đỗ ngọc anh xây dựng phương pháp định lượng acid corosolic trong lá ổi bằng kỹ thuật hplc

Dược điển Việt Nam V có chuyên luận về lá ổi [5], nhưng chỉ mới có chỉ tiêu định tính mà chưa xây dựng phương pháp định lượng các thành phần cụ thể, tại Việt Nam, lá ổi là dược liệu rất

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ NGỌC ANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID COROSOLIC TRONG LÁ

ỔI BẰNG KỸ THUẬT HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

ỔI BẰNG KỸ THUẬT HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến

TS Lê Thị Kim Vân và PGS TS Lê Đình Chi, những người thầy cô đã giúp em hoàn

thành khóa luận này Thầy cô luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, quan tâm, luôn giải đáp những thắc mắc trong thực nghiệm và đóng góp ý kiến hỗ trợ em mỗi khi em vướng mắc, gặp khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Tiếp theo, em cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị nghiên cứu viên tại Viện Dược liệu đã tạo điều kiện tốt nhất cho em được hoàn thành khóa luận tốt nghiệp cũng như

động viên, hỗ trợ em trong quá trình sử dụng thiết bị trong thời gian em tiến hành thực nghiệm

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến chị Lê Thị Loan, người đã tận tình hướng dẫn em từ những ngày đầu làm nghiên cứu đến khi hoàn thành đề tài, chị Đàm Thị Thanh Nhàn, chị Lương Thị Lan, người thân và gia đình đã luôn ủng hộ, động viên và giúp

đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, em xin kính chúc các thầy cô, anh chị nghiên cứu viên luôn có một sức khỏe dồi dào, luôn thành công trong công việc và hạnh phúc trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Đỗ Ngọc Anh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2 TỔNG QUAN VỀ ACID COROSOLIC 10

1.2.1 Công thức cấu tạo và đặc tính vật lý 10

1.2.2 Tác dụng của acid corosolic 10

1.2.3 Một số phương pháp định lượng acid corosolic 12

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 13

1.4.6 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Acid corosolic trong lá ổi bằng

phương pháp HPLC 19

2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích 20

2.2.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng acid corosolic trong Lá ổi……… 23

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu và đánh giá kết quả 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 24

3.1.1 Xây dựng điều kiện sắc ký 24

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 27

3.1.3 Quy trình định lượng acid corosolic trong lá ổi bằng phương pháp HPLC……… 31

3.4.2 Về lựa chọn phương pháp định lượng 39

3.4.3 Về kết quả định lượng mẫu 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC International (Association of Official Analytical Collaboration International) Hiệp hội về hợp tác phân tích chính thống quốc tế

DAD Diod Array Detector (Detector mảng diod)

(High Perfomance Liquid Chromatography)

(High Perfomance Thin Layer Chromatography)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Công thức hóa học nhóm acid triterpenic phân lập từ lá ổi 4

Bảng 1.2 Công thức hóa học một số triterpenoid phân lập từ lá ổi 5

Bảng 2.1 Các mẫu lá ổi 18

Bảng 3.1 Các chương trình gradient khảo sát 25

Bảng 3.2 Hàm lượng acid corosolic chiết được theo dung môi chiết 27

Bảng 3.3 Hàm lượng acid corosolic chiết được theo phương pháp chiết 29

Bảng 3.4 Hàm lượng acid corosolic chiết được theo thời gian chiết 30

Bảng 3.5 Chương trình gradient dung môi chính thức 31

Bảng 3.6 Kết quả độ thích hợp hệ thống 33

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 34

Bảng 3.8 Kết quả độ thu hồi acid corosolic 35

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu LO01 36

Bảng 3.10 Hàm lượng acid corosolic trong các mẫu lá ổi 38

Bảng 4.1 Chương trình grandient đã xây dựng 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Ảnh cây ổi và hoa ổi (Psidium guajava L Myrtaceae) 2

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học nhóm acid triterpenic phân lập từ lá ổi 3

Hình 1.3 Công thức hóa học triterpenoid phân lập từ lá ổi 4

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học triterpenoid khung lupan trong lá ổi 5

Hình 1.5 Một số flavonoid của lá ổi 6

Hình 1.6 Tanin của lá ổi 6

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của acid corosolic 10

Hình 1.8 Cấu tạo máy HPLC [19] 15

Hình 3.1 Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn acid corosolic 24

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 1 26

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 2 26

Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 3 27

Hình 3.5 Kết quả khảo sát chiết siêu âm với hai dung môi methanol và ethanol 28

Hình 3.6 Kết quả khảo sát thời gian chiết 30

Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp 32

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic của acid corosolic 34

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hóa, có đặc điểm tăng glucose huyết mạn tính do khiếm khuyết về tiết insulin và về tác động của insulin [6] Theo Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế, năm 2019 toàn thế giới có 463 triệu người (trong độ tuổi 20-79) bị bệnh đái tháo đường (ĐTĐ), trong đó Việt Nam chiếm đến 6% tỷ lệ người trưởng thành mắc ĐTĐ, ước tính hơn 4 triệu người trong độ tuổi từ 20-79 đã tử vong vì các nguyên nhân liên quan đến ĐTĐ Cùng tốc độ phát triển nhanh chóng, với tính chất của một bệnh mạn tính kéo dài gây nhiều biến chứng (bệnh tim mạch, mù hòa, suy thận, ), ĐTĐ đã và đang gây ra gánh nặng về sức khỏe và kinh tế cho cá nhân người bệnh cũng như cho toàn xã hội [3]

