Dược điển Việt Nam V có chuyên luận về lá ổi [5], nhưng chỉ mới có chỉ tiêu định tính mà chưa xây dựng phương pháp định lượng các thành phần cụ thể, tại Việt Nam, lá ổi là dược liệu rất
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ CÂY ỔI (Psidium guajava L.)
1.1.1 Đặc điểm thực vật Ổi có tên khoa học là Psidium guajava L., họ Sim - Myrtaceae Ổi còn có tên khác là Psidium guajava L var pyryferum hoặc Psidium guajava L var pomiferum[17]
Cây nhỡ cao 3-6m Thân có vỏ mỏng, trơn nhẵn, khi già bong ra từng mảng Cành non vuông có lông mềm, cành già hình trụ nhẵn Lá mọc đối, hình trái xoan hoặc hình trứng, gốc tròn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có gân nổi rõ [17]
Hoa màu trắng, mọc đơn độc hoặc tập trung 2-3 cái ở kẽ lá, cuống có lông mịn, đài nhỏ có ống, 4-5 răng không đều, tràng 5 cánh dày, có lông mịn, nhị rất nhiều xếp thành nhiều dãy, chỉ nhị rời, bao phấn có trung đới rộng: bầu hạ, 5 ô dính vào ống đài [17], [5]
Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, khi xanh có vị chua chát, khi chín màu vàng, ruột màu đỏ, trắng hoặc vàng, vỏ quả giữa dày, có rất nhiều hạt hình thận [13]
Hình 1.1 Ảnh cây ổi và hoa ổi (Psidium guajava L Myrtaceae)
1.1.2 Phân bố Ổi có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ Các nước trồng nhiều ổi nhất thế giới là Brazin, Mexico, Thái Lan, Indonesia và một số nước khác ở Châu Á Ước tính mỗi năm có khoảng vài trăm ngàn tấn quả được đưa ra thị trường thế giới [17] Ở nước ta, ổi là cây ăn quả quan trọng, được trồng hầu như khắp các địa phương, cả vùng đồng bằng lẫn miền núi, trừ vùng cao trên 1500m [17]
Lá, quả, búp non, vỏ rộp và đôi khi cả vỏ rễ [17]
Triterpenoid là nhóm hoạt chất chính trong lá ổi và được công bố trong nhiều nghiên cứu trước đó Tính đến nay, hàng chục terpenoid đã được phân lập từ P guajava, trong số đó, acid corosolic, acid asiatic [21], acid maslinic, acid ursolic [43] và acid oleanolic [22] đã được nghiên cứu và chứng minh là góp phần vào các hoạt động dược lý của P guajava Đã có khoảng hơn 20 triterpenoid đã được công bố phân lập từ lá ổi với cấu trúc đa dạng thuộc nhiều nhóm khung cấu trúc từ pentacyclic như olean, ursan, lupan… đến khung tetracyclic như nhóm lanostan [16] Điển hình là các triterpenoid pentacyclic có khung cấu trúc olean, ursan
Triterpenoid có khung cấu trúc ursan: acid corosolic, acid ursolic, acid 2α- hydroxyursolic, acid guavanoid, acid guavacoumaric, acid guajanoic, acid asiatic, acid jacoumaric, acid isoneriucoumaric [21], [22]
Triterpenoid có khung cấu trúc olean: acid oleanolic, acid maslinic, acid arijunolic [21]
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học nhóm acid triterpenic phân lập từ lá ổi
4 Bảng 1.1 Công thức hóa học nhóm acid triterpenic phân lập từ lá ổi
Acid guavaoic OH OH CH3 CH3 -OAc CH3
Acid guavacoumaric OH OH R CH3 H CH3
Acid guajanoic OMe R CH3 CH3 H CH3
Acid ursolic H OH CH3 CH3 H CH3
Acid 2α-hydroxyursolic OH OH CH3 CH3 H CH3
Acid corosolic OH OH CH3 CH3 H CH3
Acid asiatic OH OH CH3 CH2OH H CH3
Acid jacoumaric OH R CH3 CH3 H CH3
Acid isoneriucoumaric R OH CH3 CH3 H CH3
Acid maslinic OH OH CH3 CH3 CH3 H
Acid oleanolic H H CH3 CH3 CH3 H
Acid arjunolic OH OH CH3 CH2OH CH3 H
Ngoài ra, còn có 4 triterpenoid cũng được phân lập P guajava, chúng là este của acid corosolic hoặc acid maslinic [44]
Hình 1.3 Công thức hóa học triterpenoid phân lập từ lá ổi
Acid 3β- O-cis-p-coumaroyl-2α- hydroxy-olean-12-en-28-oic OH cis-p-coumaroyl H CH3 H Acid 3β- O-cis-p-coumaroyl-2α- hydroxy-urs-12-en-28-oic OH cis-p-coumaroyl H H CH3
2α-hydroxy-olean-12-en-28-oic OH trans-p-coumaroyl H CH3 H Acid 3β- O-trans-p-coumaroyl-
2α-hydroxy-urs-12-en-28-oic OH trans-p-coumaroyl H H CH3
Nghiên cứu định lượng 9 triterpeniod gồm acid asiatic (1), acid maslinic (2), acid corosolic (3), acid 3β-O-cis-p-coumaroyl-2α-hydroxy-olean-12-en-28-oic (4), acid 3β-
O-cis-p-coumaroyl-2α-hydroxy-urs-12-en-28-oic (5), acid 3β-O-trans-p-coumaroyl-
2α-hydroxy-olean-12-en-28-oic (6) và acid 3β-O-trans-p-coumaroyl-2α-hydroxy-urs- 12-en-28-oic (7), acid oleanolic (8), acid ursolic (9) trong lá và quả của P guajava được trồng ở một số vùng tại Trung Quốc Kết quả cho thấy rằng các triterpenoid chủ yếu tập trung ở lá và có hàm lượng rất khác nhau, tính theo tổng số triterpenoid thì có hàm lượng vào khoảng 12-35 mg/g, trong đó hàm lượng acid corosolic thu được là lớn nhất, dao động từ 4,25-15,25 mg/g [25]
Triterpenoid có khung cấu trúc lupan: acid betulinic và lupeol [30].
