng đầu dò huỳnh quang Hiệu quả của quercetin là cao nhất trong các hợp chất thử nghiệm [38] c Tác dụng lên hệ thần kinh

Cao Đỏ ngọn có tác dụng hoạt hóa hệ thần kinh, trong đó có hệ thần kinh thực vật, biểu hiện ở sự tăng hàm lượng catecholamin trong máu và tăng nhẹ thành phần sóng beta trên điện não đồ ở thỏ uống thuốc [16]

Dịch chiết Đỏ ngọn có tác dụng làm tăng khả năng thành lập phản xạ có điều kiện và dập tắt phản xạ trên chuột nhắt trắng và như vậy làm tăng các quá trình hưng phấn và ức chế có điều kiện trên động vật thí nghiệm [16]

7 d Tác dụng chống đái tháo đường

Dịch chiết lá, rễ, thân Đỏ ngọn đều có tác dụng ức chế α-glucosidase, thể hiện tác dụng mạnh hơn ở lá và thân Hoạt tính ức chế α-glucosidase (IC50) ở rễ và lá lần lượt là 2,0 àg/ml và 3,9 àg/ml [17] α-glucosidase là enzym quan trọng trong cơ chế điều hũa nồng độ đường huyết, là một trong các đích điều trị đái tháo đường hiện nay e Tác dụng lên tế bào ung thư

Tại Thái Lan, Boonnak và các cộng sự cho thấy dịch chiết từ Đỏ ngọn ức chế sự phát triển của ung thư miệng, ung thư cổ tử cung, ung thư đường mật Tác dụng được nghiên cứu trên dịch chiết Đỏ ngọn bằng các dung môi hữu cơ, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Dịch chiết bằng methanol và ethyl acetat có hàm lượng acid gallic và quercetin cao, catechin được tìm thấy trong dịch chiết nước [35], [36], [39]

Tương tự, Buranrat và các cộng sự (2017) đã nghiên cứu và chứng minh hàm lượng phenolic và flavonoid (bằng cách sử dụng acid gallic và rutin) trong dịch chiết từ cây Đỏ ngọn có tác dụng chống ung thư vú [22]

Năm 2014, Nonpunya cùng cộng sự của mình chứng minh rằng dịch chiết Đỏ ngọn phá vỡ tế bào ung thư gan HepG2 ở người bằng cách hình thành apoptosis [33]

1.2.4 Sử dụng trong y học cổ truyền

Tính vị, công năng: Đỏ ngọn có vị đắng chát, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiêu hóa

- Lá được dùng phổ biến làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian, lá thái nhỏ, sắc uống thay chè có tác dụng phòng cảm nắng và chữa bệnh kiết lỵ [16]

- Phụ nữ sau khi đẻ, lấy lá Đỏ ngọn nấu nước uống với liều lượng mỗi ngày 15-30 g giúp tiêu hóa, ăn ngon (có thể thêm lá Vối) hoặc phối hợp với lá Thanh cao hoa vàng, sắc uống để chữa sốt, mồ hôi trộm, chân tay bải hoải [13], [16]

- Dùng ngoài: Lá Đỏ ngọn giã nát, trộn với nước vo gạo đặc, đắp chữa bỏng [16]

Một số quan điểm tiếp cận và hướng dẫn về xây dựng tiêu chuẩn dược liệu

Tiêu chuẩn cơ sở dược liệu là một tập hợp các phép thử, phép tham chiếu và quy trình phân tích thiết lập các tiêu chí mà dược liệu phải tuân theo để được coi là đạt tiêu chuẩn cho mục đích sử dụng của nó [45] Tiêu chuẩn cơ sở ràng buộc về mặt pháp lý do cơ sở sản xuất đề xuất và chứng minh và được cơ quan quản lý có thẩm quyền phê duyệt

Hệ thống tiêu chuẩn và ký hiệu tiêu chuẩn của Việt Nam bao gồm [3],[5]:

- Tiêu chuẩn quốc gia, ký hiệu TCVN: Dược điển Việt Nam là bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc

- Tiêu chuẩn cơ sở, ký hiệu TCCS: là tiêu chuẩn do cơ sở sản xuất, pha chế biên soạn, áp dụng đối với các sản phẩm do cơ sở sản xuất, pha chế Tiêu chuẩn cơ sở của thuốc tối thiểu phải đáp ứng các yêu cầu về chỉ tiêu chất lượng và mức chất lượng được quy định tại chuyên luận tiêu chuẩn chất lượng thuốc tương ứng của Dược điển Việt Nam

1.3.2 Phương thức xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

Tiêu chuẩn cơ sở có thể được xây dựng theo những phương thức cơ bản sau:

- Dựa trên chấp nhận tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực hoặc tiêu chuẩn nước ngoài tương ứng thành tiêu chuẩn cơ sở [3],[5] Cụ thể, đối với xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu, có thể tham khảo Dược điển Việt Nam V, Dược điển nước ngoài như: Dược điển Anh, Mỹ, Ấn Độ…

- Sử dụng tiêu chuẩn cơ sở hiện hành, rồi sửa đổi và bổ sung thêm [3],[5]

- Sử dụng các kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, các kết quả thử nghiệm, đánh giá, phân tích và thực nghiệm rồi từ đó xây dựng tiêu chuẩn cơ sở riêng [3],[5] Đồng thời dựa trên cơ sở các quy định trong Dược điển Việt Nam và các văn bản pháp luật liên quan

1.3.3 Một số chỉ tiêu và phương pháp trong xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu nói chung

Theo hướng dẫn của Dược điển châu Âu và Dược điển Việt Nam V, đối với dược liệu, cần kiểm soát các chỉ tiêu sau:

Nguồn gốc thực vật, bộ phận dùng, trạng thái dược liệu (tươi, khô, dạng bột,…), nguồn gốc địa lý và các điều kiện nơi dược liệu được thu hái [45]

Bao gồm các mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu và đặc điểm thể chất dược liệu, sử dụng phương pháp cảm quan, vi học [4]

Phép thử định tính bao gồm các thử nghiệm vật lý và/hoặc hóa học, đảm bảo tính đặc hiệu nhất có thể Tính đặc hiệu của phép thử thể hiện qua phép thử đó cho kết quả dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt chất phân tích, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc tương tự chất phân tích [15] Các thử nghiệm không được quá nhạy cảm, tức là phải tránh các phản ứng nhiễu gây ra bởi các tạp chất dung nạp trong mẫu thử và chúng không đòi hỏi phải thử nghiệm nhiều hơn mức cần thiết để phân biệt chất được quan tâm với các chất tương tự [47]

