đặng ngọc tuyết bước đầu tạo nguyên liệu probiotic dạng bột đông khô chứa lactobacillus acidophilus

Một số chỉ tiêu chất lượng áp dụng trong nghiên cứu chế phẩm bột đông khô chứa probiotic .... Xuất phát từ các lí do trên, đề tài được thực hiện “Bước đầu tạo nguyên liệu p

CHỨA Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG NGỌC TUYẾT Mã sinh viên: 1901770

BƯỚC ĐẦU TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC DẠNG BỘT ĐÔNG KHÔ

CHỨA Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 ThS Lê Ngọc Khánh 2 ThS Kiều Thị Hồng

Nơi thực hiện:

Bộ môn Công nghệ sinh học Dược Khoa Công nghệ sinh học

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp “Bước đầu tạo nguyên liệu probiotic dạng bột đông khô

chứa Lactobacillus acidophilus” được thực hiện và hoàn thành tại Bộ môn Công nghệ

sinh học Dược – Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Dược Hà Nội

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân,

ThS Lê Ngọc Khánh và ThS Kiều Thị Hồng – người thầy, người cô đã trực tiếp

hướng dẫn chỉ bảo em tận tình, giúp em giải quyết các vấn đề gặp phải trong quá trình

nghiên cứu đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Khắc Tiệp, TS Trần Minh Đức, các chị kỹ thuật viên, bạn Nguyễn Hà Minh Đức, bạn Nguyễn Thị Hoài cùng các bạn

K74, các em khóa dưới nghiên cứu tại bộ môn Công nghệ sinh học Dược, đã giúp đỡ, đồng hành cùng em trong quá trình hoàn thiện khóa luận

Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu cùng toàn thể

các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền tải cho em những kiến thức

nền tảng, tạo điều kiện để em được học tập và nghiên cứu tại bộ môn

Lời cuối cùng, em xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, ủng hộ em trong quá trình học tập và cuộc sống

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Đặng Ngọc Tuyết

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Tổng quan về probiotic 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Công dụng và cơ chế tác dụng của probiotic 2

1.1.3 Vi sinh vật sử dụng để sản xuất probiotic 3

1.2 Tổng quan về Lactobacillus acidophillus 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và điều kiện nuôi cấy 4

1.2.2 Vai trò của Lactobacillus acidophillus với sức khỏe con người 5

1.3 Tổng quan về nguyên liệu probiotic dạng bột đông khô 6

1.3.1 Sơ lược về nguyên liệu probiotic dạng bột đông khô 6

1.3.2 Kỹ thuật đông khô tạo nguyên liệu probiotic 7

1.3.3 Ứng dụng của nguyên liệu bột đông khô chứa probiotic 10

1.3.4 Một số chỉ tiêu chất lượng áp dụng trong nghiên cứu chế phẩm bột đông khô chứa probiotic 11

1.3.5 Nghiên cứu trong nước và quốc tế về chế phẩm bột đông khô chứa probiotic 12

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 13

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất 13

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 13

2.1.3 Môi trường 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn dụng cụ, môi trường, hóa chất 14

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 15

2.3.3 Phương pháp đông khô tạo nguyên liệu bột chứa probiotic 15

2.3.4 Phương pháp mất khối lượng do làm khô xác định độ ẩm 16

2.3.5 Phương pháp pha loãng liên tục định lượng VSV trong chế phẩm 16

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Đánh giá cảm quan, thể chất và độ ẩm của bột đông khô chứa L

acidophilus 18

3.1.1 Sử dụng đơn lẻ một số chất bảo vệ lạnh 18

3.1.2 Phối hợp các chất bảo vệ lạnh 22

3.2 Đánh giá khả năng sống sót của vi sinh vật và độ ổn định của bột đông khô chứa L acidophilus: 26

3.2.1 Đánh giá khả năng sống sót của vi sinh vật: 26

3.2.2 Đánh giá độ ổn định 30

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

A Kết luận 34

B Đề xuất 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Chú giải Tiếng Anh Chú giải Tiếng Việt CFU Colony - Forming Units Số đơn vị khuẩn lạc

GRAS Generally recognized as safe Được công nhận chung là an toàn

L acidophilus Lactobacillus acidophilus

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tên các vi sinh vật dùng làm probiotic 4 Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 13 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 14 Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 3.1 Tên các mẫu sử dụng tá dược bảo vệ lạnh đơn lẻ ở các nồng độ

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá thể chất của các mẫu sử dụng tá dược bảo vệ

Bảng 3.3 Kết quả đo độ ẩm của các mẫu sử dụng tá dược bảo vệ lạnh đơn

Bảng 3.4 Tên các mẫu ứng với tá dược bảo vệ lạnh được sử dụng phối

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá thể chất của các mẫu ứng với tá dược bảo vệ

Bảng 3.6 Kết quả đo độ ẩm của các mẫu nguyên liệu bột sử dụng phối hợp

Bảng 3.7 Các mẫu được lựa chọn để đánh giá chỉ tiêu tỷ lệ vi sinh vật

Bảng 3.8 Kết quả số lượng vi sinh vật sống sót (log CFU/g) của các mẫu

nguyên liệu bột với các tá dược tương ứng (n = 3) 28

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược bảo vệ lạnh đến lượng

vi sinh vật sống sót (log CFU/g) theo thời gian 31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh thể hiện một số cơ chế tác dụng của probiotic 3