Hiện nay, đái tháo đường được kiểm soát bằng nhiều hướng như sử dụng thuốc duy trì lượng glucose trong máu, thuốc hoạt hóa sự tiết insulin… với công dụng chính là hạ đường huyết hoặc cung cấp insulin thay thế tạm thời cho người bị ĐTĐ, tuy vậy, phần lớn thường có thêm tác dụng phụ không mong muốn Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các thuốc hạ đường huyết có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là những cây thuốc đã được sử dụng phổ biến trong dân gian, nhằm tìm những thuốc mới hiệu quả và không gây tác dụng phụ là cần thiết Ổi từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền phương Đông để giúp đẩy lùi bệnh đái tháo đường một cách tự nhiên ở các nước châu Á như Việt Nam, Trung Quốc Triterpenoid là thành phần chính trong lá ổi, đã có khoảng hơn 20 triterpenoid được phân lập, trong đó acid corosolic chiếm hàm lượng lớn nhất, là

triterpenoid chính trong lá Acid corosolic có khả năng ức chế α-glucosidase rất mạnh [25], sự ức chế α-glucosidase làm chậm quá trình phân hủy carbohydrate và làm giảm

lượng đường huyết sau bữa ăn, điều này có lợi cho việc điều trị bệnh tiểu đường [45]

Dược điển Việt Nam V có chuyên luận về lá ổi [5], nhưng chỉ mới có chỉ tiêu định tính mà chưa xây dựng phương pháp định lượng các thành phần cụ thể, tại Việt Nam, lá ổi là dược liệu rất rẻ tiền và thu hái dễ dàng, tuy nhiên nghiên cứu về lá ổi mới chỉ dừng lại ở mức độ sơ cấp mà chưa được nghiên cứu sâu, vì vậy nhóm nghiên cứu

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng acid corosolic trong lá ổi bằng kỹ thuật HPLC” với hai mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid corosolic trong lá ổi 2 Ứng dụng phương pháp mới xây dựng, định lượng acid corosolic trong một số mẫu lá ổi

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY ỔI (Psidium guajava L.) 1.1.1 Đặc điểm thực vật

Ổi có tên khoa học là Psidium guajava L., họ Sim - Myrtaceae Ổi còn có tên khác là Psidium guajava L var pyryferum hoặc Psidium guajava L var pomiferum[17]

Cây nhỡ cao 3-6m Thân có vỏ mỏng, trơn nhẵn, khi già bong ra từng mảng Cành non vuông có lông mềm, cành già hình trụ nhẵn Lá mọc đối, hình trái xoan hoặc hình trứng, gốc tròn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có gân nổi rõ [17]

Hoa màu trắng, mọc đơn độc hoặc tập trung 2-3 cái ở kẽ lá, cuống có lông mịn, đài nhỏ có ống, 4-5 răng không đều, tràng 5 cánh dày, có lông mịn, nhị rất nhiều xếp thành nhiều dãy, chỉ nhị rời, bao phấn có trung đới rộng: bầu hạ, 5 ô dính vào ống đài [17], [5]

Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, khi xanh có vị chua chát, khi chín màu vàng, ruột màu đỏ, trắng hoặc vàng, vỏ quả giữa dày, có rất nhiều hạt hình thận [13]

Hình 1.1 Ảnh cây ổi và hoa ổi (Psidium guajava L Myrtaceae)

1.1.2 Phân bố

Ổi có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ Các nước trồng nhiều ổi nhất thế giới là Brazin, Mexico, Thái Lan, Indonesia và một số nước khác ở Châu Á Ước tính mỗi năm có khoảng vài trăm ngàn tấn quả được đưa ra thị trường thế giới [17]

Ở nước ta, ổi là cây ăn quả quan trọng, được trồng hầu như khắp các địa phương, cả vùng đồng bằng lẫn miền núi, trừ vùng cao trên 1500m [17]

Triterpenoid là nhóm hoạt chất chính trong lá ổi và được công bố trong nhiều

nghiên cứu trước đó Tính đến nay, hàng chục terpenoid đã được phân lập từ P guajava,

trong số đó, acid corosolic, acid asiatic [21], acid maslinic, acid ursolic [43] và acid oleanolic [22] đã được nghiên cứu và chứng minh là góp phần vào các hoạt động dược

lý của P guajava

Đã có khoảng hơn 20 triterpenoid đã được công bố phân lập từ lá ổi với cấu trúc đa dạng thuộc nhiều nhóm khung cấu trúc từ pentacyclic như olean, ursan, lupan… đến khung tetracyclic như nhóm lanostan [16] Điển hình là các triterpenoid pentacyclic có khung cấu trúc olean, ursan

