bùi minh nam khảo sát một số điều kiện tách chiết protease từ tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng

Độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính khi tách chiết enzym bằng các ATPS khác nhau từ dịch enzym sau kết tủa A và dịch tụy ban đầu B .... Đặc điểm của một số loại endopeptidase [40

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI MINH NAM KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT PROTEASE TỪ TỤY LỢN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT

2 PHA LỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI MINH NAM

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin được gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo của Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã luôn tâm huyết giảng dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian năm năm học tập và rèn luyện tại trường Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Hóa Sinh – khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập, nghiên cứu

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Ths Mai Văn Hiên, là người giảng viên hướng dẫn đầy nhiệt huyết, đã định hướng ý tưởng nghiên

cứu, tận tình bổ sung cho em những kiến thức chuyên môn cần thiết và tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tại bộ môn Hóa Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Đào Thị Mai Anh, Ths Vũ Thị Phượng, giảng

viên tại bộ môn Hóa Sinh đã sẵn sàng giúp đỡ, đưa cho em những lời khuyên về chuyên môn và kinh nghiệm quý báu để hoàn thành tốt khóa luận

Thêm vào đó, sự đồng hành của em Thu, em Trâm Anh, em Quỳnh và toàn thể nhóm nghiên cứu enzym là sự động viên vô cùng to lớn đối với em Cảm ơn các em đã luôn sẵn sàng giúp đỡ để em có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới ba mẹ, người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực cho em trên con đường học tập và rèn luyện bản thân

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 1 tháng 6 năm 2024

Sinh viên

Bùi Minh Nam

1.3.2 Cơ chế hoạt hóa và xúc tác của enzym 10

1.3.2.1 Cơ chế hoạt hóa 10

1.3.2.2 Cơ chế xúc tác 11

1.3.3 Ứng dụng 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Hóa chất 15

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 16

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3.1 Chiết tách protease từ tụy lợn 18

2.3.1.1 Chiết lấy dịch tụy đồng nhất 18

2.3.1.2 Tách chiết bằng phương pháp kết tủa 18

3.1.1 Đánh giá hiệu quả tách chiết của ATPS 24

3.1.1.1 Chiết lấy dịch tụy đồng nhất 24

3.1.1.2 Tách chiết protease qua một bước kết tủa 24

3.1.1.3 Tách chiết protease qua hai bước kết tủa và ATPS 25

3.1.1.4 Tách chiết protease qua một bước ATPS 25

3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả tách chiết bằng ATPS 27

3.1.2.1 Thay đổi các thành phần của ATPS 27

3.1.2.2 Thay đổi tỷ lệ các thành phần của ATPS 30

3.1.2.3 Thay đổi pH của ATPS 31

3.2 BÀN LUẬN 32

3.2.1 Về kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết của ATPS 32

3.2.1.1 Về kết quả tách chiết protease qua một bước kết tủa 32

3.2.1.2 Về kết quả tách chiết protease qua hai bước kết tủa và ATPS 33

3.2.1.3 Về kết quả tách chiết protease qua một bước ATPS 33

3.2.2 Về kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình tách chiết bằng ATPS 36

3.2.2.1 Về kết quả đánh giá ảnh hưởng của thành phần hai pha 36

3.2.2.2 Về kết quả đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ hai pha 37

3.2.2.3 Về kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH 38

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

4.1 KẾT LUẬN 39

4.2 ĐỀ XUẤT 39TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

APS Ammonium persulphate ATPS Aqueous two-phase system Hệ thống hai pha lỏng

Bis-acrylamid N, N’-Methylen-bis-acrylamid

FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm và

Dược phẩm Hoa Kỳ

mg pr Miligram protein NaPA Natri polyacrylat PAGE Polyacrylamid gel electrophoresis PEG Polyethylene glycol

SDS Sodium dodecyl sulfat TCA Tricloacetic acid TEMED N,N,N’,N’-

Tetramethylethylenediamin TTP Three-phase partitioning Phân vùng ba pha Tris Tris –(hydroxymethyl)-aminomethan

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm của một số loại endopeptidase 4

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu tách chiết protease bằng ATPS 8

Bảng 1.3 Tính chất hóa lý của protease tụy 10

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu tách chiết protease từ tuyến tụy 13

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 15

Bảng 2.2 Thành phần các loại đệm và dung dịch 16

Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng 16

Bảng 2.4 Thành phần gel tách và gel gom trong điện di SDS-PAGE 22

Bảng 3.1 Kết quả tách chiết protease qua một bước kết tủa 24

Bảng 3.2 Kết quả tách chiết enzym qua hai bước kết tủa và ATPS 25

Bảng 3.3 Kết quả tách chiết enzym qua một bước ATPS 26

Bảng 3.4 Kết quả tách chiết enzym bằng ATPS từ dịch tụy ban đầu và dịch enzym thô sau kết tủa 28

Bảng 3.5 Kết quả tách chiết enzym với hệ PEG6000/Natri citrat với các tỷ lệ hai pha khác nhau 30

Bảng 3.6 Kết quả tách chiết enzym với hệ PEG6000/Natri citrat với các pH khác nhau 31

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc hai thùng beta của trypsin 9

Hình 1.2 Tính đặc hiệu của túi S1 của trypsin, chymotrypsin và elastase 10

Hình 1.3 Sơ đồ thể hiện quá trình hoạt hóa trypsin bởi enterokinase 11

Hình 1.4 Sơ đồ thể hiện quá trình hoạt hóa tiền enzym các protease tụy 11

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu 17

Hình 2.2 Quy trình tách chiết protease từ tụy lợn 18

Hình 2.3 Đường chuẩn Tyrosin 20

Hình 2.4 Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn 21

Hình 3.1 Điện di đồ quá trình tách chiết protease từ tụy lợn bằng SDS-PAGE 27

Hình 3.2 Độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính khi tách chiết enzym bằng các ATPS khác nhau từ dịch enzym sau kết tủa (A) và dịch tụy ban đầu (B) 29