Hình 1.2 Hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) của

Lactobacillus acidophilus (độ phóng đại x 3000) 5

Hình 1.3 Hình ảnh biểu diễn giản đồ pha của nước 7

Hình 1.4 Hình ảnh thể hiện trạng thái của màng tế bào trong quá trình

đông khô khi sử dụng và không sử dụng chất bảo vệ lạnh 9

Hình 3.2 Hình ảnh các mẫu từ ĐL1* đến ĐL8* 21

Hình 3.4 Hình ảnh các mẫu từ PH1* đến PH8* 25

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tá dược bảo vệ lạnh đến độ ẩm

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tá dược bảo vệ lạnh đến tỷ lệ vi

Hình 3.7 Giai đoạn đông lạnh hình thành tinh thể băng gây chết vi sinh

Hình 3.8 Cơ chế thay thế lớp đệm nước trên màng tế bào vi sinh vật của

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tá dược bảo vệ lạnh đến độ ổn

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của Lactose và Saccarose 33

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, mối quan tâm của người tiêu dùng về các chế phẩm probiotic có xu hướng tăng mạnh bởi những hiệu quả mà nó mang lại Để đạt hiệu quả tốt, chế phẩm probiotic phải chứa lượng VSV sống đáng kể và duy trì cho đến thời điểm

lâm sàng, được coi là một trong những VSV tốt nhất để sản xuất chế phẩm probitic [32]

Lactobacillus acidophilus được sử dụng dưới nhiều dạng bào chế khác nhau như: viên

nén, viên nang, bột, hỗn dịch… đặc biệt các dạng bào chế rắn có tiềm năng rất lớn trong lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm chức năng Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm probiotic

dạng rắn chứa Lactobacillus acidophilus ở nước ta còn hạn chế, do chưa chủ động được nguồn nguyên liệu, hơn nữa tính nhạy cảm của Lactobacillus acidophilus cũng là một

thách thức lớn trong quá trình sản xuất, bảo quản và vận chuyển Để khắc phục vấn đề này, cần cải thiện chất lượng của nguyên liệu bột chứa VSV Đông khô là kỹ thuật khử nước được dùng để tạo dạng bột chứa VSV probiotic có tính ổn định cao và bảo quản được trong thời gian dài [38], [10] Tuy nhiên, trong quá trình đông khô, sự mất nước và nhiệt độ thấp có thể gây tổn thương màng tế bào dẫn đến giảm khả năng sống sót của VSV [10] Do đó, một số chất được gọi là chất bảo vệ lạnh đã được sử dụng để tăng khả năng sống sót của tế bào trong quá trình đông khô và trong thời gian bảo quản tiếp theo [41], [39]

Xuất phát từ các lí do trên, đề tài được thực hiện “Bước đầu tạo nguyên liệu

probiotic dạng bột đông khô chứa Lactobacillus acidophilus” với mục tiêu sau: Đánh

giá ảnh hưởng của tá dược bảo vệ lạnh đến chất lượng của bột đông khô chứa

Lactobacillus acidophilus

Trong một báo cáo vào tháng 10 năm 2001, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã đưa ra định nghĩa đầy đủ về probiotic và vẫn đang được sử dụng đến hiện nay: “probiotics là những vi sinh vật sống, khi được bổ sung một lượng vừa đủ sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” [35]

Định nghĩa về men vi sinh của FAO/WHO đặt ra hai thách thức đối với các nhà sản xuất chế phẩm sinh học: đầu tiên là cung cấp vi khuẩn còn sống tại thời điểm tiêu thụ, và thứ hai là đảm bảo rằng vi khuẩn có thể sống sót trong đường tiêu hóa với số lượng vừa đủ

1.1.2 Công dụng và cơ chế tác dụng của probiotic

Các chế phẩm probiotic ngày càng được sử dụng phổ biến, với những công dụng và lợi ích đã được ghi nhận Một trong những tác dụng đáng chú ý của probiotic là khả năng cân bằng hệ vi sinh đường ruột, từ đó mang lại nhiều lợi ích cho đường tiêu hóa như: giảm và kiểm soát tiêu chảy nhiễm trùng, tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, cải thiện khả năng dung nạp lactose… [40] Probiotic cũng đã được chứng minh có công dụng cải thiện hệ miễn dịch: giúp ổn định hàng rào niêm mạc ruột, phòng chống ung thư ruột kết và cải thiện, tăng cường chức năng miễn dịch… Ngoài ra, một số lợi ích khác của chế phẩm probiotic đáng kể đến như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn âm đạo, ngăn ngừa cholesterol máu cao, ngừa sâu răng [23]

Xem xét các tác dụng có lợi của men vi sinh trên đường tiêu hóa và miễn dịch, người ta đề xuất việc sử dụng chế phẩm sinh học cho bệnh nhân COVID-19 có thể giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và giảm nhiễm trùng thứ cấp [13], [22] COVID-19 là bệnh viêm phổi do virut Ở bệnh nhân COVID-19 nhận thấy có sự mất cân bằng vi khuẩn đường ruột, do đó chức năng đường tiêu hóa có thể bị ảnh hưởng [82] Probiotic có thể kích thích các phản ứng miễn dịch trong ruột khi nhiễm COVID-19, giúp loại bỏ

3 virut hoặc vô hiệu hóa sự tiến triển của bệnh [50] Hơn nữa, men vi sinh bám vào thành tế bào ruột giúp giảm nhiễm trùng SARS-CoV2, bao gồm cả sự phát triển của virut [13]