Triterpenoid có khung cấu trúc ursan: acid corosolic, acid ursolic, acid

2α-hydroxyursolic, acid guavanoid, acid guavacoumaric, acid guajanoic, acid asiatic, acid jacoumaric, acid isoneriucoumaric [21], [22]

Triterpenoid có khung cấu trúc olean: acid oleanolic, acid maslinic, acid arijunolic [21]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học nhóm acid triterpenic phân lập từ lá ổi

Ngoài ra, còn có 4 triterpenoid cũng được phân lập P guajava, chúng là este của

acid corosolic hoặc acid maslinic [44]

Hình 1.3 Công thức hóa học triterpenoid phân lập từ lá ổi

O-trans-p-coumaroyl-2α-hydroxy-urs-12-en-28-oic OH trans-p-coumaroyl H H CH3

Nghiên cứu định lượng 9 triterpeniod gồm acid asiatic (1), acid maslinic (2), acid

corosolic (3), acid O-cis-p-coumaroyl-2α-hydroxy-olean-12-en-28-oic (4), acid

3β-O-cis-p-coumaroyl-2α-hydroxy-urs-12-en-28-oic (5), acid

3β-O-trans-p-coumaroyl-2α-hydroxy-olean-12-en-28-oic (6) và acid 12-en-28-oic (7), acid oleanolic (8), acid ursolic (9) trong lá và quả của P guajava được

3β-O-trans-p-coumaroyl-2α-hydroxy-urs-trồng ở một số vùng tại Trung Quốc Kết quả cho thấy rằng các triterpenoid chủ yếu tập trung ở lá và có hàm lượng rất khác nhau, tính theo tổng số triterpenoid thì có hàm lượng vào khoảng 12-35 mg/g, trong đó hàm lượng acid corosolic thu được là lớn nhất, dao động từ 4,25-15,25 mg/g [25]

Triterpenoid có khung cấu trúc lupan: acid betulinic và lupeol [30]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học triterpenoid khung lupan trong lá ổi1.1.4.2 Nhóm phenolic và flavonoid

Flavonoid trong loài Psidium guajava L có thành phần chủ yếu là quercetin, với

hàm lượng 0,181 – 0,393% [29] Ngoài ra còn có các dẫn chất của quercetin như

Bảng 1.2 Công thức hóa học một số triterpenoid phân lập từ lá ổi

6

isoquercetin, avicularin, guajaverin, morin, lyxoside,

morin-3-O-arabinoside, quercetin-3-O-arabinoside, quercetin-3-O-glucopyranoside,

leucocyanidi… [36]

R = H: Quercetin R = -L-arabinofuranose: Avicularin R = -L-arabinopyranose: Guajaverin

1.1.4.3 Tanin

Lá ổi rất giàu tanin, búp và lá non chứa tới 8 – 15% tanin loại pyrrogalol (tanin thủy phân được) như acid gallic, acid ellagic [3], [17] Bên cạnh đó lá còn chứa cả tanin catechol [17] và loại kết hợp giữa tanin thủy phân được và tanin ngưng tụ là guvacin A, guvacin B,

Hình 1.6 Tanin của lá ổi 1.1.4.4 Tinh dầu

Tinh dầu lá ổi có màu xanh vàng hoặc vàng đỏ, có mùi dễ chịu Tùy theo từng loại ổi, hàm lượng tinh dầu trong lá khoảng 0,2 – 0,4% Thành phần chính của tinh dầu

lá ổi gồm d và dl-limonen, β-carophyllen, sesquiterpen alcol bậc 4 [15], [14], [17]

Ở Việt Nam đã có một số tài nghiên cứu khá kỹ về tinh dầu lá ổi Psidium guajava

L Bằng các phương pháp cất khác nhau, hàm lượng tinh dầu cũng khác nhau, các tác

giả đã xác định được 42 hợp chất trong tinh dầu với thành phần chính là β-carophyllen (39 – 58%), α-carophyllen (8 – 12%), carophyllen oxyd (9%) [14], [15]

COOH

OHOH

HO

Hình 1.5 Một số flavonoid của lá ổi

O

OHHO

OO

OHOH

R

O

OC

OHO

HO

O

OHOH

+ Tác dụng chống ĐTĐ của dịch chiết lá ổi cũng đã được một số nhà khoa học nghiên cứu Chuột 1 tháng tuổi và 3 tháng tuổi bị gây ĐTĐ được tiêm màng bụng phân đoạn butanol của lá ổi với liều 10 mg/kg/ngày trong 4 tuần Kết quả nồng độ glucose huyết sau 28 ngày của nhóm chuột 1 tháng tuổi là 127 ± 29 (mg/dl) so với lô chứng là 412 ± 45 (mg/dl) và của nhóm chuột 3 tháng tuổi là 246 ± 35 (mg/dl) so với lô chứng là 587 ± 39 (mg/dl) Như vậy sau 4 tuần dùng phân đoạn butanol từ dịch chiết lá ổi qua đường tiêm màng bụng nhận thấy rằng nồng độ glucose huyết ở chuột giảm có ý nghĩa Người ta cho rằng tác dụng làm hạ đường huyết của dịch chiết lá ổi là do khả năng ức chế protein tyrosine phosphatase 1B (PTP 1B) [42]

