Độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính khi tách chiết enzym bằng các ATPS khác nhau từ dịch enzym sau kết tủa A và dịch tụy ban đầu B .... Đặc điểm của một số loại endopeptidase [40
TỔNG QUAN
PROTEASE
Protease hay enzym thủy phân protein, peptidase, proteinase được định nghĩa là các enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid [17] Theo Ủy ban Danh pháp của Liên minh Hóa sinh và Sinh học Phân tử Quốc tế (IUBMB), protease được xếp vào lớp 3 – Hydrolase và là phân lớp 4 (EC 3.4) [47]
Việc phân nhóm các protease có thể dựa trên loại phản ứng trong đó protease đóng vai trò là chất xúc tác hay bản chất và tính chất hóa học của vị trí xúc tác, cũng như sự phát triển của cấu trúc protease và mối quan hệ của chúng [39] Việc phân loại protease dựa trên tính đặc hiệu hoặc cơ chế xúc tác của chúng đã được Agarwal thảo luận [6] Trong nghiên cứu này, dựa trên loại phản ứng, enzym protease được chia thành Exopeptidase (EC 3.4.11 - 3.4.19) và Endopeptidase (EC 3.4.21-3.4.24, 3.4.99) [59]
Exopeptidase hoạt động ở cuối hoặc gần cuối chuỗi polypeptid và được phân loại thành aminopeptidase hoặc carboxypeptidase Exopeptidase giải phóng acid amin đầu
N được gọi là aminopeptidase Những chất xúc tác phản ứng giải phóng dipeptid hoặc tripeptid lần lượt được gọi là dipeptidylpeptidase hoặc tripeptidylpeptidase [17], [73]
Sự hiện diện của aminopeptidase được báo cáo ở rất nhiều loài vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật Các aminopeptidase được tiết ra dưới dạng aminopeptidase nội bào và ngoại bào [92] Methionin aminopeptidase (MAP) thực hiện các chức năng quan trọng của tế bào, có nhiều đặc điểm tương đồng giữa các sinh vật khác nhau và hoạt động bằng cách tách methionin ở đầu N khỏi các protein mới được tổng hợp [58] Đầu C của chuỗi protein chịu ảnh hưởng chủ yếu của carboxypeptidase Tùy thuộc vào đặc tính của acid amin còn sót lại ở vị trí hoạt động, carboxypeptidase được phân thành ba loại: serin carboxypeptidase, cystein carboxypeptidase và metallico- carboxypeptidase [70] Các carboxypeptidase thế hệ đầu tiên như carboxypeptidase A1 và A2 của tuyến tụy có tiềm năng trong quá trình tiêu hóa các phân tử thức ăn Ngoài ra các carboxypeptidase tham gia tích cực vào việc chữa lành vết thương và quá trình đông máu
Protease là một endopeptidase nếu nó cắt một liên kết ở xa đầu peptid, bất kể nó có cắt thêm liên kết ở gần hai đầu hay không Tuy nhiên, có những endopeptidase không có khả năng phân cắt protein mà chỉ có thể phân cắt các peptid ngắn Chúng được gọi là
“oligopeptidase”[74] Các endopeptidase được phân loại tùy thuộc vào loại acid amin
3 của nhóm chịu trách nhiệm chính cho hoạt động xúc tác Có sáu loại endopeptidase: (i) cystein protease, (ii) serin protease, (iii) threonin protease, (iv) acid glutamic protease, (v) acid aspartic protease và (vi) metalloprotease (protease chứa ion kim loại)
Cystein protease có bộ đôi xúc tác cystein và histidin, là thành phần rất quan trọng để enzym nhóm này thể hiện khả năng xúc tác của nó Khoảng 20 họ cystein protease đã được công nhận [70] Các cystein protease được chia thành bốn nhóm: (i) giống papain, (ii) giống trypsin với ưu tiên phân cắt ở arginin, (iii) đặc hiệu với acid glutamic và (iv) các loại khác Calpains là một loại cystein protease cần ion canxi để kích hoạt enzym [71]
Serin protease được sắp xếp thành 20 họ tùy thuộc vào sự giống nhau về cấu trúc của chúng Mỗi serin protease có ba phân tử acid amin ở vị trí liên kết xúc tác: aspartat, histidin và serin Serin protease đóng góp tới 1/3 tổng số protease đã biết [30]
Mỗi metalloprotease đều cần một ion kim loại hóa trị hai để thể hiện hoạt tính thủy phân protein của nó trên protease cụ thể Cho đến nay có khoảng 30 họ được xác định [69] Metalloprotease có thể được chia thành bốn nhóm tùy thuộc vào tính đặc hiệu của hoạt động của chúng, (i) trung tính, (ii) kiềm, (iii) Myxobacter I và (iv) Myxobacter
Acid aspartic protease là các protease có tính acid, sử dụng phân tử nước để tạo ra aspartat tại vị trí xúc tác [91] Những protease này được chia thành ba họ là retropepsin, protein pararetrovirus và pepsin Các ví dụ về acid aspartic protease tiềm năng bao gồm pepsin, cathepsin và rennin Acid aspartic protease có hoạt tính cao và hiệu quả ở phạm vi pH thấp (3–4)
Enzym thủy phân protein có threonin ở vị trí xúc tác được gọi là threonin protease Xúc tác enzym bằng threonin protease bao gồm hai giai đoạn Ban đầu, chất nền được nucleophile nhắm đến để tạo thành chất trung gian acyl-enzym, sau đó là quá trình thủy phân phụ thuộc vào nước để giải phóng các sản phẩm và enzym tự do [15]
Acid glutamic protease được đặc trưng bởi việc tất cả vị trí hoạt động đều chứa acid glutamic Acid glutamic protease có tính acid và hoạt động tốt ở pH 2 Eqolisin là một ví dụ tiềm năng của protease glutamic được phân lập từ nấm Scytalidium lignicola [84] Đặc điểm chung của một số loại endopeptidase được trình bày trong Bảng 1.1
B ả ng 1.1 Đặc điểm của một số loại endopeptidase [40]
Loại Cystein protease Serin protease Metallo- protease
Ví dụ μ-Calpain m-Calpain Cathapsin B H L
Mã EC 3.4.22 3.4.21 3.4.24 3.4.23 pH tối ưu 2-3 6-11 5-8 2-5
1.1.3.1 Th ự c v ật Ở thực vật, protease tham gia vào các quá trình như huy động protein dự trữ, apoptosis (chết theo chu trình), Protease nói chung là tồn tại dưới dạng proenzym, nó được hoạt hóa sau khi cắt đi đoạn ở đầu N [101] Chủ yếu, protease thực vật là các endopeptidase loại cystein và hiếm khi quan sát thấy các protease loại khác [13]
Bromelain và papain là các enzym thủy phân protein từ thực vật đã được thương mại hóa và lần lượt được chiết xuất từ dứa và đu đủ [98] Các nguồn thực vật khác cũng đã được nghiên cứu để xác định các nguồn tiềm năng cho việc sản xuất protease Sun và cộng sự [90] đánh giá gần 90 loài thực vật và cho thấy có năm loại enzym khác từ quả kiwi, bông cải xanh, gừng, tỏi tây và ớt đỏ đã chứng minh hoạt tính protease đáng kể và những loại thực vật này là nguồn cung cấp protease tiềm năng cho các ứng dụng công nghiệp
1.1.3.2 Độ ng v ật Ở động vật, protease được tìm thấy trong các mô, khiến quá trình chiết phức tạp hơn Hơn nữa, nguồn gốc nguyên liệu thô có thể chứa mầm bệnh, là những chất có khả năng gây ô nhiễm, đặc biệt nếu mục đích của sản phẩm là dành cho các ứng dụng chữa bệnh [97] Tuy nhiên, protease động vật đã được sử dụng từ lâu, chẳng hạn như chymosin được chiết xuất từ dạ dày của bê và cừu non chưa cai sữa được sử dụng trong sản xuất phô mai [60] Trypsin, chymotrypsin, pepsin là những protease động vật có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm [40]
Các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu các protease mới từ nguồn động vật khác như protease từ tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei có tính ổn định ở nhiệt độ cao và