Các chế phẩm sinh học như Lactobacillus rhamnosus GG có thể giúp giảm nguy cơ mắc

COVID-19 thông qua việc cải thiện các chức năng hàng rào ruột bao gồm khả năng phòng vệ chống virut và giảm các cytokine gây viêm [17] Tuy nhiên, không phải tất cả các chế phẩm men vi sinh đều giống nhau, cần có nhiều nghiên cứu hơn để xem xét vai trò tiềm năng của men vi sinh trong việc ngăn ngừa COVID-19 [15]

Mặc dù cơ chế tác dụng của probiotics chưa được làm rõ, nhưng có một số cơ chế sau đây đã được đề xuất [6]

Hình 1.1 Hình ảnh thể hiện một số cơ chế tác dụng của probiotic [6]

1.1.3 Vi sinh vật sử dụng để sản xuất probiotic

Để sản xuất probiotic vi sinh vật phải đáp ứng các tiêu chuẩn sau [14]: - Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng (chủng phải được lưu giữ tại ngân hàng giống

quốc tế) - Không gây bệnh, không sinh độc tố (thuộc nhóm GRAS an toàn và lành tính,

không liên quan đến bệnh tật, không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được)

- Có đặc tính probiotic, sinh sản phẩm với hiệu suất cao (có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa, có khả năng phát triển trong đường ruột, có hiệu quả có lợi và đáng tin cậy được chứng minh khoa học)

- Dễ nuôi cấy

4 - Ổn định trong bảo quản và dễ bảo quản: có khả năng tồn tại độc lập trong thời

gian dài và tỷ lệ sống sót cao trong thời gian bảo quản Hiện nay các chủng probiotic được sử dụng phổ biến là các vi khuẩn thuộc chi

Lactobacillus, Bacillus, Bifidobacterium và nấm men [46], cụ thể gồm:

Bảng 1.1 Tên các vi sinh vật dùng làm probiotic [46]

1.2 Tổng quan về Lactobacillus acidophillus

1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và điều kiện nuôi cấy

Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập từ đường tiêu hóa của con

người vào năm 1900 bởi Ernst Moro với tên ban đầu là Bacillus acidophilus Sau đó,

chúng được tìm thấy phổ biến nhất ở người, đặc biệt là đường tiêu hóa, khoang miệng và âm đạo, cũng như các loại thực phẩm lên men khác nhau như sữa hoặc sữa chua lên men [7]

Phân loại:

- Ngành: Fermicutes - Lớp: Bacilli

- Bộ: Lactobacillales - Họ: Lactobacillaceae - Chi: Lactobacillus - Loài: Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus spp acidophilus, plantarum, rhamnosus, reuteri, casei,…

Bifidobacterium spp bifidum, longum, animalis, infantis,…

Bacillus spp coagulans, cereus,…

Streptococus spp thermophilus

Enterococus spp feacalis

Saccharomyces spp cerevisiae

5

Hình 1.2 Hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) của Lactobacillus

acidophilus (độ phóng đại x 3000) [66]

Đặc điểm hình thái: vi khuẩn Gram dương hình que, không sinh bào tử với các đầu tròn, kích thước 0,6-0,9 x 1,5–6 µm, đứng đơn lẻ, theo cặp hoặc thành chuỗi ngắn Khuẩn lạc thường nhỏ (2–5 mm) với rìa rõ ràng, lồi, nhẵn, sáng lấp lánh và mờ đục [7]

Đặc điểm sinh lý và điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ tối ưu là 37 - 42℃, lên tới 45℃ vi khuẩn vẫn có thể phát triển pH tối ưu trong khoảng 5,5 - 6,0 và ngừng phát triển khi pH < 4,0 Môi trường thích hợp là môi trường vi hiếu khí tiêu chuẩn chứa 5% CO2, 10%

hydro và 85% nitơ Trong quá trình sinh trưởng phát triển, L.acidophilus có khả năng

tạo ra nhiều hợp chất kháng khuẩn, bao gồm: axit lactic (> 85%), hydrogen peroxid và một số bacteriocin [62], [7]

Tuy nhiên, L acidophilus không thể tự tổng hợp hầu hết các acid amin, và

vitamin, do đó môi trường nuôi cấy phải giàu dinh dưỡng, chứa acid amin và vitamin (pepton, trypton, cao nấm men, cao thịt), natri acetat, muối magie để kích thích sự phát triển của vi khuẩn Nhân giống hoặc lên men thu sinh khối trong thời gian khoảng 24 giờ vì đây là lúc vi khuẩn đang ở pha sinh trưởng và phát triển nhất [7]

1.2.2 Vai trò của Lactobacillus acidophillus với sức khỏe con người

So với nhiều chế phẩm sinh học khác, L acidophilus có khả năng kháng axit và

muối mật tốt hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển trong đường

tiêu hóa Bởi vậy, L acidophilus được coi là một trong những vi sinh vật được khuyên

dùng phổ biến nhất để bổ sung vào chế độ ăn uống [71] với nhiều tác dụng như:

Giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch: Tăng cholesterol máu là một yếu tố nguy cơ

ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh tim mạch Có báo cáo cho rằng việc bổ sung L

acidophilus vào thức ăn trẻ em làm giảm cholesterol huyết thanh ở trẻ sơ sinh vào ngày

6 can thiệp thứ 8 [34] Tuy nhiên, ở những mô hình nghiên cứu khác nhau đã cho các kết

quả khác nhau, cần phải nghiên cứu chi tiết hơn về công dụng này của L acidophilus