+ Cho chuột nhắt trắng chủng Swiss uống 0,6 g bột phân đoạn methanol hoặc 4,5g cao lỏng 2:1 chiết từ lá (thu hái ở Sơn Tây – Hà Nội) tương đương 9 g dược liệu/kg thể trọng chuột đều gây hạ đường huyết rõ rệt ở chuột gây ĐTĐ bằng alloxan [16] Kết quả cho thấy độ giảm đường huyết của lô uống bột phân đoạn methanol và lô uống cao lỏng so với lô chứng lần lượt là 41,16% và 40,27% với p < 0,05 Như vậy có thể thấy tác dụng hạ đường huyết của bột phân đoạn methanol chiết từ phân đoạn methanol là

tương đương với cao nước lá ổi

+ Cao nước và cao ethanol lá ổi có tác dụng làm giảm đường huyết ở chuột bị đái

tháo đường gây bởi STZ [44]

+ Cao nước lá ổi có tác dụng ức chế -glucosidase ở niêm mạc ruột chuột gây đái tháo đường bởi STZ, dẫn đến hạ đường huyết [47]

8 • Tác dụng trên chuyển hóa lipid

Cao phân đoạn butanol từ dịch chiết lá ổi còn có khả năng làm giảm nồng độ mỡ ở gan Việc làm giảm sự tích lũy mỡ ở gan có thể là một cách để làm tăng tính nhạy cảm của insulin [42]

• Tác dụng chống oxy hóa Cao chiết nước lá ổi có tác dụng chống oxy hóa và thu dọn các gốc tự do Các kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết lá ổi có tác dụng ức chế 94,4 – 96,2% sự oxy hóa acid linoleic với nồng độ 100 g/mL [27], [26]

b Tác dụng kháng khuẩn

Cao lá, hoa, quả ổi có tác dụng ức chế tụ cầu vàng và Escherichia coli Dịch chiết nước lá ổi có tác dụng chống lại tụ cầu vàng Staphylococcus aureus [20] [38] Cao quả có tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột như Salmonella typhosa và Shigella

dysenteriae, do đó lá và quả ổi được sử dụng như một phương thuốc để chữa tiêu chảy

[31], [38], [17] Tinh dầu lá ổi có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram (+) như Bacillus

subtilis, Staphylococcus aureus; vi khuẩn Gram (-) như E.coli, Pseudomonas aeruginosa; nấm mốc (Fusarium oxysponem), nấm men (Saccharomyces cerevisiae )

[15], [14] c Tác dụng trên hệ tiêu hóa

Cao chiết nước lá ổi có tác dụng chống co thắt ruột trong điều trị bệnh tiêu chảy cấp tính [23], [39], [38] Thí nghiệm tiến hành dựa trên việc đo tốc độ đẩy về phía trước trong ruột non chuột cống trắng ở lô chứng và lô thử thuốc để đánh giá hoạt tính chống tiêu chảy của cao nước lá ổi Sự tăng tốc độ đẩy về phía trước được gây ra bằng cách sử dụng thuốc nhuận tràng Microlax, trộn lẫn chất đỏ phenol làm chỉ thị trong ruột và xác định tốc độ trung bình của sự tăng đẩy về phía trước Ở nhóm thử thuốc, Microlax được dùng trước morphin hoặc cao nước lá ổi 1 giờ Tỷ lệ % ức chế tốc độ tăng đẩy (hoạt tính chống tiêu chảy) được tính toán Cả morphin và cao nước lá ổi có tác dụng chống tiêu chảy phụ thuộc vào liều Liều cao nước lá ổi tươi 0,2 mg/kg ức chế 65% sự đẩy về phía trước, tương đương với tác dụng của liều 0,2 mL/kg morphin sulphat [17], [40]

1.1.5.2 Sử dụng trong dân gian và y học cổ truyền

a Trong dân gian

9 Trong dân gian người ta thường sử dụng búp và lá non để chữa đau bụng tiêu chảy, thường dùng dạng thuốc sắc hoặc hãm Lá ổi nấu nước tắm trị rôm sẩy, lở ngứa

b Trong y học cổ truyền Việt Nam Vị thuốc là búp non, lá bánh tẻ, vỏ rộp thân cây ổi

- Tính vị: Vị đắng, chát, tính ấm - Quy kinh: Quy vào hai kinh đại tràng, vị - Công năng chủ trị

+ Thanh tràng, chỉ tả: dùng trong bệnh ỉa chảy cấp hoặc mạn tính Để chữa ỉa chảy do tính hàn thì phối hợp với các vị thuốc khác có vị cay tính ấm như: hương phụ, trần bì, [4]

+ Làm săn da, sát khuẩn: dùng khi mụn nhọt lở ngứa, có thể giã nát lá hoặc búp ổi, lấy dịch thấm vào chỗ vết bị bệnh [4]