Hình 3.3 Sự thay đổi của độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính khi tách chiết enzym bằng hệ PEG6000/Natri citrat theo tỷ lệ hai pha 30

Hình 3.4 Sự thay đổi của độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính khi tách chiết enzym bằng hệ PEG6000/Natri citrat theo pH 31

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong bối cảnh toàn cầu hóa và phát triển bền vững hiện nay, việc khai thác và sử dụng hiệu quả các nguồn tài nguyên sẵn có, đặc biệt là các phụ phẩm và phế phẩm từ các ngành công nghiệp khác nhau, đang trở thành một vấn đề cấp bách Không chỉ góp phần giảm thiểu tác động đến môi trường, việc tận dụng các phụ phẩm và phế phẩm còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế, đồng thời thúc đẩy sự phát triển của nền kinh tế tuần hoàn bền vững Trong lĩnh vực chăn nuôi, ngành công nghiệp chế biến thịt lợn là một trong những ngành sản xuất ra nhiều phụ phẩm và phế phẩm nhất như tụy, ruột, da, xương,… Trong đó, tụy lợn là một nguồn phụ phẩm giàu tiềm năng vì chứa một lượng lớn enzym protease [20], [28], [82]

Protease là enzym đóng vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp khác nhau, chiếm 60% thị trường enzym Chúng được sử dụng trong sản xuất chất tẩy rửa, da, thực phẩm, dược phẩm, giấy và bột giấy, cũng như trong việc thu hồi bạc từ phim ảnh và các quy trình xử lý sinh học [40] Đặc biệt trong ngành y dược học, protease vừa có thể là nguyên liệu thô để tổng hợp các chế phẩm dược dụng, vừa đóng vai trò như một công cụ để sản xuất ra các loại thuốc khác [40], [95] Nhờ những ứng dụng của mình, thị trường protease dự kiến sẽ tăng trưởng đáng kể trong những năm tới, có thể đạt 3,54 tỷ đô la trong năm 2024 và dự kiến đạt 4,72 tỷ đô la vào năm 2029 [46] Đây là lý do thôi thúc các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu về các nguồn tổng hợp, các phương pháp làm tăng hiệu suất, độ tinh sạch của protease

Trong khi đó phương pháp tách chiết 2 pha lỏng gần đây được quan tâm để thay thế các phương pháp truyền thống trong chiết xuất enzym nhờ sở hữu nhiều ưu điểm như hiệu suất cao, chi phí thấp, thân thiện với môi trường và dễ dàng mở rộng quy mô [62], [63] Tuy nhiên, hiệu suất tách chiết phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần, tỷ lệ pha lỏng, pH, nhiệt độ, thời gian và các điều kiện khác [48], [77]

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Khảo sát một số điều kiện tách chiết protease từ tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng” được thực hiện với 2 mục tiêu

chính: 1 Đánh giá hiệu quả tách chiết protease từ tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2

pha lỏng 2 Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả tách chiết protease tụy lợn

bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 PROTEASE

1.1.1 Định nghĩa

Protease hay enzym thủy phân protein, peptidase, proteinase được định nghĩa là các enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid [17] Theo Ủy ban Danh pháp của Liên minh Hóa sinh và Sinh học Phân tử Quốc tế (IUBMB), protease được xếp vào lớp 3 – Hydrolase và là phân lớp 4 (EC 3.4) [47]

1.1.2 Phân loại

Việc phân nhóm các protease có thể dựa trên loại phản ứng trong đó protease đóng vai trò là chất xúc tác hay bản chất và tính chất hóa học của vị trí xúc tác, cũng như sự phát triển của cấu trúc protease và mối quan hệ của chúng [39] Việc phân loại protease dựa trên tính đặc hiệu hoặc cơ chế xúc tác của chúng đã được Agarwal thảo luận [6] Trong nghiên cứu này, dựa trên loại phản ứng, enzym protease được chia thành Exopeptidase (EC 3.4.11 - 3.4.19) và Endopeptidase (EC 3.4.21-3.4.24, 3.4.99) [59]

1.1.2.1 Exopeptidase

Exopeptidase hoạt động ở cuối hoặc gần cuối chuỗi polypeptid và được phân loại thành aminopeptidase hoặc carboxypeptidase Exopeptidase giải phóng acid amin đầu N được gọi là aminopeptidase Những chất xúc tác phản ứng giải phóng dipeptid hoặc tripeptid lần lượt được gọi là dipeptidylpeptidase hoặc tripeptidylpeptidase [17], [73] Sự hiện diện của aminopeptidase được báo cáo ở rất nhiều loài vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật Các aminopeptidase được tiết ra dưới dạng aminopeptidase nội bào và ngoại bào [92] Methionin aminopeptidase (MAP) thực hiện các chức năng quan trọng của tế bào, có nhiều đặc điểm tương đồng giữa các sinh vật khác nhau và hoạt động bằng cách tách methionin ở đầu N khỏi các protein mới được tổng hợp [58]

Đầu C của chuỗi protein chịu ảnh hưởng chủ yếu của carboxypeptidase Tùy thuộc vào đặc tính của acid amin còn sót lại ở vị trí hoạt động, carboxypeptidase được phân thành ba loại: serin carboxypeptidase, cystein carboxypeptidase và metallico-carboxypeptidase [70] Các carboxypeptidase thế hệ đầu tiên như carboxypeptidase A1 và A2 của tuyến tụy có tiềm năng trong quá trình tiêu hóa các phân tử thức ăn Ngoài ra các carboxypeptidase tham gia tích cực vào việc chữa lành vết thương và quá trình đông máu