Mục đích của các phép thử định tính là phân biệt thành công chất cần phân tích với chất tương tự nó có trong cùng mẫu thử Vì vậy, việc thẩm định lại các phép định tính thông qua thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp luôn được thực hiện Hiện nay, các phương pháp định tính thường được sử dụng phải kể đến như:

- Phương pháp vi học: là việc quan sát đặc điểm của các tế bào, các mô của lát cắt, của bột hay trong một vài trường hợp là của bề mặt dược liệu dưới kính hiển vi [4]

- Phương pháp lý học: xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực… của dược liệu [4]

- Phương pháp hóa học: xác định sự có mặt của các thành phần chính trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học như: phản ứng tạo màu hoặc kết tủa và xác định các chỉ số hóa học [4]

- Phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao … để phát hiện một số thành phần trong dược liệu, so sánh với chất chuẩn hoặc thành phần trong dược liệu chuẩn [4]

- Tính chọn lọc có thể được cải thiện bằng cách kết hợp sắc ký lớp mỏng với các phản ứng hóa học tại chỗ, tức là bằng cách phun thuốc thử thích hợp lên bản mỏng [47]

- Hiện tại, việc tách hoạt chất ra khỏi dịch chiết dược liệu trong phép thử định tính không còn bắt buộc, tuy nhiên, trong quá trình thẩm định lại phép thử định tính, phải chứng minh được sự phân tách của chất này khỏi các chất tương tự, tức là chứng minh được tính đặc hiệu của phép thử [47]

Phép thử định lượng nhằm xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi, thường sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao [4]

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do sự vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa hai pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột Tùy theo bản chất của pha tĩnh, bản chất chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất ra khỏi cột sắc ký Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta có một sắc ký đồ gồm nhiều pic Phương pháp định lượng bằng HPLC dựa trên nguyên tắc: nồng độ chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Phương pháp định lượng được thẩm định đầy đủ về độ chọn lọc (tính đặc hiệu của hệ thống), độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác gồm tính thích hợp hệ thống và độ lặp lại theo yêu cầu của AOAC [44]

Chuyên luận Ngành ngạnh (Đỏ ngọn) trong Dược điển Việt Nam V

NGÀNH NGẠNH (Lá) Folium Cratoxylum pruniflorum (Đỏ ngọn, Cỏ kín lang)

Lá phơi hay sấy khô của cây Ngành ngạnh (Cratoxylum pruniflorum Kurtz), họ Ban (Hypericaceae)

Lá hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu nhọn, dài 6 cm đến 11 cm, rộng 2,5 cm đến 3,5 cm, mặt trên có lông nhỏ, dày hơn ở mặt dưới; cuống lá ngắn

Gân lá: Mặt trên lõm, mặt dưới lồi Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào thành dày mang lông che chở đa bào Mô mềm gồm các tế bào hình đa giác, thành mỏng Libe-gỗ xếp thành hình cung sát mô mềm Bao quanh bó libe-gỗ là các bó sợi xếp thành hình vòng cung Nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai rải rác trong mô mềm

Phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào mang nhiều lông che chở đa bào Mô giậu gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp vuông góc với biểu bì

Bột màu nâu vàng, mùi thơm, vị hơi chua chát Soi kinh hiển vi thấy: Mảnh biểu bì gồm những tế bào hình chữ nhật mang lông che chở và nhiều lỗ khí kiểu song bào đứng riêng lẻ Rải rác có lông che chở đa bào Sợi dài, thành dày, tập trung thành từng bó Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình đa giác thành mỏng Các tinh thể calci oxalat hình cầu gai Mảnh mạch xoắn, mạch vạch

A Lấy khoảng 10 g bột dược liệu, đun hồi lưu trên cách thủy với 30 ml ether

(TT) khoảng 5 min, lọc, loại dịch chiết ether Bã dược liệu để bay hết ether ở nhiệt độ phòng, thêm 30 ml ethanol (TT), đun sôi trên cách thủy 10 min, lọc, dịch lọc dùng làm các phản ứng sau:

Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi (TT), 3 giọt acid hydrocloric (TT), đun nóng nhẹ, dung dịch chuyển từ vàng sang nâu đỏ

Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt dung dịch sắt (III) clorid 5 % (TT), xuất hiện màu xanh đen

Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 3 giọt dung dịch natri hydroxyd 10 % (TT), xuất hiện tủa màu vàng Thêm 1 ml nước tủa tan, màu vàng của dung dịch tăng lên

B Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)

Bản mỏng: Silica gel GF254

Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5 :4 :1 )

Dung dịch thử: Lấy khoảng 10 g bột dược liệu cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình

Soxhlet, chiết bằng 50 ml n-hexan (TT) đến khi dịch chiết không màu Loại bỏ dịch chiết n-hexan, lấy bã dược liệu để bay hơi hết dung môi, chiết tiếp bằng 50 ml methanol (TT) trong 1 h Lấy dịch chiết methanol, cất thu hồi dung môi đến cắn Hòa tan can vào 20 ml nước cất, đun nóng cách thủy cho tan hết, lọc qua giấy lọc Chiết dịch lọc bằng ethyl acetat (TT) 3 lần, mỗi lần 20 ml Gộp dịch chiết, cẩt thu hồi ethyl

13 acetat đến cắn Hòa tan cắn bằng 5 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT), lọc, acid hóa dịch lọc đến pH 3 bằng dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT), lọc thu tủa Để tủa khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan trong 10 ml methanol (TT)

Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 10 g bột nửa thô lá Ngành ngạnh (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử

Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch trờn Sau triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, hiện màu bằng hơi amoniac

(TT) Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng giá trị Rf và cùng màu sắc với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (6 vết màu vàng đến vàng nâu, trong đó các vết 2, 3 có màu vàng đậm nhất)

Không được quá 12,0 % (Phụ lục 9.6, 1 g, 105°C, 4 h)

Không được quá 5,0 % (Phụ lục 9.8)

Qua rây có kích thước mắt rây 4 mm: Không quá 3,0 % (Phụ lục 12.12)

1.4.9 Chất chiết được trong dược liệu

Không ít hơn 20,0 % tính theo dược liệu khô kiệt Tiến hành theo phương pháp chiết nóng (Phụ lục 12.10) Dùng ethanol 96 % (TT) làm dung môi