- Liều dùng: Liều dùng 10 – 20 g - Bài thuốc có ổi:

• Tiểu đường: Quả ổi 250 g, rửa sạch, thái miếng, dùng máy ép lấy nước, chia uống 2 lần hàng ngày; mỗi ngày ăn vài quả ổi (chừng 200 g); hoặc lá ổi khô 15 – 30 g, sắc uống hàng ngày [12]

• Chữa tiêu chảy: Búp ổi 20 g, lá khổ sâm 12 g, gừng sống 8 g Băm nhỏ, sắc uống làm 2 lần trong ngày [17]

10

1.2.1 Công thức cấu tạo và đặc tính vật lý

Tên khoa học:

Acid (1S, 2R, 4aS, 6aS, 6bR, 8aR, 10R, 11R, 12aR, 12bR, 14bS)-10,11-

Dihydroxy-1, 2, 6a, 6b, 9, 9, 12a-heptamethyl-2, 3, 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 10, 11, 12, 13, 14b-tetradecahydro-1H-picene-4a-cacboxylic

1.2.2 Tác dụng của acid corosolic

Trong lá ổi, tác dụng của acid corosolic tập trung chủ yếu vào tác dụng hạ đường huyết và tác dụng chống ung thư

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của acid corosolic

11

Tác dụng hạ đường huyết

Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trên chuột ĐTĐ typ 2 chủng KK-Ay, sau khi uống corosolic với liều đơn 10 mg/kg, có sợ chênh lệch đáng kể mật độ GLUT4 giữa màng microsom và màng bào tương so với lô chứng Điều đó chứng to acid corosolic có tác dụng kích thích sự chuyển dịch của GLUT4 – yếu tố vận chuyển glucose ở tế bào cơ của chuột ĐTĐ typ 2, cải thiện lượng glucose chuyển hóa thông qua việc giảm tình trạng kháng insulin [41]

Năm 2008, Takagi và cộng sự [49] đã kiểm tra ảnh hưởng của acid corosolic đến mức đường huyết và quá trình thủy phân disacarid trong ruột non ở chuột, phát hiện ra CA (10 mg/kg trọng lượng cơ thể) đã cải thiện tình trạng tăng đường huyết sau khi uống sucrose và giảm đáng kể quá trình thủy phân sucrose ở ruột non Những kết quả này cho thấy hoạt động hạ đường huyết của CA có nguồn gốc ít nhất một phần là do sự ức chế quá trình thủy phân sucrose

Tác dụng chống ung thư

Các nghiên cứu về tác dụng chống ung thư và các cơ chế liên quan đến acid corosolic đã được nghiên cứu rộng rãi từ năm 1998, Ahn và cộng sự [18] đã phát hiện ra rằng acid corosolic có thể ngăn chặn sự phân cực M2 của đại thực bào và sự tăng sinh tế bào khối u bằng cách ức chế cả bộ chuyển đổi tín hiệu và bộ kích hoạt của phiên mã 3

Acid corosolic cũng có thể ngăn chặn sự biểu hiện của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì ở người, từ đó thúc đẩy việc bắt giữ chu kỳ tế bào và làm chết tế bào apoptotic của các tế bào ung thư dạ dày [35], và kích hoạt protein kinase hoạt hóa qua trung gian dẫn đến ức chế mục tiêu rapamycin của động vật có vú , cung cấp một cơ chế có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và gây ra hiện tượng apoptosis (giáng hóa tế bào) [34]

Năm 2014, Bokyung Sung và cộng sự [48] đã nghiên cứu về tác dụng của acid corosolic trên tế bào ung thư đại trực tràng HCT116, nhận thấy CA có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thu đại trực tràng HCT116 thông qua sự thay đổi về hình thái tế bào, gây ngưng tụ nhiễm sắc thể, giáng hóa tế bào (apoptosis) HCT116 ở giai đoạn S-G1 và hoạt hóa caspase - một enzym thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong làm chết tế bào theo chu trình

12

1.2.3 Một số phương pháp định lượng acid corosolic

Năm 2011, một phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), đơn giản và chính xác đã được Ying Chen và cộng sự [28] phát triển để xác định acid corosolic trong

Psidium guajava Cột Agilent SB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm) được sử dụng để phân tách

và phân tích Quá trình phân tách được thực hiện với pha động không đổi của acetonitril và axit formic 0,2% trong nước (75:25, tt/tt) ở tốc độ dòng 1 mL/ phút, thể tích tiêm mẫu là 10 µL Sắc ký đồ được theo dõi bằng PAD ở bước sóng 210 nm Kết quả thu được: thời gian xuất hiện chất phân tích từ 9,4-10 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9999, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày lần lượt là 1,8 và 1,5%

Chao In Cheng và cộng sự [25] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với mảng diode và phương pháp tán xạ ánh sáng bay hơi (HPLC–DAD–ELSD)

để xác định đồng thời chín triterpenoid trong P guajava, trong đó có acid corosolic