Cải thiện bệnh đường tiêu hóa: L acidophilus có khả năng chống viêm mạnh mẽ,

ức chế sự phát triển của các mầm bệnh đường tiêu hóa như Salmonella

enteritidis, Staphylococcus aureus và Shigella dysenteriae [83], làm giảm sự chuyển

hóa tạo các chất độc hại như dimethylamine và nitrosodimethylamine trong máu [24]

Cải thiện tình trạng không dung nạp Lactose: Tình trạng cơ thể con người không

sản xuất ra enzyme lactase để tiêu hóa lactose trong sữa hoặc các sản phẩm từ sữa, khiến một số người có thể bị tiêu chảy và các triệu chứng khó chịu ở đường ruột khác do tác dụng thẩm thấu của đường lactose không bị phân hủy Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra

rằng Lactobacillus NCFM có thể cải thiện quá trình tiêu hóa lactose và làm giảm các

triệu chứng không dung nạp lactose như đầy hơi và tiêu chảy [43], [52]

Phòng ngừa và điều trị ung thư: Probiotic có thể ngăn ngừa hoặc điều trị nhiều

loại bệnh ung thư, bao gồm ung thư ruột kết và gan Việc tiêu thụ sữa có chứa L NCFM

hàng ngày làm giảm hoạt động của ba enzyme trong phân này từ hai đến bốn lần và giảm tỷ lệ mắc bệnh ung thư ruột kết [30], [31] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số

polysaccharide do L acidophilus tổng hợp đã mang lại lợi ích cho sức khỏe bằng cách

kích thích phản ứng miễn dịch chống lại các tế bào khối u [26]

Điều hòa khả năng miễn dịch: L acidophilus điều hòa hệ thống miễn dịch của cơ

thể bằng cách hạn chế sự xâm nhập của mầm bệnh trong cơ thể và kiểm soát các rối loạn chuyển hóa và viêm ruột [75]

Ngoài ra, một số tác dụng đáng chú ý của L acidophilus đang trong quá trình

nghiên cứu chứng minh như: ngăn ngừa bệnh mạch vành, hỗ trợ điều trị ở phụ nữ bị viêm âm đạo do vi khuẩn… [28]

1.3 Tổng quan về nguyên liệu probiotic dạng bột đông khô 1.3.1 Sơ lược về nguyên liệu probiotic dạng bột đông khô

Nguyên liệu bột chứa probiotic là dạng bột được tạo thành bằng cách làm khô hỗn hợp đồng nhất của vi sinh vật và tá dược thích hợp Bột khô nhẹ, dễ xử lý, độ ổn định cao, cần ít không gian để lưu trữ, dễ vận chuyển và chi phí vận chuyển rẻ, mang lại lợi thế trong ứng dụng quy mô công nghiệp và giao dịch đường dài [27]

Nhược điểm của dạng bào chế bột là độ ổn định của chế phẩm phụ thuộc vào điều kiện môi trường như: độ ẩm, pH, hoạt độ nước và oxy,… gây ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tồn tại của men vi sinh [12], [80]

7

1.3.2 Kỹ thuật đông khô tạo nguyên liệu probiotic 1.3.2.1 Các giai đoạn của quá trình đông khô

Đông khô là phương pháp loại bỏ nước khỏi vật liệu đông lạnh thông qua quá

3 giai đoạn

Giai đoạn 1: đông lạnh - một trong những giai đoạn quan trọng nhất của quá trình đông khô: Mẫu được đông lạnh ở nhiệt độ từ -80⁰C đến -60⁰C trong tủ đông 24 giờ (tốc độ được kiểm soát) [11] Nước tự do trong chế phẩm chuyển từ thể lỏng sang thể rắn (hình 1.3) Giai đoạn này ngoài mục đích chuẩn bị cho quá trình thăng hoa ở giai đoạn tiếp theo, còn có vai trò cố định các thành phần, hạn chế những thay đổi về mặt hóa học, sinh hóa và vi sinh diễn ra trong nguyên liệu [59] Cần kiểm soát tốc độ đông lạnh bởi quá trình hình thành tinh thể băng sẽ quyết định trạng thái vật lý, tính chất của sản phẩm đông khô [59], [36]

Hình 1.3 Hình ảnh biểu diễn giản đồ pha của nước [78]

Giai đoạn 2: Sấy sơ cấp – thăng hoa: Đưa mẫu vào thiết bị đông khô, cài đặt nhiệt

độ và áp suất thích hợp Thông số: nhiệt độ – 50⁰C , áp suất 0.2 atm, sấy sơ cấp trong 24 giờ Quá trình thăng hoa diễn ra từ bề mặt sản phẩm khi giảm áp suất trong máy đông khô, nước tự do chuyển pha từ thể rắn sang thể hơi (hình 1.3) Kết thúc quá trình, khoảng 80% - 95% nước được loại ra khỏi sản phẩm [59], [10]

Giai đoạn 3: Sấy thứ cấp – giải hấp: Diễn ra dưới áp suất giảm đồng thời tăng

nhiệt độ sản phẩm đến khi đạt hàm lượng nước mong muốn, thường kéo dài từ 1-2 giờ

Ngoài lượng nước tự do, trong chế phẩm còn chứa nước dạng liên kết với các lực tương tác khác nhau, lượng nước này không bị đóng băng nên chưa được loại đi ở giai đoạn