5 độ pH trong khoảng 7-9 [25], hay một serin protease đầu tiên từ nọc độc của loài rắn
Bothrops Brazili có tác dụng tiêu sợi huyết tốt [102]
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT PROTEASE
Kết tủa là phương pháp phổ biến nhất trong các quá trình “hạ nguồn” (downstream) Ước tính hơn 80% các quy trình thu hồi và tinh sạch đều sử dụng kỹ thuật này [8] Việc thay đổi các tính chất của dung dịch nước (liên quan đến độ hòa tan) gây ra sự hình thành kết tủa bằng cách thay đổi pH, nhiệt độ, thêm muối, dung môi hữu cơ hoặc polyme
Phương pháp này thường được áp dụng khi bắt đầu quy trình thu hồi và tinh sạch và có thể được sử dụng như một thao tác duy nhất Nó đặc biệt hữu ích cho việc tách các enzym ngoại bào và các chế phẩm không yêu cầu độ tinh khiết cao [38], [85] Đây là một kỹ thuật đơn giản và đòi hỏi ít năng lượng do đó dễ dàng để mở rộng quy mô và các hóa chất được sử dụng làm tác nhân gây tủa, chẳng hạn như ethanol và amoni sulfat, có thể được tái chế [85] Nhược điểm là chất kết tủa có thể chứa tạp chất [8], làm ảnh hưởng đến độ tinh khiết của sản phẩm và nhiệt độ phải được kiểm soát để tránh sự biến tính của enzym [85]
Hai tác nhân chính ảnh hưởng đến tương tác protein-dung môi và khả năng hòa tan protein là muối và dung môi hữu cơ Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử
6 dụng do có độ hòa tan trong nước cao và tính ưa nước nên giảm thiểu sự biến tính Đây cũng là một nguồn tài nguyên giá rẻ được sản xuất trên khắp thế giới [38] Ngoài ra ethanol có ưu điểm là nhiệt độ bay hơi thấp nên có thể thu hồi dễ dàng và độc tính thấp [64], [89] Còn tác nhân muối được dùng phổ biến nhất là muối amoni sulfat do tính đơn giản và không sinh nhiệt (như xảy ra với dung môi hữu cơ) cũng như độ hòa tan cao và không biến tính Tuy nhiên, amoni sulfat có tính ăn mòn và việc thải bỏ cần được giám sát Dung dịch enzym phải được làm lạnh đến 4-5°C để tránh sự biến tính của enzym trong quá trình kết tủa bằng muối [5], [25], [45]
1.2.2 Phương pháp tách chiết hai pha lỏng
Hệ thống hai pha lỏng (ATPS) được tạo thành từ hai pha lỏng thân nước không thể trộn lẫn Chúng được sử dụng làm phương pháp chiết lỏng-lỏng để tách các hợp chất sinh học, như protein, vật liệu di truyền, hạt nano sinh học, bào quan, virus và toàn bộ tế bào [24], [99], cũng như để loại bỏ các phân tử vô cơ [42] Kỹ thuật này thay thế việc sử dụng dung môi hữu cơ trong chiết lỏng-lỏng truyền thống [83], nhờ ưu điểm bảo tồn được các phân tử sinh học, đặc biệt là cấu trúc không gian của protein và do đó tránh được sự biến tính và bất hoạt của chúng Phương pháp này có nhiều ưu điểm do bao gồm quá trình cô đặc và tinh chế protein trong một thao tác duy nhất [76]
ATPS được hình thành bằng cách thêm hai hoặc nhiều polyme có tính ưa nước khác nhau, hoặc một polyme và một muối ở nồng độ và nhiệt độ tới hạn trong nước Tính không trộn lẫn một phần của các thành phần cho phép hình thành hai pha: pha trên được hình thành bởi polyme kỵ nước hơn và pha dưới giàu muối hoặc polyme thứ hai ưa nước hơn [19] Các đặc tính sinh học của phân tử đem tinh chế được bảo tồn do hàm lượng nước cao (65 đến 90% w/w ở cả hai pha), giúp giảm nguy cơ biến tính cũng như mất hoạt tính [12] ATPS có lợi thế kinh tế so với các kỹ thuật sắc ký truyền thống về khả năng thu hồi, tái sử dụng polyme, dễ sử dụng, chi phí thấp, thời gian tách pha ngắn và tiêu thụ năng lượng thấp [61], [62] Hơn nữa, ATPS không gây cháy nổ, an toàn với môi trường và dễ mở rộng quy mô, thể hiện độ phân giải tốt [9], [65], [72]
Tuy nhiên, ATPS có hai nhược điểm chính đó là khó khăn trong việc thu hồi protein ra khỏi pha polyme và các vấn đề về ăn mòn và xử lý muối đã sử dụng [76] Muối được thải vào môi trường nước sẽ dẫn đến nhu cầu xử lý nước và do đó làm tăng chi phí của các quá trình tiếp theo [76] Các thành phần có khả năng phân hủy sinh học hoặc tái chế được, chẳng hạn như muối citrat, đã được đề xuất để giảm thiểu những vấn đề này [67], [78]
Các đặc tính của protein như cấu trúc, tính kỵ nước và khối lượng phân tử ảnh hưởng đến sự phân bố và mức độ ưu tiên của chúng vào hai pha [65] Các thông số liên quan đến sự hình thành hệ thống cũng như loại muối và polyme, khối lượng mol và nồng độ của polyme, nồng độ ion muối và độ pH cũng ảnh hưởng đến sự phân bố của protein
7 [48] Hệ số phân bố của các phân tử sinh học vào pha polyme giảm khi khối lượng mol của polyme tăng lên hoặc với polyme ít nhóm hydroxyl hơn ở cùng nồng độ, dẫn đến tăng tính kỵ nước trong pha này [77] Do đó, khi khối lượng mol của PEG giảm, hệ số phân bố protein và sự di chuyển của protein sang pha giàu PEG sẽ tăng lên [65] Mặt khác, nồng độ muối cao hơn dẫn đến giảm khả năng hòa tan của protein ở pha dưới giàu muối, dẫn đến sự di chuyển của protein lên pha trên giàu polyme [24] Một sự tương tác xảy ra giữa các ion muối và các nhóm protein tích điện trái dấu, tạo ra một lớp kép các nhóm ion Vùng kỵ nước của protein dần dần lộ ra do tác dụng hydrat hóa của các phân tử muối xung quanh phân tử sinh học [65]
Một số nghiên cứu phân lập và tinh chế protease bằng ATPS được tóm tắt và trình bày ở Bảng 1.2
Polyethylene glycol (PEG) là một trong những polyme phổ biến nhất được sử dụng trong quá trình tạo pha do tính ổn định đáng kể và chi phí thấp Các enzym thủy phân protein được ưu tiên phân bố vào pha polyme, đặc biệt là những enzym có đặc tính kỵ nước [72]
Hầu hết ATPS polyme/muối bao gồm PEG và muối, đặc biệt là amoni, kali và natri/phosphat, sulfat hoặc cacbonat Ngoài ra các muối không độc hại có khả năng phân hủy sinh học như citrat và tartrat cũng đã được đề xuất [24] Việc bổ sung các ion muối có ảnh hưởng đến sự phân bố protein do tương tác tĩnh điện giữa chúng và các thành phần của hệ thống Những muối này có thể làm suy yếu hoặc tăng cường tương tác giữa các nhóm ion có điện tích trái dấu so với protein, do đó ảnh hưởng đến sự phân bố [77]
Hệ thống polyme/muối có ưu điểm so với hệ thống polyme/polyme, chẳng hạn như độ nhớt thấp của pha muối, sức căng bề mặt giữa hai pha thấp, chi phí muối thấp và độ chọn lọc cao hơn [42], [65] Việc sử dụng ATPS polyme/polyme đã được cải thiện do việc thay thế dextran bằng các polyme rẻ hơn Hệ thống PEG/natri polyacrylate (NaPA) đã được chế tạo với các thành phần trơ và tương đối rẻ, mang lại độ nhớt thấp và tách pha nhanh [18]
Hệ hai pha lỏng micell được hình thành bởi các chất hoạt động bề mặt cũng đã được nghiên cứu để phân chia các protease [10], [86] Các tác giả đã chứng minh rằng các enzym được ưu tiên phân chia ở pha dưới giàu chất hoạt động bề mặt, nơi các micell được hình thành
ATPS dựa trên chất lỏng ion (IL) cũng đã được khám phá để tinh chế các enzym thủy phân protein, chẳng hạn như papain [14] và bromelain [96].