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học triterpenoid khung lupan trong lá ổi
Flavonoid trong loài Psidium guajava L có thành phần chủ yếu là quercetin, với hàm lượng 0,181 – 0,393% [29] Ngoài ra còn có các dẫn chất của quercetin như
Bảng 1.2 Công thức hóa học một số triterpenoid phân lập từ lá ổi
6 isoquercetin, avicularin, guajaverin, morin, morin-3-O-lyxoside, morin-3-O- arabinoside, quercetin-3-O-arabinoside, quercetin-3-O-glucopyranoside, leucocyanidi… [36]
Lá ổi rất giàu tanin, búp và lá non chứa tới 8 – 15% tanin loại pyrrogalol (tanin thủy phân được) như acid gallic, acid ellagic [3], [17] Bên cạnh đó lá còn chứa cả tanin catechol [17] và loại kết hợp giữa tanin thủy phân được và tanin ngưng tụ là guvacin A, guvacin B,
Hình 1.6 Tanin của lá ổi
Tinh dầu lá ổi có màu xanh vàng hoặc vàng đỏ, có mùi dễ chịu Tùy theo từng loại ổi, hàm lượng tinh dầu trong lá khoảng 0,2 – 0,4% Thành phần chính của tinh dầu lá ổi gồm d và dl-limonen, β-carophyllen, sesquiterpen alcol bậc 4 [15], [14], [17] Ở Việt Nam đã có một số tài nghiên cứu khá kỹ về tinh dầu lá ổi Psidium guajava
L Bằng các phương pháp cất khác nhau, hàm lượng tinh dầu cũng khác nhau, các tác giả đã xác định được 42 hợp chất trong tinh dầu với thành phần chính là β-carophyllen (39 – 58%), α-carophyllen (8 – 12%), carophyllen oxyd (9%) [14], [15]
Hình 1.5 Một số flavonoid của lá ổi
Ngoài các thành phần chính đã trình bày ở trên, trong lá ổi còn chứa 1 số thành phần sau: nhựa, sáp, đường, caroten, các vitamin B1, B2, B6, và vitamin C [17]
1.1.5.1 Tác dụng dược lý a Tác dụng trên chuyển hóa
• Tác dụng hạ đường huyết
+ Tiêm phúc mạc 1 g/kg dịch ép quả ổi gây hạ đường huyết rõ rệt ở chuột nhắt trắng bình thường và chuột gây đái tháo đường (ĐTĐ) bằng alloxan Thời gian kéo dài tác dụng ngắn và yếu hơn so với clopropamid và metformin Khi cho người bệnh ĐTĐ không phụ thuộc insulin và người bình thường uống dịch ép quả ổi cũng thấy có tác dụng hạ đường huyết [17]
+ Tác dụng chống ĐTĐ của dịch chiết lá ổi cũng đã được một số nhà khoa học nghiên cứu Chuột 1 tháng tuổi và 3 tháng tuổi bị gây ĐTĐ được tiêm màng bụng phân đoạn butanol của lá ổi với liều 10 mg/kg/ngày trong 4 tuần Kết quả nồng độ glucose huyết sau 28 ngày của nhóm chuột 1 tháng tuổi là 127 ± 29 (mg/dl) so với lô chứng là
412 ± 45 (mg/dl) và của nhóm chuột 3 tháng tuổi là 246 ± 35 (mg/dl) so với lô chứng là
587 ± 39 (mg/dl) Như vậy sau 4 tuần dùng phân đoạn butanol từ dịch chiết lá ổi qua đường tiêm màng bụng nhận thấy rằng nồng độ glucose huyết ở chuột giảm có ý nghĩa Người ta cho rằng tác dụng làm hạ đường huyết của dịch chiết lá ổi là do khả năng ức chế protein tyrosine phosphatase 1B (PTP 1B) [42]
+ Cho chuột nhắt trắng chủng Swiss uống 0,6 g bột phân đoạn methanol hoặc 4,5g cao lỏng 2:1 chiết từ lá (thu hái ở Sơn Tây – Hà Nội) tương đương 9 g dược liệu/kg thể trọng chuột đều gây hạ đường huyết rõ rệt ở chuột gây ĐTĐ bằng alloxan [16] Kết quả cho thấy độ giảm đường huyết của lô uống bột phân đoạn methanol và lô uống cao lỏng so với lô chứng lần lượt là 41,16% và 40,27% với p < 0,05 Như vậy có thể thấy tác dụng hạ đường huyết của bột phân đoạn methanol chiết từ phân đoạn methanol là tương đương với cao nước lá ổi
+ Cao nước và cao ethanol lá ổi có tác dụng làm giảm đường huyết ở chuột bị đái tháo đường gây bởi STZ [44]
+ Cao nước lá ổi có tác dụng ức chế -glucosidase ở niêm mạc ruột chuột gây đái tháo đường bởi STZ, dẫn đến hạ đường huyết [47]
• Tác dụng trên chuyển hóa lipid
Cao phân đoạn butanol từ dịch chiết lá ổi còn có khả năng làm giảm nồng độ mỡ ở gan Việc làm giảm sự tích lũy mỡ ở gan có thể là một cách để làm tăng tính nhạy cảm của insulin [42]
• Tác dụng chống oxy hóa
TỔNG QUAN VỀ ACID COROSOLIC
1.2.1 Công thức cấu tạo và đặc tính vật lý
Acid (1S, 2R, 4aS, 6aS, 6bR, 8aR, 10R, 11R, 12aR, 12bR, 14bS)-10,11- Dihydroxy-1, 2, 6a, 6b, 9, 9, 12a-heptamethyl-2, 3, 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 10, 11, 12,
Acid 2α-Hydroxyursolic, Glucosol, Acid corsolic, Acid colosic
+ Bột màu trắng có nhiệt độ nóng chảy 243-245 o C
+ Acid corosolic là 1 pentacyclic triterpen thuộc nhóm saponin [24] Do các saponin ít có nối đôi, nhất là nối đôi liên hợp nên thường chỉ hấp thu tử ngoại ở vùng sóng ngắn từ 195-210 nm
1.2.2 Tác dụng của acid corosolic
Trong lá ổi, tác dụng của acid corosolic tập trung chủ yếu vào tác dụng hạ đường huyết và tác dụng chống ung thư
Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của acid corosolic
Tác dụng hạ đường huyết
Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trên chuột ĐTĐ typ 2 chủng KK-Ay, sau khi uống corosolic với liều đơn 10 mg/kg, có sợ chênh lệch đáng kể mật độ GLUT4 giữa màng microsom và màng bào tương so với lô chứng Điều đó chứng to acid corosolic có tác dụng kích thích sự chuyển dịch của GLUT4 – yếu tố vận chuyển glucose ở tế bào cơ của chuột ĐTĐ typ 2, cải thiện lượng glucose chuyển hóa thông qua việc giảm tình trạng kháng insulin [41]
Năm 2008, Takagi và cộng sự [49] đã kiểm tra ảnh hưởng của acid corosolic đến mức đường huyết và quá trình thủy phân disacarid trong ruột non ở chuột, phát hiện ra
CA (10 mg/kg trọng lượng cơ thể) đã cải thiện tình trạng tăng đường huyết sau khi uống sucrose và giảm đáng kể quá trình thủy phân sucrose ở ruột non Những kết quả này cho thấy hoạt động hạ đường huyết của CA có nguồn gốc ít nhất một phần là do sự ức chế quá trình thủy phân sucrose
Tác dụng chống ung thư
Các nghiên cứu về tác dụng chống ung thư và các cơ chế liên quan đến acid corosolic đã được nghiên cứu rộng rãi từ năm 1998, Ahn và cộng sự [18] đã phát hiện ra rằng acid corosolic có thể ngăn chặn sự phân cực M2 của đại thực bào và sự tăng sinh tế bào khối u bằng cách ức chế cả bộ chuyển đổi tín hiệu và bộ kích hoạt của phiên mã
Acid corosolic cũng có thể ngăn chặn sự biểu hiện của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì ở người, từ đó thúc đẩy việc bắt giữ chu kỳ tế bào và làm chết tế bào apoptotic của các tế bào ung thư dạ dày [35], và kích hoạt protein kinase hoạt hóa qua trung gian dẫn đến ức chế mục tiêu rapamycin của động vật có vú , cung cấp một cơ chế có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và gây ra hiện tượng apoptosis (giáng hóa tế bào) [34]