8 sấy sơ cấp, có thể ảnh hưởng đến độ ổn định khi bảo quản [74].Cần có giai đoạn giải

hấp loại bỏ lượng nước liên kết để đạt đến độ ẩm thích hợp

1.3.2.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp đông khô trong việc tạo nguyên liệu bột chứa probiotic

Phương pháp đông khô là phương pháp được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất để ổn định các chế phẩm sinh học và dược phẩm như protein, vắc xin, vi sinh vật… do mang lại nhiều ưu điểm Chế phẩm đông khô cải thiện độ ổn định:nước đóng băng trong vật liệu trước khi đông khô sẽ ức chế các quá trình hóa học, sinh hóa và vi sinh, bảo

So với các phương pháp tách nước sử dụng nhiệt độ có thể làm chết vi sinh vật, đông khô phù hợp với những chế phẩm nhạy cảm với ẩm và nhiệt như men vi sinh, giúp duy

đông khô giúp tối ưu hóa quá trình vận chuyển, linh hoạt trong việc phối hợp công thức

Một số nhược điểm của quá trình đông khô như: thời gian dài, chi phí cao, tế bào vi sinh vật phải đối mặt với các điều kiện khắc nghiệt như áp suất và nhiệt độ thấp trong thời gian dài [70], [16], sự hình thành tinh thể băng và mất nước có thể ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của màng tế bào, gây biến tính protein [19], [33], dẫn đến chết tế bào [47], mất hoạt tính của chế phẩm probiotic.Do đó, điều quan trọng là giảm tổn thương tế bào và duy trì khả năng sống cũng như chức năng của tế bào Việc bổ sung các chất bảo vệ

nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi thêm chất bảo vệ lạnh vào nguyên liệu có thể làm tăng đáng kể khả năng sống sót của vi sinh vật sau khi đông khô [47]

1.3.2.3 Chất bảo vệ lạnh sử dụng trong quá trình đông khô

Chất bảo vệ lạnh – Cryoprotectant (CPA) là các chất được thêm vào nguyện liệu đông khô có tác dụng bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô, đảm bảo chế phẩm đạt yêu cầu về hàm lượng vi sinh vật

Các chất bảo vệ lạnh khác nhau đem lại hiệu quả bảo vệ khác nhau với một số cơ chế bảo vệ đã được biết đến như:

Thay thế nước trong lớp màng kép: Các phân tử nước đóng vai trò chất đệm giữa

các phân tử phospholipid giúp duy trì trạng thái tự nhiên của màng sinh học Trong quá trình đông khô loại nước, làm mất lớp đệm này khiến các phân tử phospholipid xếp sát lại (Hình 1.4), các gốc acyl tương tác với nhau làm gia tăng lực van-der-Waals, kết quả là cấu trúc màng tế bào trở nên không đồng nhất [10] Khi bù nước cho chế phẩm, màng tế bào xảy ra hiện tượng co kéo màng do chuyển pha cục bộ: phần màng không có đệm

9 nước chuyển sang pha gel đặc và co lại, phần màng có đệm nước chuyển thành pha lỏng, làm mất tính toàn vẹn của màng, gây chết tế bào [69]

Khi thêm các chất bảo vệ, nhóm hydroxyl của chúng thông qua liên kết Hydro gắn với phospholipid, đóng vai trò chất đệm thay thế các phân tử nước trong quá trình đông khô [9] (Hình 1.4) Theo cách tương tự, protein của tế bào cũng được ổn định và ngăn ngừa khỏi bị biến tính bằng cách hình thành liên kết hydro-đường-protein, giúp duy trì cấu trúc protein bậc ba khi không có nước [53]

Hình 1.4 Hình ảnh thể hiện trạng thái của màng tế bào trong quá trình đông khô khi sử

dụng và không sử dụng chất bảo vệ lạnh [10]

Làm giảm nhiệt độ chuyển pha của màng tế bào (Tm): Một đặc tính đặc trưng

của màng tế bào là nhiệt độ chuyển pha màng (Tm), dưới Tm màng chuyển sang trạng thái gel Quá trình đông khô gây mất nước, làm tăng Tm của màng tế bào Việc bổ sung chất bảo vệ có thể tránh được sự gia tăng Tm, do đó giảm được hiện tượng co kéo gây tổn thương màng tế bào theo cơ chế tương tự như trên [10]

Tạo mạng lưới thủy tinh hóa: Trong giai đoạn đông lạnh, tinh thể băng tạo thành có thể đâm xuyên gây tổn thương màng tế bào, làm giảm khả năng sống sót của vi sinh vật [57] Các chất bảo vệ có khả năng thủy tinh hóa như carbohydrate, protein và polyme

loại bỏ nước và ở nhiệt độ nhất định (gọi là nhiệt độ chuyển thủy tinh), các chất bảo vệ sẽ chuyển sang trạng thái thủy tinh – chất rắn vô định hình có độ nhớt rất cao bao xung

lý và hóa học không mong muốn đối với vi sinh vật, tăng khả năng sống sót của vi sinh

vật sau đông khô [54], [56]

10 Một số chất bảo vệ lạnh được sử dụng trong quá trình đông khô probiotic bao gồm: các chất đường, axit amin, sữa gầy, peptid, protein, polymer… Trong đó, các chất bảo vệ lạnh phổ biến nhất là các loại đường như: disaccharid (saccarose, lactose, trehalose), polyols (mannitol, sorbitol) và polysaccharid (maltodextrin, dextran, inulin, tinh bột…) Đường disacarit và đường oligosaccharid được ưa thích được sử dụng trong quá trình đông khô vì chúng có khả năng thủy tinh hóa tốt, cấu trúc phân tử nhỏ có thể dễ dàng thay thế các phân tử nước trong màng kép [10]