B ả ng 1 2 Một số nghiên cứu tách chiết protease bằng ATPS
Nguồn chiết xuất Enzym ATPS Pha giàu enzym Độ tinh sạch (lần)
Nguồn tham khảo Gan tụy Tôm thẻ chân trắng Protease PEG1000/Magiesulfat Pha trên giàu PEG 8,60 65,50 [80]
URM4634 Protease PEG8000/Natricitrat Pha trên giàu PEG 3,95 55,80 [24]
Carica papaya Latex Papain PEG8000/Natricitrat/Alginat Pha trên giàu PEG 2,40 72 [76]
Penicillium restrictum Protease NaPA/PEG2000 Pha dưới giàu
Serratia marcescens P3 Keratinase PEG4000/Natricitrat
PEG4000/Amonisulfat Pha trên giàu PEG 2,70
Thân, vỏ, lá dứa Bromelain PEG4000/Amonisulfat Pha trên giàu PEG 11,80 66,38 [23]
PEG2000/Magiesulfat Pha trên giàu PEG 7,20
Nội tạng cá da tra dầu Protease PEG2000/Natricitrat Pha trên giàu PEG 12 273 [52]
Tụy bò Trypsin PEH3350/Natricitrat/Natriclorid Pha trên giàu PEG 2,55 99,7 [67]
Lá cây Keisinai Protease PluronicL61/Kalinitrat Pha dưới giàu chất diện hoạt 10,30 92 [10] Đu đủ Papain [Brim]Bromo/Dikalihydrophosphat Pha dưới giàu IL - 98,33 [14]
PROTEASE TUYẾN TỤY
Tụy là nơi sản sinh ra nhiều loại enzym có thể tiêu hóa phần lớn các thành phần thức ăn Do vậy hệ enzym tụy rất đa dạng, bao gồm protease để thủy phân protein, lipase để tiêu hóa mỡ, amylase giúp phân cắt đường, và nhiều loại enzym khác [20] Riêng nhóm protease tụy đã rất phong phú, có tới 5 loại enzym: trypsin, chymotrypsin, elastase, carboxypeptidase A và carboxypeptidase B Nhưng trong tụy những enzym này đều tồn tại dưới dạng tiền chất (zymogen hoặc proenzym) chưa hoạt động [20], [28]
1.3.1 Cấu trúc và tính chất
Trypsin (EC 3.4.21.4) trước khi hoạt động nó tồn tại chủ yếu dưới dạng zymogen là trypsinogen Trypsinogen bao gồm một chuỗi polypeptid gồm 229 acid amin và được liên kết chéo bằng sáu cầu nối disulfid [31] Sau khi được hoạt hóa, trypsinogen chuyển thành trypsin, là một polypeptid chuỗi đơn gồm 223 acid amin [49] Dạng trypsin tự nhiên này được gọi là β-trypsin Quá trình tự phân hủy β-trypsin (được phân cắt ở Lys131- Ser132) tạo ra α-trypsin được liên kết với nhau bằng cầu nối disulfid [31] Cấu trúc nếp gấp của trypsin được đặc trưng bởi “hai thùng beta” Đơn vị xúc tác nằm ở giao diện giữa các thùng này His 57 và Asp 102 có nguồn gốc từ thùng beta đầu N, trong khi Ser 195 có nguồn gốc từ thùng đầu C [95] Hình 1.1 minh họa cấu trúc nếp gấp của trypsin
Hình 1.1 Mô hình cấu trúc hai thùng beta của trypsin [95]
Ba acid amin ở vị trí xúc tác được hiển thị bằng màu xanh lá cây
Các dấu gạch ngang màu đen thể hiện sự kết nối giữa các đơn vị xúc tác
Các cầu nối disulfid được bảo toàn được hiển thị bằng màu vàng
10 Trypsin, chymotrypsin (EC 3.4.21.1) và elastase (EC 3.4.21.36) có cùng cấu trúc nếp gấp nhưng có độ đặc hiệu khác nhau: túi S1 của trypsin đặc hiệu cho Arg và Lys, trong khi túi S1 của chymotrypsin đặc hiệu cho các acid amin thơm Phe, Tyr và Trp Sự khác biệt này bắt nguồn từ các đơn vị acid amin bám ở đáy túi này: trypsin có Asp ở đáy cho phép hình thành cầu muối với Arg hoặc Lys; chymotrypsin có Ser ở đáy túi S1 đặc hiệu đối với acid amin thơm Elastase đặc hiệu cho các acid amin phân tử nhỏ do trong túi S1 có sự hiện diện của Val 216 và Thr 226 giúp ngăn các phân tử lớn xâm nhập [95]
Sự khác nhau này được minh họa trong Hình 1.2
Hình 1 2 Tính đặc hiệu của túi S1 của trypsin, chymotrypsin và elastase [95] Carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1) chứa một ion kẽm liên kết với một chuỗi polypeptid gồm 307 acid amin Các acid amin quan trọng với hoạt động xúc tác của enzym này là Glu 270, Arg 71, Arg 127, Asn 144, Arg 145 và Tyr 248 [22]
Carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2) có thành phần acid amin được xác định và tương tự như carboxypeptidase A, nhưng có hàm lượng serin thấp hơn, acid amin chứa lưu huỳnh và nitơ amid cao hơn Carboxypeptidase B cũng có một ion kẽm trên mỗi phân tử Các nghiên cứu đã cho thấy ion này là một cofactor của enzym [36]
1.3.1.2 Tính ch ất hóa lý
Tính chất hóa lý của các enzym protease trong tụy lợn được tóm tắt tại Bảng 1.3
B ả ng 1.3 Tính chất hóa lý của protease tụy [20], [28], [35], [43], [50]
Enzym Khối lượng phân tử (kDa) pI pH tối ưu
1.3.2 Cơ chế hoạt hóa và xúc tác của enzym
1.3.2.1 Cơ chế ho ạt hóa
Enzym phân giải protein được tuyến tụy tổng hợp và tiết ra dưới dạng chưa hoạt động (zymogen hoặc proenzym) Chúng chỉ có được hoạt tính thủy phân protein sau khi
11 được hoạt hóa bởi enzym enterokinase ở tá tràng Enzym này bắt đầu hoạt hóa các tiền chất của protease tuyến tụy bằng cách chuyển đổi trypsinogen thành trypsin Enterokinase tác động lên trypsinogen, loại bỏ chuỗi hexapeptid đầu N [valin-(acid aspartic)4-lysin], do đó phá vỡ các liên kết tĩnh điện bao phủ trung tâm hoạt động của trypsinogen [20] Điều này được thể hiện trong Hình 1.3
Hình 1.3 Sơ đồ thể hiện quá trình hoạt hóa trypsin bởi enterokinase [20]
V: Valine; A: Acid aspartic; L: Lysine; I: Isoleucine; G: Glycine; H: Histidine
S: Trung tâm hoạt động; -: liên kết tĩnh điện Trypsin lần lượt hoạt hóa các enzym tuyến tụy khác Enterokinase chỉ hoạt hóa trypsin nhưng không thể hoạt hóa chymotrypsinogen, proelastase và procarboxypeptidase Quá trình hoạt hóa các tiền enzym của các protease tụy được thể hiện ở Hình 1.4
Hình 1.4 Sơ đồ thể hiện quá trình hoạt hóa tiền enzym các protease tụy [20] 1.3.2.2 Cơ chế xúc tác
Trypsin, chymotrypsin, elastase đều là các serin protease, vị trí xúc tác được đặc trưng bởi bộ ba acid amin: His 57, Asp 102 và Ser 195 Mỗi acid amin đảm nhận một chức năng nhất định trong quá trình xúc tác Ser 195 chứa nhóm -OH có khả năng hoạt động như một nucleophil, tấn công nguyên tử C ở nhóm carbonyl của liên kết peptid trong cơ chất Một cặp electron trên nitơ của His 57 có khả năng tiếp nhận hydro từ
12 nhóm -OH Ser 195, do đó phối hợp tấn công liên kết peptid Nhóm cacboxyl trên Asp
102 lần lượt liên kết hydro với His 57, làm cho nguyên tử nitơ đề cập ở trên có độ âm điện lớn hơn nhiều [44]