1.1.2.2 Endopeptidase

Protease là một endopeptidase nếu nó cắt một liên kết ở xa đầu peptid, bất kể nó có cắt thêm liên kết ở gần hai đầu hay không Tuy nhiên, có những endopeptidase không có khả năng phân cắt protein mà chỉ có thể phân cắt các peptid ngắn Chúng được gọi là “oligopeptidase”[74] Các endopeptidase được phân loại tùy thuộc vào loại acid amin

3 của nhóm chịu trách nhiệm chính cho hoạt động xúc tác Có sáu loại endopeptidase: (i) cystein protease, (ii) serin protease, (iii) threonin protease, (iv) acid glutamic protease, (v) acid aspartic protease và (vi) metalloprotease (protease chứa ion kim loại)

Cystein protease có bộ đôi xúc tác cystein và histidin, là thành phần rất quan trọng để enzym nhóm này thể hiện khả năng xúc tác của nó Khoảng 20 họ cystein protease đã được công nhận [70] Các cystein protease được chia thành bốn nhóm: (i) giống papain, (ii) giống trypsin với ưu tiên phân cắt ở arginin, (iii) đặc hiệu với acid glutamic và (iv) các loại khác Calpains là một loại cystein protease cần ion canxi để kích hoạt enzym [71]

Serin protease được sắp xếp thành 20 họ tùy thuộc vào sự giống nhau về cấu trúc của chúng Mỗi serin protease có ba phân tử acid amin ở vị trí liên kết xúc tác: aspartat, histidin và serin Serin protease đóng góp tới 1/3 tổng số protease đã biết [30]

Mỗi metalloprotease đều cần một ion kim loại hóa trị hai để thể hiện hoạt tính thủy phân protein của nó trên protease cụ thể Cho đến nay có khoảng 30 họ được xác định [69] Metalloprotease có thể được chia thành bốn nhóm tùy thuộc vào tính đặc hiệu của hoạt động của chúng, (i) trung tính, (ii) kiềm, (iii) Myxobacter I và (iv) Myxobacter II

Acid aspartic protease là các protease có tính acid, sử dụng phân tử nước để tạo ra aspartat tại vị trí xúc tác [91] Những protease này được chia thành ba họ là retropepsin, protein pararetrovirus và pepsin Các ví dụ về acid aspartic protease tiềm năng bao gồm pepsin, cathepsin và rennin Acid aspartic protease có hoạt tính cao và hiệu quả ở phạm vi pH thấp (3–4)

Enzym thủy phân protein có threonin ở vị trí xúc tác được gọi là threonin protease Xúc tác enzym bằng threonin protease bao gồm hai giai đoạn Ban đầu, chất nền được nucleophile nhắm đến để tạo thành chất trung gian acyl-enzym, sau đó là quá trình thủy phân phụ thuộc vào nước để giải phóng các sản phẩm và enzym tự do [15]

Acid glutamic protease được đặc trưng bởi việc tất cả vị trí hoạt động đều chứa acid glutamic Acid glutamic protease có tính acid và hoạt động tốt ở pH 2 Eqolisin là một ví dụ tiềm năng của protease glutamic được phân lập từ nấm Scytalidium lignicola [84]

Đặc điểm chung của một số loại endopeptidase được trình bày trong Bảng 1.1

4

Bảng 1.1 Đặc điểm của một số loại endopeptidase [40]

Loại Cystein protease Serin protease

Metallo-protease

Acid aspartic protease

m-Calpain Cathapsin B H L

Trypsin Chymotrypsin

Pepsin Cathapsin D

Bromelain và papain là các enzym thủy phân protein từ thực vật đã được thương mại hóa và lần lượt được chiết xuất từ dứa và đu đủ [98] Các nguồn thực vật khác cũng đã được nghiên cứu để xác định các nguồn tiềm năng cho việc sản xuất protease Sun và cộng sự [90] đánh giá gần 90 loài thực vật và cho thấy có năm loại enzym khác từ quả kiwi, bông cải xanh, gừng, tỏi tây và ớt đỏ đã chứng minh hoạt tính protease đáng kể và những loại thực vật này là nguồn cung cấp protease tiềm năng cho các ứng dụng công nghiệp

1.1.3.2 Động vật

Ở động vật, protease được tìm thấy trong các mô, khiến quá trình chiết phức tạp hơn Hơn nữa, nguồn gốc nguyên liệu thô có thể chứa mầm bệnh, là những chất có khả năng gây ô nhiễm, đặc biệt nếu mục đích của sản phẩm là dành cho các ứng dụng chữa bệnh [97] Tuy nhiên, protease động vật đã được sử dụng từ lâu, chẳng hạn như chymosin được chiết xuất từ dạ dày của bê và cừu non chưa cai sữa được sử dụng trong sản xuất phô mai [60] Trypsin, chymotrypsin, pepsin là những protease động vật có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm [40]

Các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu các protease mới từ nguồn động vật khác

như protease từ tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei có tính ổn định ở nhiệt độ cao và

5 độ pH trong khoảng 7-9 [25], hay một serin protease đầu tiên từ nọc độc của loài rắn

Bothrops Brazili có tác dụng tiêu sợi huyết tốt [102]

1.1.3.3 Vi sinh vật

Nguồn protease vi sinh vật từ vi khuẩn, nấm men và nấm sợi chiếm khoảng 40%

tổng doanh số bán enzym trên toàn thế giới [27] Các loài Bacillus là chủng vi sinh vật

tiêu biểu nhất được sử dụng trong sản xuất protease, đặc biệt là các serin protease trung

tính và kiềm [98] Bên cạnh nhiều nghiên cứu về Bacillus sp., các vi khuẩn khác cũng là những “nhà sản xuất” protease đáng kể như Pseudomonas aeruginosa [68],