Chiết chất lỏng có áp suất (PLE) được thực hiện để chuẩn bị mẫu và phân tích được thực hiện trên cột Cosmosil 5C18-MS-II (4,6 mm × 250 mm, ID, 5 μm) Pha động gradient bao gồm 0,1% axit formic trong nước (A) và metanol (B) và việc phân tách đạt được bằng chương trình gradient sau: 1–18 phút, 70% B; 18–20 phút, 70–83% B; 20–60 phút, 83% B; sau đó, cột rửa được thực hiện với 100 % B trong 5 phút và sau đó quay trở lại 70 % B ban đầu sau 5 phút chạy Thể tích tiêm là 10 µL Nhiệt độ ống trôi của ELSD được đặt ở 40°C và tốc độ dòng nitơ là 1,6 L/phút Kết quả thu được: thời gian xuất hiện CA từ 35,875 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan 0,9993, độ lệch chuẩn tương đổi (RSD) trong ngày là 0,7%

Tác giả Trần Thị Hằng [7] sử dụng HPLC nghiên cứu định lượng acid corosolic

trong lá một số mẫu thuộc chi Lagerstroemia ở Việt Nam với điều kiện sắc ký: cột RP

18 (240 x 4mm, 5 μm), pha động là acetonitril: acid formic 0,1% (80:20, tt/tt), detector UV bước sóng 205 nm Kết quả thu được: thời gian xuất hiện chất phân tích từ 19,1-19,3 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9959

Nghiên cứu của tác giả Lê Thị Hoa [8] đã sử dụng HPLC nghiên cứu định lượng acid corosolic trong cao bằng lăng nước với điều kiện sắc ký: cột Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) Pha động là acetonitril : dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước, thể tích tiêm: 10 µL, tốc độ dòng: 1,0 mL/ phút, nhiệt độ cột: 30oC Kết quả thu được: thời gian xuất hiện chất phân tích từ 14,5-15 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9998

13 Katta Vijaykuma và cộng sự [46] sử dụng phương pháp HPLC và HPTLC để

định lượng acid corosolic trong cao, lá và chế phẩm của L.speciosa Với phương pháp

HPLC tác giả sử dụng điều kiện phân tích như sau: cột Phenomenex Luna C18 ( 250 mm × 4,6 mm, 5 μm), pha động là acetonitril : dung dịch H3PO4 0,1% trong nước (75:25, tt/tt), rửa giải isocratic, detector PDA bước sóng 210 nm Kết quả phân tích thu được: thời gian xuất hiện pic chất phân tích khoảng 9,4 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan 0,9981, độ lặp lại RSD: 0,02-0,08% (< 2%), độ đúng nằm trong khoảng 95,98-100,16% Với phương pháp HPTLC: pha động là cloroform: methanol tỷ lệ 9:1, hệ số di chuyển Rf là 0,4 Kết quả thu được: độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9735, độ lặp lại có RSD bằng 1,16-1,78% (< 2%), độ đúng nằm trong khoảng 98,91-100,93%

Neeshad P Joshi và cộng sự [33] sử dụng phương pháp HPLC định lượng acid

corosolic trong lá và chế phẩm L.speciosa Dịch chiết methanol từ lá cây BLN được sử

dụng để phân tích HPLC với cột HyPurity C18 (100 x 2,1 mm, 5 μm), pha động acetonitril : nước, rửa giải gradient, sử dụng detector PDA với bước sóng 210 nm Kết quả phân tích: thời gian xuất hiện pic phân tích: 7,366 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9998, độ đúng RSD trong phạm vi 85 -115%

W Zong và cộng sự [49] sử dụng HPLC để định lượng acid corosolic trong dịch

chiết MeOH của lá L.speciosa với cột Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5

μm), pha động là acetonitril : dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước (60:40, tt/tt), rửa giải isocratic, detector UV bước sóng 204 nm Kết quả phân tích: thời gian xuất hiện pic chất phân tích là 19,05 phút, độ tuyến tính hệ số tương quan 0,9998

1.3.1 Nguyên tắc

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [2], [1]

1.3.2 Một số thông số đặc trưng

a Hệ số phân bố K

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:

14 K = CS

CMTrong đó CS là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và CM là nồng độ mol trong pha động Ái lực tương đối của chất tan với hai pha sẽ lượng giá hệ số K Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn [1]

b Thời gian lưu

Thời gian lưu tR của một chất là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại

Thời gian lưu là đại lượng để định tính 1 chất

t0 là thời gian để pha động ra khỏi cột phân tích (phút) Nếu hệ số k’ << 1 quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh cho nên khó xác định chính xác thời gian tR Nếu k’ quá lớn (từ 20 - 30), quá trình rửa giải quá dài Thông thường người ta chọn điều kiện sắc ký để k’ dao động từ 1 – 5 [1]

d Hệ số chọn lọc α:

Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đổi của hai chất A và B

α = KBKA =

k'Bk'A =

(tR)B - t0(tR)A - t0Để tách riêng 2 chất A và B cần α > 1; thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 - 2 Nếu α quá lớn thời gian phân tích sẽ dài

e Độ phân giải

Độ phân giải RS cho khả năng tách 2 chất A, B ra khỏi hỗn hợp

RS = 1(tR)B - (tR)A2(WA + WB)Trong đó: (tR)A, (tR)B là thời gian lưu của hai chất A và B (phút)