Cơ chế xúc tác của ba enzym có thể được tổng quát qua 4 bước (i) Cơ chất liên kết với trung tâm hoạt động trên enzym, định vị nhóm carbonyl của các gốc acid amin về phía các gốc nucleophil Ser 195 trên enzym (ii) Acid amin His 57 trong vị trí hoạt động nhận proton từ nhóm -OH của Ser 195 Do đó, Ser 195 tấn công vào nhóm carbonyl trong liên kết peptid của cơ chất và tạo ra liên kết cộng hóa trị với cơ chất Điện tích âm phát triển trên nhóm carbonyl được ổn định nhờ hai proton amid trên phân tử của enzym (iii) Nitơ amid của cơ chất đẩy nguyên tử H cho His 57 bằng cách giải phóng phần đầu
C một cách tự do (iv) Cuối cùng, một phân tử nước từ quá trình thủy phân liên kết este được hình thành giữa peptid cơ chất và oxy Ser 195 của enzym, đồng thời tái tạo -OH của Ser 195 cho vòng xúc tác tiếp theo, sau đó là sự phân ly peptid cơ chất bị thủy phân [49]
Trong khi đó, carboxypeptidase A, B có trung tâm hoạt động đặc trưng bởi 6 acid amin Glu 270, Arg 71, Arg 127, Asn 144, Arg 145, Tyr 248 và 1 ion kẽm Có hai giả thuyết về cơ chế xúc tác của carboxypeptidase Thứ nhất, promoted-water pathway tạm dịch là “con đường thúc đẩy nước” Trong con đường này, Glu 270 đóng vai trò kép Vừa là một base chung để tạo điều kiện thuận lợi cho sự tấn công của nước liên kết kẽm vào nhóm carbonyl bằng cách chuyển một proton nước sang oxy carboxylate Vừa như một acid thông thường để chuyển proton này sang nhóm nitơ rời đi Cơ chế thứ hai là nucleophilic pathway - con đường nucleophilic nhưng không khả thi với cơ chất là peptid [100]
Protease từ tụy có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp chế biến và có ý nghĩa đặc biệt với y dược học
Protease cùng với lipase và amylase từ tụy có trong thành phần thuốc điều trị các bệnh liên quan đến chứng thiếu hụt enzym tụy như viêm tụy, tổn thương tuyến tụy, khiếm khuyết gen Zenpep, Pancreaze, Ultresa, Viokase, Pertzye là một số sản phẩm thuốc chứa enzym tuyến tụy ngoại tiết được FDA cấp phép lưu hành trên thị trường [82]
Trypsin và chymotrypsin được sử dụng như là các chất chống viêm trong điều trị chấn thương thể thao, nhiễm trùng vết thương, đau dây thần kinh tọa [81] Latha và cộng sự [55] đã sử dụng sự kết hợp trypsin:chymotrypsin theo tỷ lệ 6:1 làm chất chống viêm để điều trị cho bệnh nhân bỏng và nhận thấy kết quả vượt trội so với việc chỉ sử dụng trypsin Sự kết hợp của trypsin, chymotrypsin và papain được nghiên cứu trong điều trị ung thư Chế phẩm enzym này cho thấy giảm tác dụng phụ khi hóa trị và xạ trị, đồng
13 thời kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân [56] Ngoài ra, chymotrypsin còn có vai trò trong phẫu thuật điều trị đục thể tinh thể, hóa lỏng tinh trùng trong điều trị vô sinh, thủy phân protein nọc độc rắn [104] Trypsin và carboxypeptidase B đã được nghiên cứu để điều chế các thuốc có bản chất là protein như insulin từ proinsulin [51], thuốc ức chế dipeptidyl peptidase IV từ protein sữa bò [66] Đặc biệt, trypsin còn là protease được sử dụng thường xuyên nhất trong các thí nghiệm proteomics dựa trên phép đo khối phổ nhờ tính đặc hiệu phân tách đầu C của Arg và Lys Trypsin giúp phân cắt các chuỗi peptid dài hoặc protein thành các biến thể nhỏ hơn nằm trong khoảng phân tích của máy khối phổ Nhờ vậy mà có thể phân tích được các protein mục tiêu hay định lượng peptid [95] Cũng nhờ sự phân tách đặc hiệu Arg-Lys, nên gần đây trypsin được sử dụng như một cảm biến sinh học, sử dụng các protein chứa Arg-Lys làm cơ chất cho sơ đồ phát hiện [49]
1.3.3.2 Ứ ng d ụng trong các lĩnh vự c khác
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
Tụy lợn được thu mua, bảo quản ở nhiệt độ - 20°C cho đến khi sử dụng
Các hóa chất sử dụng đều đạt tiêu chuẩn phân tích, được liệt kê ở Bảng 2.1
B ả ng 2 1 Các hóa chất sử dụng
Tên hóa chất Hãng sản xuất (Nước)
Amoni sulfat Xilong (Trung Quốc)
Dinatri hydrophosphat Xilong (Trung Quốc)
Natri hydroxyd Xilong (Trung Quốc)
Acid tricloacetic (TCA) Xilong (Trung Quốc)
Coomassie Brilliant Blue G250 Bio Basic (Canada)
Coomassie Brilliant Blue R250 Bio Basic (Canada)
Tris-HCl Bio Basic (Canada)
Tris-Base Bio Basic (Canada)
Bis-acrylamid Bio Basic (Canada)
Amoni persulfat (APS) Bio Basic (Canada)
Bromophenol blue Merck (Đức) β-mercaptoethanol Bio Basic (Canada)
Acid acetic Xilong (Trung Quốc)
Các dung dịch và đệm sử dụng được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong Bảng 2.2
B ả ng 2 2 Thành phần các loại đệm và dung dịch
Dung dịch Thành phần, nồng độ
Thuốc thử Bradford 100mg Coomassie Brilliant Blue G250, 50ml ethanol 95%, 100ml acid phosphoric 85%, 850ml nước cất
Acrylamid 30% Acylamid 30% (w/v), bis-acylamid 1% (w/v) Đệm gel tách Tris-HCl 1,5M, SDS 0,4%, pH 8,8 Đệm gel gom Tris-HCl 0,5M, SDS 0,4%, pH 6,8 Đệm chạy có SDS 10X Tris-base 250mM, SDS 1%, glycin 2M, pH 8,3 Đệm mẫu 4X Tris-HCl 250mM pH 6,8, SDS 8%, glycerol 40%, bromophenol blue 0,02%, thêm β-mercaptoethanol 20% trước khi sử dụng
Dung dịch tẩy màu gel Methanol 50%, acid acetic 10% trong nước
Dung dịch nhuộm gel Coomassie Brilliant Blue R250 0,25 % (w/v) pha trong dung dịch tẩy màu gel Đệm pH 7,5 0,2M KH2PO4-KOH, pH 7,5
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phòng thực tập Bộ môn Hóa Sinh
- Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội được liệt kê ở Bảng 2.3
B ả ng 2 3 Các thiết bị sử dụng
Tên thiết bị Xuất xứ
Bể điều nhiệt Memmert Đức
Máy đo pH700 Uutech Singapore
Máy lắc rung IKA KS125 basic Đức
Máy ly tâm HERMLE Z 207 A Đức
Máy ly tâm lạnh Hanil Supra R22 Hàn Quốc
Máy khuấy từ Daihan MSH-20A Hàn Quốc
Máy quang phổ UV-Vis Hitachi U-5100 Nhật Bản
Hệ thống điện di đứng mini BIO-RAD Mỹ
Tủ lạnh 4°C, -20°C Samsung Hàn Quốc
Cân kỹ thuật AND EK-410i Nhật Bản
Cân phân tích AND GF-224A Nhật Bản
- Các ống Falcon 15ml, 50ml
- Các ống Eppendorf 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml
- Micropipet cà đầu cụn thể tớch 0,5-10 àl, 10-100 àl, 100-1000 àl
- Dụng cụ thủy tinh: Ống nghiệm, cốc có mỏ, pipet paster, đũa thủy tinh, bình định mức, ống đong, chai đựng hóa chất