Năm 2014, Bokyung Sung và cộng sự [48] đã nghiên cứu về tác dụng của acid corosolic trên tế bào ung thư đại trực tràng HCT116, nhận thấy CA có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thu đại trực tràng HCT116 thông qua sự thay đổi về hình thái tế bào, gây ngưng tụ nhiễm sắc thể, giáng hóa tế bào (apoptosis) HCT116 ở giai đoạn S-G1 và hoạt hóa caspase - một enzym thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong làm chết tế bào theo chu trình
1.2.3 Một số phương pháp định lượng acid corosolic
Năm 2011, một phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), đơn giản và chính xác đã được Ying Chen và cộng sự [28] phát triển để xác định acid corosolic trong
Psidium guajava Cột Agilent SB-C18 (4,6 ì 250 mm, 5 àm) được sử dụng để phõn tỏch và phân tích Quá trình phân tách được thực hiện với pha động không đổi của acetonitril và axit formic 0,2% trong nước (75:25, tt/tt) ở tốc độ dòng 1 mL/ phút, thể tích tiêm mẫu là 10 àL Sắc ký đồ được theo dừi bằng PAD ở bước súng 210 nm Kết quả thu được: thời gian xuất hiện chất phân tích từ 9,4-10 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9999, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày lần lượt là 1,8 và 1,5%
Chao In Cheng và cộng sự [25] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với mảng diode và phương pháp tán xạ ánh sáng bay hơi (HPLC–DAD–ELSD) để xác định đồng thời chín triterpenoid trong P guajava, trong đó có acid corosolic Chiết chất lỏng có áp suất (PLE) được thực hiện để chuẩn bị mẫu và phân tích được thực hiện trên cột Cosmosil 5C18-MS-II (4,6 mm × 250 mm, ID, 5 μm) Pha động gradient bao gồm 0,1% axit formic trong nước (A) và metanol (B) và việc phân tách đạt được bằng chương trình gradient sau: 1–18 phút, 70% B; 18–20 phút, 70–83% B; 20–60 phút, 83% B; sau đó, cột rửa được thực hiện với 100 % B trong 5 phút và sau đó quay trở lại
70 % B ban đầu sau 5 phỳt chạy Thể tớch tiờm là 10 àL Nhiệt độ ống trụi của ELSD được đặt ở 40°C và tốc độ dòng nitơ là 1,6 L/phút Kết quả thu được: thời gian xuất hiện
CA từ 35,875 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan 0,9993, độ lệch chuẩn tương đổi (RSD) trong ngày là 0,7%
Tác giả Trần Thị Hằng [7] sử dụng HPLC nghiên cứu định lượng acid corosolic trong lá một số mẫu thuộc chi Lagerstroemia ở Việt Nam với điều kiện sắc ký: cột RP
18 (240 x 4mm, 5 μm), pha động là acetonitril: acid formic 0,1% (80:20, tt/tt), detector
UV bước sóng 205 nm Kết quả thu được: thời gian xuất hiện chất phân tích từ 19,1- 19,3 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9959
Nghiên cứu của tác giả Lê Thị Hoa [8] đã sử dụng HPLC nghiên cứu định lượng acid corosolic trong cao bằng lăng nước với điều kiện sắc ký: cột Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) Pha động là acetonitril : dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước, thể tớch tiờm: 10 àL, tốc độ dũng: 1,0 mL/ phỳt, nhiệt độ cột: 30 o C Kết quả thu được: thời gian xuất hiện chất phân tích từ 14,5-15 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9998
13 Katta Vijaykuma và cộng sự [46] sử dụng phương pháp HPLC và HPTLC để định lượng acid corosolic trong cao, lá và chế phẩm của L.speciosa Với phương pháp HPLC tác giả sử dụng điều kiện phân tích như sau: cột Phenomenex Luna C18 ( 250 mm × 4,6 mm, 5 μm), pha động là acetonitril : dung dịch H3PO4 0,1% trong nước (75:25, tt/tt), rửa giải isocratic, detector PDA bước sóng 210 nm Kết quả phân tích thu được: thời gian xuất hiện pic chất phân tích khoảng 9,4 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan 0,9981, độ lặp lại RSD: 0,02-0,08% (< 2%), độ đúng nằm trong khoảng 95,98-100,16% Với phương pháp HPTLC: pha động là cloroform: methanol tỷ lệ 9:1, hệ số di chuyển
Rf là 0,4 Kết quả thu được: độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9735, độ lặp lại có RSD bằng 1,16-1,78% (< 2%), độ đúng nằm trong khoảng 98,91-100,93%
Neeshad P Joshi và cộng sự [33] sử dụng phương pháp HPLC định lượng acid corosolic trong lá và chế phẩm L.speciosa Dịch chiết methanol từ lá cây BLN được sử dụng để phân tích HPLC với cột HyPurity C18 (100 x 2,1 mm, 5 μm), pha động acetonitril : nước, rửa giải gradient, sử dụng detector PDA với bước sóng 210 nm Kết quả phân tích: thời gian xuất hiện pic phân tích: 7,366 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9998, độ đúng RSD trong phạm vi 85 -115%
TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [2], [1]
1.3.2 Một số thông số đặc trưng a Hệ số phân bố K
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:
C M Trong đó CS là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và CM là nồng độ mol trong pha động Ái lực tương đối của chất tan với hai pha sẽ lượng giá hệ số K Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn [1] b Thời gian lưu
Thời gian lưu tR của một chất là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại
Thời gian lưu là đại lượng để định tính 1 chất c Hệ số dung lượng k’
Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A qua cột Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố giữa 2 pha k ' = t R - t 0 t 0 Trong đó: tR là thời gian lưu của chất phân tích (phút) t0 là thời gian để pha động ra khỏi cột phân tích (phút)
Nếu hệ số k’ 1; thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 - 2 Nếu α quá lớn thời gian phân tích sẽ dài e Độ phân giải Độ phân giải RS cho khả năng tách 2 chất A, B ra khỏi hỗn hợp
2(W A + W B ) Trong đó: (tR)A, (tR)B là thời gian lưu của hai chất A và B (phút)
WA, WB là độ rộng pic đo ở đáy pic A và B (phút)
Một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản đều có các bộ phận sau:
- Hệ thống cấp pha động sắc ký lỏng Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và chạy qua detector [9]
- Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu.
THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Dựa trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại theo hướng dẫn của ICH và AOAC International
1.4.1 Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất phân tích với sự có mặt của các thành phần có thể có mặt Thông thường, những chất này có thể bao gồm tạp chất, chất phân hủy, chất nền mẫu… [11]
Chứng minh phương pháp phân tích định lượng và định tính chất cần phân tích không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong mẫu [10]
Một quy trình phân tích kém đặc hiệu có thể được hỗ trợ bằng một hoặc nhiều quy trình phân tích khác
Hình 1.8 Cấu tạo máy HPLC [18]
16 Đối với quy trình sắc ký, nên sử dụng sắc ký đồ đại diện để chứng minh tính đặc hiệu và các thành phần riêng lẻ phải được dán nhãn thích hợp Các cân nhắc tương tự nên được đưa ra cho các kỹ thuật phân tách khác
Sự phân tách quan trọng trong sắc ký cần được nghiên cứu ở mức độ thích hợp Đối với sự phân tách quan trọng, tính đặc hiệu có thể được chứng minh bằng độ phân giải của hai thành phần rửa giải gần nhau nhất
1.4.2 Độ ổn định hệ thống
Thử nghiệm độ ổn định hệ thống là một phần không thể thiếu của nhiều quy trình phân tích Thử nghiệm dựa trên khái niệm rằng thiết bị, hoạt động phân tích và các mẫu phân tích tạo thành một hệ thống thích hợp có thể được đánh giá như vậy Các thông số kiểm tra tính phù hợp của hệ thống được thiết lập cho một quy trình cụ thể phụ thuộc vào loại quy trình được thẩm định [32]
1.4.3 Độ tuyến tính và đường chuẩn Độ tuyến tính nên được đánh giá trên phạm vi của quy trình phân tích, có thể được chứng minh trực tiếp trên dược chất (bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc) và/hoặc cân riêng hỗn hợp của các thành phần sản phẩm thuốc, sử dụng quy trình được đề xuất Độ tuyến tính nên được đánh giá qua biểu đồ tín hiệu như một hàm của nồng độ hoặc hàm lượng chất phân tích Nếu có mối quan hệ tuyến tính, kết quả thử nghiệm phải được đánh giá bằng các phương pháp thống kê thích hợp
Hệ số tương quan, hệ số chặn y, độ dốc của đường hồi quy phải được đưa ra, nên bao gồm biểu đồ dữ liệu Để thiết lập độ tuyến tính, nên sử dụng tối thiểu 5 nồng độ [32]
1.4.4 Độ đúng Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Độ đúng phải được thiết lập trong phạm vi quy định của quy trình phân tích Một số phương pháp để xác định độ đúng:
- Áp dụng quy trình phân tích đối với các hỗn hợp tổng hợp của các thành phần sản phẩm thuốc đã được bổ sung một lượng đã biết dược chất cần phân tích;
- Trong trường hợp không thể lấy mẫu của tất cả các thành phần của sản phẩm thuốc, có thể chấp nhận thêm một lượng chất phân tích đã biết vào thành phẩm thuốc hoặc so sánh kết quả thu được từ quy trình thứ hai, được đặc trưng rõ ràng, độ đúng được nêu và/hoặc xác định
- Độ chính xác có thể được suy ra khi độ chụm, độ tuyến tính và độ đặc hiệu đã được thiết lập Độ đúng phải được đánh giá bằng cách sử dụng tối thiểu 9 phép thử trên tối thiểu
3 mức nồng độ bao trùm khoảng xác định [32]
1.4.5.1 Độ lặp lại Độ lặp lại thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định Độ lặp lại nên được đánh giá bằng cách sử dụng: a) tối thiểu 9 phép thử trong khoảng xác định đối với quy trình (ví dụ: 3 nồng độ/3 lần lặp lại mỗi lần); b) tối thiểu 6 phép thử ở 100% nồng độ thử [32]
1.4.5.2 Độ chính xác trung gian
Tiến hành như độ lặp lại nhưng thực hiện khác ngày
1.4.6 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu mà tại đó chất phân tích có thể phát hiện hoặc định lượng một cách đáng tin cậy
Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N: xác định thông qua việc so sánh tín hiệu đo được từ các mẫu có nồng độ thấp đã biết của chất phân tích và tin hiệu đo được từ mẫu trắng, từ đó xác nhận nồng độ tối thiểu tại đó có thể phát hiện chất phân tích một cách tin cậy Giới hạn phát hiện (LOD) được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N=3/1 Giới hạn định lượng (LOQ) tỷ lệ S/N/1 [33]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Dược liệu dùng trong nghiên cứu là lá ổi (Psidium guajava L., họ Sim Myrtaceae) ở Hưng Yên và vùng lân cận Nguyên liệu đã thu hái được làm sạch, sấy khô rồi xay thành bột và bảo quản trong túi nilon kín
Bảng 2.1 Các mẫu lá ổi
STT Tên mẫu Nơi thu hái Thời điểm thu hái Độ ẩm
1 LO01 Thị trấn Văn Giang, Văn
2 LO02 Xã Liên Nghĩa, Văn
3 LO03 Xã Tân Tiến, Văn Giang,
4 LO04 Xã Đức Chính, Cẩm
2.1.2 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất
- Chuẩn chuẩn Acid corosolic (Chem Faces, số lô: CFN98685, độ tinh khiết 98%)
- Dung môi loại dùng cho HPLC: acetonitril (Fisher), acid phosphoric, acid formic (Merck), methanol (Trung Quốc)
- Nước cất hai lần đã được loại ion
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (Nhật Bản) trang bị detector UV-Vis, phần mềm Lab Solution
- Cột HPLC Aligent Zorbax C18 (250 x 4,6mm, 5àm, Mỹ).
- Cân phân tích Sartorius độ chính xác 0,0001 g
- Cân phân tích MS105/Mettler Toledo độ chính xác 0,00001 g
- Cân sấy hàm ẩm Precisa XM 60-HR
- Máy siêu âm Power sonic 405
- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115
- Pipet chính xác 1 mL, 2 mL, 3 mL, 5 mL (Wertlab, Đức)
- Dụng cụ khỏc: pipet Pasteur, màng lọc 0,45 àm (Mỹ), ống ly tõm 50 mL, cốc có mỏ, ống đong, sinh hàn, bình nón, bình định mức (class A, Isolab, Đức), vial (Waters, Mỹ), giấy lọc…
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Acid corosolic trong lá ổi bằng phương pháp HPLC
2.2.1.1 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký
Dựa trên công thức cấu tạo, đặc điểm lý hóa của acid corosolic, các tài liệu tham khảo [8], [46], [49] cũng như đặc điểm của phương pháp phân tích, tiến hành khảo sát để lựa chọn được điều kiện tối ưu cho việc phân tích acid corosolic, đảm bảo pic thu được có hình dạng cân đối, tách hoàn toàn khỏi nền mẫu, thời gian phân thích hợp lý
- Lựa chọn cột sắc ký:
Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp định lượng acid corosolic [7], [32], [45] và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, lựa chọn cột sắc ký Aligent Zobrax C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) để tiến hành khảo sát Duy trì nhiệt độ cột ở
40 o C trong quá trình chạy sắc ký
- Lựa chọn bước sóng phát hiện:
Quét phổ UV-VIS dung dịch chuẩn acid corosolic để xác định cực đại hấp thụ, từ đó chọn bước sóng thích hợp để lấy sắc ký đồ
Dựa vào tính chất lý hóa của chất cần nghiên cứu và tham khảo một số tài liệu nghiên cứu cũng như hóa chất sẵn có của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát pha động là acetonitril – dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước với chương trình rửa giải gradient khác nhau
- Lựa chọn tốc độ dòng:
Tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp định lượng acid corosolic, lựa chọn tốc độ dòng phù hợp, đảm bảo tách được các chất với thời gian phân tích hợp lý
2.2.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Để định lượng được acid corosolic cần phải chiết được hoàn toàn chất này và loại bỏ ảnh hướng của nền mẫu, đồng thời quy trình xử lý mẫu phải đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm
Căn cứ vào công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của chất cần phân tích và các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu trên mẫu thử LO01 như sau:
- Khảo sát dung môi chiết: methanol, ethanol
- Khảo sát phương pháp chiết: chiết siêu âm, chiết hồi lưu
- Khảo sát thời gian chiết: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút
Quy trình xử lý mẫu gồm các bước sau:
- Dược liệu tươi sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ bụi bẩn đất cát, sấy khô, xay thành bột
- Xác định hàm ẩm của mẫu dược liệu theo Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 9.6)
- Chiết dược liệu bằng dung môi chiết và phương pháp chiết thích hợp
- Chuyển dịch chiết vào bình định mức 50 mL, thêm dung môi vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm để tiêm sắc ký
2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích
Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của ICH và AOAC về thẩm định phương pháp phân tích thuốc với các chỉ tiêu sau:
Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên mẫu trắng (dung môi), mẫu chuẩn (chất chuẩn acid corosolic) và mẫu thử (mẫu dược liệu) Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu và phổ UV-Vis của chất cần phân tích
- Trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn xuất hiện pic acid corosolic (CA), pic phải cân đối, tách hoàn toàn và đạt độ tinh khiết sắc ký
- Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện các pic có thời gian lưu tương ứng với pic CA trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn Nếu có đáp ứng pic phải không quá 1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn
- Trên sắc ký đồ của mẫu thử có thể xuất hiện pic có thời gian lưu và phổ UV-VIS tương ứng với pic CA trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn Các pic (nếu có) phải tách khỏi nền mẫu và đạt độ tinh khiết sắc ký
2.2.2.2 Độ thích hợp hệ thống
Tiến hành xử lý và phân tích lặp lại ít nhất 06 lần theo phương pháp đã xây dựng của mẫu chuẩn Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích pic của hoạt chất cần phân tích
Yêu cầu: Đối với mỗi hoạt chất, pic sắc ký phải đạt yêu cầu về hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết, độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic Đồng thời phương pháp phải đạt yêu cầu về độ phân giải giữa các chất
Chênh lệch về thời gian lưu và diện tích pic biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD % không được lớn hơn 2%
2.2.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3
- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10
Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích
- Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất còn xác định được bằng sắc ký Xác định tỷ lệ S/N
Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn (ít nhất 05 dung dịch) có nồng độ thích hợp bằng cách pha loãng từ một dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau Tiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồ và diện tích các pic tại mỗi nồng độ Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan
22 tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và diện tích pic chất đó thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu
Hệ số tương quan tuyến tính r 0,998 (hay R 2 0,995)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
3.1.1 Xây dựng điều kiện sắc ký
3.1.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng phân tích
Thực hiện quét phổ UV dung dịch chuẩn của acid corosolic có nồng độ khoảng 0,5 mg/mL ở dải bước sóng 200-800 nm Kết quả thu được như hình 3.1
Hình 3.1 Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn acid corosolic Nhận xét:
Kết quả cho thấy acid corosolic có đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 205 nm
Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn bước sóng 205 nm để ghi lại sắc ký đồ
3.1.1.2 Khảo sát lựa chọn pha động Để tiến hành khảo sát chương trình pha động, chúng tôi tiến hành chuẩn bị dung dịch chuẩn CA có nồng độ 0,5 mg/mL và dung dịch mẫu thử LO01 được chuẩn bị với quy trình như sau:
Cân chính xác 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 mL, thêm chính xác 50 mL MeOH, tiến hành chiết hồi lưu 90 phút, để nguội, lọc lấy dich chiết vào bình định mức 50 mL, bổ sung lượng dung môi đã mất bằng MeOH đến vạch Lọc qua màng lọc 0,45 àm thu được dung dịch thử
Các điều kiện sắc ký được giữ cố định như sau:
+ Pha tĩnh: Aligent Zorbax C18 (250 x 4,6mm, 5àm)
+ Bước sóng phát hiện: 205 nm
25 + Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL
+ Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
Dựa vào tính chất lý hóa của acid corosolic kết hợp với tham khảo một số tài liệu nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn pha động gồm acetonitrl (A) và dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước (B) với chương trình rửa giải gradient khác nhau để tiến hành khảo sát ban đầu Tiến hành sắc ký theo các chương trình pha động khác nhau được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Các chương trình gradient khảo sát
STT Chương trình Thời gian (phút) % ACN
26 Chương trình gradient 1 : Sắc ký đồ được thể hiện ở hình 3.2
Với chương trình grandient 1, ta thấy trên sắc ký đồ pic CA chưa tách hoàn toàn khỏi các pic khác và pic không cân đối
Chương trình gradient 2: Sắc ký đồ được thể hiện ở hình 3.3
Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 2
Với chương trình grandient 2, ta thấy pic CA chưa tách hoàn toàn và chưa tách ra khỏi các pic khác
Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 1
Chương trình gradient 3: Sắc ký đồ được thể hiện ở hình 3.4
Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 3
Với chương trình gradient 3, pic CA đã tách hoàn toàn so với các pic khác, pic cân đối
3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu
3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết
Dựa trên tham khảo các nghiên cứu đã được công bố, nhóm nghiên cứu lựa chọn khảo sát với hai dung môi chiết là ethanol và methanol ở các nồng độ 50%, 70%, 100%
Cân chính xác 0,5 g bột dược liệu, chiết siêu âm với 50 mL dung môi trong 1h, , thu dịch chiết, lọc qua màng lọc 0,45 μm Tiến hành sắc ký với chương trình phân tích đã chọn
Tiến hành khảo sát lặp lại 3 lần Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.2 Hàm lượng acid corosolic chiết được theo dung môi chiết
Dung môi chiết Hàm lượng (% kl/kl, tính theo dược liệu khô kiệt) (TB ± SD, n=3)
Hình 3.5 Kết quả khảo sát chiết siêu âm với hai dung môi methanol và ethanol
Kết quả khảo sát cho thấy đối với chất phân tích, dung môi methanol cho hiệu suất chiết cao nhất (cụ thể, hàm lượng CA chiết được bằng MeOH là 0,50 ± 0,01 %)
Do đó, methanol được lựa chọn làm dung môi chiết để tiến hành các khảo sát tiếp theo
3.1.2.2 Khảo sát phương pháp chiết
Với điều kiện thực tế trong phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu nhận thấy có hai phương pháp chiết thường được sử dụng và chiết siêu âm và chiết hồi lưu Với mục tiêu lựa chọn được phương pháp chiết cho hiệu suất tối ưu, tiến hành khảo sát với hai phương pháp chiết là chiết siêu âm và chiết hồi lưu
Tiến hành khảo sát phương pháp chiết với một số điều kiện sau:
- Thể tích dung môi chiết: 50 mL
- Nhiệt độ chiết: 65 o C (bình chiết hồi lưu nhúng trong bể cách thủy 65 o C hoặc đặt chiết trong bể siêu âm cài nhiệt độ nước của bể ở 65 o C)
EtOH 50% EtOH 70% EtOH 96% MeOH 50% MeOH 70% MeOH
Hàm lượng (%) CA chiết bằng dung môi
29 Sau khi chiết, lọc lấy dịch lọc, lắc đều lọc qua màng 0,45 μm Tiến hành sắc ký với chương trình phân tích đã chọn
Bảng 3.3 Hàm lượng acid corosolic chiết được theo phương pháp chiết
Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp chiết hồi lưu cho hiệu suất cao hơn chiết siêu âm Do đó lựa chọn phương pháp chiết này để thực hiện các khảo sát tiếp theo
3.1.2.3 Khảo sát thời gian chiết
Trong quy trình xử lý mẫu, thời gian chiết có vai trò quan trọng đến hiệu suất chiết cũng như thời gian chuẩn bị mẫu Để xác định thời gian chiết tối ưu, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát với phương pháp chiết hồi lưu, dung môi methanol ở 65 o C, tỷ lệ dược liệu 1:50, trong thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút Tại mỗi nhiệt độ, tiến hành khảo sát lặp lại 3 lần Kết quả thu được như sau:
Hàm lượng (% kl/kl, tính theo dược liệu khô kiệt)
Bảng 3.4 Hàm lượng acid corosolic chiết được theo thời gian chiết
Hình 3.6 Kết quả khảo sát thời gian chiết Nhận xét:
Kết quả khảo sát cho thấy, khi tăng thời gian chiết từ 30 phút lên 90 phút, hiệu suất chiết tăng rõ rệt (hàm lượng CA tăng từ 0,51% lên 0,55%) Tiếp tục tăng thời gian chiết thì hiệu suất chiết có xu hướng giảm đi và không tăng nữa (hàm lượng CA giảm từ 0,55% xuống 0,48%) Do đó để đạt được hiệu suất cao nhất, đồng thời tiết kiệm thời gian chuẩn bị mẫu, lựa chọn thời gian chiết là 90 phút là tối ưu để thực hiện các khảo sát tiếp theo
Hàm lượng (% kl/kl, tính theo dược liệu khô kiệt) (TB ± SD, n=3)
30 phút 60 phút 90 phút 120 phút 150 phút
Hàm lượng (%) CA chiết được theo thời gian
3.1.3 Quy trình định lượng acid corosolic trong lá ổi bằng phương pháp HPLC
Sau quá trình khảo sát điều kiện sắc ký bằng phương pháp HPLC và điều kiện xử lý mẫu, phương pháp định lượng acid corosolic trong lá ổi được thiết lập như sau:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu, bộ tiêm mẫu tự động SIL- 20AHT, detector UV
- Pha tĩnh: Cột HPLC Aligent Zorbax C18 (250 x 4,6mm, 5àm)
- Pha động: Kênh A: Acetonitril, kênh B: dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước Chạy theo chương trình gradient được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5 Chương trình gradient dung môi chính thức
- Tốc độ dòng: 1,0 mL/ phút
- Bước sóng phát hiện: 205 nm
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL
Thông số đánh giá: thời gian lưu của CA chuẩn: tR = 39,4 phút
• Quy trình xử lý mẫu:
- Dung dịch chuẩn gốc: Dung dịch chuẩn acid corosolic pha trong methanol có nồng độ chính xác 1 mg/mL
- Dãy các dung dịch chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng methanol để thu được dãy các dung dịch chuẩn C1, C2, C3, C4, C5, C6 Lọc qua màng 0,45 μm
- Dung dịch thử: Cân 1,0 g bột dược liệu, chiết hồi lưu với 50 mL methanol ở 65 o C
1 lần, thời gian chiết 90 phút Lọc dịch chiết vào bình định mức 50 mL, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng 0,45 μm, lấy dịch lọc để tiêm sắc ký
- Tiến hành sắc ký dãy các dung dịch chuẩn C1, C2, C3, C4, C5, C6 xây dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ
- Tiến hành sắc ký với dung dịch thử: Hàm lượng acid corosolic được tính toán dựa trên diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử và phương trình đường chuẩn.
THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Tiến hành thẩm định độ đặc hiệu trên mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử
- Mẫu trắng: dung môi pha mẫu (MeOH)
- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc acid corosolic có nồng độ 0,5 mg/mL
- Mẫu thử: cân chính xác khoảng 1,0 g mẫu LO01 vào bình nón 100 mL, chiết hồi lưu với 50 mL methanol ở 65 o C 1 lần, thời gian chiết 90 phút Lọc dịch chiết vào bình định mức 50 mL, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng 0,45 μm, lấy dịch lọc tiến hành tiêm sắc ký
Tiêm mẫu vào hệ thống HPLC, tiến hành phân tích như điều kiện đã lựa chọn, thu được sắc ký đồ như hình 3.7
Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp
A Mẫu trắng B Mẫu thử LO01 C Mẫu chuẩn CA
Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện pic chất tương ứng với pic của chất nghiên cứu trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn Kết luận, phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độ đặc hiêu, phù hợp cho phân tích định lượng acid corosolic trong dược liệu lá ổi
3.2.2 Độ thích hợp hệ thống
Tiến hành tiêm 6 lần dung dịch chuẩn acid corosolic có nồng độ 100 μg/mL theo điện kiện sắc ký đã lựa chọn ở muc 3.1.3 Ghi lại sắc ký đồ, xác định các thông số của pic chất phân tích Kết quả được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả độ thích hợp hệ thống
STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)
Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic của acid corosolic trong 6 phép phân tích song song đều nhỏ hơn 2,7% Điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký sử dụng là phù hợp, đảm bảo độ ổn định cho phép phân tích định lượng acid corosolic
3.2.3 Độ tuyến tính Để xây dựng khoảng tuyến tính và đường chuẩn, chúng tôi tiến hành chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn bao gồm dung dịch C1, C2, C3, C4, C5, C6 được pha loãng chính xác từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 0,5 mg/mL bằng MeOH Lọc qua màng lọc 0,45 μm Tiến hành sắc ký theo điều điện đã lựa chọn mục 3.1.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.8
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Tờn mẫu Nồng độ (àg/mL) Diện tớch pic (mAU.s)
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic của acid corosolic Nhận xét:
Kết quả khảo sỏt độ tuyến tớnh cho thấy trong khoảng nồng độ từ 12,5-250 àg/mL có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic (hệ số tương quan r = 0,9999) y = 12564x + 2428.4 R² = 1
Nồng độ (àg/mL) Đường chuẩn
3.2.4 Độ thu hồi Để đánh giá độ thu hồi (hay độ đúng), chất chuẩn được thêm vào dược liệu đã biết hàm lượng của chất phân tích sao cho lượng chuẩn thêm vào với từng chất tương ứng với 3 mức nồng độ khác nhau tính trong dược liệu, mỗi mức nồng độ chuẩn bị 3 mẫu độc lập
Mẫu thêm chuẩn: Cân chính xác 0,5 g bột dược liệu vào bình nón 50 mL Tiến hành thêm chuẩn acid corosolic ở 3 mức nồng độ chính xác tương ứng với khoảng 20%, 40% và 80% nồng độ acid corosolic có sẵn trong mẫu thử LO01 (nồng độ mẫu thử khoảng 121 àg/mL) Chuẩn bị cỏc dung dịch methanol chứa chuẩn với cỏc nồng độ tương ứng trên Sau đó thêm 25 mL dung dịch methanol chứa chuẩn tương ứng vào các mẫu dược liệu Tiến hành xử lý mẫu và phân tích theo điều kiện đã lựa chọn ở mục 3.1.3, kết quả khảo sát được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.8 Kết quả độ thu hồi acid corosolic
Cc (àg/mL) Độ tìm lại (%)
Cm+c : Nồng độ acid corosolic trong dung dịch mẫu thử thờm chuẩn (àg/mL)
Cm: Nồng độ acid corosolic từ mẫu thử cú trong dịch mẫu thử (àg/mL)
Cc: Nồng độ acid corosolic từ chuẩn thờm vào dung dịch mẫu thử thờm chuẩn (àg/mL)
Với quy trình phân tích đã lựa chọn, độ thu hồi của chất phân tích đều nằm trong khoảng đáp ứng yêu cầu về thẩm định phương pháp đối với phân tích mẫu của AOAC: mẫu LO01 có độ thu hồi của acid corosolic là 97,5 – 102,8% (nằm trong khoảng 97 – 103% với hàm lượng mẫu 0,1% - 1%, RSD ≤ 2,7% theo AOAC) Kết luận, phương pháp phân tích đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng
3.2.5 Độ lặp lại Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa trên kết quả phân tích của các mẫu độc lập trong cùng một điều kiện phân tích Tiến hành định lượng 6 mẫu độc lập trên mẫu thử LO01 (độ ẩm h = 10,35%) theo điều kiện xử lý mẫu và sắc ký đã lựa chọn ở mục 3.1.3 Kết quả được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu LO01
Hàm lượng (% kl/kl, tính theo dược liệu khô kiệt)
Thống kê độ lặp lại
0,54% Độ lệch chuẩn tương đối:
Theo AOAC International, hàm lượng chất phân tích và ≤ 1%, độ lặp lại của phương pháp RSD (%) phải ≤ 2,7% Kết quả phân tích cho thấy độ lặp lại của phương pháp đối với acid corosolic đạt yêu cầu (RSD = 1,93%) Như vậy, phương pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu AOAC International [19]
3.2.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp Để xác định giới hạn phát hiện, pha loãng chính xác mẫu thử có nồng độ CA đã biết bằng methanol, tiêm vào hệ thống sắc ký và xem xét tỷ lệ S/N giữa chiều cao pic của CA và dao động đường nền ở vựng gần pic CA Ở nồng độ CA bằng 1,42 àg/mL (tương đương hàm lượng CA là 8×10 -3 % (kl/kl) trong dược liệu khô kiệt theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng) thì S/N xấp xỉ 3, như vậy đây là LOD với CA của phương pháp
Khi đánh giá độ đúng ở mục 3.2.4, độ đúng của phương pháp đã được đánh giá ở mức nồng độ thấp nhất của CA là 24,2 àg/mL Kết quả xỏc định giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng của phương pháp được trình bày ở bảng 3.8 đạt yêu cầu về độ thu hồi khi định lượng, nồng độ này cũng nằm trong dải nồng độ tuyến tính đã thẩm định ở mục 3.2.3, do vậy giới hạn định lượng của CA là 24,2 àg/mL, tương đương với hàm lượng CA là 0,13% (kl/kl) trong mẫu dược liệu khô kiệt.
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG ACID
COROSOLIC TRONG MỘT SỐ MẪU LÁ ỔI Áp dụng phương pháp phân tích đã xây dựng để định lượng acid corosolic trong một số mẫu lá ổi
Tiêm riêng biệt các dung dịch mẫu thử, mỗi mẫu thử lặp lại 3 lần, ghi nhận sắc ký đồ và ghi lại đáp ứng của chất cần phân tích Kết quả phân tích hàm lượng CA xác định được trong các mẫu này được trình bày ở bảng 3.10
Bảng 3.10 Hàm lượng acid corosolic trong các mẫu lá ổi
Nồng độ CA trong dung dịch tiêm sắc ký (àg/mL)
Hàm lượng (% kl/kl, tính theo dược liệu khô kiệt)
Kết quả phân tích bước đầu cho thấy, các mẫu thu hái tại các vùng khác nhau có hàm lượng CA dao động từ 0,54% đến 0,77% tính theo dược liệu khô kiệt.
BÀN LUẬN
3.4.1 Về lựa chọn hoạt chất chính để xây dựng phương pháp định lượng
Triterpenoid là nhóm hoạt chất chính trong lá ổi Hầu hết các tác dụng sinh học lá ổi trên chuyển hóa và trên hệ tiêu hóa đều do nhóm triterpenoid mang lại Tổng lượng triterpenoid có thể cải thiện sự phát triển của bệnh thần kinh ngoại biên do tiểu đường ở chuột [48] và cải thiện tình trạng kháng insulin ở tế bào mỡ 3T3-L1 [37]
Acid corosolic là triterpenoid chính trong lá, là chất ức chế α-glucosidase rất mạnh [25] Sự ức chế α-glucosidase làm chậm quá trình phân hủy carbohydrate và làm
39 giảm lượng đường huyết sau bữa ăn, điều này có lợi cho việc điều trị bệnh tiểu đường Hợp chất này đã thu hút lợi ích toàn cầu gần đây do các hoạt động chống hạ đường huyết và chống ung thư Acid corosolic đã trở thành một trong những hợp chất tự nhiên phổ biến nhất trong những năm gần đây vì hoạt động giống insulin của nó [30] Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn acid corosolic là marker để tiến hành xây dựng phương pháp định lượng
3.4.2 Về lựa chọn phương pháp định lượng
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hiện đại có thể định tính, định lượng và phân tích được nhiều hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mà không cần phân tách trước đó Phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác cao nên được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm
- Điều kiện xử lý mẫu Để định lượng acid corosolic trong lá ổi, cần chiết kiệt hoạt chất ra khỏi dược liệu bằng kỹ thuật chiết đơn giản, nhanh gọn, dung môi dễ kiếm và dễ thực hiện trong phòng thí nghiệm
Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu dựa vào độ tan của hoạt chất trong dung môi thông thường Acid corosolic là một triterpenoid, dễ tan trong methanol, vì vậy chúng tôi lựa chọn methanol để chiết hoạt chất trong dược liệu, đây là một dung môi rất phổ biến trong các phòng thí nghiệm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết mẫu là phương pháp chiết hồi lưu, đây là phương pháp phổ biến trong phân tích hoạt chất trong dược liệu với ưu điểm chiết kiệt được hoạt chất, trang thiết bị đơn giản, dễ thực hiện Chúng tôi đã so sánh giữa hai phương pháp chiết hồi lưu và chiết siêu âm, kết quả cho thấy chiết hồi lưu cho hiệu suất chiết cao hơn, dễ duy trì ổn định các điều kiện (nhiệt độ, thể tích dung môi chiết) hơn so với phương pháp chiết siêu âm
Chúng tôi đã lựa chọn được nhiệt độ, thời gian chiết và số lần chiết mẫu nhằm đạt được hiệu suất chiết cao nhất
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách và phát hiện các chất như loại cột sử dụng, dung môi pha động và detector
40 Trong nghiờn cứu này, pha tĩnh được sử dụng là cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 àm) Đây là loại pha tĩnh được sử dụng phổ biến trong phân tích kiểm nghiệm thuốc Lựa chọn này của nhóm nghiên cứu phù hợp với một số nghiên cứu đã công bố trước đó [30], [27], [12] Chương trình dung môi được xây dựng dựa trên tham khảo tài liệu đã công bố và điều chỉnh thành phần pha động để phù hợp với mẫu nghiên cứu, đảm bảo khả năng tách của chất phân tích so với nền mẫu Hệ pha động gồm acetonitril và dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước, đây là các dung môi rất phổ biến trong phòng thí nghiệm
Bước sóng phát hiện được lựa chọn tại cực đại hấp thụ của acid corosolic, đảm bảo kết quả có độ chính xác và độ nhạy cao
Với điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ là 39,2 – 39,4 phút (xấp xỉ thời gian lưu của CA trong nghiên cứu của tác giả Chao In Cheng [27]), chất phân tích được tách khỏi nền mẫu, pic cân đối, thời gian phân tích phù hợp, đáp ứng sắc ký có độ lặp lại ổn định, phù hợp và ứng dụng định lượng hoạt chất phục vụ kiểm tra chất lượng dược liệu
- Thẩm định phương pháp định lượng
Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn của ICH và AOAC International
2016 với các chỉ tiêu độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác
Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy có độ đặc hiệu tốt với acid corosolic Trong khoảng nồng độ từ 12,5 - 250 àg/mL, cú sự tương quan tuyến tớnh giữa nồng độ và diện tích pic với hệ số tương quan r xấp xỉ 1 Hàm lượng hoạt chất được tính theo phương pháp đường chuẩn, cho phép ứng dụng được với nhiều mẫu dược liệu có hàm lượng hoạt chất dao động lớn
Phương pháp có độ nhạy tốt, giá trị LOQ của hoạt chất trong dung dịch phân tích là 24,2 àg/mL Độ thu hồi của phương pháp được đánh giá tại ba mức nồng độ khác nhau bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu dược liệu sao cho tổng lượng chất nghiên cứu trong mãu thêm chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính đã xây dựng Kết quả cho thấy phương pháp có độ thu hồi tương đối tốt, độ thu hồi của CA nằm trong khoảng 97,5 – 102,8%, đạt yêu cầu về độ thu hồi theo AOAC (yêu cầu trong khoảng 97% đến 103% với nồng độ không quá 1%)
41 Áp dụng quy trình định lượng và điều kiện sắc ký, kết quả cho thấy áp dụng phương pháp phân tích acid corosolic cho kết quả độ lặp lại RSD = 1,93%, đạt yêu cầu về độ chính xác theo AOAC (yêu cầu RSD không vượt quá 2,7% với hàm lượng chất trong khoảng 0,1% đến 1,0%)
3.4.3 Về kết quả định lượng mẫu
Phương pháp phân tích đã được ứng dụng để định lượng hàm lượng acid corosolic trong 4 mẫu dược liệu ổi được thu hái tại các vùng lân cận Hưng Yên Kết quả phân tích cho thấy có sự dao động lớn về hàm lượng acid corosolic trong các mẫu thu hái tại các địa phương khác nhau Cụ thể, hàm lượng acid corosolic dao động từ 0,54% đến 0,77%, trong đó, mẫu lá ổi thu hái tại xã Tân Tiến, Văn Giang, Hưng Yên cho hàm lượng acid corosolic cao nhất là 0,77% Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hằng về định lượng acid corosolic trong lá một số mẫu thuộc chi Lagerstroemia tại Việt Nam [7] (với hàm lượng acid corosolic dao động từ 0,032%-0,84%)