Sữa gầy cũng là một chất bảo vệ lạnh đáng chú ý Sữa gầy (skim milk) là sữa đã được loại bỏ một số axit béo, các chất còn lại chủ yếu là protein và lactose Protein và lactose là những thành phần có khả năng thủy tinh hóa tốt, ngoài ra, lactose còn giúp tăng cường khả năng bảo vệ lạnh thông qua cơ chế tạo liên kết hydro với màng tế bào Một cơ chế bảo vệ lạnh khác của sữa gầy được đề xuất là cung cấp chất đệm như muối phosphat, muối citrat… tan được trong nước giúp ổn định pH trong quá trình đông khô

[67], [39]

1.3.3 Ứng dụng của nguyên liệu bột đông khô chứa probiotic

Nguyên liệu bột đông khô chứa probiotic có thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như: có thể dử dụng trực tiếp bằng cách pha với nước uống hoặc trộn với một số thực phẩm ăn hàng ngày như cháo, sữa, ngũ cốc, nước trái cây… [68] với nhiệt độ không quá 40 ⁰ C tránh làm chết vi sinh vật Trong lĩnh vực bào chế, bột đông khô chứa probiotic còn dùng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm probiotic với dạng bào chế khác như: viên nén, viên nang, cốm…

1.3.3.1 Bột, cốm

Đa phần các chế phẩm sinh học có trên thị trường đều được bào chế ở dạng bột hoặc hạt Dạng bào chế này có khả năng cung cấp một lượng lớn men vi sinh, phân tán nhanh và chi phí thấp Các hạt tạo cốm (vi nang) có thể được phủ bằng nhiều loại polyme khác nhau để tăng cường tính ổn định của vi sinh vật nhạy cảm với axit hoặc để kiểm soát tốc độ giải phóng của men vi sinh [12]

1.3.3.2 Viên nang và viên nén

Viên nang chứa probiotics là dạng bào chế rắn có vỏ cứng hoặc mềm, hoặc vỏ làm bằng các loại gelatin thích hợp Dạng bào chế này cho phép phối hợp nhiều loại tá dược giúp duy trì tính chất sinh lý của probiotics, tăng khả năng bảo vệ vi khuẩn khỏi môi trường axit của dạ dày, muối mật và kiểm soát việc giải phóng vi sinh vật tại vị trí mong muốn [37], [81]

Viên nén chứa probiotics là một dạng bào chế rắn có nhiều ưu điểm như: quy trình sản xuất đơn giản, chi phí sản xuất thấp [72] Mặc dù viên nén không phải là dạng

11 bào chế được ưu tiên sử dụng trong các chế phẩm probiotic nhưng các đặc tính của viên nén khiến chúng trở thành một hướng quan trọng để phát triển thuốc probiotic

Sử dụng nguyên liệu bột đông khô chứa probiotic để sản xuất chế phẩm dạng viên nén/viên nang giúp giảm thiểu các tác động của quá trình bào chế viên lên VSV, giúp tăng lượng VSV sống sót trong chế phẩm cuối cùng và tránh nhiễm chéo trong quá trình sản xuất [81] Ngoài ra, một số tá dược bảo vệ lạnh được phối hợp trong nguyên liệu bột đông khô còn có vai trò là tá dược dính, tá dược trơn chảy, điều vị… giúp cải thiện chất lượng viên [79]

1.3.3.3 Dạng lỏng

Chế phẩm probiotic dạng lỏng trên thị trường hiện rất đa dạng tùy theo nhu cầu của người tiêu dùng, với các sản phẩm như sữa không lên men, nước ép trái cây và một số sản phẩm làm từ ngũ cốc… [65] Thách thức lớn nhất khi xây dựng công thức sản phẩm là sự ảnh hưởng của men vi sinh đến các đặc tính lưu biến và cảm quan của sữa như độ axit, độ nhớt và hương vị trong thời gian bảo quản [81]

1.3.4 Một số chỉ tiêu chất lượng áp dụng trong nghiên cứu chế phẩm bột đông khô chứa probiotic

Các chỉ tiêu chất lượng được đánh giá dựa trên yêu cầu chung của Dược điển Việt Nam V về chế phẩm probiotic

1.3.4.1 Hình thức, cảm quan

Yêu cầu thành phẩm có màu sắc đồng nhất, màu trắng, trắng xám hoặc vàng xám [3]

1.3.4.2 Độ ẩm

Chế phẩm đông khô chứa probiotic ở dạng bất hoạt, độ ẩm lớn có thể làm vi sinh vật chuyển sang trạng thái hoạt động, kích hoạt quá trình phát triển sinh trưởng và suy thoái, gây chết sớm vi sinh vật, ảnh hưởng đến sự ổn định, hạn dùng của chế phẩm [73], [85] Do đó, độ ẩm càng lớn chế phẩm càng kém ổn định, làm giảm lượng vi sinh vật sống sót trong thời gian bảo quản Dược điển Việt Nam V yêu cầu độ ẩm của chế phẩm probiotic không được quá 5.0 % [3]