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để thực hiện để tài, trước hết, chúng tôi chiết lấy dịch tụy đồng nhất từ tuyến tụy lợn thu mua được Sau đó, tách chiết enzym protease theo ba con đường Thứ nhất, sử dụng phương pháp kết tủa để thu lấy enzym với một bước duy nhất Thứ hai, kết hợp hai phương pháp kết tủa và sử dụng ATPS Thứ ba, tách chiết protease qua một bước ATPS Sau đó kiểm tra hoạt tính cũng như độ tinh sạch protease từ dịch tụy Đồng thời đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết bằng ATPS: thành phần hai pha (muối và PEG), tỷ lệ hai pha, pH
Hình 2 1 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu
Tách chiết protease từ tụy lợn Đánh giá hiệu quả tách chiết của ATPS
Tách chiết protease qua một bước kết tủa
Tách chiết protease qua hai bước: kết tủa và ATPS
Tách chiết protease qua một bước ATPS Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả tách chiết bằng ATPS
Tỷ lệ hai pha pH
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Chiết tách protease từ tụy lợn
Hình 2 2 Quy trình tách chiết protease từ tụy lợn 2.3.1.1 Chi ết lấ y d ịch tụ y đồ ng nh ất
Tụy lợn được làm sạch và xay nhuyễn với đệm phosphat pH 7,5 Sau đó, chia vào các ống falcon và ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút tại 4°C, thu lấy phần dịch Kiểm tra hoạt tính của dịch tụy đồng nhất
2.3.1.2 Tách chi ết b ằng phương pháp kết tủa
Nguyên lý Ở nồng độ muối cao, các ion cô lập các phân tử nước bao quanh protein trong lớp hydrat hóa, làm giảm độ hòa tan và kết tủa protein Trong khi đó dung môi hữu cơ khiến hằng số điện ly của dung dịch nước giảm, từ đó gây ra sự gia tăng tương tác tĩnh điện của các vùng protein tích điện trái dấu, khiến protein kết tủa [8]
Kết tủa 10ml dịch tụy đồng nhất lần lượt bằng dung dịch muối amoni sulfat bão hòa và ethanol 70° với các thể tích là 2,5ml, 5,0ml, 7,5ml, 10,0ml tại 4°C Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút tại 4°C, thu lấy tủa Hòa tan tủa với 15ml dung dịch đệm pH 7,5 được dịch chiết enzym thô Chọn mẫu cho hoạt tính cao đem tách chiết bằng ATPS
Dịch enzym tinh sạch Xay, hòa tan, ly tâm
Kết tủa, ly tâm, hòa tan
2.3.1.3 Tách chi ết b ằ ng ATPS
Vùng kỵ nước của protein dần dần lộ ra do tác dụng hydrat hóa của các phân tử muối xung quanh phân tử sinh học [65] cộng thêm nồng độ muối cao hơn làm giảm khả năng hòa tan của protein ở pha dưới giàu muối, dẫn đến sự di chuyển của protein sang pha trên giàu polyme và kỵ nước hơn [24]
Chuẩn bị dung dịch gốc: Pha các dung dịch gốc PEG4000 40% (w/w), PEG6000
40% (w/w), natri citrat 30% (w/w), amoni sulfat 30% (w/w), dinatri hydrophosphat 30% (w/w)
Thay đổi thành phần hai pha: Cân khoảng 10,00g dung dịch PEG gốc (4000 hoặc
6000), thêm 2ml dịch enzym cần tách chiết (dịch tụy đồng nhất hoặc dịch chiết enzym thô), thêm 5ml nước và khuấy đều trên máy khuấy từ Sau đó thêm từ từ dung dịch muối gốc đến khi hỗn hợp chuyển đục thì dừng lại Để yên tại 4°C đến khi hai pha tách riêng hoàn toàn Kiểm tra hoạt tính pha trên của mỗi hệ PEG và muối cho hệ có hoạt tính cao nhất được đem đi thay đổi tỷ lệ hai pha và pH
Thay đổi tỷ lệ hai pha: Cân chính xác khoảng 10,0000g dung dịch PEG gốc, thêm
2ml dịch tụy đồng nhất, thêm lần lượt 0ml, 2,5ml, 5ml, 7,5ml, 10ml nước, khuấy đều trên máy khuấy từ Sau đó thêm từ từ dung dịch muối gốc đến khi hỗn hợp chuyển đục thì dừng lại Lưu ý đem cân hỗn hợp sau mỗi bước để tính toán hàm lượng từng thành phần Để yên tại 4°C đến khi hai pha tách riêng hoàn toàn Kiểm tra hoạt tính pha trên của mỗi hệ
Thay đổi pH: Điều chỉnh pH của dung dịch muối gốc đến các khoảng giá trị 5-
5,5; 6,5-7; 8,5-9 bằng dung dịch acid hydroclorid 1M và natri hydroxid 1M Cân khoảng 10,00g dung dịch PEG gốc, thêm 2ml dịch tụy đồng nhất, 5ml nước và dung dịch muối gốc với các pH khác nhau đến khi hỗn hợp chuyển đục thì dừng lại, khuấy đều trên máy khuấy từ Để yên tại 4°C đến khi hai pha tách riêng hoàn toàn Kiểm tra hoạt tính pha trên của mỗi hệ
2.3.2 Xác định hoạt tính enzym protease
Dựa theo phương pháp xác định hoạt tính protease trong dịch tụy của Dược điển
Nguyên lý: Dựa vào khả năng thủy phân protein của protease Hoạt tính của enzym được xác định theo lượng tyrosin giải phóng ra từ phản ứng thủy phân casein 1% trong một đơn vị thời gian Nồng độ tyrosin trong dung dịch tỷ lệ thuận với độ hấp thụ quang tại bước sóng 280nm Lượng tyrosin giải phóng ra được xác định dựa vào đồ thị chuẩn tyrosin
20 Đơn vị hoạt độ: Một đơn vị hoạt độ protease theo Dược điển Mỹ (USP 43) là lượng tyrosin (tương đương số lần 15nmol tyrosin) giải phóng ra từ phản ứng thủy phân casein của 1 ml protease trong một phút ở điều kiện nhất định (U/ml enzym)
Dựng đường chuẩn Tyrosin: Tyrosin chuẩn được hòa tan hoàn toàn trong nước với dải nồng độ 50-500 àg/ml Sau đú, đo độ hấp thụ ở bước súng 280nm Kết quả đường chuẩn Tyrosin có phương trình y = 0,0007x – 0,0055 với y là độ hấp thụ ở bước súng 280nm, x là nồng độ Tyrosin (àg/ml)
Pha dung dịch Casein 1%: Cân 1g casein, thêm 80ml nước, chỉnh pH 9-10 bằng natri hydroxid 1M Khuấy trên máy khuấy từ tại 60°C đến khi casein tan hoàn toàn Điều chỉnh về pH 7-8 bằng acid hydroclorid 0,1M Thêm nước vừa đủ 100ml
Chuẩn bị mẫu trắng: Hút 0,1ml dịch enzym pha loãng với 0,9ml dung dịch đệm pH 7,5, ủ 10 phút ở 40°C Thêm 2ml dung dịch TCA 10%, lắc đều và ủ 60 phút ở 40°C Sau đó bổ sung 2ml dung dịch casein 1%, lắc đều, để yên 10 phút Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, thu lấy dịch, đem đo quang ở bước sóng 280nm
Chuẩn bị mẫu thử (lặp lại 3 lần): Hút 0,1ml dịch enzym pha loãng với 0,9ml dung dịch đệm pH 7,5, ủ 10 phút ở 40°C Thêm 2ml dung dịch casein 1%, lắc đều và ủ chính xác 60 phút ở 40 o C Sau đó bổ sung 2ml dung dịch TCA 10%, lắc đều và để yên 10 phút Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, thu lấy dịch, đem đo quang ở bước sóng 280nm
2.3.3 Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [21] y = 0,0007x - 0,0055 R² = 1
Nồng độ Tyrosin (àg/ml)
Nguyên lý: Các protein phản ứng với Coomassie brilliant blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 595nm, độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ protein Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò
Dựng đường chuẩn: Albumin huyết thanh bò (BSA) được pha trong nước cất với dải nồng độ từ 0,10 đến 1,25 mg/ml Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm giữa 0,1ml dung dịch BSA chuẩn và 3 ml dung dịch Bradford Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595nm (ống trắng là 0,1ml nước và 3ml dung dịch Bradford) Kết quả đường chuẩn protein có phương trình y = 1,0985x + 0,0507 với y là độ hấp thụ ở bước sóng 595nm, x là nồng độ BSA (mg/ml)
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
KẾT QUẢ
3.1.1 Đánh giá hiệu quả tách chiết của ATPS
3.1.1.1 Chi ết lấ y d ịch tụ y đồ ng nh ất
400g tụy lợn được làm sạch mỡ, hệ mạc treo, sau đó xay nhuyễn trong 1000ml dung dịch đệm pH 7,5 để giải phóng và hòa tan enzym protease Đem hỗn hợp ly tâm thu lấy dịch tụy đồng nhất Dịch tụy ban đầu có hoạt tính riêng là 429,935 ± 3,625 (U/mgpr)
Có thể nhận thấy, dịch chiết từ tụy lợn bằng các phương pháp đơn giản (xay, hòa tan) có hoạt tính protease Tuy nhiên, hoạt tính riêng của dịch chiết này còn thấp Bởi vậy, chúng tôi sẽ thực hiện các biện pháp tách chiết protease để nâng cao hoạt tính riêng của dịch chiết Protease được tách chiết theo ba con đường: một bước với phương pháp kết tủa, một bước với ATPS, hai bước với phương pháp kết tủa kết hợp ATPS nhằm đánh giá hiệu quả của ATPS trong việc tách chiết enzym protease từ tụy lợn
3.1.1.2 Tách chi ết protease qua một bướ c k ết tủa
Kết tủa protease trong 10ml dịch chiết tụy lợn bằng dung dịch muối amoni sulfat bão hòa và ethanol 70° tại 4°C với các tỷ lệ khác nhau Ly tâm lạnh 4°C thu lấy tủa Hòa tan tủa trong 15ml dung dịch đệm pH 7,5 thu được dịch chiết enzym thô Kết quả kiểm tra hoạt tính và độ tinh sạch được trình bày trong Bảng 3.1
B ả ng 3.1 Kết quả tách chiết protease qua một bước kết tủa
Thể tích – Tác nhân kết tủa
Hoạt tính riêng (U/mg pr) Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) 2,5ml - (NH4)2SO4 bh 451,432 ± 19,890 1,05 ± 0,01 67,1 ± 0,4 5,0ml - (NH4)2SO4 bh 532,627 ± 4,424 1,24 ± 0,06 88,9 ± 2,5 7,5ml - (NH4)2SO4 bh 524,521 ± 36,024 1,22 ± 0,17 92,9 ± 7,1 10,0ml - (NH4)2SO4 bh 498,725 ± 8,228 1,16 ± 0,03 97,5 ±1,4 2,5ml - EtOH 70° 511,623 ± 6,704 1,19 ± 0,07 27,7 ± 1,0 5,0ml - EtOH 70° 494,425 ± 6,281 1,15 ± 0,06 34,9 ± 1,3 7,5ml - EtOH 70° 460,030 ± 3,893 1,07 ± 0,02 24,9 ± 0,4 10,0ml - EtOH 70° 503,024 ± 7,540 1,17 ± 0,02 33,9 ± 0,4
Tách chiết bằng phương pháp kết tủa có khả năng làm tăng nhẹ hoạt tính riêng Độ tinh sạch của mẫu tách chiết nhìn chung vẫn còn thấp, dao động trong khoảng 1,05 đến 1,24, cao nhất ở mẫu kết tủa bằng 5,0ml dung dịch amoni sulfat bão hòa Hiệu suất thu hồi hoạt tính khác nhau rõ rệt giữa hai nhóm tác nhân Kết tủa bẳng dung dịch amoni sulfat bão hòa cho hiệu suất thu hồi hoạt tính tương đối cao, tăng tỷ lệ thuận theo lượng
25 tác nhân sử dụng, từ 67,1% đến 97,5% Trong khi đó, con số này ở nhóm tủa bằng ethanol 70° rất khiêm tốn, dao động từ 24,9% đến 34,9% Cân nhắc giữa độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính, lựa chọn mẫu kết tủa bằng 5,0ml dung dịch amoni sulfat bão hòa có độ tinh sạch cao nhất (1,24 lần) và hiệu suất thu hồi hoạt tính tương đối cao (88,9%) để tiếp tục tách chiết bằng ATPS
3.1.1.3 Tách chi ết protease qua hai bướ c k ết tủa và ATPS
Mỗi 2ml dịch chiết enzym sau kết tủa được tách chiết với 6 hệ ATPS khác nhau được tạo thành bởi PEG4000, PEG6000 và 3 muối: amoni sulfat ((NH4)2SO4), natri citrat (Na3C6H5O7), dinatri hyrophosphat (Na2HPO4) Kết quả tách chiết được trình bày trong Bảng 3.2
B ả ng 3 2 Kết quả tách chiết enzym qua hai bước kết tủa và ATPS
Hệ PEG/Muối Hoạt tính riêng
(U/mg pr) Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) PEG4000/(NH4)2SO4 884,972 ± 6,573 2,06 ± 0,02 75,7 ± 0,3 PEG4000/Na3C6H5O7 983,018 ± 9,485 2,29 ± 0,02 58,2 ± 0,3 PEG4000/Na2HPO4 804,154 ± 3,474 1,87 ± 0,01 51,7 ± 0,1 PEG6000/(NH4)2SO4 1043,788 ± 20,241 2,43 ± 0,05 63,3 ± 0,7 PEG6000/ Na3C6H5O7 1087,287 ± 39,166 2,53 ± 0,09 60,4 ± 1,3 PEG6000/ Na2HPO4 663,023 ± 8,917 1,54 ± 0,02 47,6 ± 0,4
Từ bảng số liệu trên, có thể nhận ra hai xu hướng chính Thứ nhất, sau khi tách chiết bằng các ATPS khác nhau, hoạt tính riêng đều tăng so với trước đó Độ tinh sạch của các mẫu dao động từ 1,54 đến 2,53 lần, cao nhất ở mẫu tách chiết bằng hệ PEG6000/Natri citrat Thứ hai, hiệu suất thu hồi hoạt tính của các mẫu nhìn chung đều giảm, dao động từ 47,6% đến 75,7%, cao nhất ở mẫu tách chiết bằng hệ PEG4000/Amoni sulfat
3.1.1.4 Tách chi ết protease qua một bướ c ATPS
Dựa vào ưu điểm có khả năng vừa cô lập vừa tinh sạch enzym chỉ với một bước của ATPS, thực hiện tách chiết dịch tụy ban đầu qua một bước ATPS duy nhất Sau đó so với dịch tụy ban đầu, dịch chiết enzym tách chiết bằng phương pháp kết tủa và các dịch tách chiết qua hai bước kết tủa kết hợp ATPS Kết quả tách chiết qua một bước ATPS được trình bày trong Bảng 3.3
B ả ng 3.3 Kết quả tách chiết enzym qua một bước ATPS
Hệ PEG/Muối Hoạt tính riêng
(U/mg pr) Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) PEG4000/(NH4)2SO4 1149,794 ± 17,784 2,67 ± 0,04 81,4 ± 1,3 PEG4000/ Na3C6H5O7 1544,352 ± 29,496 3,59 ± 0,07 83,3 ± 1,6 PEG4000/ Na2HPO4 1271,094 ± 28,589 2,96 ± 0,07 57,0 ± 1,0 PEG6000/(NH4)2SO4 1254,365 ± 6,282 2,92 ± 0,01 78,5 ± 0,4 PEG6000/ Na3C6H5O7 1581,052 ± 39,046 3,68 ± 0,09 83,1 ± 2,0 PEG6000/ Na2HPO4 923,679 ± 0,944 2,15 ± 0,00 59,9 ± 0,4
Từ số liệu, có thể thấy tách chiết bằng các ATPS khác nhau đều giúp làm tăng hoạt tính riêng của enzym Độ tinh sạch dao động trong khoảng 2,15 đến 3,68 lần, cao nhất ở hệ PEG6000/Natri citrat Hiệu suất thu hồi hoạt tính tương đối cao, có một số hệ cho hiệu suất trên 80% như PEG4000/Natri citrat (83,3%), PEG6000/Natri citrat (83,1%), PEG4000/Amoni sulfat (81,4%)
Mặt khác, dễ dàng nhận thấy mẫu dịch enzym được tách chiết qua một bước ATPS đều có độ tinh sạch cao hơn mẫu tách chiết bằng phương pháp kết tủa Còn khi đối chiếu với các mẫu tách chiết qua hai bước kết tủa và ATPS, các mẫu qua một bước ATPS với thành phần tương ứng đều cho độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính cao hơn
