lê quỳnh hương góp phần xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng dược liệu đỏ ngọn

Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.. Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiê

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ QUỲNH HƯƠNG

GÓP PHẦN XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU

ĐỎ NGỌNKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ QUỲNH HƯƠNGMã sinh viên: 1901274

GÓP PHẦN XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU

ĐỎ NGỌN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Chử Thị Thanh Huyền 2 HVCH Nguyễn Thanh Hiền

Nơi thực hiện:

Bộ môn Dược học cổ truyền, Khoa Dược liệu – Dược cổ truyền

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện nghiên cứu và hoàn thành tại Bộ môn Dược học cổ truyền, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội Khóa luận có thể hoàn thành như này, lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Chử Thị Thanh Huyền, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tỉ mỉ,

cặn kẽ, truyền đạt kiến thức và luôn tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giảng viên, các thầy cô kỹ thuật viên của Bộ môn Dược học cổ truyền đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Bộ môn

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến chị HVCH Nguyễn Thanh Hiền và các bạn

sinh viên nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược học cổ truyền, đặc biệt là 2 bạn sinh

viên K75 Lê Thị Thu Hà, Lê Thị Ngọc Hà đã giúp đỡ em trong quá trình làm thực

nghiệm Sự hỗ trợ nhiệt tình của các bạn là đóng góp to lớn giúp em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giảng viên, các thầy cô kỹ thuật viên của Bộ môn Dược học cổ truyền đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Bộ môn

Cuối cùng, em xin bày tỏ lời cảm ơn và sự yêu thương tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên, quan tâm và là chỗ dựa tinh thần cho em những lúc khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Mặc dù em đã cố gắng hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất nhưng không tránh khỏi có những sai sót trong quá trình thực hiện Kính mong các thầy cô chỉ bảo, góp ý để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 29 tháng 5 năm 2024

Sinh viên

Lê Quỳnh Hương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠNMỤC LỤCDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Cratoxylum 2

1.1.1 Vị trí phân loại chi Cratoxylum 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Cratoxylum 2

1.1.3 Tình hình nghiên cứu hóa thực vật của chi Cratoxylum 2

1.2 Tổng quan về loài Cratoxylum formosum (Jack) Benth & Hook.f ex Dyer 3

1.3.2 Phương thức xây dựng tiêu chuẩn cơ sở 8

1.3.3 Một số chỉ tiêu và phương pháp trong xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu nói chung 9

1.4 Chuyên luận Ngành ngạnh (Đỏ ngọn) trong Dược điển Việt Nam V 11

1.5 Các phương pháp định lượng flavonoid trong Đỏ ngọn 14

1.5.1 Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến 14

1.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 16

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 16

2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 17

2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng dược liệu Đỏ ngọn 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 18

2.3.2 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Đỏ ngọn 23

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 25

3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp 25

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu dược liệu Đỏ ngọn 28

3.1.3 Quy trình phân tích 30

3.1.4 Thẩm định phương pháp phân tích 31

3.2 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Đỏ ngọn 35

3.2.1 Mô tả, vi phẫu và bột 35

3.2.2 Định tính bằng phản ứng hóa học 37

3.2.3 Mất khối lượng do làm khô 38

3.2.4 Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrocloric 38

3.2.5 Phân tích định lượng 39

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 40

4.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng IQE trong Đỏ ngọn 40

4.2 Các chỉ tiêu chất lượng đã xây dựng được trên dược liệu Đỏ ngọn 42

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44

5.1 KẾT LUẬN 44

5.2 ĐỀ XUẤT 45TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu hóa thực vật của loài 3

Bảng 1.2 Hàm lượng phenolic và flavonoid tổng số trong lá, rễ và thân cây C formosum ssp pruniflorum [19] 14

Bảng 1.3 Điều kiện sắc ký phân tích dịch chiết Đỏ ngọn bằng phương pháp HPLC 14

Bảng 2.1 Các yếu tố khảo sát quy trình xử lý mẫu 17

Bảng 3.1 Khảo sát hệ pha động MeOH - H3PO4 26

Bảng 3.2 Khảo sát hệ pha động ACN - H3PO4 26

Bảng 3.3 Kết quả khoảng tuyến tính của IQE 32

Bảng 3.4 Kết quả tính thích hợp của hệ thống 33

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ chụm của phương pháp 33

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng 34

Bảng 3.7 Kết quả S/N của mẫu chuẩn 35

Bảng 3.8 Kết quả định tính dược liệu bằng phản ứng hóa học 37

Bảng 3.9 Kết quả độ ẩm của dược liệu 38

Bảng 3.10 Kết quả xác định độ tro của dược liệu 38

Bảng 3.11 Kết quả phân tích định lượng các mẫu Đỏ ngọn 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại của IQE 25

Hình 3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ cột 27

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng dung môi chiết 28

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng phương pháp chiết 28

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng số lần chiết 29

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng thời gian chiết 29

Hình 3.7 Kết quả độ đặc hiệu 31

Hình 3.8 So phổ IQE của mẫu thử với mẫu chuẩn 31

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc nồng độ (μg/ml) và diện tích pic (mAU.s) của IQE 32

Hình 3.10 Dược liệu Đỏ ngọn 35

Hình 3.11 Vi phẫu lá Đỏ ngọn 36

Hình 3.12 Một số đặc điểm bột lá Đỏ ngọn 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Đỏ ngọn hay còn gọi là cây Thành ngạnh (Cratoxylum formosum (Jack) Benth

& Hook.f ex Dyer), loại cây có nhiều ứng dụng và có các thành phần hóa học có lợi cho sức khỏe Tại một số nước thuộc Đông Nam Á như Thái Lan, Hàn Quốc, lá của cây Đỏ ngọn được sử dụng để làm trà thảo dược và được cho là có tác dụng giải nguy cơ chữa các bệnh tim mạch [20],[32] Trong y học cổ truyền, thuốc sắc lá Đỏ ngọn có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, bổ và trị ngộ độc thực phẩm [37] Hiện nay tại Việt Nam, đỏ ngọn được điều chế dưới dạng bột cao khô bằng phương pháp phun sấy, làm trà thực phẩm chức năng

Các nghiên cứu hóa học thực vật đã chỉ ra rằng Đỏ ngọn chứa xanthon và các phenolic là các chất hoạt động có khả năng chống oxy hóa, chống vi khuẩn và chống nấm Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về nhóm chất xanthon trong cây đỏ ngọn, nhưng về flavonoid thì vẫn còn hạn chế Trong khi đó, flavonoid là một nhóm hợp chất hóa học tự nhiên được biết đến với khả năng chống viêm, tác dụng lên hệ thần kinh, đặc biệt là chống oxy hóa và phá hủy tế bào ung thư Do đó, công việc nghiên cứu thêm về flavonoid trong dược liệu Đỏ ngọn có thể mang lại những thông tin quan trọng về một số tác dụng sinh học của cây này [7], [17], [38]

Trong chuyên luận Đỏ ngọn (Ngành ngạnh) của Dược điển Việt Nam V có một số chỉ tiêu nhưng chưa có các chỉ tiêu như: định lượng, tro không tan trong acid, giới hạn các tạp chất, Các tài liệu về quy định tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu Đỏ ngọn còn hạn chế và chưa đầy đủ Vì vậy, việc khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của dược liệu có ý nghĩa quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng, làm tiền đề để xây dựng tiêu chuẩn của dược liệu Đỏ ngọn và các chế phẩm

Từ những lý do trên, đề tài “Góp phần xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng dược

liệu Đỏ ngọn” được thực hiện với 2 mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng flavonoid trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

2 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho dược liệu Đỏ ngọn

Chi: Cratoxylum [43] Theo tài liệu Thực vật Chí Trung Quốc: chi Cratoxylum được xếp vào họ Măng cụt

(Clusiaceae) [49]

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Cratoxylum

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật của chi Cratoxylum

Cây gỗ hay cây bụi Lá nguyên, có cuống hoặc gần như không cuống Cụm hoa ở nách lá hay ở ngọn thành chùy Lá đài 5, dai, và tồn tại trên quả nang Cánh hoa 5, màu trắng, hồng hoặc đỏ kèm theo vẩy gốc hay không, ở bên trong, và dính với cánh Tuyến 3-5, áp trên lưng của các lá noãn, nạc Nhị nhiều, thành 3-5 bó có cuống, cuống hình dải, dài bằng hoặc ngắn hơn chỉ nhị rời, chỉ nhị xếp trên một hoặc nhiều dãy, bao phấn nhỏ, hướng ngoài Bầu có 3 ô, với 3 vòi nhụy rời, dạng sợi Quả nang có 3 van mang theo vách, hạt 4 hoặc nhiều trong mỗi ô, đính trên những giá noãn, mọc đứng, có cánh [8]

1.1.2.2 Phân bố của chi Cratoxylum

Chi Cratoxylum được biết là có nguồn gốc từ Đông Nam Á, với sáu loài được chấp nhận: C arborescens, C cochinchinense, C.formosum, C glaucum, C maingayi và

C.sumatranum Chúng được phổ biến rộng rãi ở khu vực Đông Nam Á, bao gồm các

nước như Malaysia, Singapore, Indonesia, Việt Nam và Thái Lan Chúng cũng được tìm thấy ở các nước châu Á như Ấn Độ và Trung Quốc [19]

Ở Việt Nam: Chi Cratoxylum có 5 loài phân bố khắp nước ta từ Bắc vào Nam, nhưng

phân bố chủ yếu ở các tỉnh Trung Bộ và Tây Nguyên [13]

1.1.3 Tình hình nghiên cứu hóa thực vật của chi Cratoxylum

Các nghiên cứu đã chỉ ra một số hợp chất được phân lập từ chi Cratoxylum có khung

xanthone (α-mangostin, formoxanthon A, ), khung flavonoid, khung anthraquinon,

khung terpen [20],[21], [27],[29]

1.2 Tổng quan về loài Cratoxylum formosum (Jack) Benth & Hook.f ex Dyer

1.2.1 Đặc điểm thực vật, phân bố Mô tả:

Loài Cratoxylum formosum chia thành hai dưới loài gồm Cratoxylum formosum subsp pruniflorum (Kurz) Gogelein) và Cratoxylum formosum subsp formosum

[49],[50] Tại Việt Nam, loài được gọi với các tên như : Đỏ ngọn, Thành ngạnh, Lành ngạnh, Vàng la, Cúc lương, Hoàng ngưu trà, Voòng a mộc, Mạy tiên (Tày), Co kín lang (Thái) [4]

Cây Đỏ ngọn là loại cây nhỏ, phần gốc có gai (trong rừng lâu năm cây có thể cao và to), cành non có lông tơ, màu đỏ nên gọi là đỏ ngọn Lá hình mác dài 12–13 cm, rộng 3,5–4 cm, mọc đối xứng, cuống ngắn 3–5 mm, gốc tròn, đỉnh tù hoặc nhọn Mặt gân chính màu đỏ đến 1/3 lá non, gân lá và lá có màu đỏ đến quá nửa Hoa mọc trên những cành ở kẽ lá màu trắng hoặc hồng có lông màu tía Quả nang dài 15 mm, rộng 7–8 mm Hạt hình trứng dài 6 mm, rộng 3 mm [16], [49]

Phân bố: Tại Việt Nam, cây mọc hoang tại các tỉnh miền Bắc, nhất là mọc trên các

đồi trọc của vùng trung du Ngoài ra, loài có ở Malaysia, Indonesia, Lào, Thái Lan, Campuchia, [16], [49]

1.2.2 Nghiên cứu hóa thực vật

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu hóa thực vật của loài

1 Nhóm Flavonoid

- Flavan: catechin-3-O-(3,4- dihydroxybenzoyl) (1)

- Flavonol và flavonol glycosid: quercetin (2), quercitrin (3),

hyperin (quercetin-3-O-β-galactopyranoside) (4) , afzelin

(kaempferol-3-O-rhamnoside) (5), isoquercetin

(quercetin-3-O-β-glucopyranoside) (6)

[17], [31], [38], [41],

Kaempferol α-L-arabinopyranoside (7), Kaempferol

3-O-α-L-rhamnopyranoside (8), Quercetin

3-O-α-L-arabinofuranoside (9)

7 R = α-L-arabinoryranoside 8 R = α-L-rhamnopyranoside

9 R = α-L-arabinofuranoside Epicatechin (10), isorhamnetin-3-O-glucoside (11), quercetin-3-O-α-L-arabinoside (gujaverin) (12), quercetin-3-O-α-L-

rhamnoside (13)

10 Epicatechin

11 R1 = CH3, R2 = glucose

2 Nhóm Xanthon

Các prunifloron được đánh số từ 1 đến 10 Công thức của

Formoxanthone A

[20], [27]

1.2.3 Bộ phận dùng và tác dụng dược lý

1.2.3.1 Bộ phận dùng

Lá, vỏ thân, rễ, hoa, thân, quả, cành đều có thể sử dụng Đỏ ngọn được thu hái quanh năm, dùng tươi hay ủ rồi phơi khô Tại Việt Nam, bộ phận được nghiên cứu và sử dụng

Choi cùng các cộng sự (2014), nghiên cứu in vitro dịch chiết Đỏ ngọn trên các

flavonoid đã được phân lập: quercitrin và glycosid của quercitrin (quercitrin, hyperin, isoquercitrin, afzelin), cho thấy khả năng chống oxy hóa của chúng rất rõ ràng Trong đó, tác dụng loại bỏ gốc tự do mạnh nhất là hợp chất isoquercitrin tại nồng độ 1 µl [38] Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết Đỏ ngọn được báo cáo bởi Sripanidkulchai cùng các cộng sự (2010) trên chuột nhắt trắng Có nồng độ hiệu quả ở mức 10,5 µg/ml,

gấp khoảng 3 lần so với acid ascorbic và α-tocopherol (chất chống oxy hóa tiêu chuẩn)

Tuy dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn chất chống oxy hóa tiêu chuẩn nhưng nó chứa hàm lượng phenolic cao với nồng độ đương lượng acid gallic là 161,7 ± 2,7 mg/g [42]

b Tác dụng chống viêm

Choi cùng các cộng sự (2014), nghiên cứu in vitro dịch chiết Đỏ ngọn trên các

flavonoid đã được phân lập: quercitrin và glycosid của quercitrin (quercitrin, hyperin, isoquercitrin, afzelin), đồng thời cho thấy khả năng chống viêm bởi khả năng ngăn chặn sản sinh NO của đại thực bào được kích thích bằng LPS đã được phân tích bằng đầu dò huỳnh quang Hiệu quả của quercetin là cao nhất trong các hợp chất thử nghiệm [38]

c Tác dụng lên hệ thần kinh

Cao Đỏ ngọn có tác dụng hoạt hóa hệ thần kinh, trong đó có hệ thần kinh thực vật, biểu hiện ở sự tăng hàm lượng catecholamin trong máu và tăng nhẹ thành phần sóng beta trên điện não đồ ở thỏ uống thuốc [16]

Dịch chiết Đỏ ngọn có tác dụng làm tăng khả năng thành lập phản xạ có điều kiện và dập tắt phản xạ trên chuột nhắt trắng và như vậy làm tăng các quá trình hưng phấn và ức chế có điều kiện trên động vật thí nghiệm [16]

d Tác dụng chống đái tháo đường

Dịch chiết lá, rễ, thân Đỏ ngọn đều có tác dụng ức chế α-glucosidase, thể hiện tác

2,0 µg/ml và 3,9 µg/ml [17] α-glucosidase là enzym quan trọng trong cơ chế điều hòa

nồng độ đường huyết, là một trong các đích điều trị đái tháo đường hiện nay

e Tác dụng lên tế bào ung thư

Tại Thái Lan, Boonnak và các cộng sự cho thấy dịch chiết từ Đỏ ngọn ức chế sự phát triển của ung thư miệng, ung thư cổ tử cung, ung thư đường mật Tác dụng được nghiên cứu trên dịch chiết Đỏ ngọn bằng các dung môi hữu cơ, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Dịch chiết bằng methanol và ethyl acetat có hàm lượng acid gallic và quercetin cao, catechin được tìm thấy trong dịch chiết nước [35], [36], [39]

Tương tự, Buranrat và các cộng sự (2017) đã nghiên cứu và chứng minh hàm lượng phenolic và flavonoid (bằng cách sử dụng acid gallic và rutin) trong dịch chiết từ cây Đỏ ngọn có tác dụng chống ung thư vú [22]

Năm 2014, Nonpunya cùng cộng sự của mình chứng minh rằng dịch chiết Đỏ ngọn phá vỡ tế bào ung thư gan HepG2 ở người bằng cách hình thành apoptosis [33]

1.2.4 Sử dụng trong y học cổ truyền Tính vị, công năng: Đỏ ngọn có vị đắng chát, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải

độc, lợi tiêu hóa

- Dùng ngoài: Lá Đỏ ngọn giã nát, trộn với nước vo gạo đặc, đắp chữa bỏng [16] Năm 2001, nhóm nghiên cứu của Học viện Quân Y - Hà Nội đã phát hiện rằng cây Đỏ ngọn ít độc, và dịch chiết từ lá và thân cây có khả năng chống oxy hóa tốt, cũng như có tác dụng hoạt huyết và làm lưu thông máu, giảm đông máu ở những trường hợp tăng đông Dựa trên nghiên cứu này, Học viện Quân Y đã phát triển sản phẩm trà thực phẩm chức năng TANAKA từ cây Đỏ ngọn Sản phẩm này đã được Bộ Y tế Việt Nam cấp phép lưu hành trên toàn quốc với số đăng ký 4375/2008/YT-TPCN Điều này chỉ ra rằng

sản phẩm đã được kiểm định và an toàn để sử dụng, cung cấp lợi ích cho sức khỏe của người tiêu dùng [6]

Tại Nhật Bản, từ rễ cây của một số loài thuộc chi Cratoxylum người ta bào chế thành

thuốc làm tăng trí nhớ, chống lão hoá, mất ngủ ở người già Ở Trung Quốc, lá của cây Đỏ ngọn được chế biến thành trà pha nước uống hàng ngày vì chứa các xanthone có tác dụng kháng khuẩn, chống vi khuẩn của muỗi gây sốt vàng da, vượt trội hơn so với chất rotenone [30]

Trong dân gian Việt Nam, cây Đỏ ngọn mới thấy dùng trong phạm vi nhân dân làm thuốc kích thích tiêu hóa, phục hồi sức khoẻ khi ốm dậy, sinh đẻ, bảo vệ thành mạch, chống lão hoá, tăng trí nhớ ở người cao tuổi Người ta thu hái lá Đỏ ngọn vào dịp tháng 5 để nấu nước uống hoặc có thể ủ sau đó đem phơi khô mới dùng [9]

Tại cơ sở sản xuất Saman ở Thái Nguyên, Bác sĩ Hoàng Sầm đã sử dụng dịch chiết của lá Đỏ ngọn để làm thực phẩm chức năng, thay chè làm nước uống, chữa một số bệnh như: ngứa, ghẻ lở, zona thần kinh, mất ngủ, miệng đắng ăn không ngon, giảm trí nhớ…

1.3 Một số quan điểm tiếp cận và hướng dẫn về xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 1.3.1 Khái niệm

Tiêu chuẩn cơ sở dược liệu là một tập hợp các phép thử, phép tham chiếu và quy trình phân tích thiết lập các tiêu chí mà dược liệu phải tuân theo để được coi là đạt tiêu chuẩn cho mục đích sử dụng của nó [45] Tiêu chuẩn cơ sở ràng buộc về mặt pháp lý do cơ sở sản xuất đề xuất và chứng minh và được cơ quan quản lý có thẩm quyền phê duyệt

Hệ thống tiêu chuẩn và ký hiệu tiêu chuẩn của Việt Nam bao gồm [3],[5]: - Tiêu chuẩn quốc gia, ký hiệu TCVN: Dược điển Việt Nam là bộ tiêu chuẩn quốc

gia về thuốc

- Tiêu chuẩn cơ sở, ký hiệu TCCS: là tiêu chuẩn do cơ sở sản xuất, pha chế biên soạn, áp dụng đối với các sản phẩm do cơ sở sản xuất, pha chế Tiêu chuẩn cơ sở của thuốc tối thiểu phải đáp ứng các yêu cầu về chỉ tiêu chất lượng và mức chất lượng được quy

định tại chuyên luận tiêu chuẩn chất lượng thuốc tương ứng của Dược điển Việt Nam 1.3.2 Phương thức xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

Tiêu chuẩn cơ sở có thể được xây dựng theo những phương thức cơ bản sau: - Dựa trên chấp nhận tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực hoặc tiêu chuẩn nước ngoài tương ứng thành tiêu chuẩn cơ sở [3],[5] Cụ thể, đối với xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu, có thể tham khảo Dược điển Việt Nam V, Dược điển nước ngoài như: Dược điển Anh, Mỹ, Ấn Độ…

- Sử dụng tiêu chuẩn cơ sở hiện hành, rồi sửa đổi và bổ sung thêm [3],[5] - Sử dụng các kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, các kết quả thử nghiệm, đánh giá, phân tích và thực nghiệm rồi từ đó xây dựng tiêu chuẩn cơ sở riêng [3],[5] Đồng thời dựa trên cơ sở các quy định trong Dược điển Việt Nam và các văn bản pháp

luật liên quan 1.3.3 Một số chỉ tiêu và phương pháp trong xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu nói chung

Theo hướng dẫn của Dược điển châu Âu và Dược điển Việt Nam V, đối với dược

liệu, cần kiểm soát các chỉ tiêu sau:

Mục đích của các phép thử định tính là phân biệt thành công chất cần phân tích với chất tương tự nó có trong cùng mẫu thử Vì vậy, việc thẩm định lại các phép định tính thông qua thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp luôn được thực hiện Hiện nay, các phương pháp định tính thường được sử dụng phải kể đến như:

- Phương pháp vi học: là việc quan sát đặc điểm của các tế bào, các mô của lát cắt, của bột hay trong một vài trường hợp là của bề mặt dược liệu dưới kính hiển vi [4]

- Phương pháp lý học: xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực… của dược liệu [4]

- Phương pháp hóa học: xác định sự có mặt của các thành phần chính trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học như: phản ứng tạo màu hoặc kết tủa và xác định các chỉ số hóa học [4]

- Phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao … để phát hiện một số thành phần trong dược liệu, so sánh với chất chuẩn hoặc thành phần trong dược liệu chuẩn [4]

- Tính chọn lọc có thể được cải thiện bằng cách kết hợp sắc ký lớp mỏng với các phản ứng hóa học tại chỗ, tức là bằng cách phun thuốc thử thích hợp lên bản mỏng [47]

- Hiện tại, việc tách hoạt chất ra khỏi dịch chiết dược liệu trong phép thử định tính không còn bắt buộc, tuy nhiên, trong quá trình thẩm định lại phép thử định tính, phải chứng minh được sự phân tách của chất này khỏi các chất tương tự, tức là chứng minh được tính đặc hiệu của phép thử [47]

Phương pháp định lượng được thẩm định đầy đủ về độ chọn lọc (tính đặc hiệu của hệ thống), độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác gồm tính thích hợp hệ thống và độ lặp lại theo yêu cầu của AOAC [44]

1.3.3.5 Thử tinh khiết

Phép thử tinh khiết nhằm kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu thông qua một hoặc một số chỉ tiêu như: tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrocloric; hàm ẩm; tạp vô cơ, tạp hữu cơ, tạp kim loại nặng, mycotoxin, dư lượng các chất bảo vệ thực vật…[4] Trong phân phối chuẩn của các giá trị, khoảng tin cậy được xác định bằng giá trị trung bình ± 3 lần độ lệch chuẩn chiếm 99,7% tổng số dữ liệu Phải có tối thiểu 10 kết quả thử nghiệm để tính giá trị trung bình, tức là cần thử tối thiểu 10 mẫu [47]

- Tro toàn phần:

• Tro là chất còn lại của một số vật sau khi cháy hết, nát vụn như bột và thường có màu xám Tro toàn phần là khối lượng cắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược liệu Chỉ tiêu này luôn được xây dựng trong chuyên luận dược liệu, trừ khi có lý do khác [26]

• Ưu điểm chính của phép thử này đối với các chất dễ sinh cacbon là thường có độ nhạy cao Tuy nhiên, nó lại có nhược điểm là không đặc hiệu khi cung cấp thông tin về các tạp chất hữu cơ

- Độ ẩm: • Dược liệu được sấy khô cho mục đích bảo quản: nếu chúng được sấy khô không đủ, sẽ tạo điều kiện cho sự phát triển của nấm men hoặc nấm mốc Phép đo độ ẩm nhằm xác định lượng nước tối đa có thể có trong dược liệu ở các điều kiện đã nêu

• Thường sử dụng phương pháp mất khối lượng do làm khô để xác định độ ẩm Giới hạn được quy định trên cơ sở kết quả thu được từ một số lượng hợp lý các mẫu khác nhau có chất lượng chấp nhận được Cần lưu ý rằng sự mất khối lượng khi sấy khô bao gồm cả nước và các chất khác dễ bay hơi ở nhiệt độ sấy theo quy định [47]

• Các chuyên luận thường quy định việc sấy khô trong một khoảng thời gian xác định hơn là sấy khô đến khối lượng không đổi (trừ khi có lý do khác) Khi thời gian sấy được quy định, phải cung cấp đầy đủ dữ liệu xác nhận Khi nhiệt độ sấy được chỉ ra bằng một

sai lớn hơn nên được chỉ ra trong chuyên khảo, nếu cần [47]

1.3.3.6 Chất chiết được trong dược liệu

Chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất tan có trong dược liệu, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan của dược liệu Phần dung môi đã hòa tan các chất tan được gọi là dịch chiết Phần không tan của dược liệu được gọi là bã dược liệu Các chất có tác dụng điều trị trong dược liệu được gọi là hoạt chất

Nguyên liệu dùng để chiết xuất thường là những bộ phận của cây có thành phần phức tạp, không rõ ràng và kém ổn định, hàm lượng hoạt chất hay thay đổi vì phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: giống, loài, khí hậu, đất đai, điều kiện trồng trọt, bộ phận dùng, giai đoạn sinh trưởng, thời kỳ thu hái, bảo quản và quá trình chiết xuất

1.4 Chuyên luận Ngành ngạnh (Đỏ ngọn) trong Dược điển Việt Nam V

NGÀNH NGẠNH (Lá) Folium Cratoxylum pruniflorum (Đỏ ngọn, Cỏ kín lang)

Lá phơi hay sấy khô của cây Ngành ngạnh (Cratoxylum pruniflorum Kurtz), họ Ban

(Hypericaceae)

1.4.1 Mô tả

Lá hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu nhọn, dài 6 cm đến 11 cm, rộng 2,5 cm đến 3,5 cm, mặt trên có lông nhỏ, dày hơn ở mặt dưới; cuống lá ngắn

1.4.2 Vi phẫu

Gân lá: Mặt trên lõm, mặt dưới lồi Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào

thành dày mang lông che chở đa bào Mô mềm gồm các tế bào hình đa giác, thành mỏng Libe-gỗ xếp thành hình cung sát mô mềm Bao quanh bó libe-gỗ là các bó sợi xếp thành hình vòng cung Nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai rải rác trong mô mềm

Phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào mang nhiều lông che chở đa

bào Mô giậu gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp vuông góc với biểu bì

1.4.3 Bột

Bột màu nâu vàng, mùi thơm, vị hơi chua chát Soi kinh hiển vi thấy: Mảnh biểu bì gồm những tế bào hình chữ nhật mang lông che chở và nhiều lỗ khí kiểu song bào đứng riêng lẻ Rải rác có lông che chở đa bào Sợi dài, thành dày, tập trung thành từng bó Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình đa giác thành mỏng Các tinh thể calci oxalat hình cầu gai Mảnh mạch xoắn, mạch vạch

1.4.4 Định tính

A Lấy khoảng 10 g bột dược liệu, đun hồi lưu trên cách thủy với 30 ml ether

(TT) khoảng 5 min, lọc, loại dịch chiết ether Bã dược liệu để bay hết ether ở nhiệt độ

phòng, thêm 30 ml ethanol (TT), đun sôi trên cách thủy 10 min, lọc, dịch lọc dùng làm

các phản ứng sau:

Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi (TT), 3 giọt acid

hydrocloric (TT), đun nóng nhẹ, dung dịch chuyển từ vàng sang nâu đỏ Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt dung dịch sắt (III) clorid 5 % (TT), xuất hiện màu xanh đen

Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 3 giọt dung dịch natri hydroxyd 10 % (TT), xuất hiện tủa màu vàng Thêm 1 ml nước tủa tan, màu vàng của dung dịch tăng lên

B Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)

Bản mỏng: Silica gel GF254 Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5 :4 :1 ) Dung dịch thử: Lấy khoảng 10 g bột dược liệu cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình

Soxhlet, chiết bằng 50 ml n-hexan (TT) đến khi dịch chiết không màu Loại bỏ

dịch chiết n-hexan, lấy bã dược liệu để bay hơi hết dung môi, chiết tiếp bằng 50

ml methanol (TT) trong 1 h Lấy dịch chiết methanol, cất thu hồi dung môi đến cắn Hòa tan can vào 20 ml nước cất, đun nóng cách thủy cho tan hết, lọc qua giấy lọc Chiết dịch lọc bằng ethyl acetat (TT) 3 lần, mỗi lần 20 ml Gộp dịch chiết, cẩt thu hồi ethyl

acetat đến cắn Hòa tan cắn bằng 5 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT), lọc, acid

hóa dịch lọc đến pH 3 bằng dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT), lọc thu tủa Để tủa khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan trong 10 ml methanol (TT)

Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 10 g bột nửa thô lá Ngành ngạnh (mẫu chuẩn), tiến

hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên Sau triển

khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, hiện màu bằng hơi amoniac

(TT) Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết

có cùng giá trị Rf và cùng màu sắc với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (6

vết màu vàng đến vàng nâu, trong đó các vết 2, 3 có màu vàng đậm nhất)

1.4.9 Chất chiết được trong dược liệu

Không ít hơn 20,0 % tính theo dược liệu khô kiệt Tiến hành theo phương pháp chiết nóng (Phụ lục 12.10) Dùng ethanol 96 % (TT) làm dung môi

1.5 Các phương pháp định lượng flavonoid trong Đỏ ngọn 1.5.1 Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến

Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến, sử dụng phản ứng tạo màu với dung dịch nhôm triclorua, định lượng đối chiếu theo quercetin

- Quercetin được sử dụng để tạo đường chuẩn 10 mg quercetin đã được hòa tan trong ethanol 80% và sau đó pha loãng thành 25, 50 và 100 µg/ml Hút 0,5 ml các dung dịch chuẩn đã pha loãng, thêm 1,5 ml ethanol 95%; 0,1 ml Nhôm clorua 10%; 0,1 ml Kali axetat 1 M và 2,8 ml nước cất Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 415 nm với máy Shimadzu Máy quang phổ UV-160A (Kyoto, Nhật Bản) [23]

- Mẫu trắng được làm tương tự như trên nhưng không có thuốc thử nhôm clorua 10% Mẫu thử làm tương tự, 0,5 ml dịch chiết ethanol phản ứng với nhôm clorua để xác định hàm lượng flavonoid như mô tả ở trên [23]

Lá, rễ và thân của C formosum ssp pruniflorum được chiết xuất tương ứng với

MeOH 80% Tổng lượng phenolic và flavonoid của mỗi chiết xuất được định lượng tương ứng bằng cách sử dụng thuốc thử Folin–Ciocalteu và thuốc thử nhôm clorua [17]

Bảng 1.2 Hàm lượng phenolic và flavonoid tổng số trong lá, rễ và thân cây C

formosum ssp pruniflorum [17]

Tổng hàm lượng Phenolic (mg GAE/g dịch chiết)

Tổng hàm lượng Flavonoid (mg CE/g dịch chiết)

1.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bảng 1.3 Điều kiện sắc ký phân tích dịch chiết Đỏ ngọn bằng phương pháp HPLC

cột

Tốc độ dòng

Detector UV

Chất chuẩn sử dụng

TLTK

1Lichrosphere C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm)

acid formic 0,1% và acetonitril

2Inertsil ODS- 3 C18

(Hichrom

acid

0,8 ml/phút

Bước sóng 370 nm

[28]

Limited, Berks, UK)

2,74 và acetonitril

3Phenomenex C18 (5 µm, 150 x 4,6 mm)

methanol và acid phosphori -c 0,5%

ml/phút

Bước sóng 270 nm

acid gallic, quercetin , acid ferulic, catechin mỗi chuẩn pha trong methanol có nồng độ khoảng 1 µg/µl

[36]

4Hypersil ODS (5 µm; 4,6 x 250 mm)

acetonitril và acid phosphori -c 0,4%

ml/phút

Bước sóng 327 nm

acid chloroge -nic pha trong methanol

[42]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Lá của cây Đỏ ngọn thu hái tại Ba Vì (ĐN1), Quảng Ninh (ĐN2), Tam Đảo (ĐN3), các mẫu lá được thu hái vào tháng 4 năm 2024, mẫu nghiên cứu được giám định tên

khoa học là Cratoxylum formosum subsp pruniflorum

Tiêu bản được lưu trữ tại bộ môn Dược học Cổ truyền, khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội

Xử lý mẫu trước khi chiết: dược liệu được làm nhỏ bằng máy xay, rây qua rây 500, đồng nhất mẫu, bảo quản trong túi PE, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng

Xác định độ ẩm bột dược liệu < 13% (thường là 10-12%)

2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất

Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích, gồm có:

- Thuốc thử, dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật:

• Dung dịch javen, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn, ethanol 96%

- Thuốc thử, dung môi, hóa chất dùng trong định tính sơ bộ các nhóm chất hóa học:

gelatin 1%, chì acetat 10%, đồng acetat 10%

• Dung môi: methanol, ethanol Hóa chất và dung môi trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn HPLC, gồm có: • Dung môi: acetonitril, methanol, acid phosphoric, nước tinh khiết • Chất chuẩn: isoquercitrin độ tinh khiết 98,2% (Công ty Chengdu Biopurify

Phytochemicals Ltd, Trung Quốc)

2.1.2.2 Dụng cụ và máy móc

- Cân kỹ thuật AND EK – 410 (Japan) - Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy sĩ) - Tủ sấy Memmert (Đức)

- Bể siêu âm Elmasonic S 100H (Đức) - Cân sấy ẩm Ohaus (Trung quốc)

- Máy li tâm HermLe Z207A (Đức) - Kính hiển vi Labomed CxL (Mỹ) - Bếp điện hồng ngoại

- Máy tính và hệ thống HPLC Shimadzu, LC –10ADxr (Nhật bản) - Máy xay Dược liệu DQF - 200 (Trung quốc)

- Tủ hốt hóa chất Fume hood (Việt Nam, Ati) - Cột sắc ký lỏng Kromasil®

- Lò nung (tro toàn phần) - Khác: tủ lạnh bảo quản mẫu, bông lọc, giấy lọc, bình nón, bình định mức (10, 25,

50, 100 ml), cốc có mỏ, pipet (1, 2, 5, 10 ml), bộ dụng cụ hồi lưu, bình sắc ký, mao

quản, ống nghiệm, cồn kế, nhiệt kế, ống đong, ống ly tâm, pipet nhựa, kẹp gỗ 2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp để tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng IQE có trong dược liệu Đỏ ngọn

Xây dựng quy trình xử lý mẫu dược liệu Đỏ ngọn bằng cách khảo sát các yếu tố sau đây:

Bảng 2.1 Các yếu tố khảo sát quy trình xử lý mẫu

MeOH 50-70-100%

Hàm lượng IQE có trong dược liệu Đỏ

ngọn

Hồi lưu

Phương pháp định lượng được thẩm định về độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng, độ chụm, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo như AOAC [18]

2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng dược liệu Đỏ ngọn

Nghiên cứu xây dựng các chỉ tiêu chất lượng dược liệu Đỏ ngọn: cảm quan, vi học, định tính hóa học, tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrocloric, độ ẩm, định lượng

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.3.1.1 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC – 10Adxr để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn IQE có nồng độ 20 µg/ml:

- Thiết bị: Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC – 10Adxr - Cột pha đảo: Kromasil® 100 – 5 C18 Column 250 × 4.0 mm

- Detector: UV-Vis (D2&W) - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

a Quan sát phổ đồ, lựa chọn bước sóng phát hiện

Quét phổ của chất chuẩn IQE từ bước sóng 190 nm đến 600 nm của hệ thống HPLC (Shimadzu Nhật Bản)

b Khảo sát hệ dung môi pha động

Pha động là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký, nó có thể ảnh hưởng tới độ chọn lọc, thời gian lưu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của pic sắc ký…

Tiến hành với các thành phần pha động khác nhau gồm: kênh D là Acid phosphoric, kênh B là dung môi ACN hay MeOH, thay đổi tỷ lệ các thành phần pha động, cố định các điều kiện phân tích khác

c Khảo sát nhiệt độ cột

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến khả năng tách pic sắc ký Điều

Thông số đánh giá: thời gian lưu, độ cân đối của pic sắc ký, hệ số phân giải của pic IQE

Yêu cầu: pic sắc ký gọn, cân đối, pic IQE tách khỏi các pic xung quanh, hệ số phân

2.3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Đỏ ngọn

a Khảo sát dung môi chiết

Dung môi thường được sử dụng để chiết xuất flavonoid là methanol [17] và ethanol [48] có thể là hỗn hợp dung môi với nước ở các tỷ lệ khác nhau Thực tế trong sản xuất công nghiệp, các quy trình chiết xuất ít sử dụng ethanol tuyệt đối làm dung môi chiết do

khi sử dụng cồn tuyệt đối, một số tạp chất bị tủa lại có thể dẫn đến hiện tượng mất hoạt chất do cơ chế bao gói Do đó nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành khảo sát chiết bằng ethanol ở các nồng độ 50%, 70%, 96% và methanol ở các nồng độ 50%, 70%, 100%

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào ống ly tâm 50 ml, chiết siêu âm bằng 20 ml methanol ở các nồng độ 50%, 70%, 100% và ethanol ở các nồng độ

50%, 70%, 96% trong 20 phút, chiết 2 lần b Khảo sát phương pháp chiết dược liệu

Có nhiều phương pháp có thể chiết xuất flavonoid từ dược liệu như chiết siêu âm, hồi lưu, ngâm [25], [33], [38], [48] Tuy nhiên với quy mô phòng thí nghiệm và điều kiện sẵn có, nhóm nghiên cứu lựa chọn khảo sát 2 phương pháp: hồi lưu và siêu âm

Cách tiến hành: - Phương pháp siêu âm: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào ống ly tâm 50 ml, thêm 20 ml dung môi chiết vào siêu âm 20 phút, ly tâm dịch chiết 4000v/ph trong 7 phút, hút lấy dịch trong cho vào bình định mức 50 ml Lặp lại quy trình chiết 2 lần, định mức đến vạch BĐM 50 ml bằng dung môi chiết Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Phương pháp hồi lưu: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml dung môi chiết hồi lưu 20 phút, lọc nóng bằng bông vào bình định mức 50 ml Gộp bông và bã dược liệu vào bình nón, chiết theo quy trình trên lần 2, định mức đến vạch BĐM 50 ml bằng dung môi chiết Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

c Khảo sát số lần chiết

Số lần chiết ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid chiết được trong dược liệu Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát số lần chiết là 1, 2, 3 lần

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, chiết

hồi lưu bằng 20 ml ethanol 70% trong 20 phút, chiết lần lượt 1, 2, 3 lần d Khảo sát thời gian chiết

Thời gian chiết ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng dịch chiết Hoạt chất thường có khối lượng phân tử nhỏ hơn tạp chất, khuếch tán và đạt cân bằng chiết sớm hơn tạp chất, do đó nếu chiết trong thời gian dài, tỉ lệ hoạt chất không tăng mà tỉ lệ tạp sẽ tăng Nhóm nghiên cứu lựa chọn khảo sát khoảng thời gian là 10, 20, 30, 40 phút cho một lần chiết cho thí nghiệm khảo sát

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, chiết hồi lưu bằng 20 ml ethanol 70%, 2 lần trong 10, 20, 30, 40 phút

2.3.1.3 Cách tiến hành và đánh giá kết quả

Định lượng isoquercitrin trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp đường chuẩn.Xây dựng đường chuẩn: Nồng độ IQE trong khoảng từ 1,5625 μg/ml đến 50 μg/ml

Cách tiến hành:

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc IQE: Cân chính xác khoảng 12,50 mg IQE chuẩn vào

bình định mức 50 ml, thêm ethanol hòa tan và định mức đến vạch, được dung dịch gốc nồng độ 250 μg/ml

Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc tính theo công thức:

𝑉

Trong đó: m: khối lượng chất chuẩn đã cân (μg); V: thể tích dung dịch chuẩn (ml);

0,4%).Tiến hành tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn IQE đã chuẩn bị ở các nồng độ trong khoảng từ 1,5625 μg/ml đến 50 μg/ml, thu được các diện tích pic Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ IQE: y = ax + b với hệ số tương quan 0,995 ≤ R ≤ 1,000 Các mẫu thử được pha loãng ở các nồng độ thích hợp rồi tiến hành chạy sắc ký, thu được diện tích pic và thời gian lưu, tính theo các công thức sau:

Hàm lượng IQE (%) trong mẫu thử được tính theo công thức:

Mẫu thử thêm chuẩn: Dung dịch dược liệu đỏ ngọn thêm khoảng 20% chuẩn IQE - Ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu, phổ UV của pic chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn

Trong đó: ∆i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn; Ct: Nồng

độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn; Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn

c Tính thích hợp hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống sắc ký được khảo sát dựa vào việc phân tích 6 lần một mẫu chuẩn trên máy HPLC với cùng điều kiện đã nêu, được đánh giá dựa vào sai số tương đối của 6 phép thử song song đối với thời gian lưu, diện tích pic

Yêu cầu:

- Dung dịch chuẩn: %RSD của thời gian lưu IQE trong 6 mẫu ≤ 2%

%RSD của Spic IQE trong 6 mẫu ≤ 2%

trong dược điển [4]

lại sắc ký đồ Xác định độ lệch tương đối RSD% của hàm lượng hoạt chất Yêu cầu:

RSD đối với hoạt chất không lớn hơn 3% đối với 6 mẫu tiến hành trong cùng 1 ngày (đối với hàm lượng từ 0,1% - 1% )

- Độ chính xác trung gian: Bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của phương

pháp nhưng tiến hành vào ngày khác nhau Yêu cầu: RSD đối với hoạt chất không lớn

hơn 6% đối với 12 mẫu tiến hành vào 2 ngày khác nhau (đối với hàm lượng từ 0,1% - 1%) [18]

e Độ đúng (tỷ lệ thu hồi)

Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn - Phương pháp thêm chuẩn: Chuẩn isoquercitrin tương ứng với 50%, 100%, 200% vào mẫu thử ở mức 100% để thu được dung dịch có nồng độ 150%, 200%, 300% so với nồng độ định lượng trong mẫu thử kí hiệu lần lượt là T1, T2, T3 Tạo 3 mẫu thử thêm chuẩn với mỗi nồng độ thêm chuẩn

- Tính tỷ lệ thu hồi R% của mỗi lượng chất chuẩn thêm vào các mẫu thêm chuẩn theo công thức:

f Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

LOD: Nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không cần thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể

LOQ: Nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận được

Trong đó: H là chiều cao tín hiệu của chất phân tích; h là chiều cao nhiễu đường nền

xung quanh vùng pic của chất phân tích (20 lần độ rộng của pic ở nửa chiều cao pic)

Yêu cầu: LOQ được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu nhiễu gấp 10-20 lần nhiễu

đường nền, thường lấy S/N =10 LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu

nhiễu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thường lấy S/N = 3 [18]

2.3.1.5 Các công cụ tính toán kết quả

- Nghiên cứu đặc điểm bột: Lá Đỏ ngọn được sấy khô, đem tán thành bột mịn, rây qua rây mịn Quan sát và mô tả đặc điểm qua kính hiển vi với các vật kính x10 và x40 [10],[11]

2.3.2.2 Định tính bằng phản ứng hóa học

Định tính các nhóm chất trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phản ứng hóa học như trong tài liệu: Thực tập dược liệu phần hóa học [1] và Dược liệu học tập I, II [2]

2.3.2.3 Mất khối lượng do làm khô

Tiến hành sấy trong tủ sấy ở áp suất thường với 1 g dược liệu Đỏ ngọn ở nhiệt độ

2.3.2.4 Định lượng tro

a Tro toàn phần

Lấy chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân Lấy chính xác 1 g bột dược liệu cho vào chén nung, rồi đem nung trong lò nung ở nhiệt độ không

hút ẩm rồi đem cân Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo khối lượng dược liệu

khô (phụ lục 9.7 – DĐVN V) [4]

b Tro không tan trong acid hydrocloric

Cho 25 ml dung dịch acid HCl 2 M (TT) vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một phễu thủy tinh xốp đã cân bì, hoặc vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500°C đến khối lượng không đổi Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã làm khô trong

không khí (phụ lục 9.7 – DĐVN V) [4]

2.3.2.5 Phân tích định lượng

Định lượng IQE trong các mẫu dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao (HPLC) đã được xây dựng và thẩm định theo mục 2.3.1

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoquercitrin trong dược liệu đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC – 10Adxr để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn IQE có nồng độ 20 µg/ml:

- Thiết bị: Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, LC – 10Adxr - Cột pha đảo: Kromasil® 100 – 5 C18 Column 250 × 4.0 mm

- Detector: UV-Vis (D2&W) - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Thể tích tiêm: 20 μl

- Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 1 mg chuẩn IQE pha vào BĐM 10 ml, pha loãng 5 lần bằng cách hút 2 ml pha tiếp vào BĐM 10 ml, pha và định mức bằng EtOH 96% Thu được chuẩn IQE nồng độ 20 μg/ml

- Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu Đỏ ngọn, chiết siêu âm với 20 ml MeOH 50% 2 lần trong 15 phút, đem ly tâm 5 phút với tốc độ 4000 v/ph Định mức tới vạch BĐM 50 ml bằng dung môi chiết, lọc dịch chiết bằng màng lọc 0,45 μg/ml

3.1.1.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ của chất chuẩn IQE từ bước sóng 190 nm đến 600 nm của hệ

thống HPLC (Shimadzu Nhật Bản) cho kết quả như hình 3.1 Từ phổ đồ thu được, chuẩn

IQE đạt cực đại hấp thụ tại 204 nm, 255 nm và 353 nm Nhóm nghiên cứu quyết định lựa chọn bước sóng đo là 255 nm

Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại của IQE

-2.50.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.5

3.1.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động thể hiện dưới bảng 3.1 và sắc ký đồ ở phụ lục 3.1

Bảng 3.1 Khảo sát hệ pha động MeOH - H3PO4

Nhận xét: Chạy chương trình gradient để

xác định sơ bộ khoảng tỷ lệ dung môi mà chuẩn IQE ra pic Pic IQE của mẫu thử vẫn còn dính với các pic xung quanh

Nhận xét: Pic IQE ở mẫu thử tách hoàn

toàn khỏi các pic xung quanh, nhưng thời gian lưu quá dài (54,93 phút) Nên nhóm nghiên cứu quyết định đổi từ MeOH sang ACN

Bảng 3.2 Khảo sát hệ pha động ACN - H3PO4

Thời gian (phút)

ACN (%)

Dung dịch đệm

0,1% (%)

Thời gian (phút)

ACN (%)

Dung dịch đệm

0,1% (%)

Thời gian (phút)

ACN (%)

Dung dịch đệm

Nhận xét: Pic IQE chưa

tách khỏi các pic xung quanh

Nhận xét: Pic IQE chưa

tách khỏi các pic xung quanh

Nhận xét: Pic IQE đã tách

khỏi các pic xung quanh nên nhóm nghiên cứu lựa chọn hệ 5 (tR = 15,93 phút)

3.1.1.3 Khảo sát nhiệt độ cột

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến khả năng tách pic sắc ký

- Dung dịch chuẩn IQE nồng độ 6,25 µg/ml - Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,50 g bột dược liệu Đỏ ngọn vào ống ly tâm, thêm khoảng 20 ml MeOH 50%, siêu âm 15 phút, ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút, lặp lại 2 lần quy trình chiết như trên, định mức đến vạch BĐM 50ml bằng dung

môi chiết Lọc dịch chiết bằng lọc 0,45 µl Thu được kết quả như hình 3.2 và sắc ký đồ ở phụ lục 3.2

Hình 3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ cột

Nhận xét:

2.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.032.535.037.5 min-25000

0250005000075000100000125000150000175000200000225000uV

1 Mẫu trắng 2 Mẫu chuẩn ở nhiệt độ cột 25oC 3 Mẫu thử ở nhiệt độ cột 25oC

5 4 3 2 1

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu dược liệu Đỏ ngọn

3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng dung môi chiết

Nhận xét: Qua biểu đồ trên và bảng (Phụ lục 4.1) thấy rằng, hàm lượng IQE chiết được thấp

nhất khi chiết bằng MeOH 100%, còn khi chiết bằng EtOH 70% thu được hàm lượng IQE cao nhất (hàm lượng IQE trung bình là 0,094%) Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn Ethanol 70% cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo

3.1.2.2 Khảo sát phương pháp chiết

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng phương pháp chiết

Nhận xét: Từ kết quả nghiên cứu (đồ thị trên và phụ lục 4.2) cho thấy hàm lượng chiết IQE khi

chiết bằng phương pháp hồi lưu tốt hơn (hàm lượng IQE trung bình là 0,106%) Do vậy,

nhóm thí nghiệm lựa chọn phương pháp chiết là hồi lưu cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo

3.1.2.3 Khảo sát số lần chiết

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng số lần chiết

Nhận xét: Trên biểu đồ và bảng (Phụ lục 4.3) cho thấy, số lần chiết có hàm lượng IQE nhiều

nhất và hợp lý nhất là khi chiết 2 lần Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn số lần chiết là 2 lần cho thí nghiệm khảo sát tiếp theo

3.1.2.4 Khảo sát thời gian chiết

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng thời gian chiết

Nhận xét:

Biểu đồ biểu diễn hàm lượng IQE chiết được chênh lệch nhiều trong khoảng thời gian

chiết từ 10 phút đến 20 phút, còn sau đó hàm lượng IQE ổn định ở khoảng 0,106% (Phụ

3.1.3.2 Điều kiện sắc ký

- Cột sắc ký: cột Krosmasil C18 (250 x 4,0 mm, 5 µm) - Detector PDA bước sóng 255nm

V: thể tích mẫu thử (ml) M(t): khối lượng lượng dược liệu (g) a: độ ẩm của dược liệu (%)

-20000-100000100002000030000400005000060000700008000090000100000uV

051015202530m AU 0.9972

4 Mẫu thử thêm chuẩn

4 3 2 1