1.3.4.3 Khả năng sống sót của vi sinh vật

Lượng vi sinh vật trong chế phẩm probiotic bị giảm khi đi qua đường tiêu hóa do phải chịu tác động của các điều kiện bất lợi trong môi trường tiêu hóa Vì vậy, để nồng độ vi sinh vật trong ruột đạt giá trị mang lại hiệu quả (≥ 106 CFU/g), các sản phẩm probiotic được khuyến cáo phải đạt tối thiểu 108 – 109 CFU/g [55], [8]

12

1.3.5 Nghiên cứu trong nước và quốc tế về chế phẩm bột đông khô chứa probiotic

Trên thế giới, các nghiên cứu về chế phẩm bột đông khô chứa probiotic đa số tập trung vào việc cải thiện khả năng sống sót của vi sinh vật thông qua đánh giá các chất bảo vệ và tối ưu hóa quy trình đông khô

Năm 2012, Zhen và các cộng sự đã khảo sát ảnh hưởng của sucrose, lactose,

glucose, maltose đến khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình

đông khô ở các nồng độ 3%, 6%, 9%, 12% và 15% Kết quả cho thấy chất bảo vệ là

Năm 2013, Nghiên cứu của Shu và các cộng sự đã cho thấy sự ảnh hưởng khác nhau của trehalose, tinh bột, raffinose và galactose đến khả năng sống sót

của Lactobacillus acidophilus với các nồng độ lần lượt là 3%, 6%, 9%, 12% và 15%

Kết quả: nồng độ trehalose, tinh bột hòa tan, raffinose và galactose tối ưu là 12%, 9%,

Năm 2011, khóa luận của tác giả Nguyễn Thị Thu Hà qua khảo sát một số chất bảo vệ lạnh đã thu được kết quả sử dụng sữa gầy và avicel ở tỷ lệ 3:7 cho tỷ lệ

Lactobacillus acidophilus sống sót cao nhất [1]

Năm 2015, tác giả Nguyễn Thị Mai Hương khảo sát ảnh hưởng của sữa gầy đến

khả năng sống sót của Saccharomyces Boulardii đã cho thấy sữa gầy ở nồng độ 10%

cho kết quả bảo vệ tốt nhất với tỷ lệ sống sót sau đông khô đạt 37,68% [2]

Năm 2015, luận văn thạc sĩ của tác giả Trần Văn Thái đã đề cập đến vấn đề ảnh hưởng của một số chất bảo vệ: sữa gầy, tinh bột và alginat đến độ ổn định của nguyên

liệu đông khô dạng bột chứa Lactobacillus acidophilus, cho kết quả mẫu sử dụng aginat

phối hợp sữa gầy cho lượng VSV sống sót cao nhất [4]

Có thể thấy chế phẩm bột đông khô chứa probiotic hiện nay ở nước ta là một chế phẩm có nhiều tiềm năng trong việc nghiên cứu phát triển và ứng dụng

13

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất

- Nguyên liệu: Lactobacillus acidophilus dạng bột đông khô cung cấp bởi công ty

Han Wha Pharma, lô 220310, NSX 03/05/2022 với số lượng VSV ghi trên nhãn là 108 log CFU/g

- Hóa chất:

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Nguyên liệu Nhà sản xuất Tiêu chuẩn

CH3COONa.3H2O Trung Quốc TKHH Triamoni citrate Trung Quốc TKHH

MgSO4.7H2O Trung Quốc TKHH MnSO4.4H2O Trung Quốc TKHH

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - Thiết bị:

14

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Nguồn gốc Tên thiết bị Nguồn gốc Cân kỹ thuật Đức (Sartorius) Tủ sấy Đức (Memmert) Cân phân tích Đức (Sartorius) Máy Votex Nhật (Nikon) Nồi hấp tiệt trùng Nhật (ALP) Kính hiển vi Nhật (Nikon)

Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo) Tủ đông sâu – 80 ⁰ C Hàn Quốc (LG) Máy ly tâm Đức (Sigma) Máy đông khô Đức (Christ alpha)

- Dụng cụ: các dụng cụ sử thường quy trong phòng thí nghiệm vi sinh 2.1.3 Môi trường

Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường MRS lỏng

Triamoni citrate 2g Nước cất vừa đủ 1000ml

Môi trường MRS thạch MRS lỏng + Thạch agar (20g/1000ml)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá ảnh hưởng của một số tá dược bảo vệ lạnh đến chất lượng của nguyên

liệu bột đông khô chứa L acidophilus:

- Đánh giá cảm quan, thể chất và độ ẩm của bột đông khô chứa L acidophilus

- Đánh giá tỷ lệ VSV sống sót và độ ổn định của bột đông khô chứa L acidophilus.

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn dụng cụ, môi trường, hóa chất

Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm: sử dụng cho tiệt khuẩn dụng cụ và chất lỏng Dụng cụ (ví dụ: đĩa petri, pipet,…) được gói kín trong giấy bạc hoặc giấy báo Chất lỏng được đựng trong ống nghiệm có nắp kín hoặc bình nón đậy kín bằng nút bông

15 Tiến hành tiệt khuẩn bằng nồi hấp với tác nhân tiệt khuẩn là hơi nước bão hòa dưới áp suất cao Thông số kỹ thuật: nhiệt độ 115°C trong tối thiểu 15 phút [3]

Phương pháp tiệt khuẩn bằng UV: Dùng tia UV có bước sóng 254 nm để tiệt khuẩn tủ cấy trong 15 phút, tạo môi trường vô khuẩn khi thực hiện các thí nghiệm [3]

Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall: Tiệt khuẩn Tyndall (tiệt khuẩn gián đoạn) được sử dụng trong tiệt khuẩn các hóa chất dễ bị biến đổi như tinh bột bị hồ hóa khi tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm Tá dược được đựng trong bình nón, đậy kín bằng nút bông không thấm nước Đun cách thủy bình nón ở nhiệt độ 80oC trong vòng 1 giờ sau đó đưa bình vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ Lặp lại quy trình trên trong 3 ngày liên tiếp [3]

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

Nuôi cấy VSV: Cân, đong các thành phần trong công thức (mục 2.1.3) vừa đủ 200ml MRS lỏng vào bình nón đậy nút bông kín Sau đó, tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ở 121oC trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Môi trường sau tiệt khuẩn để nguội đến nhiệt độ 37 - 40oC Phối hợp gói giống vào môi trường trên, ủ bình nón trong tủ ấm 5% CO2 ở nhiệt độ 37 oC trong 48 giờ

Thu sinh khối tế bào: lấy 33ml hỗn dịch ly tâm ở điều kiện 4000 vòng/phút trong 10 phút, gạn bỏ phần dịch trong, thu sinh khối tế bào

Rửa sinh khối: thêm 5ml nước cất đã hấp tiệt khuẩn, vortex kĩ khoảng 30 giây, sau đó ly tâm bỏ dịch Lặp lại thao tác lần 2

Tất cả thao tác trên đều được tiến hành trong tủ cấy vô trùng

2.3.3 Phương pháp đông khô tạo nguyên liệu bột chứa probiotic

Nguyên liệu bột đông khô chứa probiotic được tạo gồm 2 thành phần: sinh khối VSV và tá dược bảo vệ lạnh Các bước tiến hành như sau:

- Chuẩn bị sinh khối VSV: Nuôi cấy VSV, thu sinh khối theo mục 2.3.2 - Chuẩn bị tá dược bảo vệ lạnh: cân tá dược theo tỷ lệ nghiên cứu vào ống nghiệm

đáy bằng có nắp, thêm 5ml nước cất, lắc đến khi tan hết, tiệt khuẩn bằng phương pháp thích hợp (mục 2.3.1)

- Phối hợp tá dược bảo vệ lạnh và VSV: vortex kĩ tối thiểu 60s, đổ ra đĩa petri - Kỹ thuật đông khô tạo bột chứa probiotic:

+ Tiền đông: mẫu đã tạo được đặt trong tủ đông sâu -80 ⁰ C trong 24 giờ + Đông khô: Các mẫu sau tiền đông được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô ở -50oC, áp suất 0,100 mbar trong 24 giờ

+ Kết thúc quá trình đông khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, bảo quản ở nhiệt độ khoảng 2 – 8oC

16

2.3.4 Phương pháp mất khối lượng do làm khô xác định độ ẩm

Nguyên tắc: mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng cùa mẫu thừ biểu

thị bằng phần trăm (khối lượng/khối lượng) khi được làm khô [49]

Tiến hành: lấy tối thiểu 0,6g mẫu đã tạo cho vào máy đo độ ẩm, sau khoảng 3 phút, ghi kết quả độ ẩm hiển thị

2.3.5 Phương pháp pha loãng liên tục định lượng VSV trong chế phẩm - Chuẩn bị:

Môi trường MRS thạch: Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS thạch (mục 2.1.3) vào bình nón, thêm nước cất vừa đủ, lắc đến tan hết các thành phần hòa tan, đậy kín bằng nút bông không thấm nước Tiến hành tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm (mục 2.3.1), kết thúc quá trình lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường lên các đĩa petri (đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô) sao cho bề mặt thạch phẳng, nhẵn, bề dày lớp thạch khoảng 2 mm Chờ cho môi trường nguội và đông rắn lại, đậy kín đĩa petri Có thể bảo quản đĩa thạch ở nhiệt độ 0-5°C

Môi trường pha loãng: Chuẩn bị lượng ống nghiệm có nắp tương ứng với nồng độ pha loãng đã được tính toán trước Cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, đậy nắp kín, hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút

Dụng cụ thí nghiệm: ống eppendorf, đĩa petri, đầu côn đem hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút, sau đó sấy khô trong tủ sấy vô khuẩn

- Nguyên tắc phương pháp pha loãng liên tục:

Theo Phụ lục 1.26 Dược điển Việt Nam V, để xác định số lượng VSV sống trong các chế phẩm probiotic (chủ yếu dưới dạng bột, cốm, viên nén) người ta sử dụng phương pháp pha loãng liên tục rồi cấy trộn hoặc cấy trải bề mặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp [49]

Lấy chính xác một lượng chế phẩm (mcân khoảng vài gam) cho vào ống Eppendorf, thêm 1ml nước cất đã hấp tiệt khuẩn, vortex kĩ cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất Chuyển dung dịch trong ống eppendorf vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã chuẩn bị, vortex đến khi dung dịch đồng nhất

Hút chính xác 1ml từ ống nghiệm này sang ống nghiệm thứ 2 chứa 9ml nước cất đã chuẩn bị, vortex đều thu được nồng độ pha loãng 10-1 Tiếp tục pha loãng như vậy cho tới nồng độ pha loãng cuối cùng phù hợp 10-n Hút chính xác 10 µl dịch tại 3 nồng độ cuối cùng cấy lên đĩa petri có môi trường MRS thạch theo phương pháp cấy chảy dòng Đặt đĩa petri vào tủ ấm 37°C, 5% CO2, sau 48 giờ tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa Mỗi thí nghiệm tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình