Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hàm lượng flavonoid toàn phần .... - Phương pháp hóa học: xác định sự có mặt của các thành phần chính trong dược liệu bằng cá
QUAN
Tổng quan về dược liệu lá Sen (liên diệp)
1.1.1 Vị trí, phân loại thực vật
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 2009 [32], loài Nelumbo nucifera có vị trí phân loại như sau:
Liên bộ : Proteanae Họ: Nelumbonaceae Chi: Nelumbo Loài: Nelumbo nucifera Danh pháp: Nelumbo nucifera Gaertn
1.1.2 Đặc điểm thực vật học, sinh thái loài Nelumbo nucifera
Cây Sen có tên khoa học là : Nelumbo nucifera Gaertn Một số tên đồng nghĩa có thể được dùng như Nelumbium speciosum (Willd.) hay Nymphaea nelumbo Họ Sen
Sen còn gọi là Liên, Quỳ [6] Sen là cây thân thảo, sống ở nước, cao hơn 1m Thân rễ (ngó sen) mập, mọc bò dài trong bùn, bén rễ ở những mấu, từ đó mọc lên thân và lá Lá hình khiên, to, đường kính 30-40 cm, màu lục xám, mép nguyên lượn sóng, giữa lá trường trũng xuống, Mặt sau đôi khi điểm những đốm màu tím, gân tỏa tròn, hằn rõ; cuống lá dính vào giữa lá, dài 1m hay hơn, có nhiều gai cứng nhọn [1], [6]
Hoa to, mọc riêng lẻ trên cuống dài và thẳng, phủ đầy gai nhọn, đường kính 8-12 cm, màu hồng, hồng đỏ hoặc trắng Lá đài 3-5, màu lục nhạt, rụng sớm Cánh hoa nhiều, những cánh phía ngoài to, khum lòng máng, những cánh hoa giữa và ở trong nhỏ hẹp dần Nhị rất nhiều, màu vàng,bao phấn 2 ô nứt theo một kẽ dọc chỉ nhị mảnh, trung đới mọc dài ra thành một phần thường được gọi là gạo sen màu trắng và thơm Bộ nhụy gồm nhiều lá noãn rời nằm trên một đế hoa hình nón ngược (gương sen) Mỗi lá noãn có 1-2 tiểu noãn [1], [6] Quả bế có núm nhọn, thường được gọi là hạt sen chứa một hạt không nội nhũ Phần ngoài mỏng và cứng có màu lục tía, phần giữa mềm chứa tinh bột màu trắng ngà và phần trong là lá mầm dày, màu lục sẫm Chồi mầm gồm 4 lá non gập vào phía trong [1], [6] Sen được trồng ở nhiều nơi trong nước ta để ăn và dùng làm thuốc Mùa hoa: tháng 5-6, mùa quả: tháng 7-9 [1], [6] Ở Việt Nam chỉ có 1 loài và cây sen mọc hoang dại chủ yếu ở vùng Đồng Tháp Mười Bên cạnh quần thể hoang dại, sen cũng là cây trồng quen thuộc ở các tỉnh đồng bằng và
3 trung du từ bắc đến nam Do ưa khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới, nên sen được trồng ở hầu hết các nước khu vực Đông Nam Á đến Nam Á, như Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ và một số tỉnh phía nam Trung Quốc [1]
Thành phần hóa học có vai trò quan trọng trong việc chứng minh hoạt tính sinh học, công dụng của dược liệu
Lá Sen chứa alcaloid 0,77-0,84%, trong đó nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, anonain, liriodenine, pronuciferin, O- nornuciferin, armepavin, N- norarmepavin, methylcoclaurin, nepherin, dehydroroemerin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N- methylisocolaurin [1]
Lá Sen chứa các flavonoid như quercetin, isoquercitrin, leucocyanidin, leucodelphinidin, nelumbosid [1]
Trong nghiên cứu của Ki Hyun Kim và các cộng sự cho thấy dịch chiết methanol của lá cây Nelumbo nucifera phân lập được 5 norsesquiterpen, 4 flavonoid, 2 triterpen và 1 alcaloid [22] Cấu trúc của chúng được xác định gồm: (E)-3-hydroxymegastigm-7-en-9-on, (3S,5R,6S,7E)- megastigma-7-en-3,5,6,9-tetrol , dendranthemosid B, icarisid B2, sedumosid F1, luteolin, quercetin 3-O-β-D-glucuronid, quercetin 3-O- β-D-glucosid, isorhamnetin 3-O-rutinosid, acid alphitolic, acid maslinic, N – methylasimilobin [22]. nuciferin roemerin anonain pronuciferin
Hình 1.1 CTCT một số hợp chất alcaloid có trong lá Sen
Kết quả nghiên cứu của Mukherjee và cộng sự cho thấy lá Sen rất giàu alcaloid, bao gồm nuciferin, roemerin, anonain, pronuciferin và N-nornuciferin Hai alcaloid benzylisoquinolin , 6 bazơ không phenolic và 2 bazơ phenolic đã được xác định Lá cũng chứa một glycosid, nelumbosid và các flavonoid như quercetin và leuco-anthocyanidin được xác định là leucocyanidin và leucodelphinidin Sự hiện diện của một số flavonoid khác trong lá như quercetin 3-O-α-arabinopyranosyl-(12)-galactopyranosid, quercetin-3-
O-β-D-glucuronid , rutin, (+)-catechin, hyperosid, isoquercitrin và astragalin cũng đã được báo cáo [27]. luteolin
Quercetin 3-O-β-D-glucuronid quercetin 3-O- β-D-glucosid isorhamnetin 3-O-rutinosid
Hình 1.2 CTCT một số hợp chất flavonoid có trong lá Sen
Ngoài thành phần chính như alcaloid và flavonoid, một số nhóm chất khác cũng được tìm thấy trong lá Sen như nhóm acid phenolic [36], polysaccarid (rhamnose, arabinose, xylose, mannose, glucose and galactose) [36], terpenoid [22], nhóm sterol, nhóm saponin [30],…
1.1.4 Tác dụng sinh học và công dụng của loài Nelumbo nucifera a Công dụng, chỉ định và phối hợp theo y học cổ truyền
Lá Sen có vị đắng, tính mát, quy vào 3 kinh can, tỳ, vị, có tác dụng thăng thanh tán ứ, thanh thử, lợi thấp, chỉ huyết Dùng chữa thử thấp tiết tả, thủy chí phù thũng, lôi đầu phong, nôn ra máu, băng trung huyết lỵ Lá Sen chữa chảy máu (đại tiểu tiện ra máu, chảy máu chân răng,…) Ngày dùng 15-20 g dưới dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán [1], [6] Ở Trung Quốc, Sen được dùng như sau: Lá Sen chủ trị tức ngực có nóng sốt, tiểu tiện ít, đỏ, ho ra máu, kinh nguyệt nhiều Dùng ngoài chữa dị ứng với sơn (sắc nước rửa) Liều dùng hàng ngày: Lá tươi 1/4 - 1/2 lá, lá khô 4 -12g, sắc nước uống [1] b Tác dụng dược lý đã được nghiên cứu
Lá Sen có tác dụng chống béo phì thông quan 3 cơ chế Thứ nhất, NNE ức chế hoạt động của amylase và lipase in vitro và in vivo, trong đó thành phần có tác dụng chủ yếu là các phenolic Thứ hai, kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng NNE thúc đẩy quá trình phân giải lipid trong tế bào mỡ 3T3-L1 Thứ ba, tác dụng chống béo phì của NNE bắt nguồn từ việc tăng sinh nhiệt do điều chỉnh tăng biểu hiện UCP3 Tóm lại, những kết quả nghiên cứu cho thấy NNE là một loại thuốc có lợi cho bệnh béo phì vì nó làm tăng sinh nhiệt, điều chỉnh tăng quá trình phân giải lipid trong tế bào mỡ và ức chế sự hấp thụ [28]
Bảo vệ gan và chống oxy hóa
Trong nghiên cứu hiện tại, dịch chiết lá Sen (NNE) có hoạt tính bảo vệ gan và chống oxy hóa mạnh mẽ trên mô hình gây tổn thương gan chuột bằng CCl4 Hoạt tính bảo vệ gan của dịch chiết lá Sen (NNE) ở liều 300 và 500 mg/kg và hoạt tính chống oxy hóa in vivo ở liều
100 mg/kg tương đương với chứng dương silymarin 100 mg/kg Hoạt động bảo vệ gan của NNE có thể là do khả năng chống oxy hóa và loại bỏ gốc tự do, thông qua sự hiện diện của một số hợp chất flavonoid và phenolic trong dịch chiết.[20]
Dịch chiết ethylacetat và n-butanol của lá N nucifera có tác dụng bảo vệ gan đáng kể đối với tổn thương gan do CCl4 gây ra Chúng có hoạt tính loại bỏ gốc DPPH, ABTS tốt và khả năng chống oxy hóa khử sắt trong ống nghiệm Từ đó cho thấy tác dụng chống oxy hóa của lá Sen N nucifera.[38]
Lá của N nucifera được chiết xuất liên tiếp bằng n-hexane, CHCl3 và EtOH 95% Hoạt tớnh chống HIV được tỡm thấy trong dịch chiết EtOH 95% (EC50 < 20 àg/mL) Dịch chiết EtOH 95% được tiếp tục chiết phân đoạn n-BuOH và nước thu được phần hòa tan n-BuOH có hoạt tính chống HIV Alcaloid (+)-1(R)-coclaurine và (-)-1(S)-norcoclaurine thể hiện hoạt tính kháng HIV Quercetin glucuronid cho thấy hoạt tính kháng HIV vừa phải (EC50
2 àg/mL) và độc tớnh tế bào thấp (IC50 >100 àg/mL), dẫn đến giỏ trị TI >50 [21]
Dịch chiết ethanol thô và các hợp chất tinh khiết được phân lập từ lá Sen được đánh giá là có hoạt tính chống sốt rét in vitro (chống lại các dòng Plasmodium falciparum nhạy cảm với chloroquin (D6) và kháng (W2), độc tính tế bào và cho hoạt động kháng nấm [11]
Hoạt tính giảm đau của dịch chiết lá N nucifera được đánh giá bằng acid acetic gây đau quặn ở chuột để đánh giá loại hoạt động giảm đau ngoại biên Dịch chiết lá Sen là giảm số lần đau quặn ở chuột thí nghiệm Dựa trên kết quả thu được có thể suy ra rằng tất cả các dịch thử đều có tác dụng giảm đau ngoại biên hiệu quả Dịch chiết methanol được cho là có tác dụng mạnh nhất, tiếp theo là cloroform và ete dầu mỏ [15]
Nghiên cứu đánh giá tác dụng dịch chiết ethanol của N nucifera Gaertn trên mô hình thiếu máu bất sản do Cyclophosphamid gây ra và mô hình thiếu máu thiếu sắt do Haloperidol gây ra Tất cả các chỉ số huyết học như thiếu máu bất sản và thiếu máu do thiếu sắt đã được phục hồi về số lượng gần như bình thường sau khi sử dụng liên tục dịch chiết thông qua việc sửa chữa tủy xương (Erythropoiesis) và cơ chế phục hồi sắt trong hồng cầu
Khái niệm và nội dung xây dựng tiêu chuẩn dược liệu
Tiêu chuẩn cơ sở dược liệu là tập hợp các phép thử, các phép tham chiếu, các quy trình phân tích; nó thiết lập các tiêu chí mà một dược liệu phải tuân theo để được coi là đạt tiêu chuẩn cho mục đích sử dụng của dược liệu đó [10]
Hệ thống tiêu chuẩn và ký hiệu tiêu chuẩn của Việt Nam bao gồm [2]:
- Tiêu chuẩn quốc gia, ký hiệu TCVN: Dược điển Việt Nam là bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc
- Tiêu chuẩn cơ sở, ký hiệu TCCS: là tiêu chuẩn do cơ sở sản xuất, pha chế biên soạn, áp dụng đối với các sản phẩm do cơ sở sản xuất, pha chế Tiêu chuẩn cơ sở của thuốc tối thiểu phải đáp ứng các yêu cầu về chỉ tiêu chất lượng và mức chất lượng được quy định tại chuyên luận tiêu chuẩn chất lượng thuốc tương ứng của Dược điển Việt Nam
1.2.2 Các chỉ tiêu và phương pháp trong xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu nói chung
Theo hướng dẫn của Dược điển châu Âu và Dược điển Việt Nam V, đối với dược liệu, cần kiểm soát các chỉ tiêu sau:
Nguồn gốc thực vật, bộ phận dùng, trạng thái dược liệu (tươi, khô, dạng bột,…), nguồn gốc địa lý và các điều kiện nơi dược liệu được thu hái [10]
Bao gồm các mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu và đặc điểm thể chất dược liệu, sử dụng phương pháp cảm quan, vi học [3]
Thử định tính là phép thử cần thiết để nhận biết một dược chất hay những thành phần chính của thuốc dựa trên tính chất vật lý hay hóa học đặc trưng Nhận biết một dược liệu hay thuốc từ dược liệu dựa trên mô tả, đặc điểm vi phẫu, bột và các phép thử vật lý hóa học đặc trưng [3]
Hiện nay, các phương pháp định tính thường được sử dụng phải kể đến như:
- Phương pháp vi học: là việc quan sát đặc điểm của các tế bào, các mô của lát cắt, của bột hay trong một vài trường hợp là của bề mặt dược liệu dưới kính hiển vi [3]
- Phương pháp lý học: xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực,… của dược liệu [3]
- Phương pháp hóa học: xác định sự có mặt của các thành phần chính trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học như: phản ứng tạo màu hoặc kết tủa (bao gồm hình thành các dẫn xuất hoặc sản phẩm phân hủy, sau đó có thể kiểm tra bằng phương pháp lý học) và xác định các chỉ số hóa học (chỉ số xà phòng hóa, este hóa, hydroxyl hóa) [3]
- Phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao,… để phát hiện một số thành phần trong dược liệu, so sánh với chất chuẩn hoặc thành phần trong dược liệu chuẩn [3]
Phép thử định lượng nhằm xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi [3]
Các phương pháp định lượng flavonoid toàn phần được sử dụng hiện nay bao gồm [9]
- Phương pháp cân: Chỉ ứng dụng khi nguyên liệu giàu flavonoid và dịch chiết ít tạp chất như định lượng rutin trong hoa hòe
- Phương pháp đo quang phổ tử ngoại: Dùng phổ từ ngoại, dựa vào độ hấp thụ phân tử (ɛ) hoặc độ hấp thụ 𝐴 1 𝑐𝑚 1% ở một λmax và dung môi qui định cho từng loại flavonoid để định lượng Có thể kết hợp sắc ký để loại tạp chất hoặc tách thành phần cần định lượng rồi mới đo mật độ quang
- Phương pháp so màu: Bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan, crom
Hiện nay, trên thế giới có khá nhiều nghiên cứu về ứng dụng phương pháp quang phổ UV-Vis để định lượng flavonoid tổng trong dược liệu [4], [5], [19]
Phép thử tinh khiết nhằm kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu thông qua một hoặc một số chỉ tiêu như: tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrocloric; hàm ẩm; tạp vô cơ, tạp hữu cơ, tạp kim loại nặng, dư lượng các chất bảo vệ thực vật,…[3] Cụ thể nghiên cứu này xây dựng tiêu chuẩn về chỉ tiêu tro toàn phần, tro không tan trong acid, độ ẩm
+ Tro là chất còn lại của một số vật sau khi cháy hết, nát vụn như bột và thường có màu xám Tro toàn phần là khối lượng cắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược liệu Chỉ tiêu này luôn được xây dựng trong chuyên luận dược liệu, trừ khi có lý do khác [41]
+ Ưu điểm chính của phép thử này đối với các chất dễ sinh cacbon là thường có độ nhạy cao Tuy nhiên, nó lại có nhược điểm là không đặc hiệu khi cung cấp thông tin về các tạp chất hữu cơ
- Tro không tan trong acid: Thử nghiệm này có thể được thực hiện phụ thuộc vào loại thảo dược cụ thể và được dùng để phát hiện giới hạn của một số khoáng chất nhất định [41]
+ Dược liệu thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn của dược liệu, ở độ ẩm này hay thấp hơn, dược liệu có thể được an toàn trong quá trình lưu trữ Trong đa số trường hợp, độ ẩm an toàn của dược liệu được quy định là không quá 13% Để đánh giá chỉ tiêu này, người ta phải xác định độ ẩm của dược liệu Thêm vào đó, khi định lượng hoạt chất trong dược liệu, cũng cần phải xác định độ ẩm để qui hàm lượng về dược liệu khô tuyệt đối [9]
+ Thường sử dụng phương pháp mất khối lượng do làm khô để xác định độ ẩm Giới hạn được quy định trên cơ sở kết quả thu được từ một số lượng hợp lý các mẫu khác nhau có chất lượng chấp nhận được Cần lưu ý rằng sự mất khối lượng khi sấy khô bao gồm cả nước và các chất khác dễ bay hơi ở nhiệt độ sấy theo quy định [26].
Định lượng flavonoid bằng phương pháp đo quang
Cho flavonoid phản ứng với thuốc thử để tạo các hợp chất màu có độ hấp thụ xác định rồi định lượng bằng phương pháp đo quang: phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3,…
Tất cả phenol đều hấp thụ bức xạ ở vùng UV Flavonoid thường có 2 loại quang phổ hấp thụ cực đại trong phạm vi 240–285 nm (dải II) và 300–550 nm (dải I) Flavonoid như 6- và 8- hydroxyflavonol, chalcone và aurones được hấp thụ ở cực đại sóng dài từ 380 đến 430 nm trong khi anthocyanin hấp thụ ở vùng khả kiến, thường ở bước sóng trên 500 nm Việc phát hiện các chất được rửa giải thường dựa trên phép đo độ hấp thụ bức xạ ở các bước sóng đặc trưng [13]
Với AlCl3, flavon và flavonol có chứa nhóm hydroxyl ở C-3 hoặc C-5 tạo thành phức acid ổn định Ngoài ra, dạng AlCl3 phức hợp acid không bền với flavonoid có chứa nhóm ortho-dihydroxyl Ngược lại, phức hợp AlCl3 giữa keto C-4 và nhóm 3- hoặc 5-hydroxyl ổn định khi có mặt acid [25]
Hình 1.3 Sơ đồ minh họa các loại phức mà AlCl 3 có thể tạo thành với một số flavon và flavonol nhất định 1.3.2 Định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu lá Sen bằng phương pháp đo quang
Chuẩn bị dịch chiết: 1 g lá Sen chiết bằng 400 ml ethanol hoặc methanol bằng máy lắc trong 24h, tốc độ 200 vòng/phút Lọc dịch chiết và cô quay thu hồi dung môi ở 45℃ đến cắn Cân và hòa tan cắn trong dung môi thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định: Lấy 0,5 mL dịch chiết từ lá cây (1 mg/ml), thêm 0,5 mL dung dịch AlCl3 2% trong ethanol Phản ứng 1 giờ ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ ở bước sóng 420 nm Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo nồng độ kaempferol xác định từ đường chuẩn
Hàm lượng flavonoid toàn phần của dịch chiết ethanol 69,5 ± 0,10 mg kaempferol/g dịch chiết khô, dịch chiết methanol 106,9 ± 0,13 mg kaempferol/g dịch chiết khô
Chuẩn bị dung dịch thử: chiết siêu âm 100g bột lá Sen khô với 1000 ml ethanol 70% ở nhiệt độ phòng trong 40 phút, chiết 3 lần Gộp dịch chiết, lọc và cất cô quay thu hồi dung môi Đông khô dịch đặc thu được cắn màu xanh đậm Hòa tan cắn trong 50 ml H2O, chiết phân đoạn lỏng/lỏng bằng ete dầu mỏ để loại bỏ chất diệp lục Sau đó, lớp dưới được làm bay hơi và được phân đoạn bằng sắc ký nhựa macroporous D101
Dung dịch thử: Trộn 30 μl dung dịch mẫu được pha loãng thích hợp với 180 μl nước cất trong giếng của đĩa 96 giếng và sau đó thêm 10 μl dung dịch NaNO2 5% Sau 6 phút, thêm
20 àl dung dịch AlCl3 10% và để yờn trong 6 phỳt trước khi thờm 60 àl dung dịch NaOH
4% Độ hấp thụ của hỗn hợp được xác định ở bước sóng 510 nm so với mẫu trắng nước bằng đầu đọc vi đĩa đa chức năng sau 15 phút
Isoquercitrin được sử dụng làm chất chuẩn để định lượng flavonoid tổng Tất cả các giá trị được biểu thị bằng miligam đương lượng isoquercitrin trên mỗi gam mẫu (mg IE/g mẫu)
Chuẩn bị dung dịch thử: 20 g bột lá Sen khô được chiết ba lần với 2 l ethanol 80% ở 80°C trong 3 giờ Các dịch chiết được gộp lại và cô đặc đến khô dưới áp suất giảm Chiết phân đoạn thu được phần ethyl acetat Cô thu hồi dung môi, sau đó đông khô thu được 0,25 g bột
Dung dịch thử: 5 ml AlCl3 2% được trộn với 5 mL dung dịch mẫu (1 mg/ml) Độ hấp thụ ở bước sóng 415 nm được đo sau 10 phút Mẫu trắng gồm 5 ml dung dịch mẫu và 5 ml nước cất không có AlCl3
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định bằng cách sử dụng đường chuẩn của quercetin và kết quả được biểu thị bằng miligam đương lượng quercetin trên mỗi gam mẫu (mg QUE/g mẫu)
Hàm lượng flavonoid toàn phần là 115,86 ± 1,12 mg QUE/g mẫu
Một số nghiên cứu ở trên đã chỉ ra rằng, phương pháp so màu bằng quang phổ UV – Vis thường được sử dụng định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu lá Sen Vì vậy, có thể sử dụng phản ứng tạo màu với thuốc thử AlCl3 để tiến hành xây dựng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu lá Sen
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần
3.1.1 Khảo sát độ hấp thụ cực đại
Tiến hành như mục 2.4.1.1, khảo sát cực đại hấp thụ quang mẫu chuẩn cho thấy độ hấp thụ quang đạt giá trị cực đại tại bước sóng 415 nm và 276 nm Bước sóng 415 nm được chọn để tiến hành định lượng
Hình 3.1 Kết quả khảo sát cực đại hấp thụ quang chuẩn isoquercitrin
3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp định lượng flavonoid toàn phần
Khảo sát nồng độ thuốc thử
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử đến hàm lượng flavonoid toàn phần được thể hiện dưới hình 3.2 và bảng 3.1 - phụ lục 3
Hình 3.2 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng flavonoid tăng khi nồng độ thuốc thử AlCl3 tăng từ 1% đến 2%, sau đó gần như không thay đổi nhiều khi tăng lên 5% Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn nồng độ AlCl3 2% cho các khảo sát tiếp theo
Khảo sát thời gian phản ứng
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hàm lượng flavonoid toàn phần được thể hiện dưới hình 3.3 và bảng 3.2 - phụ lục 3
Hình 3.3 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian phản ứng gần như không ảnh hưởng đến kết quả định lượng kể từ thời điểm phút thứ 15 Vì vậy nhóm nghiên cứu lựa chọn thời gian phản ứng là 15 phút cho các phản ứng đo quang sau đó
Ảnh hưởng của phương pháp chiết
Khảo sát phương pháp chiết được tiến hành như mục 2.4.1.2 và kết quả được thể hiện dưới hình 3.4 và bảng 3.3 - phụ lục 3
Hình 3.4 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp siêu âm có hiệu suất chiết cao hơn phương pháp hồi lưu (2,32% > 2,16%) Vì thế trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp siêu âm cho các khảo sát tiếp theo
Ảnh hưởng của dung môi chiết
Khảo sát dung môi chiết được tiến hành như mục 2.4.1.2 và kết quả được thể hiện dưới hình 3.5 và bảng 3.4 - phụ lục 3
Hình 3.5 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Từ kết quả cho thấy dung môi EtOH 50% cho hiệu suất thấp nhất và dung môi MeOH 70% cho hiệu suất chiết cao nhất với hiệu suất chiết trung bình là 2,83% Vì vậy MeOH 70% được lựa chọn để làm dung môi chiết cho các khảo sát tiếp theo
Ảnh hưởng của số lần chiết
Khảo sát số lần chiết được tiến hành như mục 2.4.1.2 và kết quả được thể hiện dưới hình
Hình 3.6 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy khi tăng số lần chiết từ 1 lên 2 thì lượng flavonoid chiết được trong dược liệu cũng tăng lên với hiệu suất tương ứng là 3,02% và 3,42% Còn khi số lần chiết 3 lần thì hiệu suất chiết gần như không thay đổi Vì thế, nhóm nghiên cứu chọn quy trình với 2 lần chiết cho các nghiên cứu tiếp theo
Ảnh hưởng của thời gian chiết
Khảo sát thời gian chiết được tiến hành như mục 2.4.1.2 và kết quả được thể hiện dưới hình 3.7 và bảng 3.6 - phụ lục 3
Hình 3.7 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Kết quả thu được cho thấy hàm lượng flavonoid tăng lên khi tăng thời gian chiết từ 10 đến 30 phút, sau đó tăng gần như không đáng kể nếu chiết trong 40 phút Vì vậy nhóm nghiên cứu lựa chọn thời gian chiết 30 phút / lần cho những nghiên cứu tiếp theo
3.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Độ thích hợp hệ thống
Bảng 3.1 Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng flavonoid toàn phần
Lần đo 1 2 3 4 5 6 Độ hấp thụ 0,375 0,376 0,376 0,375 0,375 0,375 Độ hấp thụ trung bình 0,375
Nhận xét: Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối là 0,1% nằm trong giới hạn yêu cầu
Vì vậy, hệ thống sử dụng định lượng phù hợp với phép định lượng
Bảng 3.2 Kết quả đo độ hấp thụ của dãy chuẩn isoquercitrin
Hình 3.8 Kết quả xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính dãy chuẩn
Nhận xột: Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sỏt 4,8-28,8 àg/ml cú sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa độ hấp thụ và nồng độ isoquercitrin với hệ số tương quan
R là 0,9995 nằm trong khoảng giới hạn yêu cầu (R ≥ 0,995) Hệ số chắn Y% là 0,16% (- 2,0% < Y% < 2,0%) Vì vậy, đường chuẩn trên có độ tuyến tính phù hợp để tiến hành định lượng
Tiến hành đo quang lặp lại 6 mẫu thử để đánh giá độ lặp lại trong ngày và khác ngày Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ lặp lại trung gian
Ngày 1 Phương trình tuyến tính: y = 0,0259x + 0,0006
Ngày 2 Phương trình tuyến tính: y = 0,0277x + 0,0025
STT Khối lượng dược liệu (g) Độ hấp thụ
Hàm lượng flavonoid toàn phần % (g/g)
Khối lượng dược liệu (g) Độ hấp thụ
Hàm lượng flavonoid toàn phần % (g/g)
Hàm lượng flavonoid toàn phần trung bình 2 ngày (%) (n = 12) 3,55%
Nhận xét: Kết quả cho thấy RSD mỗi ngày đều nằm trong khoảng yêu cầu