Lá thu hái quanh năm, ủ, rồi phơi hay sấy khô

1.4.11 Bảo quản Để nơi khô ráo, thoáng mát, tránh mốc

Vị đắng chát, tính mát

Thanh nhiệt, giải độc, lợi tiêu hóa Chủ trị: sốt, ra mô hôi trộm, chân tay mỏi; cảm sốt, viêm ruột, tiêu chảy, khan cổ, ho mất tiếng

Ngày dùng từ 15 g đến 30 g, dạng thuốc sắc Thường phối hợp với một số vị thuốc khác

Các phương pháp định lượng flavonoid trong Đỏ ngọn

1.5.1 Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến

Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến, sử dụng phản ứng tạo màu với dung dịch nhôm triclorua, định lượng đối chiếu theo quercetin

- Quercetin được sử dụng để tạo đường chuẩn 10 mg quercetin đã được hòa tan trong ethanol 80% và sau đú pha loóng thành 25, 50 và 100 àg/ml Hỳt 0,5 ml cỏc dung dịch chuẩn đã pha loãng, thêm 1,5 ml ethanol 95%; 0,1 ml Nhôm clorua 10%; 0,1 ml Kali axetat 1 M và 2,8 ml nước cất Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 415 nm với máy Shimadzu Máy quang phổ UV- 160A (Kyoto, Nhật Bản) [23]

- Mẫu trắng được làm tương tự như trên nhưng không có thuốc thử nhôm clorua 10% Mẫu thử làm tương tự, 0,5 ml dịch chiết ethanol phản ứng với nhôm clorua để xác định hàm lượng flavonoid như mô tả ở trên [23]

Lá, rễ và thân của C formosum ssp pruniflorum được chiết xuất tương ứng với MeOH 80% Tổng lượng phenolic và flavonoid của mỗi chiết xuất được định lượng tương ứng bằng cách sử dụng thuốc thử Folin–Ciocalteu và thuốc thử nhôm clorua [17]

Bảng 1.2 Hàm lượng phenolic và flavonoid tổng số trong lá, rễ và thân cây C formosum ssp pruniflorum [17]

Tổng hàm lượng Phenolic (mg GAE/g dịch chiết)

Tổng hàm lượng Flavonoid (mg CE/g dịch chiết)

1.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bảng 1.3 Điều kiện sắc ký phân tích dịch chiết Đỏ ngọn bằng phương pháp HPLC

STT Cột sắc ký Pha động Nhiệt độ cột

C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm). acid formic 0,1% và acetonitril

(Hichrom acid acetic pH 38°C 0,8 ml/phút

150 x 4,6 mm) methanol và acid phosphori -c 0,5%

Bước sóng 270 nm acid gallic, quercetin , acid ferulic, catechin

mỗi chuẩn pha trong methanol có nồng độ khoảng 1 àg/àl

250 mm) acetonitril và acid phosphori -c 0,4%

Bước sóng 327 nm acid chloroge -nic pha trong methanol

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Lá của cây Đỏ ngọn thu hái tại Ba Vì (ĐN1), Quảng Ninh (ĐN2), Tam Đảo (ĐN3), các mẫu lá được thu hái vào tháng 4 năm 2024, mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học là Cratoxylum formosum subsp pruniflorum

Tiêu bản được lưu trữ tại bộ môn Dược học Cổ truyền, khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội

Xử lý mẫu sau thu hái: cành mang lá tuốt lấy lá, đem sấy khô ở 55 o C

Xử lý mẫu trước khi chiết: dược liệu được làm nhỏ bằng máy xay, rây qua rây 500, đồng nhất mẫu, bảo quản trong túi PE, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng

Xác định độ ẩm bột dược liệu < 13% (thường là 10-12%)

2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất

Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích, gồm có:

- Thuốc thử, dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật:

• Dung dịch javen, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn, ethanol 96%

- Thuốc thử, dung môi, hóa chất dùng trong định tính sơ bộ các nhóm chất hóa học:

• Thuốc thử: alcaloid (mayer, dragendorff, bouchardat), diazo mới pha, FeCl3, gelatin 1%, chì acetat 10%, đồng acetat 10%

• Hóa chất: NaOH, HCl, ethanol, amoniac, H2SO4, anhydrid acetic…

Hóa chất và dung môi trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn HPLC, gồm có:

• Dung môi: acetonitril, methanol, acid phosphoric, nước tinh khiết

• Chất chuẩn: isoquercitrin độ tinh khiết 98,2% (Công ty Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd, Trung Quốc)

2.1.2.2 Dụng cụ và máy móc

- Cân kỹ thuật AND EK – 410 (Japan)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy sĩ)

- Bể siêu âm Elmasonic S 100H (Đức)

- Cân sấy ẩm Ohaus (Trung quốc)

- Máy li tâm HermLe Z207A (Đức)

- Kính hiển vi Labomed CxL (Mỹ)

- Máy tính và hệ thống HPLC Shimadzu, LC –10ADxr (Nhật bản)

- Máy xay Dược liệu DQF - 200 (Trung quốc)

- Tủ hốt hóa chất Fume hood (Việt Nam, Ati)

- Cột sắc ký lỏng Kromasil®

- Lò nung (tro toàn phần)

- Khác: tủ lạnh bảo quản mẫu, bông lọc, giấy lọc, bình nón, bình định mức (10, 25,

50, 100 ml), cốc có mỏ, pipet (1, 2, 5, 10 ml), bộ dụng cụ hồi lưu, bình sắc ký, mao quản, ống nghiệm, cồn kế, nhiệt kế, ống đong, ống ly tâm, pipet nhựa, kẹp gỗ

Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp để tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng IQE có trong dược liệu Đỏ ngọn

Xây dựng quy trình xử lý mẫu dược liệu Đỏ ngọn bằng cách khảo sát các yếu tố sau đây:

Bảng 2.1 Các yếu tố khảo sát quy trình xử lý mẫu

Yếu tố khảo sát Giá trị khảo sát các yếu tố Thông số đánh giá

Hàm lượng IQE có trong dược liệu Đỏ ngọn

Phương pháp chiết Siêu âm

Phương pháp định lượng được thẩm định về độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng, độ chụm, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo như AOAC [18]

2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng dược liệu Đỏ ngọn

Nghiên cứu xây dựng các chỉ tiêu chất lượng dược liệu Đỏ ngọn: cảm quan, vi học, định tính hóa học, tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrocloric, độ ẩm, định lượng

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.3.1.1 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC – 10Adxr để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn IQE cú nồng độ 20 àg/ml:

- Thiết bị: Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC – 10Adxr

- Cột pha đảo: Kromasil® 100 – 5 C18 Column 250 × 4.0 mm

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút a Quan sát phổ đồ, lựa chọn bước sóng phát hiện

Quét phổ của chất chuẩn IQE từ bước sóng 190 nm đến 600 nm của hệ thống HPLC (Shimadzu Nhật Bản) b Khảo sát hệ dung môi pha động

Pha động là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký, nó có thể ảnh hưởng tới độ chọn lọc, thời gian lưu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của pic sắc ký…

Tiến hành với các thành phần pha động khác nhau gồm: kênh D là Acid phosphoric, kênh B là dung môi ACN hay MeOH, thay đổi tỷ lệ các thành phần pha động, cố định các điều kiện phân tích khác c Khảo sát nhiệt độ cột

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến khả năng tách pic sắc ký Điều kiện sắc ký khác được cố định, nhiệt độ cột khảo sát: 25 o C (tương ứng nhiệt độ phòng) và 40 o C Các số liệu được tính toán và xử lý thống kê

Thông số đánh giá: thời gian lưu, độ cân đối của pic sắc ký, hệ số phân giải của pic IQE

Yêu cầu: pic sắc ký gọn, cân đối, pic IQE tách khỏi các pic xung quanh, hệ số phân giải Rs > 1,5

2.3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Đỏ ngọn a Khảo sát dung môi chiết

Dung môi thường được sử dụng để chiết xuất flavonoid là methanol [17] và ethanol [48] có thể là hỗn hợp dung môi với nước ở các tỷ lệ khác nhau Thực tế trong sản xuất công nghiệp, các quy trình chiết xuất ít sử dụng ethanol tuyệt đối làm dung môi chiết do

19 khi sử dụng cồn tuyệt đối, một số tạp chất bị tủa lại có thể dẫn đến hiện tượng mất hoạt chất do cơ chế bao gói Do đó nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành khảo sát chiết bằng ethanol ở các nồng độ 50%, 70%, 96% và methanol ở các nồng độ 50%, 70%, 100%

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào ống ly tâm 50 ml, chiết siêu âm bằng 20 ml methanol ở các nồng độ 50%, 70%, 100% và ethanol ở các nồng độ 50%, 70%, 96% trong 20 phút, chiết 2 lần b Khảo sát phương pháp chiết dược liệu

Có nhiều phương pháp có thể chiết xuất flavonoid từ dược liệu như chiết siêu âm, hồi lưu, ngâm [25], [33], [38], [48] Tuy nhiên với quy mô phòng thí nghiệm và điều kiện sẵn có, nhóm nghiên cứu lựa chọn khảo sát 2 phương pháp: hồi lưu và siêu âm

- Phương pháp siêu âm: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào ống ly tâm 50 ml, thêm 20 ml dung môi chiết vào siêu âm 20 phút, ly tâm dịch chiết 4000v/ph trong 7 phút, hút lấy dịch trong cho vào bình định mức 50 ml Lặp lại quy trình chiết 2 lần, định mức đến vạch BĐM 50 ml bằng dung mụi chiết Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm

- Phương pháp hồi lưu: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml dung môi chiết hồi lưu 20 phút, lọc nóng bằng bông vào bình định mức

50 ml Gộp bông và bã dược liệu vào bình nón, chiết theo quy trình trên lần 2, định mức đến vạch BĐM 50 ml bằng dung mụi chiết Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm c Khảo sát số lần chiết

Số lần chiết ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid chiết được trong dược liệu Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát số lần chiết là 1, 2, 3 lần

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, chiết hồi lưu bằng 20 ml ethanol 70% trong 20 phút, chiết lần lượt 1, 2, 3 lần d Khảo sát thời gian chiết

Thời gian chiết ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng dịch chiết Hoạt chất thường có khối lượng phân tử nhỏ hơn tạp chất, khuếch tán và đạt cân bằng chiết sớm hơn tạp chất, do đó nếu chiết trong thời gian dài, tỉ lệ hoạt chất không tăng mà tỉ lệ tạp sẽ tăng Nhóm nghiên cứu lựa chọn khảo sát khoảng thời gian là 10, 20, 30, 40 phút cho một lần chiết cho thí nghiệm khảo sát

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, chiết hồi lưu bằng 20 ml ethanol 70%, 2 lần trong 10, 20, 30, 40 phút

2.3.1.3 Cách tiến hành và đánh giá kết quả Định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp đường chuẩn. Xây dựng đường chuẩn: Nồng độ IQE trong khoảng từ 1,5625 μg/ml đến 50 μg/ml.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc IQE: Cân chính xác khoảng 12,50 mg IQE chuẩn vào bình định mức 50 ml, thêm ethanol hòa tan và định mức đến vạch, được dung dịch gốc nồng độ 250 μg/ml.

Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc tính theo công thức:

Trong đó: m: khối lượng chất chuẩn đã cân (μg); V: thể tích dung dịch chuẩn (ml);

P: độ tinh khiết của chất chuẩn (PIQE = 98,2%); h: hàm ẩm trong chất chuẩn (hIQE 0,4%).

Tiến hành tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn IQE đã chuẩn bị ở các nồng độ trong khoảng từ 1,5625 μg/ml đến 50 μg/ml, thu được các diện tích pic Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ IQE: y = ax + b với hệ số tương quan 0,995 ≤ R ≤ 1,000 Các mẫu thử được pha loãng ở các nồng độ thích hợp rồi tiến hành chạy sắc ký, thu được diện tích pic và thời gian lưu, tính theo các công thức sau:

Hàm lượng IQE (%) trong mẫu thử được tính theo công thức:

C(t): nồng độ của mẫu thử tính theo phương trình đường chuẩn (μg/ml) f: độ pha loãng

V: thể tích mẫu (ml) m(t): khối lượng lượng dược liệu (g) a: độ ẩm của dược liệu (%)

2.3.1.4 Thẩm định phương pháp phân tích a Độ đặc hiệu

- Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:

Mẫu trắng: Dung môi pha mẫu EtOH 96%

Mẫu chuẩn: Dung dịch chuẩn IQE

Mẫu thử: Dung dịch thử dược liệu đỏ ngọn

21 Mẫu thử thêm chuẩn: Dung dịch dược liệu đỏ ngọn thêm khoảng 20% chuẩn IQE

- Ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu, phổ UV của pic chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn

• Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của IQE trên sắc ký đồ

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC – 10Adxr để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn IQE cú nồng độ 20 àg/ml:

- Thiết bị: Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC – 10Adxr

- Cột pha đảo: Kromasil® 100 – 5 C18 Column 250 × 4.0 mm

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 1 mg chuẩn IQE pha vào BĐM 10 ml, pha loãng

5 lần bằng cách hút 2 ml pha tiếp vào BĐM 10 ml, pha và định mức bằng EtOH 96% Thu được chuẩn IQE nồng độ 20 μg/ml

- Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu Đỏ ngọn, chiết siêu âm với 20 ml MeOH 50% 2 lần trong 15 phút, đem ly tâm 5 phút với tốc độ 4000 v/ph Định mức tới vạch BĐM 50 ml bằng dung môi chiết, lọc dịch chiết bằng màng lọc 0,45 μg/ml

3.1.1.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ của chất chuẩn IQE từ bước sóng 190 nm đến 600 nm của hệ thống HPLC (Shimadzu Nhật Bản) cho kết quả như hình 3.1 Từ phổ đồ thu được, chuẩn IQE đạt cực đại hấp thụ tại 204 nm, 255 nm và 353 nm Nhóm nghiên cứu quyết định lựa chọn bước sóng đo là 255 nm

Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại của IQE

3.1.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động thể hiện dưới bảng 3.1 và sắc ký đồ ở phụ lục 3.1

Bảng 3.1 Khảo sát hệ pha động MeOH - H 3 PO 4

Nhận xét: Chạy chương trình gradient để xác định sơ bộ khoảng tỷ lệ dung môi mà chuẩn IQE ra pic Pic IQE của mẫu thử vẫn còn dính với các pic xung quanh

Nhận xét: Pic IQE ở mẫu thử tách hoàn toàn khỏi các pic xung quanh, nhưng thời gian lưu quá dài (54,93 phút) Nên nhóm nghiên cứu quyết định đổi từ MeOH sang ACN

Bảng 3.2 Khảo sát hệ pha động ACN - H 3 PO 4

Nhận xét: Pic IQE chưa tách khỏi các pic xung quanh

Nhận xét: Pic IQE chưa tách khỏi các pic xung quanh

Nhận xét: Pic IQE đã tách khỏi các pic xung quanh nên nhóm nghiên cứu lựa chọn hệ 5 (tR = 15,93 phút)

3.1.1.3 Khảo sát nhiệt độ cột

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến khả năng tách pic sắc ký Điều kiện sắc ký tiến hành như mục trên, nhiệt độ cột khảo sát: 25 o C (tương ứng nhiệt độ phòng) và 40 o C Đối tượng khảo sát:

- Dung dịch chuẩn IQE nồng độ 6,25 àg/ml

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,50 g bột dược liệu Đỏ ngọn vào ống ly tâm, thêm khoảng 20 ml MeOH 50%, siêu âm 15 phút, ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút, lặp lại 2 lần quy trình chiết như trên, định mức đến vạch BĐM 50ml bằng dung mụi chiết Lọc dịch chiết bằng lọc 0,45 àl Thu được kết quả như hỡnh 3.2 và sắc ký đồ ở phụ lục 3.2

Hình 3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ cột

Nhận xét: Ở điều kiện nhiệt độ cột 40 o C, chất IQE rửa giải nhanh hơn (16,55 phút) so với nhiệt độ cột 25 o C (19,79 phút), ngoài ra, áp suất cũng thấp hơn (121 bar) so với 25 o C (135 bar) Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ cột ở 40 o C

2 Mẫu chuẩn ở nhiệt độ cột 25 o C

3 Mẫu thử ở nhiệt độ cột 25 o C

4 Mẫu chuẩn ở nhiệt độ cột 40 o C

5 Mẫu thử ở nhiệt độ cột 40 o C

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu dược liệu Đỏ ngọn

3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng dung môi chiết

Qua biểu đồ trên và bảng (Phụ lục 4.1) thấy rằng, hàm lượng IQE chiết được thấp nhất khi chiết bằng MeOH 100%, còn khi chiết bằng EtOH 70% thu được hàm lượng IQE cao nhất (hàm lượng IQE trung bình là 0,094%) Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn Ethanol 70% cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo

3.1.2.2 Khảo sát phương pháp chiết

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng phương pháp chiết

Từ kết quả nghiên cứu (đồ thị trên và phụ lục 4.2) cho thấy hàm lượng chiết IQE khi chiết bằng phương pháp hồi lưu tốt hơn (hàm lượng IQE trung bình là 0,106%) Do vậy,

29 nhóm thí nghiệm lựa chọn phương pháp chiết là hồi lưu cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo

3.1.2.3 Khảo sát số lần chiết

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng số lần chiết

Trên biểu đồ và bảng (Phụ lục 4.3) cho thấy, số lần chiết có hàm lượng IQE nhiều nhất và hợp lý nhất là khi chiết 2 lần Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn số lần chiết là

2 lần cho thí nghiệm khảo sát tiếp theo

3.1.2.4 Khảo sát thời gian chiết

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng thời gian chiết

Biểu đồ biểu diễn hàm lượng IQE chiết được chênh lệch nhiều trong khoảng thời gian chiết từ 10 phút đến 20 phút, còn sau đó hàm lượng IQE ổn định ở khoảng 0,106% (Phụ lục 4.4) Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn thời gian chiết là 20 phút

Qua khảo sát quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký, nhóm nghiên cứu đưa ra quy trình định lượng isoquercitrin có trong dược liệu Đỏ ngọn như sau:

3.1.3.1 Chuẩn bị dung dịch thử

Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml EtOH 70% chiết hồi lưu 20 phút, lọc nóng dịch chiết bằng bông vào bình định mức 50 ml Gộp bông và bã dược liệu cho vào bình nón, lặp lại quy trình chiết như trên, định mức đến vạch bằng dung mụi chiết Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm

- Cột sắc ký: cột Krosmasil C18 (250 x 4,0 mm, 5 àm)

- Detector PDA bước sóng 255nm

Thời gian (phút) ACN (%) Dung dịch đệm H3PO4

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

Hàm lượng isoquercitrin trong mẫu dược liệu được tính toán như sau:

X: hàm lượng IQE trong mẫu thử (% g/g)

C(t): nồng độ của mẫu thử tính theo phương trình đường chuẩn (μg/ml) f: độ pha loãng

V: thể tích mẫu thử (ml)

M(t): khối lượng lượng dược liệu (g) a: độ ẩm của dược liệu (%)

Phần mềm Microsoft Excel, SPSS 26

3.1.4 Thẩm định phương pháp phân tích

Tiến hành tiêm mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn, ghi lại sắc ký đồ Kết quả thu được như các hình dưới đây:

Hình 3.7 Kết quả độ đặc hiệu

Lấy phổ của IQE tại thời gian lưu tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử, tiến hành so phổ Kết quả thu được như hình sau:

Hình 3.8 So phổ IQE của mẫu thử với mẫu chuẩn

Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Đỏ ngọn

3.2.1 Mô tả, vi phẫu và bột

Hình 3.10 Dược liệu Đỏ ngọn

Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu nhọn, dài 7 cm đến 12 cm, rộng

3 cm đến 4 cm Mặt trên có lông nhỏ, dày hơn ở mặt dưới, lá non màu hồng đỏ, có lông tơ, cuống ngắn

Gân lá: Mặt trên lõm, mặt dưới lồi Biểu bì dưới (2) và biểu bì trên (12) cấu tạo bởi những tế bào tron, kích thước nhỏ xếp đều đặn, sít nhau, mang lông che chở đa bào (1), (13) Mô dày (3), (11) gồm 3-4 lớp tế bào xếp sát biểu bì dưới, 5-7 lớp tế bào xếp sát

36 biểu bì trên, tế bào hình tron, thành dày, kích thước không đều nhau Mô mềm (5), (10) gồm các tế bào thành mỏng, xếp lộn xộn Nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai (4) và hình khối (6) nằm rải rác trong mô mềm Bó libe gỗ xếp thành hình cung sát mô mềm Bao quanh bó libe gỗ là các bó sợi xếp thành hình vòng cung, cấu tạo bởi các tế bào có kích thước nhỏ, thành dày (7) Libe (8) bắt màu hồng, xếp liên tục, bao quanh gỗ Gỗ (9) bắt màu xanh, cấu tạo bởi các mạch gỗ xếp nối tiếp nhau thành từng dãy thẳng hàng, các dãy cách nhau bởi 1-2 hàng tế bào mô mềm gỗ

Phiến lá: Biểu bì dưới (b) và biểu bì trên (e) được cấu tạo bởi một dãy các tế bào tròn nhỏ, mang lông che chở đa bào (a) Phiến lá gồm có bó libe gỗ phụ xếp cách nhau (c)

Mô giậu (d) nằm dưới lớp biểu bì trên, gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp vuông góc với biểu bì

Hình 3.11 Vi phẫu lá Đỏ ngọn

1 Lông che chở đa bào; 2 Biểu bì dưới; 3 Mô dày dưới; 4 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 5 Mô mềm dưới; 6 Tinh thể calci oxalat hình khối; 7 Sợi mô cứng; 8 Libe;

9 Gỗ; 10 Mô mềm trên; 11 Mô dày trên; 12: Biểu bì trên; 13 Lông che chở đa bào; a Lông che chở đa bào; b Biểu bì dưới; c Bó libe gỗ phụ; d Mô giậu; e Biểu bì trên. 3.2.1.3 Bột

Bột dược liệu màu xanh rêu nhạt, mùi hơi hắc, vị ngọt Soi kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì mang lỗ khí (1) Tế bào lỗ tập trung thành từng đám (2) hoặc đứng riêng lẻ (3) Rải rác có lông che chở đơn bào (4) Sợi dài, thành dày, tập trung thành bó (5) Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình đa giác, thành mỏng (6) Mảnh mạch gồm mảnh mạch vạch (7), mảnh mạch xoắn (8), mảnh mạch điểm (9) Các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (10), tinh thể calci oxalat hình khối nằm rải rác (11) (Hình 3.12).

Hình 3.12 Một số đặc điểm bột lá Đỏ ngọn

1 Mảnh biểu bì mang lỗ khí; 2 Lỗ khí tập trung thành đám; 3 Lỗ khí đứng riêng lẻ;

4 Lông che chở đơn bào; 5 Bó sợi; 6 Mảnh mô mềm; 7 Mảnh mạch vạch; 8 Mảnh mạch xoắn; 9 Mạch mạch điểm; 10 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 11 Tinh thể calci oxalat hình khối.

3.2.2 Định tính bằng phản ứng hóa học

Dưới bảng 3.8 là kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất, ở phụ lục 6.1 là kết quả định tính bằng phản ứng hóa học chi tiết đối với từng nhóm chất

Bảng 3.8 Kết quả định tính dược liệu bằng phản ứng hóa học

Nhóm chất Kết quả Kết luận

6 Acid hữu cơ - Không có

(++): Phản ứng dương tính rõ.

(+++): Phản ứng dương tính rất rõ.

3.2.3 Mất khối lượng do làm khô

Thực hiện 3 lần với mỗi mẫu Đỏ ngọn và lấy kết quả trung bình Kết quả mất khối lượng do làm khô của dược liệu được thể hiện ở bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả độ ẩm của dược liệu

STT Tên mẫu Nơi thu hái Khối lượng cân dược liệu (g)

Khối lượng dược liệu sau khi sấy (g)

Nhận xét: Độ ẩm của dược liệu Đỏ ngọn trung bình là 6,64 ± 0,57 ở điều kiện bảo quản thông thường, đạt yêu cầu của chuyên luận riêng trong Dược điển (≤ 12%) Ở độ ẩm này dược liệu sẽ tránh bị mốc, hỏng, gây ảnh hưởng đến chất lượng dược liệu hoặc các hoạt chất có trong dược liệu Đề xuất chỉ tiêu: Giới hạn về độ ẩm không vượt quá 12%

3.2.4 Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrocloric

Bảng 3.10 Kết quả xác định độ tro của dược liệu

Khối lượng dược liệu cân (g)

Hàm lượng tro toàn phần (%)

Hàm lượng tro không tan trong acid HCl (%) ĐN1

Hàm lượng tro toàn phần của dược liệu Đỏ ngọn đạt yêu cầu theo chuyên luận riêng trong Dược điển (≤ 5%) Đề xuất chỉ tiêu: Giới hạn định lượng tro toàn phần không quá 5% và tro không tan trong acid không quá 3%

Dựa vào quy trình định lượng IQE đã xây dựng ở mục 3.1.3, tiến hành định lượng 3 mẫu Đỏ ngọn thu được kết quả dưới đây:

Bảng 3.11 Kết quả phân tích định lượng các mẫu Đỏ ngọn

Hàm lượng IQE trung bình g/g (%)

Trong 3 mẫu Đỏ ngọn được thu hái tại 3 địa điểm khác nhau, mẫu ĐN2 có hàm lượng IQE thấp nhất (0,095%) và mẫu ĐN1 có hàm lượng IQE cao nhất (0,102%) Từ kết quả định lượng trên, nhóm nghiên cứu đề xuất giới hạn hàm lượng IQE trong dược liệu Đỏ ngọn không được ít hơn 0,080% tính theo dược liệu khô kiệt

BÀN LUẬN

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng IQE trong Đỏ ngọn

Nhóm nghiên cứu lựa chọn khảo sát những điều kiện sắc ký: bước sóng phát hiện, hệ dung môi pha động, nhiệt độ cột

Thứ nhất, về bước sóng phát hiện, IQE đạt cực đại hấp thụ tại 204, 255, 353 nm Kết quả thu được có sự chênh lệch so với một số TLTK, do sự khác nhau giữa các phòng thực nghiệm về dung môi và thiết bị phân tích [34], [38] Tại bước sóng 255nm, chiều cao pic IQE ở mẫu thử cao hơn so với ở bước sóng 204 nm và 353nm Với diện tích pic IQE của dịch chiết dược liệu Đỏ ngọn bé nên chiều cao pic cao hơn sẽ dễ quan sát hơn Hơn nữa, ở bước sóng 255 nm, pic IQE gọn và cân đối hơn so với ở bước sóng 204 nm và 353 nm Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn bước sóng 255 nm Đối với hệ dung môi pha động, nhóm nghiên cứu khảo sát 5 hệ trình bày ở mục

3.1.1.2 Khảo sát hệ 2: MeOH và dung dịch đệm H3PO4 0,1% với tỷ lệ 25:75, pic IQE ở mẫu thử tách hoàn hoàn khỏi các pic xung quanh (Rs > 1,5) với thời gian lưu là 54,93 phút Thời gian lưu dài dẫn đến tốn dung môi và thời gian Đã có nhiều nghiên cứu định lượng IQE trong dược liệu sử dụng các chương trình rửa giải như: ACN – H2O [38], ACN – Acid acetic [24], ACN – Acid formic [46] hoặc ACN – Acid phosphoric [40],[48] Việc sử dụng Acetonitril thay vì Methanol đã cải thiện độ phân giải, tạo ra các pic sắc nét và đối xứng, với mức nền tốt và độ bám đuôi tối thiểu, do đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc đo chính xác tỷ lệ diện tích pic Mà các hợp chất flavonoid nói chung sẽ tách tốt hơn trong môi trường pH acid Vì vậy, với điều kiện nghiên cứu sẵn có, nhóm nghiên cứu khảo sát hệ 3, 4, 5: ACN và dung dịch đệm H3PO4 0,1% ở các tỷ lệ khác nhau Ở hệ 3 và 4, pic IQE vẫn còn dính vào pic phía trước nên nhóm nghiên cứu tiếp tục khảo sát hệ 5 Khi này, pic IQE ở mẫu thử đã tách hoàn toàn ra khỏi pic xung quanh, thời gian lưu hợp lý (15,93 phút), chân pic gọn hơn Hệ 5 bao gồm quá trình rửa giải đẳng dòng với 15% ACN cho đến khi pic IQE được tách ra (0-25 phút), đẳng dòng với 95% ACN để rửa cột (28-38 phút) rồi cho chạy ổn định trở lại tỷ lệ phân tích 15% ACN trong 15 phút Chương trình gradient cứ lặp lại như thế với các mẫu tiếp theo sẽ đảm bảo không ảnh hưởng pic IQE của các mẫu tiếp theo

Nhóm nghiên cứu khảo sát nhiệt độ cột ở nhiệt độ phòng (25 o C) và nhiệt độ 40 o C Trên sắc kí đồ mẫu chuẩn và mẫu thử, pic IQE đều tách ra khỏi nền phân tích ở cả 2 điều kiện nhiệt độ cột 25 o C và 40 o C Tuy nhiên, ở điều kiện nhiệt độ cột 40 o C, chất IQE rửa giải nhanh hơn (16,55 phút) so với nhiệt độ cột 25 o C (19,79 phút), ngoài ra thì áp suất cũng thấp hơn (121 bar) so với 25 o C (135 bar)

4.1.2 Quy trình xử lý mẫu

Isoquercitrin là một trong những flavonoid đã được phân lập từ Đỏ ngọn có tác dụng sinh học quan trọng Mặc dù tại Việt Nam đã có những nghiên cứu về thực phẩm chức năng có chiết xuất từ dược liệu Đỏ ngọn, nhưng nghiên cứu về quy trình chiết dược liệu để có hàm lượng IQE tốt nhất còn hạn chế Nhóm nghiên cứu chọn 4 yếu tố có ảnh hưởng tới hàm lượng IQE có trong dược liệu Đỏ ngọn là dung môi chiết, phương pháp chiết, số lần chiết và thời gian chiết Đầu tiên, nhóm nghiên cứu khảo sát yếu tố dung môi chiết với EtOH và MeOH ở các nồng độ Khi càng tăng nồng độ cồn thì hàm lượng IQE càng cao vì IQE tan tốt trong cồn cao độ Ở cồn nồng độ thấp, hoạt chất chưa được chiết ra hết dịch chiết nên hàm lượng IQE chiết được lại chưa nhiều Nhưng khi chiết bằng cồn quá cao độ thì lượng tạp chất được hòa tan theo cũng càng nhiều Có thể giải thích là do mức độ phân cực của dung môi phụ thuộc vào hằng số điện môi, giá trị liên kết hydro, trong đó nước có hằng số điện môi, giá trị liên kết hydro cao hơn EtOH/MeOH Do đó, khi trộn lẫn EtOH/MeOH và nước sẽ cho các hỗn hợp EtOH/MeOH nước có mức độ phân cực khác nhau, nồng độ dung môi có độ phân cực tương đương với hợp chất được trích ly sẽ hòa tan chất đó tốt hơn Do vậy, chiết bằng dung môi EtOH 70% là hợp lý nhất, cho hàm lượng IQE tốt nhất

Với điều kiện phòng thí nghiệm, cả 2 phương pháp siêu âm và hồi lưu đều phù hợp, nên nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp dựa theo hàm lượng IQE Phương pháp hồi lưu chiết tại nhiệt độ sôi của dung môi (70-80 o C) và siêu âm chiết ở khoảng 50-55 o C mà khi tăng nhiệt độ, khả năng khuếch tán của các chất trong tế bào ra môi trường chiết tốt hơn Dịch chiết thu được bằng phương pháp hồi lưu cho hàm lượng IQE cao hơn Nên nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp hồi lưu

Nhóm nghiên cứu khảo sát số lần chiết ở 3 mức, thấy sự tăng rõ ràng khi chiết 1 lần và chiết 2 lần (tăng từ 0,101% lên 0,106%) Số lần chiết ít không chiết được tối đa hoạt chất IQE có trong dược liệu Nhưng đến khi chiết 3 lần, hàm lượng IQE thu được ngang với khi chiết 2 lần, tức là khi tăng số lần chiết lên, có thể chỉ chiết thêm tạp chất Mà chiết 3 lần tốn dung môi và tốn thời gian vì cần phải cô bớt dung môi bằng máy cô quay chân không sau khi chiết để định mức vào BĐM 50 ml Vì thế, nhóm nghiên cứu lựa chọn chiết 2 lần

Khi khảo sát thời gian chiết, hàm lượng IQE chiết được tăng mạnh từ 10 phút đến 20 phút, còn sau đó hàm lượng ổn định ở khoảng 0,106% Giai đoạn đầu, thời gian mỗi lần chiết ngắn, nên khả năng tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi ngắn, chỉ có những hợp chất hữu cơ có kích thước nhỏ hòa tan vào dung môi Khi tăng thời gian chiết thì thời

42 gian tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi cũng tăng lên, lúc này các hợp chất có khối lượng phân tử lớn dưới ảnh hưởng của độ phân cực của dung môi sẽ được trích ly ra khỏi dược liệu, do đó hàm lượng IQE thu được cũng tăng lên Sau đó, hàm lượng IQE hầu như không tăng lên mà có xu hướng đi ngang Nguyên nhân có thể là do tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu đã bão hòa, không có sự chênh lệch nồng độ nên không có sự thay đổi Mặt khác, nguyên liệu được ngâm trong dung môi một thời gian dài sẽ trương nở làm bít lỗ thông của màng tế bào, cản trở khả năng thẩm thấu của dung môi vào nguyên liệu nên hàm lượng IQE không tăng lên nữa sau 2 lần chiết, mỗi lần 20 phút

Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp đáp ứng yêu cầu của AOAC Giới hạn định lượng 1,25 μg/ml nên có thể định lượng các mẫu có hàm lượng thấp Do vậy, có thể áp dụng đối với phân tích mẫu thực

Bên cạnh các điều kiện sắc ký, hệ thống máy HPLC và cột chạy sắc ký cũng có ảnh hưởng tới kết quả mẫu theo thời gian Thời gian lưu tại thời điểm khảo sát các hệ dung môi pha động và khảo sát quy trình xử lý mẫu có chênh lệch so với thời gian lưu tại thời điểm thẩm định phương pháp phân tích Nhóm nghiên cứu luôn chạy đồng thời mẫu chuẩn hoặc đường chuẩn IQE cùng mẫu thử và thực hiện kết hợp với chồng phổ UV mẫu chuẩn và mẫu thử Như vậy sẽ đảm bảo tính chính xác cho kết quả thu được.

Các chỉ tiêu chất lượng đã xây dựng được trên dược liệu Đỏ ngọn

4.2.1 Mô tả, vi phẫu và bột

Kết quả về mô tả, vi phẫu, bột tương tự với những tài liệu có cùng nội dung nghiên cứu [4],[14]

4.2.2 Định tính bằng phản ứng hóa học

Ngoài những phản ứng định tính theo yêu cầu trong DĐVN V [4], nhóm nghiên cứu có định tính thêm các nhóm chất ngoài flavonoid như trình bày ở bảng 3.8 và phụ lục

6 Kết quả thu được trùng khớp với kết quả của tài liệu có cùng nội dung nghiên cứu

4.2.3 Độ ẩm và định lượng tro

Nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng chỉ tiêu độ ẩm, tro toàn phần theo hướng dẫn của chuyên luận riêng trong DĐVN V [4], ngoài ra nhóm nghiên cứu có xây dựng thêm phần định lượng tro không tan trong acid

Các nghiên cứu liên quan đến định lượng dược liệu Đỏ ngọn theo flavonoid còn hạn chế Theo nhiều tài liệu thì IQE là một trong những flavonoid đã được phân lập từ Đỏ ngọn [17],[31],[38],[41] Isoquercitrin là một flavonoid có khung flavonol, phổ biến trong nhiều dược liệu và cũng có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý Nghiên cứu này sử dụng phương pháp HPLC để định lượng IQE có trong dược liệu Đỏ ngọn Kết quả cho thấy hàm lượng IQE có trong dược liệu Đỏ ngọn dao động trong khoảng từ 0,095% g/g đến 0,102% g/g, không có sự khác biệt rõ rệt về hàm lượng IQE giữa các mẫu tại các địa điểm thu hái khác nhau Cả 3 mẫu Đỏ ngọn đều được thu hái tại thời điểm giống nhau, có cùng điều kiện xử lý và bảo quản mẫu, thời gian lưu không quá lâu

Từ kết quả định lượng trên, nhóm nghiên cứu đề xuất giới hạn hàm lượng IQE trong dược liệu Đỏ ngọn không được ít hơn 0,080% tính theo dược liệu khô kiệt Đề tài đã hoàn thành xây dựng một số chỉ tiêu: mô tả, vi phẫu, bột, định tính bằng phản ứng hóa học, mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrocloric và định lượng Trong đó, những chỉ tiêu: mô tả, vi phẫu, bột, định tính bằng phản ứng hóa học, mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần có phương pháp và kết quả thu được tương tự như trong DĐVN V Ngoài ra, nhóm nghiên cứu có đề xuất xây dựng bổ sung một số chỉ tiêu khác như: tro không tan trong acid hydrocloric và định lượng