Streptomyces griseorubens E44G [7], Corynebacteria alkanolyticum ATH3 [16]

Các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các đặc tính xúc tác mới của protease từ nấm men để ứng dụng trong công nghiệp Li và cộng sự [57] đã báo cáo việc sản xuất protease

acid liên kết tế bào đầu tiên từ nấm men biển Metschnikowia reukaufii W6b có khả năng

đông tụ sữa, chứng tỏ tiềm năng trong ngành công nghiệp phô mai, thực phẩm và lên men Viana và cộng sự [26] đã đánh giá thành phần vi sinh vật trong sữa bò và nhận

thấy 17,60% là nấm men, trong đó Candida buinensis đã chứng minh hoạt tính thủy

phân protein cao nhất

Protease nấm có quy trình thu hồi đơn giản do sử dụng phương pháp lọc để tách sợi nấm Đây là ưu điểm vì vi khuẩn đòi hỏi các quy trình tốn kém hơn để phân tách tế

bào [29] Các loài Aspergillus là loài nấm sản xuất protease chiếm ưu thế, đặc biệt là

Phương pháp này thường được áp dụng khi bắt đầu quy trình thu hồi và tinh sạch và có thể được sử dụng như một thao tác duy nhất Nó đặc biệt hữu ích cho việc tách các enzym ngoại bào và các chế phẩm không yêu cầu độ tinh khiết cao [38], [85] Đây là một kỹ thuật đơn giản và đòi hỏi ít năng lượng do đó dễ dàng để mở rộng quy mô và các hóa chất được sử dụng làm tác nhân gây tủa, chẳng hạn như ethanol và amoni sulfat, có thể được tái chế [85] Nhược điểm là chất kết tủa có thể chứa tạp chất [8], làm ảnh hưởng đến độ tinh khiết của sản phẩm và nhiệt độ phải được kiểm soát để tránh sự biến tính của enzym [85]

Hai tác nhân chính ảnh hưởng đến tương tác protein-dung môi và khả năng hòa tan protein là muối và dung môi hữu cơ Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử

6 dụng do có độ hòa tan trong nước cao và tính ưa nước nên giảm thiểu sự biến tính Đây cũng là một nguồn tài nguyên giá rẻ được sản xuất trên khắp thế giới [38] Ngoài ra ethanol có ưu điểm là nhiệt độ bay hơi thấp nên có thể thu hồi dễ dàng và độc tính thấp [64], [89] Còn tác nhân muối được dùng phổ biến nhất là muối amoni sulfat do tính đơn giản và không sinh nhiệt (như xảy ra với dung môi hữu cơ) cũng như độ hòa tan cao và không biến tính Tuy nhiên, amoni sulfat có tính ăn mòn và việc thải bỏ cần được giám sát Dung dịch enzym phải được làm lạnh đến 4-5°C để tránh sự biến tính của enzym trong quá trình kết tủa bằng muối [5], [25], [45]

1.2.2 Phương pháp tách chiết hai pha lỏng

Hệ thống hai pha lỏng (ATPS) được tạo thành từ hai pha lỏng thân nước không thể trộn lẫn Chúng được sử dụng làm phương pháp chiết lỏng-lỏng để tách các hợp chất sinh học, như protein, vật liệu di truyền, hạt nano sinh học, bào quan, virus và toàn bộ tế bào [24], [99], cũng như để loại bỏ các phân tử vô cơ [42] Kỹ thuật này thay thế việc sử dụng dung môi hữu cơ trong chiết lỏng-lỏng truyền thống [83], nhờ ưu điểm bảo tồn được các phân tử sinh học, đặc biệt là cấu trúc không gian của protein và do đó tránh được sự biến tính và bất hoạt của chúng Phương pháp này có nhiều ưu điểm do bao gồm quá trình cô đặc và tinh chế protein trong một thao tác duy nhất [76]

ATPS được hình thành bằng cách thêm hai hoặc nhiều polyme có tính ưa nước khác nhau, hoặc một polyme và một muối ở nồng độ và nhiệt độ tới hạn trong nước Tính không trộn lẫn một phần của các thành phần cho phép hình thành hai pha: pha trên được hình thành bởi polyme kỵ nước hơn và pha dưới giàu muối hoặc polyme thứ hai ưa nước hơn [19] Các đặc tính sinh học của phân tử đem tinh chế được bảo tồn do hàm lượng nước cao (65 đến 90% w/w ở cả hai pha), giúp giảm nguy cơ biến tính cũng như mất hoạt tính [12] ATPS có lợi thế kinh tế so với các kỹ thuật sắc ký truyền thống về khả năng thu hồi, tái sử dụng polyme, dễ sử dụng, chi phí thấp, thời gian tách pha ngắn và tiêu thụ năng lượng thấp [61], [62] Hơn nữa, ATPS không gây cháy nổ, an toàn với môi trường và dễ mở rộng quy mô, thể hiện độ phân giải tốt [9], [65], [72]

Tuy nhiên, ATPS có hai nhược điểm chính đó là khó khăn trong việc thu hồi protein ra khỏi pha polyme và các vấn đề về ăn mòn và xử lý muối đã sử dụng [76] Muối được thải vào môi trường nước sẽ dẫn đến nhu cầu xử lý nước và do đó làm tăng chi phí của các quá trình tiếp theo [76] Các thành phần có khả năng phân hủy sinh học hoặc tái chế được, chẳng hạn như muối citrat, đã được đề xuất để giảm thiểu những vấn đề này [67], [78]

Các đặc tính của protein như cấu trúc, tính kỵ nước và khối lượng phân tử ảnh hưởng đến sự phân bố và mức độ ưu tiên của chúng vào hai pha [65] Các thông số liên quan đến sự hình thành hệ thống cũng như loại muối và polyme, khối lượng mol và nồng độ của polyme, nồng độ ion muối và độ pH cũng ảnh hưởng đến sự phân bố của protein

7 [48] Hệ số phân bố của các phân tử sinh học vào pha polyme giảm khi khối lượng mol của polyme tăng lên hoặc với polyme ít nhóm hydroxyl hơn ở cùng nồng độ, dẫn đến tăng tính kỵ nước trong pha này [77] Do đó, khi khối lượng mol của PEG giảm, hệ số phân bố protein và sự di chuyển của protein sang pha giàu PEG sẽ tăng lên [65] Mặt khác, nồng độ muối cao hơn dẫn đến giảm khả năng hòa tan của protein ở pha dưới giàu muối, dẫn đến sự di chuyển của protein lên pha trên giàu polyme [24] Một sự tương tác xảy ra giữa các ion muối và các nhóm protein tích điện trái dấu, tạo ra một lớp kép các nhóm ion Vùng kỵ nước của protein dần dần lộ ra do tác dụng hydrat hóa của các phân tử muối xung quanh phân tử sinh học [65]

Một số nghiên cứu phân lập và tinh chế protease bằng ATPS được tóm tắt và trình bày ở Bảng 1.2

1.2.2.1 Hệ thống Polyme/Muối

Polyethylene glycol (PEG) là một trong những polyme phổ biến nhất được sử dụng trong quá trình tạo pha do tính ổn định đáng kể và chi phí thấp Các enzym thủy phân protein được ưu tiên phân bố vào pha polyme, đặc biệt là những enzym có đặc tính kỵ nước [72]

Hầu hết ATPS polyme/muối bao gồm PEG và muối, đặc biệt là amoni, kali và natri/phosphat, sulfat hoặc cacbonat Ngoài ra các muối không độc hại có khả năng phân hủy sinh học như citrat và tartrat cũng đã được đề xuất [24] Việc bổ sung các ion muối có ảnh hưởng đến sự phân bố protein do tương tác tĩnh điện giữa chúng và các thành phần của hệ thống Những muối này có thể làm suy yếu hoặc tăng cường tương tác giữa các nhóm ion có điện tích trái dấu so với protein, do đó ảnh hưởng đến sự phân bố [77]

1.2.2.2 Hệ thống Polyme/Polyme

Hệ thống polyme/muối có ưu điểm so với hệ thống polyme/polyme, chẳng hạn như độ nhớt thấp của pha muối, sức căng bề mặt giữa hai pha thấp, chi phí muối thấp và độ chọn lọc cao hơn [42], [65] Việc sử dụng ATPS polyme/polyme đã được cải thiện do việc thay thế dextran bằng các polyme rẻ hơn Hệ thống PEG/natri polyacrylate (NaPA) đã được chế tạo với các thành phần trơ và tương đối rẻ, mang lại độ nhớt thấp và tách pha nhanh [18]

1.2.2.3 Các hệ khác

Hệ hai pha lỏng micell được hình thành bởi các chất hoạt động bề mặt cũng đã được nghiên cứu để phân chia các protease [10], [86] Các tác giả đã chứng minh rằng các enzym được ưu tiên phân chia ở pha dưới giàu chất hoạt động bề mặt, nơi các micell được hình thành

ATPS dựa trên chất lỏng ion (IL) cũng đã được khám phá để tinh chế các enzym thủy phân protein, chẳng hạn như papain [14] và bromelain [96]

8

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu tách chiết protease bằng ATPS

sạch (lần)

Hiệu suất thu hồi (%)

Nguồn tham khảo Gan tụy Tôm thẻ chân

Aspergillus tamarii

Serratia marcescens P3 Keratinase PEG4000/Natricitrat

PEG4000/Amonisulfat Pha trên giàu PEG

7,20 2,40

85,70 89,10 [63] Nội tạng cá da tra dầu Protease PEG2000/Natricitrat Pha trên giàu PEG 12 273 [52] Tụy bò Trypsin PEH3350/Natricitrat/Natriclorid Pha trên giàu PEG 2,55 99,7 [67] Lá cây Keisinai Protease PluronicL61/Kalinitrat Pha dưới giàu chất

9

1.3 PROTEASE TUYẾN TỤY

Tụy là nơi sản sinh ra nhiều loại enzym có thể tiêu hóa phần lớn các thành phần thức ăn Do vậy hệ enzym tụy rất đa dạng, bao gồm protease để thủy phân protein, lipase để tiêu hóa mỡ, amylase giúp phân cắt đường, và nhiều loại enzym khác [20] Riêng nhóm protease tụy đã rất phong phú, có tới 5 loại enzym: trypsin, chymotrypsin, elastase, carboxypeptidase A và carboxypeptidase B Nhưng trong tụy những enzym này đều tồn tại dưới dạng tiền chất (zymogen hoặc proenzym) chưa hoạt động [20], [28]

1.3.1 Cấu trúc và tính chất

1.3.1.1 Cấu trúc

Trypsin (EC 3.4.21.4) trước khi hoạt động nó tồn tại chủ yếu dưới dạng zymogen

là trypsinogen Trypsinogen bao gồm một chuỗi polypeptid gồm 229 acid amin và được liên kết chéo bằng sáu cầu nối disulfid [31] Sau khi được hoạt hóa, trypsinogen chuyển thành trypsin, là một polypeptid chuỗi đơn gồm 223 acid amin [49] Dạng trypsin tự nhiên này được gọi là β-trypsin Quá trình tự phân hủy β-trypsin (được phân cắt ở Lys131- Ser132) tạo ra α-trypsin được liên kết với nhau bằng cầu nối disulfid [31] Cấu trúc nếp gấp của trypsin được đặc trưng bởi “hai thùng beta” Đơn vị xúc tác nằm ở giao diện giữa các thùng này His 57 và Asp 102 có nguồn gốc từ thùng beta đầu N, trong khi Ser 195 có nguồn gốc từ thùng đầu C [95] Hình 1.1 minh họa cấu trúc nếp gấp của trypsin

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc hai thùng beta của trypsin [95]

Ba acid amin ở vị trí xúc tác được hiển thị bằng màu xanh lá cây Các dấu gạch ngang màu đen thể hiện sự kết nối giữa các đơn vị xúc tác

Các cầu nối disulfid được bảo toàn được hiển thị bằng màu vàng

10

Trypsin, chymotrypsin (EC 3.4.21.1) và elastase (EC 3.4.21.36) có cùng cấu trúc

nếp gấp nhưng có độ đặc hiệu khác nhau: túi S1 của trypsin đặc hiệu cho Arg và Lys, trong khi túi S1 của chymotrypsin đặc hiệu cho các acid amin thơm Phe, Tyr và Trp Sự khác biệt này bắt nguồn từ các đơn vị acid amin bám ở đáy túi này: trypsin có Asp ở đáy cho phép hình thành cầu muối với Arg hoặc Lys; chymotrypsin có Ser ở đáy túi S1 đặc hiệu đối với acid amin thơm Elastase đặc hiệu cho các acid amin phân tử nhỏ do trong túi S1 có sự hiện diện của Val 216 và Thr 226 giúp ngăn các phân tử lớn xâm nhập [95] Sự khác nhau này được minh họa trong Hình 1.2

Hình 1.2 Tính đặc hiệu của túi S1 của trypsin, chymotrypsin và elastase [95]

Carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1) chứa một ion kẽm liên kết với một chuỗi

polypeptid gồm 307 acid amin Các acid amin quan trọng với hoạt động xúc tác của enzym này là Glu 270, Arg 71, Arg 127, Asn 144, Arg 145 và Tyr 248 [22]

Carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2) có thành phần acid amin được xác định và

tương tự như carboxypeptidase A, nhưng có hàm lượng serin thấp hơn, acid amin chứa lưu huỳnh và nitơ amid cao hơn Carboxypeptidase B cũng có một ion kẽm trên mỗi phân tử Các nghiên cứu đã cho thấy ion này là một cofactor của enzym [36]

1.3.1.2 Tính chất hóa lý

Tính chất hóa lý của các enzym protease trong tụy lợn được tóm tắt tại Bảng 1.3

Bảng 1.3 Tính chất hóa lý của protease tụy [20], [28], [35], [43], [50]

Enzym Khối lượng phân tử (kDa) pI pH tối ưu

1.3.2 Cơ chế hoạt hóa và xúc tác của enzym

1.3.2.1 Cơ chế hoạt hóa

Enzym phân giải protein được tuyến tụy tổng hợp và tiết ra dưới dạng chưa hoạt động (zymogen hoặc proenzym) Chúng chỉ có được hoạt tính thủy phân protein sau khi

11 được hoạt hóa bởi enzym enterokinase ở tá tràng Enzym này bắt đầu hoạt hóa các tiền chất của protease tuyến tụy bằng cách chuyển đổi trypsinogen thành trypsin Enterokinase tác động lên trypsinogen, loại bỏ chuỗi hexapeptid đầu N [valin-(acid aspartic)4-lysin], do đó phá vỡ các liên kết tĩnh điện bao phủ trung tâm hoạt động của trypsinogen [20] Điều này được thể hiện trong Hình 1.3

Hình 1.3 Sơ đồ thể hiện quá trình hoạt hóa trypsin bởi enterokinase [20]

V: Valine; A: Acid aspartic; L: Lysine; I: Isoleucine; G: Glycine; H: Histidine

S: Trung tâm hoạt động; -: liên kết tĩnh điện Trypsin lần lượt hoạt hóa các enzym tuyến tụy khác Enterokinase chỉ hoạt hóa trypsin nhưng không thể hoạt hóa chymotrypsinogen, proelastase và procarboxypeptidase Quá trình hoạt hóa các tiền enzym của các protease tụy được thể hiện ở Hình 1.4

Hình 1.4 Sơ đồ thể hiện quá trình hoạt hóa tiền enzym các protease tụy [20] 1.3.2.2 Cơ chế xúc tác

Trypsin, chymotrypsin, elastase đều là các serin protease, vị trí xúc tác được đặc trưng bởi bộ ba acid amin: His 57, Asp 102 và Ser 195 Mỗi acid amin đảm nhận một chức năng nhất định trong quá trình xúc tác Ser 195 chứa nhóm -OH có khả năng hoạt động như một nucleophil, tấn công nguyên tử C ở nhóm carbonyl của liên kết peptid trong cơ chất Một cặp electron trên nitơ của His 57 có khả năng tiếp nhận hydro từ

12 nhóm -OH Ser 195, do đó phối hợp tấn công liên kết peptid Nhóm cacboxyl trên Asp 102 lần lượt liên kết hydro với His 57, làm cho nguyên tử nitơ đề cập ở trên có độ âm điện lớn hơn nhiều [44]

Cơ chế xúc tác của ba enzym có thể được tổng quát qua 4 bước (i) Cơ chất liên kết với trung tâm hoạt động trên enzym, định vị nhóm carbonyl của các gốc acid amin về phía các gốc nucleophil Ser 195 trên enzym (ii) Acid amin His 57 trong vị trí hoạt động nhận proton từ nhóm -OH của Ser 195 Do đó, Ser 195 tấn công vào nhóm carbonyl trong liên kết peptid của cơ chất và tạo ra liên kết cộng hóa trị với cơ chất Điện tích âm phát triển trên nhóm carbonyl được ổn định nhờ hai proton amid trên phân tử của enzym (iii) Nitơ amid của cơ chất đẩy nguyên tử H cho His 57 bằng cách giải phóng phần đầu C một cách tự do (iv) Cuối cùng, một phân tử nước từ quá trình thủy phân liên kết este được hình thành giữa peptid cơ chất và oxy Ser 195 của enzym, đồng thời tái tạo -OH của Ser 195 cho vòng xúc tác tiếp theo, sau đó là sự phân ly peptid cơ chất bị thủy phân [49]

Trong khi đó, carboxypeptidase A, B có trung tâm hoạt động đặc trưng bởi 6 acid amin Glu 270, Arg 71, Arg 127, Asn 144, Arg 145, Tyr 248 và 1 ion kẽm Có hai giả

thuyết về cơ chế xúc tác của carboxypeptidase Thứ nhất, promoted-water pathway tạm

dịch là “con đường thúc đẩy nước” Trong con đường này, Glu 270 đóng vai trò kép Vừa là một base chung để tạo điều kiện thuận lợi cho sự tấn công của nước liên kết kẽm vào nhóm carbonyl bằng cách chuyển một proton nước sang oxy carboxylate Vừa như một acid thông thường để chuyển proton này sang nhóm nitơ rời đi Cơ chế thứ hai là nucleophilic pathway - con đường nucleophilic nhưng không khả thi với cơ chất là peptid [100]

Trypsin và chymotrypsin được sử dụng như là các chất chống viêm trong điều trị chấn thương thể thao, nhiễm trùng vết thương, đau dây thần kinh tọa [81] Latha và cộng sự [55] đã sử dụng sự kết hợp trypsin:chymotrypsin theo tỷ lệ 6:1 làm chất chống viêm để điều trị cho bệnh nhân bỏng và nhận thấy kết quả vượt trội so với việc chỉ sử dụng trypsin Sự kết hợp của trypsin, chymotrypsin và papain được nghiên cứu trong điều trị ung thư Chế phẩm enzym này cho thấy giảm tác dụng phụ khi hóa trị và xạ trị, đồng

13 thời kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân [56] Ngoài ra, chymotrypsin còn có vai trò trong phẫu thuật điều trị đục thể tinh thể, hóa lỏng tinh trùng trong điều trị vô sinh, thủy phân protein nọc độc rắn [104] Trypsin và carboxypeptidase B đã được nghiên cứu để điều chế các thuốc có bản chất là protein như insulin từ proinsulin [51], thuốc ức chế dipeptidyl peptidase IV từ protein sữa bò [66]

Đặc biệt, trypsin còn là protease được sử dụng thường xuyên nhất trong các thí nghiệm proteomics dựa trên phép đo khối phổ nhờ tính đặc hiệu phân tách đầu C của Arg và Lys Trypsin giúp phân cắt các chuỗi peptid dài hoặc protein thành các biến thể nhỏ hơn nằm trong khoảng phân tích của máy khối phổ Nhờ vậy mà có thể phân tích được các protein mục tiêu hay định lượng peptid [95] Cũng nhờ sự phân tách đặc hiệu Arg-Lys, nên gần đây trypsin được sử dụng như một cảm biến sinh học, sử dụng các protein chứa Arg-Lys làm cơ chất cho sơ đồ phát hiện [49]

1.3.3.2 Ứng dụng trong các lĩnh vực khác

Cũng giống như các protease khác, protease tụy được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, da, hóa chất Chúng được sử dụng để làm mềm thịt [2], lên men, sản xuất protein thủy phân và loại bỏ protein trong xương [49] Trong ngành công nghiệp sữa, chymotrypsin được sử dụng cùng với trypsin để thủy phân casein nhằm cải thiện hoạt tính chống oxy hóa và khả năng kháng khuẩn Trypsin và chymotrypsin được dùng như chất phụ gia thêm vào để kiểm soát quá trình thủy phân protein trong sản xuất phô mai [104] Protease được sử dụng để thuộc da, tẩy lông trong ngành chế biến da hay sản xuất các chất tẩy rửa chất bẩn có bản chất là protein [49], [104]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu tách chiết protease từ tuyến tụy

1.3.4.1 Trên thế giới

Nghiên cứu tách chiết protease từ tuyến tụy rất phong phú về nguồn chiết cũng như phương pháp chiết tách Một số nghiên cứu được trình bày ở Bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu tách chiết protease từ tuyến tụy

Nguồn chiết Enzym Phương pháp Tài liệu tham khảo Ruột và tụy gà Protease Hòa tan, ly tâm [88]

Chymotrypsin

ATPS Phân vùng ái lực [75] Tụy gà

Trypsin Chymotrypsin

Elastase

Sắc ký ái lực [41] Tụy đà điểu Protease Sắc ký ái lực

Sắc ký trao đổi ion [103]

14 Tụy người Protease Sắc ký ái lực

Sắc ký trao đổi ion [33]

Các protease từ tuyến tụy có thể được chiết bằng các phương pháp đơn giản nhất như xay, hòa tan với nước, đem ly tâm thu lấy dịch và cuối cùng đông khô được enzym [88] Cũng có thể sử dụng các phương pháp phức tạp, đặc biệt là các phương pháp sắc ký cột Các chất ức chế trypsin được kết hợp để tăng hiệu quả tách chiết bằng phương pháp này [33], [103] Phương pháp ATPS sử dụng PEG3350/Natri citrat đã được áp dụng để tách chiết trypsin đơn chất trong một số nguyên cứu từ tụy bò [67], [94] Để tăng hiệu quả của ATPS, các nhà nghiên cứu đã phối hợp với phân vùng ái lực sử dụng thuốc nhuộm triazin tự do [75] hay kết hợp với hệ thống phân chia 3 pha (TPP) và chiết ngược (BE) với muối [80] Nghiên cứu về chiết tách protease từ tụy lợn bằng phương pháp ATPS chưa nhiều, chủ yếu từ các nguồn khác hoặc sử dụng các phương pháp sắc ký truyền thống

1.3.4.2 Trong nước

Tại Việt Nam, đã có những nghiên cứu về tách chiết enzym protease từ tuyến tụy, tuy nhiên còn hạn chế Nguyễn Minh Chọn và Nguyễn Phạm Tuấn (2014) [1] cho thấy phương pháp chiết enzym từ tụy gà bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 và tủa bằng (NH4)2SO4 60% bão hòa kết hợp với thẩm tích để loại muối rồi đông khô chân không đã cho hiệu quả trích ly enzym tốt Trong khi đó, Nguyễn Văn Rư (2015) [3] sử dụng sắc ký lọc gel sau khi tủa phân đoạn dịch tụy lợn đồng nhất với ethanol để thu được 3 protease: trypsin, chymotrypsin và peptidase có khối lượng phân tử khác nhau

Tên hóa chất Hãng sản xuất (Nước)

Dinatri hydrophosphat Xilong (Trung Quốc)

Acid tricloacetic (TCA) Xilong (Trung Quốc)

Coomassie Brilliant Blue G250 Bio Basic (Canada) Coomassie Brilliant Blue R250 Bio Basic (Canada)

Amoni persulfat (APS) Bio Basic (Canada)

Các dung dịch và đệm sử dụng được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong Bảng 2.2

16

Bảng 2.2 Thành phần các loại đệm và dung dịch

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Thuốc thử Bradford 100mg Coomassie Brilliant Blue G250, 50ml

ethanol 95%, 100ml acid phosphoric 85%, 850ml nước cất

Acrylamid 30% Acylamid 30% (w/v), bis-acylamid 1% (w/v) Đệm gel tách Tris-HCl 1,5M, SDS 0,4%, pH 8,8

Đệm gel gom Tris-HCl 0,5M, SDS 0,4%, pH 6,8 Đệm chạy có SDS 10X Tris-base 250mM, SDS 1%, glycin 2M, pH 8,3 Đệm mẫu 4X Tris-HCl 250mM pH 6,8, SDS 8%, glycerol 40%,

bromophenol blue 0,02%, thêm β-mercaptoethanol 20% trước khi sử dụng

Dung dịch tẩy màu gel Methanol 50%, acid acetic 10% trong nước Dung dịch nhuộm gel Coomassie Brilliant Blue R250 0,25 % (w/v) pha

trong dung dịch tẩy màu gel Đệm pH 7,5 0,2M KH2PO4-KOH, pH 7,5

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phòng thực tập Bộ môn Hóa Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội được liệt kê ở Bảng 2.3

Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng

Máy ly tâm lạnh Hanil Supra R22 Hàn Quốc

Máy quang phổ UV-Vis Hitachi U-5100 Nhật Bản Hệ thống điện di đứng mini BIO-RAD Mỹ

Dụng cụ thí nghiệm: - Các ống Falcon 15ml, 50ml - Các ống Eppendorf 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml - Micropipet cà đầu côn thể tích 0,5-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl

17 - Dụng cụ thủy tinh: Ống nghiệm, cốc có mỏ, pipet paster, đũa thủy tinh, bình định

mức, ống đong, chai đựng hóa chất - Giá đựng ống nghiệm

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để thực hiện để tài, trước hết, chúng tôi chiết lấy dịch tụy đồng nhất từ tuyến tụy lợn thu mua được Sau đó, tách chiết enzym protease theo ba con đường Thứ nhất, sử dụng phương pháp kết tủa để thu lấy enzym với một bước duy nhất Thứ hai, kết hợp hai phương pháp kết tủa và sử dụng ATPS Thứ ba, tách chiết protease qua một bước ATPS Sau đó kiểm tra hoạt tính cũng như độ tinh sạch protease từ dịch tụy Đồng thời đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết bằng ATPS: thành phần hai pha (muối và PEG), tỷ lệ hai pha, pH

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu

Tách chiết protease từ tụy lợn

Đánh giá hiệu quả tách chiết của ATPS

Tách chiết protease qua một bước kết tủaTách chiết protease qua hai

bước: kết tủa và ATPSTách chiết protease qua

2.3.1.2 Tách chiết bằng phương pháp kết tủa

Nguyên lý

Ở nồng độ muối cao, các ion cô lập các phân tử nước bao quanh protein trong lớp hydrat hóa, làm giảm độ hòa tan và kết tủa protein Trong khi đó dung môi hữu cơ khiến hằng số điện ly của dung dịch nước giảm, từ đó gây ra sự gia tăng tương tác tĩnh điện của các vùng protein tích điện trái dấu, khiến protein kết tủa [8]

Tiến hành

Kết tủa 10ml dịch tụy đồng nhất lần lượt bằng dung dịch muối amoni sulfat bão hòa và ethanol 70° với các thể tích là 2,5ml, 5,0ml, 7,5ml, 10,0ml tại 4°C Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút tại 4°C, thu lấy tủa Hòa tan tủa với 15ml dung dịch đệm pH 7,5 được dịch chiết enzym thô Chọn mẫu cho hoạt tính cao đem tách chiết bằng ATPS

Tụy lợn

Dịch chiết tụy lợn

Dịch chiết enzym thô

Dịch enzym tinh sạchXay, hòa tan,

ly tâm

Kết tủa, ly tâm, hòa tan

ATPS

ATPS