WA, WB là độ rộng pic đo ở đáy pic A và B (phút)

15

1.3.3 Cấu tạo máy HPLC

Một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản đều có các bộ phận sau: - Hệ thống cấp pha động sắc ký lỏng Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và chạy qua detector [9] - Bộ phận tiêm mẫu

- Cột và pha tĩnh - Detector

Chứng minh phương pháp phân tích định lượng và định tính chất cần phân tích không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong mẫu [10]

Một quy trình phân tích kém đặc hiệu có thể được hỗ trợ bằng một hoặc nhiều quy trình phân tích khác

Hình 1.8 Cấu tạo máy HPLC [18]

16 Đối với quy trình sắc ký, nên sử dụng sắc ký đồ đại diện để chứng minh tính đặc hiệu và các thành phần riêng lẻ phải được dán nhãn thích hợp Các cân nhắc tương tự nên được đưa ra cho các kỹ thuật phân tách khác

Sự phân tách quan trọng trong sắc ký cần được nghiên cứu ở mức độ thích hợp Đối với sự phân tách quan trọng, tính đặc hiệu có thể được chứng minh bằng độ phân giải của hai thành phần rửa giải gần nhau nhất

1.4.2 Độ ổn định hệ thống

Thử nghiệm độ ổn định hệ thống là một phần không thể thiếu của nhiều quy trình phân tích Thử nghiệm dựa trên khái niệm rằng thiết bị, hoạt động phân tích và các mẫu phân tích tạo thành một hệ thống thích hợp có thể được đánh giá như vậy Các thông số kiểm tra tính phù hợp của hệ thống được thiết lập cho một quy trình cụ thể phụ thuộc vào loại quy trình được thẩm định [32]

1.4.3 Độ tuyến tính và đường chuẩn

Độ tuyến tính nên được đánh giá trên phạm vi của quy trình phân tích, có thể được chứng minh trực tiếp trên dược chất (bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc) và/hoặc cân riêng hỗn hợp của các thành phần sản phẩm thuốc, sử dụng quy trình được đề xuất

Độ tuyến tính nên được đánh giá qua biểu đồ tín hiệu như một hàm của nồng độ hoặc hàm lượng chất phân tích Nếu có mối quan hệ tuyến tính, kết quả thử nghiệm phải được đánh giá bằng các phương pháp thống kê thích hợp

Hệ số tương quan, hệ số chặn y, độ dốc của đường hồi quy phải được đưa ra, nên bao gồm biểu đồ dữ liệu

Để thiết lập độ tuyến tính, nên sử dụng tối thiểu 5 nồng độ [32]

17 - Trong trường hợp không thể lấy mẫu của tất cả các thành phần của sản phẩm thuốc, có thể chấp nhận thêm một lượng chất phân tích đã biết vào thành phẩm thuốc hoặc so sánh kết quả thu được từ quy trình thứ hai, được đặc trưng rõ ràng, độ đúng được nêu và/hoặc xác định

- Độ chính xác có thể được suy ra khi độ chụm, độ tuyến tính và độ đặc hiệu đã được thiết lập

Độ đúng phải được đánh giá bằng cách sử dụng tối thiểu 9 phép thử trên tối thiểu 3 mức nồng độ bao trùm khoảng xác định [32]

b) tối thiểu 6 phép thử ở 100% nồng độ thử [32]

1.4.5.2 Độ chính xác trung gian

Tiến hành như độ lặp lại nhưng thực hiện khác ngày

1.4.6 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu mà tại đó chất phân tích có thể phát hiện hoặc định lượng một cách đáng tin cậy

Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N: xác định thông qua việc so sánh tín hiệu đo được từ các mẫu có nồng độ thấp đã biết của chất phân tích và tin hiệu đo được từ mẫu trắng, từ đó xác nhận nồng độ tối thiểu tại đó có thể phát hiện chất phân tích một cách tin cậy Giới hạn phát hiện (LOD) được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N=3/1 Giới hạn định lượng (LOQ) tỷ lệ S/N=10/1 [33]

18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu thử

Dược liệu dùng trong nghiên cứu là lá ổi (Psidium guajava L., họ Sim Myrtaceae)

ở Hưng Yên và vùng lân cận Nguyên liệu đã thu hái được làm sạch, sấy khô rồi xay thành bột và bảo quản trong túi nilon kín

Bảng 2.1 Các mẫu lá ổi

STT Tên mẫu Nơi thu hái Thời điểm thu hái Độ ẩm

1 LO01 Thị trấn Văn Giang, Văn

2 LO02 Xã Liên Nghĩa, Văn

3 LO03 Xã Tân Tiến, Văn Giang,

2.1.2 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất

- Chuẩn chuẩn Acid corosolic (Chem Faces, số lô: CFN98685, độ tinh khiết 98%) - Dung môi loại dùng cho HPLC: acetonitril (Fisher), acid phosphoric, acid formic (Merck), methanol (Trung Quốc)