Lấy các mẫu dịch tụy đồng nhất ban đầu, dịch chiết enzym thu được nhờ kết tủa với 5,0ml dung dịch amoni sulfat bão hòa, dịch tách chiết bằng PEG6000/Natri citrat đơn độc hoặc kết hợp với phương pháp kết tủa đi chạy điện di SDS-PAGE thu được kết quả như Hình 3.1
Hình 3.1 Điện di đồ quá trình tách chiết protease từ tụy lợn bằng SDS-PAGE
M: Marker; 1: Dịch tụy đồng nhất; 2: Dịch chiết enzym thô sau kết tủa; 3: Dịch chiết qua hai bước ATPS và kết tủa; 4: Dịch chiết qua một bước ATPS
Từ điện di đồ, dễ dàng nhận thấy qua các bước tách chiết, số băng protein giảm so với dịch đem tách chiết Dịch tụy đồng nhất có các băng protein trải từ 0 đến khoảng dưới 66,2 kDa Qua bước tách chiết bằng 5,0ml dung dịch muối amoni sulfat bão hòa, số băng protein giảm, chỉ còn các băng từ khoảng xấp xỉ 23 kDa trở lên Tiếp tục tách chiết bằng ATPS, điện di đồ còn lại 4 băng protein rõ nét, trong đó có 1 băng 25 kDa, 1 băng ngay trên 25 kDa, 1 băng ngay dưới 35 kDa, 1 băng ngay trên 35 kDa Trong khi đó, đem tách chiết dịch ban đầu trực tiếp bằng ATPS, cũng thu được 4 băng tương tự nhưng có 2 băng nhạt màu hơn (băng ngay trên 25 kDa và băng ngay trên 35 kDa) so với 2 băng còn lại (băng 25 kDa, băng ngay dưới 35 kDa)
3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả tách chiết bằng ATPS
3.1.2.1 Thay đổi các thành phầ n c ủa ATPS Ảnh hưởng của thành phần hai pha trong ATPS còn phụ thuộc vào bản chất của dịch enzym đem tách chiết Vì vậy, để có cái nhìn tổng quát, thực hiện khảo sát ảnh hưởng của thành phần hai pha đồng thời trên mẫu dịch tụy đồng nhất ban đầu và dịch chiết enzym sau khi tách chiết bằng phương pháp kết tủa Kết quả được trình bày trong
B ả ng 3.4 Kết quả tách chiết enzym bằng ATPS từ dịch tụy ban đầu và dịch enzym thô sau kết tủa ATPS
Từ dịch chiết ban đầu Từ dịch chiết enzym thô Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) PEG4000/(NH4)2SO4 2,67 ± 0,04 81,4 ± 1,3 1,66 ± 0,01 85,1 ± 0,5 PEG4000/ Na3C6H5O7 3,59 ± 0,07 83,3 ± 1,6 1,85 ± 0,02 65,5 ± 0,5 PEG4000/ Na2HPO4 2,96 ± 0,07 57,0 ± 1,0 1,51 ± 0,01 58,1 ± 0,2 PEG6000/(NH4)2SO4 2,92 ± 0,01 78,5 ± 0,4 1,96 ± 0,04 71,2 ± 1,1 PEG6000/ Na3C6H5O7 3,68 ± 0,09 83,1 ± 2,0 2,04 ± 0,07 67,9 ± 1,9 PEG6000/ Na2HPO4 2,15 ± 0,00 59,9 ± 0,4 1,24 ± 0,02 53,5 ± 0,6
H iệ u suấ t t hu hồ i ho ạt tí nh (% ) Đ ộ tinh sạ ch (lầ n) Độ tinh sạch Hiệu suất thu hồi hoạt tính
Hình 3 2 Độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính khi tách chiết enzym bằng các
ATPS khác nhau từ dịch enzym sau kết tủa (A) và dịch tụy ban đầu (B)
Từ số liệu thu được, có thể nhận thấy ATPS cho độ tinh sạch cao hơn khi đi từ dịch tụy ban đầu so với dịch chiết enym thô Trong khi không có sự khác nhau về hiệu suất thu hồi hoạt tính ở các hệ sử dụng muối amoni sulfat và dinatri hydrophosphat, thì ở hệ muối natri citrat, đi từ dịch chiết enzym thô sau tủa lại cho hiệu suất thu hồi thấp hơn đáng kể so với từ dịch tụy ban đầu
BÀN LUẬN
3.2.1 Về kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết của ATPS
Một phương pháp tách chiết enzym tốt là phương pháp cân bằng được hiệu quả (độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính) và chi phí (thời gian, hóa chất) Phương pháp kết tủa thường được lựa chọn để bắt đầu quá trình tách chiết nhờ tính đơn giản, tốn ít năng lượng và hóa chất gây tủa có thể tái chế được [85] Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là độ tinh sạch thấp, đặc biệt là đối với nguồn chiết enzym giàu tạp protein như tụy lợn [85] Do vậy, sau bước kết tủa, dịch chiết enzym thô này sẽ được tinh sạch tiếp qua các bước sắc ký để thu được dịch enzym có độ tinh sạch cao Mặc dù giúp hệ số tinh sạch tăng lên rất nhiều lần nhưng các phương pháp sắc ký thường rất phức tạp, đắt tiền và không dễ mở rộng quy mô, dẫn đến chi phí sản xuất tăng lên [38] Nhu cầu về một phương pháp vừa đem lại hiệu quả tách chiết cao nhưng có mức chi phí vừa phải đã được đặt ra Phương pháp tách chiết bằng ATPS như là một giải pháp thay thế tiềm năng Phương pháp này có ưu điểm về khả năng thu hồi do bảo tồn được các đặc tính của protein nhờ hàm lượng nước cao, tái sử dụng polyme, dễ sử dụng, chi phí thấp, thời gian tách pha ngắn và tiêu thụ năng lượng thấp [62], [63]
Dựa trên các đặc điểm này, chúng tôi xây dựng quy trình tách chiết enzym tụy lợn từ dịch tụy đồng nhất theo ba con đường Con đường thứ nhất, chỉ sử dụng phương pháp kết tủa để tách chiết protease Con đường thứ hai, sử dụng ATPS để tách chiết dịch enzym thô thu được bằng phương pháp kết tủa Con đường thứ ba, sử dụng độc lập ATPS để tách chiết dịch tụy đồng nhất ban đầu do ATPS có ưu điểm bao gồm quá trình cô đặc và tinh chế protein trong một bước duy nhất ATPS của PEG với các muối được ưu tiên sử dụng do PEG có tính ổn định cao và chi phí thấp [72] Trong khi đó hệ polyme/muối có ưu điểm là độ nhớt thấp của pha muối, tách pha nhanh, chi phí muối thấp và độ chọn lọc cao [42], [65]
3.2.1.1 V ề k ết quả tách chiết protease qua một bướ c k ết tủa
Tách chiết bằng phương pháp kết tủa nói chung cho độ tinh sạch không cao do nhược điểm của phương pháp là tính chọn lọc thấp đặc biệt là với nguồn chiết từ động vật có nhiều tạp protein
Với dung dịch muối amoni sulfat bão hòa, khi lượng muối cho vào ít, những protein có khối lượng phân tử lớn có khả năng bị kết tủa tốt hơn Trong khi các protease có trọng lượng phân tử nhỏ hơn, do đó tủa thu được chứa ít protease, chủ yếu là tạp protein khối lượng lớn Khi tăng dần lượng muối thêm vào, đến lượt các protease bị kết tủa Do đó, lượng protease trong tủa thu được tăng mạnh hơn tạp protein, kéo theo cả độ tinh sạch và độ thu hồi hoạt tính tăng Tiếp tục thêm muối, khi các protease đã bị kết
33 tủa gần hết, lúc này sẽ xuất hiện sự gia tăng mạnh các tạp protein khối lượng phân tử nhỏ hơn có trong tủa thu được Điều này dẫn đến độ tinh sạch có xu hướng giảm dần nhưng do protease vẫn tiếp tục được kết tủa thêm nên hiệu suất thu hồi hoạt tính tăng nhẹ đến gần tuyệt đối Giả thuyết này có thể được quan sát qua điện di đồ (Hình 3.1) Mẫu dịch tụy ban đầu (1) có các băng protein trải dài từ khối lượng nhỏ đến lớn Sau khi tinh sạch bằng dung dịch amoni sulfat bão hòa với tỷ lệ cho độ tinh sạch cao nhất (2), những băng protein có khối lượng phân tử từ xấp xỉ từ 23 kDa trở lên đậm hơn, trong khi các băng protein có khối lượng phân tử nhỏ hơn mờ dần
Với tác nhân tủa là ethanol 70°, không chỉ độ tinh sạch mà hiệu suất thu hồi hoạt tính cũng rất thấp Điều này có thể là do sự biến tính không hồi phục xảy ra khi tương tác giữa dung môi hữu cơ và vùng kỵ nước bên trong dẫn đến sự phá vỡ các dạng thứ cấp, chẳng hạn như chuỗi xoắn ốc và tấm β Trong khi đó, kết tủa bằng muối đã khắc phục được nhược điểm này, làm cho hiệu suất thu hồi hoạt tính ở những mẫu này rất cao
3.2.1.2 V ề k ết quả tách chiết protease qua hai bướ c k ết tủa và ATPS
Sử dụng ATPS sau phương pháp kết tủa cho thấy hiệu quả tách chiết tốt hơn phương pháp kết tủa đơn độc, độ tinh sạch được cải thiện Điều này được chứng minh qua điện di đồ, mẫu được tách chiết thêm bằng ATPS (3) cho 4 băng protein mảnh, rõ nét Trong khi mẫu chỉ dừng lại ở bước kết tủa (2) cho số băng protein nhiều hơn, dày hơn
Tuy nhiên hiệu suất thu hồi hoạt tính có xu hướng giảm Có 2 lý do chính dẫn đến sự thụt giảm của hiệu suất thu hồi hoạt tính Thứ nhất, có thể do thất thoát protease Khi sử dụng ATPS, tuy các protease được ưu tiên đẩy lên pha trên, nhưng vẫn còn một lượng nhất định ở pha dưới giàu muối Tùy vào tương tác giữa của protease với thành phần hai pha mà mức độ ưu tiên này cao hay thấp, dẫn đến sẽ có những hệ cho độ ưu tiên thấp khiến protease còn lại ở pha dưới với lượng tương đối nhiều, gây thất thoát Thứ hai, protease có khả năng tự phân hủy do hoạt tính cao hay bị bất hoạt bởi pH hoặc tạo phức với các chất ức chế nội sinh Do đó, càng trải qua nhiều bước tinh chế, hiệu suất thu hồi hoạt tính càng giảm
3.2.1.3 V ề k ết quả tách chiết protease qua một bướ c ATPS
Tách chiết qua một bước ATPS khắc phục đồng thời nhược điểm của cả hai con đường trên Vừa đảm bảo tính chọn lọc cao hơn nhờ sự tương tác với thành phần hai pha khiến cho các protease được ưu tiên đẩy lên pha trên giàu PEG hơn các protein khác, vừa giảm sự hao hụt protease do chỉ trải qua một bước tách chiết
Cụ thể, từ Hình 3.1 có thể thấy điện di đồ của mẫu sau kết tủa (2) có nhiều băng protein trải dài ở các khối lượng phân tử khác nhau chứng minh tính kém chọn lọc của phương pháp này Mặt khác, điện di đồ của mẫu sử dụng ATPS (4) có 4 băng mảnh, nét ở xung quanh khoảng 25-35 kDa, gần với khối lượng lý thuyết của các protease tụy chứng minh tính chọn lọc cao của phương pháp này Với hiệu suất thu hồi hoạt tính trên 80%, ATPS đã thể hiện được điểm mạnh của mình là duy trì được các đặc tính của enzym, nhờ đó giảm sự biến tính và mất hoạt tính Trong khi đó, đây lại là nhược điểm của phương pháp kết tủa, enzym có thể bị biến tính trong quá trình kết tủa dẫn đến mất hoạt tính, đặc biệt là khi sử dụng tác nhân kết tủa là dung môi hữu cơ và khi nhiệt độ không được kiểm soát
Tuy nhiên, sử dụng ATPS sau bước kết tủa lại không đạt được hiệu quả như dùng đơn độc Mặc dù, độ tinh sạch được cải thiện nhưng không nhiều, không những thế qua thêm một bước tách chiết đã khiến giảm hiệu suất thu hồi hoạt tính Điều này có thể giải thích rằng phương pháp kết tủa đã làm mất đi một số thành phần có tác dụng hỗ trợ đẩy protease lên pha trên, hoặc phân tử protease đã bị biến đổi một phần sau khi kết tủa, dẫn đến thay đổi khả năng phân bố và mức độ ưu tiên của chúng Có thể nhìn thấy điều này qua điện di đồ, mẫu xuất phát từ dịch tụy ban đầu (4) có 4 băng mảnh, trong đó 2 băng đậm màu hơn 2 băng còn lại; còn mẫu từ dịch sau kết tủa (3) cả 4 băng đều đậm và dày hơn
Nghiên cứu tách chiết protease từ gan tụy của tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp sử dụng ATPS của Senphan và cộng sự (2014) cho độ tinh sạch 8,60 lần và hiệu suất thu hồi hoạt tính 65,50% [80] Kết quả này cao hơn về độ tinh sạch nhưng có hiệu suất thu hồi hoạt tính thấp hơn so với chúng tôi Tuy nhiên trong nghiên cứu này đã sử dụng thêm hệ thống phân bố ba pha (TPP) giúp tăng hiệu quả tinh sạch Trải qua thêm một bước tinh sạch nữa khiến hiệu suất thu hồi của nghiên cứu này khá thấp so với nghiên cứu của chúng tôi Một phương pháp khác giúp tăng độ tinh sạch gấp 2 lần khi sử dụng ATPS để tách chiết protease từ tụy bò đã được đề cập đến trong nghiên cứu của Rocha và cộng sự (2012) [75] Nghiên cứu đã sử dụng thuốc nhuộm triazin tự do để tạo phối tử với trypsin và chymotryosin giúp thay đổi hệ số phân bố của 2 enzym này trong ATPS, từ đó chúng được ưu tiên đẩy lên pha trên giàu PEG hơn
Do hạn chế về mặt thời gian, nghiên cứu của này vẫn chưa đi vào giải quyết một vấn đề của ATPS đó chính là khó khăn trong việc thu hồi enzym từ pha giàu PEG Một giải pháp gọi là chiết ngược (BE) đã được đề ra trong nghiên cứu của Senphan [80], chính là trộn tiếp phần PEG chứa protease với một PEG khác có trọng lượng phân tử lớn (PEG8000) và muối với nồng độ thấp hơn để chuyển protease từ pha trên giàu PEG
35 xuống pha dưới giàu muối Pha dưới chứa protease sẽ được thẩm tách loại muối để thu được dịch protease tinh khiết có độ tinh sạch 9,9 lần và hiệu suất thu hồi 46,2%
Về khối lượng phân tử, các protease dao động trong khoảng xấp xỉ 25 kDa đến
35 kDa Kết quả này hơi cao hơn với lý thuyết rằng các protease trong tụy có khối lượng phân tử từ 23 kDa với trypsin đến khoảng 34 kDa với carboxypeptidase (Bảng 1.2) Kết quả này cũng cao hơn so với các nghiên cứu khác về protease tụy cho kết quả xấp xỉ 23 kDa với Trypsin và xấp xỉ 25 kDa với chymotrypsin và elastase [41], [93] Có thể do chưa thu hồi được protease từ pha PEG khiến PEG xuất hiện trong các mẫu điện di và cản trở sự di chuyển trong gel của các enzym Điều này có thể nhận thấy khi so sánh điện di đồ của các mẫu không có mặt PEG (1 và 2) với những mẫu chứa PEG (3 và 4) Ở mẫu dịch tụy ban đầu và dịch enzym thu được bằng phương pháp kết tủa không chứa PEG, có xuất hiện 2 băng protein đậm ở khoảng 23 – 25 kDa và 2 băng ở khoảng 27 –