- Nước cất hai lần đã được loại ion

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (Nhật Bản) trang bị detector UV-Vis, phần mềm Lab Solution

- Cột HPLC Aligent Zorbax C18 (250 x 4,6mm, 5µm, Mỹ) - Dàn chiết Soxhlet

- Bể điều nhiệt - Cân phân tích Sartorius độ chính xác 0,0001 g - Cân phân tích MS105/Mettler Toledo độ chính xác 0,00001 g - Cân sấy hàm ẩm Precisa XM 60-HR

- Máy siêu âm Power sonic 405 - Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

19 - Pipet chính xác 1 mL, 2 mL, 3 mL, 5 mL (Wertlab, Đức) -Micropipet 2 - 20 µL, 10 – 100 µL, 100 – 1000 µL - Dụng cụ khác: pipet Pasteur, màng lọc 0,45 µm (Mỹ), ống ly tâm 50 mL, cốc có mỏ, ống đong, sinh hàn, bình nón, bình định mức (class A, Isolab, Đức), vial (Waters, Mỹ), giấy lọc…

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Acid corosolic trong lá ổi bằng phương pháp HPLC

2.2.1.1 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký

Dựa trên công thức cấu tạo, đặc điểm lý hóa của acid corosolic, các tài liệu tham khảo [8], [46], [49] cũng như đặc điểm của phương pháp phân tích, tiến hành khảo sát để lựa chọn được điều kiện tối ưu cho việc phân tích acid corosolic, đảm bảo pic thu được có hình dạng cân đối, tách hoàn toàn khỏi nền mẫu, thời gian phân thích hợp lý

- Lựa chọn cột sắc ký: Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp định lượng acid corosolic [7], [32], [45] và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, lựa chọn cột sắc ký Aligent Zobrax C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) để tiến hành khảo sát Duy trì nhiệt độ cột ở 40oC trong quá trình chạy sắc ký

- Lựa chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV-VIS dung dịch chuẩn acid corosolic để xác định cực đại hấp thụ, từ đó chọn bước sóng thích hợp để lấy sắc ký đồ

- Lựa chọn pha động: Dựa vào tính chất lý hóa của chất cần nghiên cứu và tham khảo một số tài liệu nghiên cứu cũng như hóa chất sẵn có của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát pha động là acetonitril – dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước với chương trình rửa giải gradient khác nhau

- Lựa chọn tốc độ dòng: Tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp định lượng acid corosolic, lựa chọn tốc độ dòng phù hợp, đảm bảo tách được các chất với thời gian phân tích hợp lý

20

2.2.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Để định lượng được acid corosolic cần phải chiết được hoàn toàn chất này và loại bỏ ảnh hướng của nền mẫu, đồng thời quy trình xử lý mẫu phải đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Căn cứ vào công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của chất cần phân tích và các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu trên mẫu thử LO01 như sau:

- Khảo sát dung môi chiết: methanol, ethanol - Khảo sát phương pháp chiết: chiết siêu âm, chiết hồi lưu - Khảo sát thời gian chiết: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút

Quy trình xử lý mẫu gồm các bước sau: - Dược liệu tươi sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ bụi bẩn đất cát, sấy khô,

xay thành bột - Xác định hàm ẩm của mẫu dược liệu theo Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 9.6) - Chiết dược liệu bằng dung môi chiết và phương pháp chiết thích hợp

- Chuyển dịch chiết vào bình định mức 50 mL, thêm dung môi vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm để tiêm sắc ký

Yêu cầu: - Trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn xuất hiện pic acid corosolic (CA), pic phải cân

đối, tách hoàn toàn và đạt độ tinh khiết sắc ký - Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện các pic có thời gian lưu tương ứng

với pic CA trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn Nếu có đáp ứng pic phải không quá 1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn

21 - Trên sắc ký đồ của mẫu thử có thể xuất hiện pic có thời gian lưu và phổ UV-VIS

tương ứng với pic CA trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn Các pic (nếu có) phải tách khỏi nền mẫu và đạt độ tinh khiết sắc ký

2.2.2.2 Độ thích hợp hệ thống

Tiến hành xử lý và phân tích lặp lại ít nhất 06 lần theo phương pháp đã xây dựng của mẫu chuẩn Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích pic của hoạt chất cần phân tích

Yêu cầu:

Đối với mỗi hoạt chất, pic sắc ký phải đạt yêu cầu về hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết, độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic Đồng thời phương pháp phải đạt yêu cầu về độ phân giải giữa các chất

Chênh lệch về thời gian lưu và diện tích pic biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD % không được lớn hơn 2%

2.2.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3

- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

N: Nhiễu đường nền - Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất còn xác định được bằng sắc ký Xác định tỷ lệ S/N

2.2.2.4 Khoảng tuyến tính

Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn (ít nhất 05 dung dịch) có nồng độ thích hợp bằng cách pha loãng từ một dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau Tiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồ và diện tích các pic tại mỗi nồng độ Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan