Ở một số quốc gia, chiết xuất hương thảo với hai hoạt chất chính là acid carnosic và carnosol đã được sử dụng làm chất phụ gia trong công nghiệp thực phẩm do hoạt tính chống oxy hoá mạnh
TỔNG QUAN
Tổng quan về acid carnosic và carnosol
Acid carnosic và carnosol là hai diterpenoid (diterpen phenolic) được phân lập từ cây hương thảo (Rosmarinus officinalis) và cây xô thơm (Salvia officinalis) Tuy nhiên, trong lá hương thảo (Rosmarinus officinalis), hàm lượng acid carnosic và carnosol cao hơn (∼3% tính theo trọng lượng lá phơi khô) [45] Các giống hương thảo có hàm lượng acid carnosic và carnosol cao (4 - 10% trọng lượng của lá phơi khô trong không khí) đã được phát triển và các nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần trong dịch chiết hương thảo Ngoài yếu tố di truyền, hàm lượng acid carnosic và carnosol cũng ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như khí hậu, khả năng chịu bức xạ UV-B, nước, độ mặn, ánh sáng Acid carnosic và carnosol có chủ yếu ở các bộ phận trên mặt đất (lá, đài hoa, cánh hoa), trong đó hai hoạt chất này được tìm thấy nhiều nhất ở lá [11]
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của acid carnosic
• Tên IUPAC: (4aR,10aS)-5,6-dihydroxy-7-isopropyl-1,1-dimethyl-1,3,4,9,10, 10a-hexahydrophenanthren-4a(2H)-carboxylic acid
• Trọng lượng phân tử: 332,4 g/mol
• Bột kết tinh màu vàng nhạt đến be nhạt
• Độ tan: không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ (chloroform, methanol, ethanol, acetonitril, aceton, ethyl acetat) [9], [43] và CO2 siêu tới hạn [13]
• Dễ bị oxy hoá, bảo quản ở nhiệt độ -20 0 C
• Tính khử mạnh nhờ 2 nhóm hydroxyl gắn vào nhân thơm (-OH phenol)
• Tính acid do có nhóm carboxylic
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của carnosol
• Tên IUPAC: (4aR,9S,10aS)-5,6-dihydroxy-7-isopropyl-1,1-dimethyl-1,3,4,9, 10,10a-hexahydro-2H-9,4a-(epoxymethano)phenanthren-12-one
• Trọng lượng phân tử: 330,4 g/mol
• Bột kết tinh màu trắng
• Độ tan: không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, aceton, acetonitril, ethyl acetat, DMSO, DMF) [43]
• Dễ bị oxy hoá, bảo quản ở nhiệt độ -18 0 C ± 4 0 C
• Tính khử mạnh nhờ 2 nhóm hydroxyl gắn vào nhân thơm (-OH phenol)
1.1.4.1 Tác dụng chống oxy hoá
Acid carnosic và carnosol - có tác dụng bảo vệ, giúp chống oxy hóa, giảm stress nhờ cơ chế loại bỏ ROS (Reactive oxygen species - là các gốc tự do sinh ra trong cơ thể) hoặc ức chế quá trình oxy hóa lipid [6], [27], [31], [46].
Acid carnosic là một chất chống oxy hóa mạnh và có thể bảo vệ lipid khỏi bị oxy hóa trên cả in vitro (dung dịch lipid) và in vivo (màng sinh học) Hoạt động dọn gốc tự do thực hiện bởi hai nhóm hydroxyl O-phenolic được tìm thấy ở phân tử Sau quá trình phản ứng với ROS, acid carnosic được oxy hóa thành các dẫn xuất khác nhau Điều thú vị là carnosol - chất chuyển hóa oxy hóa chính của acid carnosic - là chất chống oxy hóa và bảo vệ lipid hiệu quả như acid carnosic Ngoài ra, các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ acid carnosic khác như rosmanol, epirosmanol hoặc rosemary diphenol cũng có khả năng chống oxy hóa Vì vậy, khi loại bỏ ROS độc hại, acid carnosic có thể tạo ra nhiều loại chất chống oxy hóa thứ cấp, quá trình này làm tăng khả năng chống oxy hóa của acid carnosic và tạo thành một cơ chế bảo vệ hiệu quả [27], [31]
4 Chức năng chống oxy hóa của carnosol còn dựa vào cơ chế khác, xảy ra trực tiếp trong quá trình oxy hóa lipid bằng cách ức chế quá trình peroxy hóa lipid Carnosol phản ứng trực tiếp với các gốc lipid nên ngăn chặn quá trình chuỗi peroxy hóa lipid [27], [31] Carnosol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ do loại bỏ các gốc tự do α,α- diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) và bảo vệ DNA khỏi phản ứng Fenton [26], [42] Ngoài ra, acid carnosic có hoạt tính chống oxy hóa lớn hơn các chất chống oxy hóa tổng hợp đang được sử dụng rộng rãi như butylat hydroxytoluen (BHT), butylat hydroxyanisole (BHA) trong dầu hướng dương [16], dầu đậu nành [37], dầu hạt tara [25], acid carnosic và carnosol cũng có tác dụng làm tăng tính ổn định của tocopherol trong dầu ngô [22], [11], [12]
Chiết xuất hương thảo được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa phụ thuộc vào nồng độ, tính chất hóa học của các hợp chất phenolic (acid carnosic, carnosol) [23] Đặc biệt khi các chất chiết xuất hòa tan trong dầu, với acid carnosic là hợp chất phenolic chính, vi khuẩn Gram dương nhạy cảm hơn vi khuẩn Gram âm và hoạt tính kháng khuẩn cũng được cải thiện nhờ sự có mặt của carnosol [23] Các vi khuẩn Gram dương như Bacillus, Enterococcus, Streptococcus,
Staphylococcus [30], Listeria [38], hoặc vi khuẩn Gram âm như Escherichia, Salmonella hoặc Campylobacter có phản ứng với acid carnosic Mặc dù tác dụng với các vi khuẩn không quá nhạy nhưng acid carnosic tạo tác dụng hiệp đồng khi dùng với các thuốc kháng vi khuẩn khác Trên Tetracyclin, Erythromycin hoặc Ethidium Bromid, tác dụng kháng khuẩn đã được cải thiện lên đến 8 lần với Staphylococcus aureus và 16 lần với Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis bằng cách thêm lần lượt 10 μg/ml và 8 μg/ml acid carnosic Bên cạnh đó, người ta cũng cho rằng cấu trúc thân dầu của các hợp chất này cho phép chúng xâm nhập vào màng vi khuẩn, các nhóm cho liên kết hydro của hoạt chất có thể tương tác với các nhóm phosphoryl hóa màng, hoặc acid carnosic hoạt động làm tăng tính thấm của màng [11]
Chiết xuất hương thảo có hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên trong các sản phẩm chăm sóc răng miệng giúp phòng ngừa sâu răng [10] Hoạt tính kháng khuẩn này cũng được ứng dụng như một chất phụ gia thực phẩm tự nhiên để bảo quản thực phẩm và kéo dài thời hạn sử dụng nhờ ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại trong thực phẩm, giảm bớt những tác động tiêu cực đến sức khỏe con người [47], [48]
1.1.4.3 Tác dụng chống ung thư
Nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy acid carnosic và carnosol có tác dụng chống ung thư trên cả in vitro và in vivo Các thí nghiệm in vivo chỉ ra rằng hai chất này ức chế hình thành khối u, chống xâm lấn và di căn Ở thử nghiệm in vivo, các thành phần của
5 dịch chiết hương thảo được chứng minh là có hiệu quả trong các loại ung thư: đối với acid carnosic là ung thư miệng, bệnh bạch cầu cấp tính tế bào tủy xương, ung thư đại tràng liên quan béo phì; đối với carnosol là ung thư tuyến tiền liệt [36], ung thư vú, ung thư da, ung thư đại trực tràng [32], khối u ác tính Fibrosarcoma [19], [35]
Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ ra các cơ chế chống viêm của acid carnosic và carnosol [27], thể hiện nhiều đặc tính như chống viêm khớp, phổi, da, tim, ruột, thận, thần kinh, các bệnh nội mô cũng như các bệnh viêm liên quan đến tiểu đường và béo phì [21], [28] Bên cạnh đó, carnosol có tác dụng chống viêm và ngăn ngừa ung thư thông qua cơ chế ngăn chặn sản xuất nitơ oxyd (NO) và hoạt động của gen NO synthase (iNOS) bằng cách ức chế hoạt hóa NF-κB [26].
1.1.4.5 Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh
Acid carnosic và carnosol được chứng minh có vai trò dược lý trong việc cải thiện tình trạng oxy hóa khử ở não của động vật có vú, giảm tình trạng viêm thần Trên in vivo, acid carnosic là tác nhân bảo vệ thần kinh, chống lại căng thẳng do hóa chất gây ra [15] Cả hai chất được sử dụng như một liệu pháp chống lại các rối loạn thoái hóa thần kinh mãn tính như bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson [41].
Acid carnosic có thể là phương pháp điều trị tiềm năng chống lại các di chứng hậu Covid-19 liên quan đến não, thần kinh như lo lắng, hội chứng “sương mù não” và bệnh phổi cấp tính, bệnh thần kinh mãn tính Hoạt chất này ức chế nhiễm SARS-CoV-
2 theo hai cơ chế: liên kết cộng hóa trị với protein thụ thể ACE2 và giảm cơn bão cytokin [41].
Cây hương thảo được báo cáo là có nhiều lợi ích cho hệ thần kinh và làm giảm chứng rối loạn tâm trạng (chống trầm cảm) Hơn nữa, các hoạt chất này có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh chống lại độc tính do corticosteron gây ra [40]
Acid carnosic và carnosol có tác dụng chữa bệnh đái tháo đường hiệu quả thông qua việc điều hòa chuyển hóa và ức chế tân tạo glucose, cải thiện tình trạng kháng insulin, điều chỉnh quá trình chuyển hóa lipid, ức chế peroxy hóa lipid và kích hoạt các enzym chống oxy hóa [7], [8]
Các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng cho thấy acid carnosic và carnosol có tác dụng chống rối loạn dị ứng và miễn dịch trên đường hô hấp Ngoài ra, carnosol tương tác lớn hơn với thụ thể ACH nicotinic so với nhóm thuốc làm thư giãn cơ trơn, khiến nó trở thành một phương pháp điều trị chống co thắt hiệu quả [17]
Các phương pháp phân tích acid carnosic và carnosol
Bảng 1.1 Tổng hợp các phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích Đối tượng, chất phân tích và xử lý mẫu Điều kiện phân tích Kết quả TLTK
- Đối tượng: Lá hương thảo, lá
Xô thơm tươi và khô
- Chất phân tích: acid carnosic và
+ Rửa giải đẳng dòng, tốc độ dòng 1 ml/phút,
LOD là 0,104 ng (acid carnosic) và 0,512 ng (carnosol) mỗi lần tiêm (S/N=3) Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 0,07 μg/ml - 2 mg/ml (acid carnosic)
- Chiết bằng aceton trong môi trường lạnh thể tớch tiờm 20 àl, bước sóng phát hiện
230 nm và 0,20 μg/ml - 0,5 mg/ml (carnosol)
- Đối tượng: Lá hương thảo tươi
- Chất phân tích: acid carnosic và carnosol
+ SP: cột pha đảo (39 × 300 mm; 4 μm) + MP: ACN - H2O -
H3PO4 (65:34,8:0,2) + Rửa giải đẳng dòng, tốc độ dòng 1 ml/phút, bước sóng phát hiện
Hàm lượng acid carnosic và carnosol trong lá non hương thảo lần lượt là 10% và 0,2%
Dịch chiết lá hương thảo khô
- Chất phân tích: acid carnosic
+ SP: cột pha đảo (4,6 x 250 mm; 5 μm) + MP: ACN - H3PO3
0,5% (60:40) + Tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích tiêm
10 μl, bước sóng phát hiện 230 nm
Khoảng nồng độ tuyến tính của acid carnosic là 0,08 - 0,4 mg/ml
Dầu ăn, sản phẩm thịt chế biến và nước sốt
- Chất phân tích: acid carnosic và carnosol
+ MP: A (acid acetic 1%) và B (methanol) + Rửa giải gradient: 0-
Khoảng nồng độ tuyến tính là 6,25 -
400 μg/ml LOD trong khoảng 0,38 - 0,78 μg/ml (dầu ăn), 0,38 - 1,50 μg/ml (sản phẩm thịt chế biến) và 0,22
- 1,73 μg/ml (nước sốt) LOQ trong
- Chiết bằng n- hexan bão hoà - acetonitril, bay hơi dung môi, hoà tan bằng acetonitril - isopropanol
(1:1) duy trì 100% A; 45-47 phút, 100 đến 10% A; và giữ 3 phút + Tốc độ dòng 1,0 ml/phút và thể tích tiờm 20 àl, bước súng phát hiện 284 nm khoảng 1,14 - 2,38 μg/ml (dầu ăn), 1,15 - 4,55 μg/ml (sản phẩm thịt chế biến) và 0,66
- Đối tượng: Lá hương thảo khô
- Chất phân tích: acid carnosic và carnosol
- Pha loãng dịch chiết thương mại với methanol
H3PO4 (65:35:0,2) + Tốc độ dòng 0,75 ml/phút, bước sóng phát hiện 230 nm
Tổng hàm lượng acid carnosic và carnosol của các loại dịch chiết thương mại khác nhau dao động từ 4,5 – 80,8%
- Đối tượng: Lá hương thảo khô
- Chất phân tích: acid rosmarinic, carnosol, acid carnosic, acid oleanolic và acid ursolic
- Chiết siêu âm với methanol ở nhiệt độ phòng
30 °C + MP: methanol (A) và acid acetic 0,6% (B) + Rửa giải gradient:
40-50% A ở 0-8 phút, 50-83% A ở 8-10 phút, 83-85% A ở 10-25 phút, 85% A sau 25-50 phút
+ Tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm
20 μl Nhiệt độ ống trôi 70°C và áp suất của khí nitơ 40 Psi
LOD là 1,3 - 8,6 μg/ml và LOQ là 4,3 - 28,8 μg/ml
- Đối tượng: Lá hương thảo, lá
- Chất phân tích: acid carnosic và carnosol
- Chiết siêu âm với aceton
+ SP: cột C18 (3 x 150mm; 5 μm), 30°C + MP: acid formic 0,05% pH 2,8-3,0 (A) và acetonitril (B) + Rửa giải gradient: 0-
+ Tốc độ dòng 0,4ml/phút, thể tích tiêm 5μl, bước sóng phát hiện 280nm
Khoảng tuyến tính của acid carnosic là 18,6x10 -3 - 0,37 mg và carnosol là 8,8 - 22 ng LOD, LOQ của acid carnosic lần lượt là 0,68 ng, 2,0 ng và của carnosol lần lượt là 1,8 ng, 4,4 ng
- Chất phân tích: acid carnosic
- Chiết siêu âm với methanol trong 1 giờ
+ Đệm borat 40 mmol/l ở pH 9,6 cố định + Mao quản silica nung chảy idPμm,
LScm, lEcm, điện thế 2 đầu mao quản V(kV
+ Tiêm mẫu ở 25°C, áp suất 5.10 -3 MPa trong 5 giây
+ Đầu dò DAD, bước sóng phát hiện 210nm
Khoảng nồng độ tuyến tính là 20 - 700 μg/ml, LOD là 2,79 μg/ml
Nhận xét: Hiện nay, tại Việt Nam, chưa có phương pháp xác định đồng thời acid carnosic và carnosol trong thực phẩm được công bố Trên thế giới, có một số nghiên cứu đã được công bố về phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol trên một số nền mẫu như: lá hương thảo (tươi hoặc khô), lá Xô thơm (tươi hoặc khô), dầu ăn, sản phẩm chế biến sẵn, nước sốt… sử dụng các kỹ thuật như: điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector khác nhau, sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc ký khí khối phổ (GC-MS) [28] Trong đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật được nhiều nghiên cứu sử dụng do tính phổ biến, độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao, đồng thời quá trình xử lý mẫu trong các nền
10 mẫu thực phẩm không quá phức tạp Với mỗi nghiên cứu, tác giả lại sử dụng một quy trình phân tích khác nhau và đưa ra kết quả thẩm định khác nhau Bên cạnh đó, các phương pháp về sắc ký khí hay sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ có nhược điểm là chi phí cao và thiết bị không phổ biến
Vì vậy, nghiên cứu này lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao detector
UV mảng diod (HPLC-PDA) để xác định đồng thời acid carnosic và carnosol trong bột lá hương thảo, do kỹ thuật này có các ưu điểm về tính phổ biến, độ tin cậy, độ chọn lọc, độ nhạy cao, khoảng tuyến tính rộng, không phá huỷ cấu trúc của mẫu và dễ dàng vận hành thiết bị, lựa chọn bước sóng phát hiện.
Vài nét về phương pháp HPLC
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [1]
Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc khác nhau, tính chất khác nhau do đó ái lực của nó với pha tĩnh dưới tác động của pha động khác nhau Với các chất cùng nhóm có cấu trúc khá tương đồng hoặc đồng phân đối quang cần tác động vào hệ tách gồm pha tĩnh và pha động để có thể thu được kết quả tách đáp ứng yêu cầu [3]
Theo phân loại, HPLC được gọi là sắc ký lỏng, sắc ký cột và sắc ký rửa giải do pha động là chất lỏng, pha tĩnh được nhồi trên cột và chất phân tích được phát hiện khi rửa giải ra khỏi pha tĩnh Cơ chế tách tùy thuộc bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích Các cơ chế tách bằng HPLC có thể là phân bố, hấp phụ, loại theo cỡ (rây phân tử), trao đổi ion, ái lực, sắc ký lỏng siêu tới hạn, tách đồng phân đối quang [3]
1.3.2 Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Do bản chất hoá học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật để tách định lượng bằng sắc ký lỏng Tuy vậy nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau:
- Hệ thống cấp pha động,
- Hệ thu nhận và xử lý dữ liệu
Hình 1.3 Sơ đồ khối của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.3 Các thông số đặc trưng cho quá trình rửa giải
• Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector.
• Thời gian lưu là đại lượng để định tính một chất.
1.3.3.2 Hệ số đối xứng của pic
2𝑎 (đo ở 1/20 chiều cao pic) Trong đó: a và b là nửa chiều rộng phía trước và sau pic
• Các hệ số AS, Tf càng gần 1 thì pic càng đối xứng, >1 thì pic kéo đuôi, 1, giá trị tối ưu RS = 1,5 [2]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: acid carnosic và carnosol
- Đối tượng phân tích: sản phẩm hương thảo (bột lá hương thảo, lá hương thảo khô, trà thảo mộc hương thảo)
Nguyên vật liệu, thiết bị
Bảng 2.1 Thông tin các chất chuẩn
Quy cách đóng gói Độ tinh khiết
Hạn sử dụng Điều kiện bảo quản
- Dung dịch chuẩn gốc acid carnosic 950 μg/ml: Hòa tan 5 mg acid carnosic trong lọ chuẩn vào bình định mức 5 ml với methanol, định mức vừa đủ, lắc đều Bảo quản ở -20°C
- Dung dịch chuẩn gốc carnosol 1936 μg/ml: Hòa tan 10 mg carnosol trong lọ chuẩn vào bình định mức 5 ml với methanol, định mức vừa đủ, lắc đều Bảo quản ở - 20°C
- Dung môi tinh khiết dùng cho HPLC: Acetonitril (Merck 99,9%), Methanol (Merck 99,9%)
- Hoá chất tinh khiết phân tích: Acid phosphoric (Merck 85%), Acid formic (Merck 99,9%), Acid acetic (Merck 99,9%),
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Alliance, Waters e2695) trang bị detector PDA với bơm cao áp, bộ điều nhiệt cột, bộ tiêm mẫu tự động; phần mềm xử lý kết quả Empower 3 (Waters, Mỹ)
- Cột sắc ký Sunfire C18 (4,6 mm x 250 mm; 5 àm)
- Máy ly tâm lạnh MIKRO 220R
- Cân phân tích Sartorius có độ chính xác ± 0,0001 g
- Bể rung siêu âm Elmasonic S180H
- Bình định mức các loại: 5, 10, 20, 25, 50 ml
- Ống ly tâm 15, 50 ml (Đức, Mỹ)
- Ống đong chia vạch các loại: 10, 100, 200 ml (Đức)
- Cốc có mỏ dung tích: 50, 100, 200, 400, 1000 ml (Đức)
- Lọ đựng pha động các loại: 250, 500, 1000 ml (Đức)
- Pipet nhựa, micropipet 20 àl; 100 àl; 200 àl; 1000 àl; 5 ml… đầu cụn (Đức)
- Màng lọc mẫu Sartorius RC 0,2 àm hoặc 0,45 àm
- Màng lọc pha động Cellulose Acetat 0,2 àm hoặc 0,45 àm
- Vial đựng mẫu loại 1,8 ml (Đức)
Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích
2.3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký trên thiết bị HPLC-PDA
- Khảo sát thành phần pha động
- Khảo sát tỉ lệ giữa các thành phần trong pha động
- Khảo sát bước sóng lấy sắc ký đồ
2.3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
- Khảo sát loại dung môi chiết mẫu
- Khảo sát thời gian chiết mẫu
- Khảo sát kỹ thuật chiết mẫu
- Khảo sát số lần chiết mẫu
- Thay đổi khối lượng cân mẫu tối ưu hoá quy trình
- Khảo sát độ ổn định của chất phân tích trong vial theo thời gian
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Các thông số thẩm định:
- Độ phù hợp hệ thống
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Độ lặp lại, độ chụm trung gian
- Độ đúng (độ thu hồi)
2.3.4 Ứng dụng phương pháp trong một số mẫu thực phẩm
- Thu thập các mẫu thực phẩm tại địa bàn Hà Nội bao gồm: bột lá hương thảo, lá hương thảo khô, trà thảo mộc hương thảo
- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích, xác định hàm lượng acid carnosic và carnosol có trong các mẫu thực phẩm đã thu thập.
Phương pháp nghiên cứu
- Thu thập một số mẫu sản phẩm trên thị trường và các trang thương mại điện tử
- Địa điểm thu thập mẫu: địa bàn Hà Nội
- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên
- Khảo sát lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp với thiết bị là hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Alliance, Waters e2695) detector PDA, mục đích nhằm tối ưu hoá các điều kiện để đạt được sự phân tách tốt nhất các chất cần phân tích trong mẫu
- Chuẩn bị mẫu chuẩn để khảo sát điều kiện sắc ký:
+ Dung môi pha mẫu: MeOH
+ Dung dịch chuẩn đơn acid carnosic 20 àg/ml: Pha loóng từ dung dịch chuẩn gốc acid carnosic 950 àg/ml bằng dung mụi methanol Lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi tiêm sắc ký
+ Dung dịch chuẩn đơn carnosol 20 àg/ml: Pha loóng từ dung dịch chuẩn gốc carnosol 1936 àg/ml bằng dung mụi methanol Lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi tiêm sắc ký
+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp acid carnosic và carnosol 20 àg/ml: Pha loóng từ dung dịch chuẩn gốc acid carnosic 950 àg/ml và dung dịch chuẩn gốc carnosol 1936 àg/ml bằng dung mụi methanol Lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi tiờm sắc ký
2.4.3 Phương pháp xử lý mẫu
- Lựa chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được tối đa chất phân tích từ nền mẫu (dựa vào tính tan của chất phân tích), chất phân tích có trong dịch chiết phải ổn định với khoảng thời gian cần thiết cho quá trình từ lúc mới xử lý mẫu đến khi chạy sắc ký, đồng thời quy trình xử lý mẫu phải đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm
- Tiến hành khảo sát phương pháp xử lý mẫu trên mẫu bột lá hương thảo cố định Chuẩn bị mẫu sơ bộ như sau: bột lá hương thảo sau khi thu thập về bảo quản kín và tránh ánh sáng trực tiếp, được làm đồng nhất trước khi cân mẫu
2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích
Dựa trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại theo hướng dẫn của AOAC (2016) [5]
2.3.2.1 Độ phù hợp hệ thống
- Độ phù hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá hiệu quả của hệ thống sắc ký, giúp xác nhận rằng độ nhạy, độ phân giải pic và độ lặp lại của hệ thống sắc ký có thể đáp ứng được yêu cầu phân tích [4]
- Tiến hành: Chạy sắc ký lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp với nồng độ thích hợp Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích pic đáp ứng của 2 hoạt chất cần phân tích qua 6 lần chạy sắc ký Độ phù hợp hệ thống được đánh giá thông qua sự lặp lại của thời gian lưu và diện tích pic của 2 chất phân tích trong mẫu chuẩn hỗn hợp
- Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn hỗn hợp acid carnosic và carnosol với thời gian lưu, diện tích pic của mỗi chất không quá 2,0% Đồng thời phương pháp phải đạt yêu cầu về độ phân giải giữa các chất, số đĩa lý thuyết của cột và hình dạng pic sắc ký [4]
- Độ đặc hiệu của phương pháp là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác nhau như tạp chất và các chất cản trở khác [4]
- Chuẩn bị các mẫu sau theo quy trình phân tích đã xây dựng:
+ Mẫu trắng (blank): dung môi pha mẫu
+ Dung dịch thử thêm chuẩn
+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp
- Tiến hành: Chạy sắc ký các dung dịch đã chuẩn bị Ghi lại sắc ký đồ, các thông số thời gian lưu, diện tích pic, phổ hấp thụ của acid carnosic và carnosol
+ Trên sắc ký đồ của dung dịch pha mẫu không được xuất hiện pic tại vị trí của acid carnosic và carnosol
+ Thời gian lưu của acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn phải trùng với thời gian lưu của acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp
+ Phổ của acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn phải trùng với phổ của acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp (hệ số Match ≥ 0,998)
17 + Pic của acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn, dung dịch chuẩn hỗn hợp phải đạt về độ tinh khiết (purity factor ≥ 999,9)
2.3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện (LOD) của một phương pháp phân tích là nồng độ hoặc hàm lượng chất có thể phát hiện được với một mức đảm bảo đo hợp lý Giới hạn định lượng (LOD) của một phương pháp phân tích là nồng độ tối thiểu của chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng được với kết quả có độ chính xác mong muốn [4]
- Tiến hành: Chạy sắc ký các dung dịch chuẩn hỗn hợp với nồng độ giảm dần còn có thể xuất hiện tín hiệu chất phân tích
Phương pháp xử lý kết quả
- Thu thập số liệu và tính kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel
- Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel:
+ Một số đại lượng đặc trưng:
Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100×𝑆𝐷
+ Tương quan hồi quy tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích Y = aX + b
Trong đó: Hệ số góc a: Hàm SLOPE; Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT; Hệ số tương quan r: Hàm CORREL
- Phương pháp đánh giá, so sánh: Đánh giá dữ liệu thu được về chuẩn hóa phương pháp theo hướng dẫn của AOAC [5]
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng phương pháp phân tích
3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên các nghiên cứu đã công bố về phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol (bảng 1.1), đặc điểm về tính chất lý hoá, công thức cấu tạo của chất phân tích ở phần tổng quan, cùng với điều kiện sẵn có tại nơi thực hiện đề tài, phương pháp này lựa chọn pha tĩnh là: cột sắc ký Sunfire C18 (4,6 mm x 250 mm; 5 àm)
Một số điều kiện sắc ký cố định:
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
3.1.1.1 Khảo sát lựa chọn thành phần pha động
- Qua tham khảo một số nghiên cứu đã công bố về phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol (bảng 1.1), cùng với điều kiện sẵn có tại nơi thực hiện đề tài, các pha động được lựa chọn để khảo sát lại là:
Pha động (1): Acid phosphoric 0,1% - acetonitril (40:60, tt/tt)
Pha động (2): Acid formic 0,1% - acetonitril (40:60, tt/tt)
Pha động (3): Acid acetic 1% - methanol (30:70, tt/tt)
- Chuẩn bị pha động để khảo sát gồm các dung dịch: acid formic 0,1%, acid phosphoric 0,1%, acid acetic 1% Các dung dịch trên được lọc qua màng lọc 0,2 àm hoặc 0,45 àm, đuổi bọt khớ trong bể siờu õm trước khi sử dụng
- Tiến hành chạy sắc ký dung môi pha mẫu blank (xác định mức độ ổn định của đường nền), dung dịch chuẩn đơn acid carnosic, dung dịch chuẩn đơn carnosol và dung dịch chuẩn hỗn hợp với 3 loại pha động trên Từ sắc ký đồ dung dịch chuẩn đơn xác định vị trí của mỗi chất dựa vào thời gian lưu, phổ hấp thụ và từ sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp xác định khả năng tách, hình dáng pic của 2 chất phân tích để chọn pha động phù hợp cho khảo sát tiếp theo
- Kết quả khảo sát thành phần pha động được thể hiện trong hình 3.1
- Nhận xét: Carnosol có độ phân cực lớn hơn acid carnosic nên được rửa giải ra trước, có thời gian lưu sớm hơn Dựa vào kết quả sắc ký đồ khi chạy pha động (1) và pha động (2), nhận thấy rằng cả 2 chất cần phân tích đều cho ra pic gọn đẹp, cân xứng, thời gian lưu tương tự nhau Với pha động (3), kết quả chạy sắc ký đồ cho nền nhiễu cao, tín hiệu thu được của carnosol thấp hơn so với 2 pha động còn lại, pic acid carnosic xấu, bị doãng chân Bên cạnh đó, pha động (3) chứa thành phần methanol có độ nhớt cao hơn acetonitril, làm tăng lực cản khi pha động chạy qua cột sắc ký, dẫn đến áp suất máy tăng cao, khó ổn định Do đó, từ kết quả sắc ký đồ
21 khảo sát thành phần pha động, pha động (1) và pha động (2) sẽ được cân nhắc lựa chọn Tuy nhiên, so với acid formic, acid phosphoric là một lựa chọn phổ biến và thông dụng trong HPLC, vì có những ưu điểm về tính kinh tế, độ an toàn, kéo dài tuổi thọ cột Trong kết quả khảo sát này, pha động (1) chứa acid phosphoric cũng cho đường nền thẳng, ít nhiễu hơn a) Pha động (1) b) Pha động (2) c) Pha động (3) Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn thành phần pha động trên mẫu chuẩn hỗn hợp
- Kết luận: Lựa chọn pha động (1) là acid phosphoric 0,1% - acetonitril (40:60, tt/tt) cho các khảo sát tiếp theo
3.1.1.2 Khảo sát lựa chọn tỉ lệ giữa các thành phần trong pha động
- Tỉ lệ thể tích acid phosphoric 0,1% - acetonitril khảo sát: 30:70 (tt/tt), 35:65 (tt/tt), 40:60 (tt/tt), 45:55 (tt/tt)
- Lựa chọn tỉ lệ thể tích các thành phần trong pha động để thu được sắc ký đồ phù hợp nhất cho khảo sát tiếp theo
- Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động được thể hiện ở hình 3.2
Tỉ lệ Mẫu chuẩn hỗn hợp Mẫu thử
Hình 3.2 Sắc ký đồ các mẫu khảo sát tỉ lệ pha động
- Nhận xét: Khi giảm tỉ lệ acid phosphoric 0,1% đồng thời tăng tỉ lệ acetonitril sẽ giảm độ phân cực của dung môi pha động, làm kéo dài thời gian lưu của acid carnosic và carnosol Ở tỉ lệ 30:70 và 35:65, kết quả sắc ký đồ trên mẫu chuẩn hỗn hợp cho thấy các pic tạp bên cạnh đã tách ra khỏi pic carnosol, tuy nhiên trên nền mẫu thử pic carnosol bị xen phủ với các pic tạp xung quanh (tỉ lệ 30:70) và bị kéo đuôi (tỉ lệ 35:65) Ở tỉ lệ 45:55, thời gian phân tích quá dài khiến doãng chân pic
Vì vậy, tỉ lệ 40:60 là phù hợp hơn cả để pic hoạt chất chính có thể tách hoàn toàn khỏi pic tạp, độ phân giải tốt và thời gian phân tích không quá dài
- Kết luận: Lựa chọn pha động acid phosphoric 0,1% - acetonitril tỉ lệ 40:60 (tt/tt)
3.1.1.3 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện
- Các nghiên cứu đã công bố thực hiện lấy sắc ký đồ tại các bước sóng 230nm, 280nm và 284nm (bảng 1.1)
- Tiến hành quét phổ UV-Vis của carnosol và acid carnosic trong mẫu chuẩn hỗn hợp ở dải bước sóng 210 – 400 nm để xác định bước sóng thích hợp phát hiện hai chất (ưu tiên bước sóng cực đại hấp thụ hoặc bước sóng tại đó có độ hấp thụ lớn nhất)
- Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện được thể hiện ở hình 3.3 và hình 3.4
Hình 3.3 Phổ hấp thụ của carnosol và acid carnosic theo bước sóng
- Nhận xét: Dựa vào phổ UV-Vis thu được khi chạy sắc ký mẫu chuẩn hỗn hợp, nhận thấy rằng bước sóng có cực đại hấp thụ của carnosol là 284nm và của acid carnosic là 285nm, tuy nhiên độ hấp thụ của cả 2 chất lại cao hơn tại bước sóng 230nm Từ kết quả sắc ký đồ tại các bước sóng khác nhau, tín hiệu thu được ở bước sóng 230nm cao hơn so với 280nm và 284nm nên 2 chất phân tích chính sẽ ít chịu ảnh hưởng của nhiễu đường nền Do đó, bước sóng phát hiện 230nm có độ
24 hấp thụ tốt, giúp thuận tiện lấy sắc ký đồ trong quá trình phân tích, đủ nhạy để phát hiện và định lượng ngay cả khi trong mẫu thử 2 chất này có hàm lượng nhỏ
- Kết luận: Lựa chọn 230nm là bước sóng phát hiện đồng thời acid carnosic và carnosol a) Bước sóng 230nm b) Bước sóng 280nm c) Bước sóng 284nm Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát bước sóng phát hiện trên mẫu chuẩn hỗn hợp
3.1.2 Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu
Căn cứ vào quy trình xử lý mẫu của các nghiên cứu đã công bố về phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol ở phần tổng quan (bảng 1.1), cùng với
25 điều kiện sẵn có tại nơi thực hiện đề tài, tiến hành khảo sát và tối ưu hoá các điều kiện xử lý mẫu như sau:
3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết mẫu a) Khảo sát dung môi chiết mẫu không thêm chất chống oxy hoá
- Dung môi chiết mẫu khảo sát: Acid phosphoric 0,5% trong MeOH, Aceton, Ethanol, Methanol
- Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,5g bột lá hương thảo vào ống ly tâm 50ml Thêm khoảng 40 ml dung môi chiết mẫu vào, đậy nắp và cho lắc ngang 30 phút Sau quá trình chiết, đem ly tâm các ống trong 5 phút với tốc độ 6000 vòng/ phút, nhiệt độ 20 0 C Gạn dịch chiết vào bình định mức 50 ml, tráng lại phần cắn bằng dung môi chiết mẫu và định mức vừa đủ đến vạch, lắc đều Sau đó, hút chính xác 5,0 ml dịch chiết trên vào bình định mức 20 ml, định mức vừa đủ đến vạch bằng dung mụi chiết mẫu tương ứng, lắc đều Lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45àm vào vial, chạy sắc ký
- Kết quả khảo sát dung môi chiết mẫu (không thêm chất chống oxy hoá) được thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.5a và phụ lục 2A
- Nhận xét: Hàm lượng acid carnosic, hàm lượng carnosol và tổng hàm lượng 2 chất chiết được có sự khác nhau đối với 4 loại dung môi khảo sát Từ bảng 3.1, chiết mẫu bằng H3PO4 : MeOH (0,5:99,5) cho hàm lượng acid carnosic và tổng hàm lượng 2 chất cao nhất, còn khi chiết mẫu bằng MeOH thì hàm lượng carnosol cao nhất Tuy nhiên, với dung môi chiết là MeOH, nhận thấy có sự oxy hoá chuyển đổi acid carnosic thành carnosol, thể hiện qua tỉ lệ acid carnosic giảm đi đồng thời carnosol tăng lên (hình 3.5a) Các nghiên cứu trước đây cũng đã mô tả điều này và gợi ý việc sử dụng thêm chất chống oxy hoá khi chiết để bảo vệ 2 chất, ngăn quá trình biến đổi diễn ra [14], [49] Vì vậy, khảo sát này được lặp lại với sự có mặt của vitamin C (hình 3.5b) b) Khảo sát dung môi chiết mẫu có thêm chất chống oxy hoá
- Tiến hành theo quy trình mô tả ở mục 3.1.2.1.a và thay thế dung môi chiết mẫu bằng cỏc dung mụi cú chứa vitamin C nồng độ 250 àg/ml
- Kết quả khảo sát dung môi chiết mẫu (thêm vitamin C) được thể hiện ở bảng 3.2, hình 3.5b và phụ lục 2B
Thẩm định phương pháp phân tích
3.2.1 Độ phù hợp hệ thống
- Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp acid carnosic và carnosol 100 àg/ml Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tớch pic đỏp ứng của 2 hoạt chất cần phân tích qua 6 lần chạy sắc ký
- Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống được thể hiện trong bảng 3.5 và phụ lục 8
- Nhận xét: Qua 6 lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn hỗn hợp acid carnosic và carnosol, độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic mỗi chất đều thấp
34 hơn 2,0% Các pic cân đối, có hệ số đối xứng trong khoảng 1,16 – 1,20 Số đĩa lý thuyết lớn
Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống
- Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ phù hợp hệ thống
- Tiến hành chạy sắc ký các dung dịch: dung môi pha mẫu (acid phosphoric 0,5% trong methanol), dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn, dung dịch chuẩn hỗn hợp acid carnosic và carnosol Ghi lại sắc ký đồ, các thông số thời gian lưu, diện tích pic, phổ hấp thụ của acid carnosic và carnosol
- Kết quả đánh giá độ đặc hiệu được thể hiện trong hình 3.9 và phụ lục 9
+ Trên sắc ký đồ của mẫu trắng (a), không xuất hiện pic tại vị trí thời gian lưu tương ứng của acid carnosic và carnosol
+ Thời gian lưu của acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ mẫu thử (b), mẫu thử thêm chuẩn (c) trùng với thời gian lưu của acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (d)
35 + Phổ của acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn trùng với phổ của acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (match angel < match threshold) dựa theo kết quả tại phụ lục 9
+ Các pic acid carnosic và carnosol trên sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn, dung dịch chuẩn đều đạt độ tinh khiết sắc ký (purity angel < purity threshold) dựa theo kết quả tại phụ lục 9 a) SKĐ mẫu trắng b) SKĐ mẫu thử c) SKĐ mẫu thử thêm chuẩn d) SKĐ mẫu chuẩn hỗn hợp
Hình 3.9 Sắc ký đồ các mẫu thẩm định độ đặc hiệu
- Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, có tính chọn lọc với acid carnosic và carnosol
3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Tiến hành chạy sắc ký các dung dịch chuẩn hỗn hợp acid carnosic và carnosol với nồng độ giảm dần còn có thể xuất hiện tín hiệu chất phân tích Ghi lại sắc ký đồ và xác định S/N (S là tín hiệu của chất phân tích, N là tín hiệu nhiễu đường nền) Yêu cầu về nồng độ được chấp nhận là LOD và LOQ ghi trong mục 2.3.2.3
- Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp được thể hiện trong bảng 3.6 và phụ lục 13
Bảng 3.6 Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp
Chất phõn tớch LOD (àg/ml) LOQ (àg/ml)
- Tiến hành chạy sắc ký dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp acid carnosic và carnosol với nồng độ từ 2,5 àg/ml đến 200 àg/ml: 2,5 àg/ml, 5 àg/ml, 10 àg/ml, 20 àg/ml,
50 àg/ml, 100 àg/ml, 200 àg/ml Ghi lại sắc ký đồ, cỏc thụng số thời gian lưu, diện tích pic của acid carnosic và carnosol tại mỗi nồng độ
- Kết quả xây dựng đường chuẩn được thể hiện trong bảng 3.7 và phụ lục 10
Bảng 3.7 Kết quả xây dựng đường chuẩn
Nồng độ lý thuyết (àg/ml)
Nồng độ thực tế (àg/ml) Độ chệch (%)
Nồng độ thực tế (àg/ml) Độ chệch (%)
- Nhận xét: Hệ số tương quan đạt yêu cầu 0,995 ≤ R ≤ 1 Độ chệch của các điểm trên đường chuẩn sau khi xây dựng đường chuẩn thấp hơn ± 15%
- Kết luận: Phương pháp có độ tuyến tính đạt yêu cầu khi xây dựng đường chuẩn
Hình 3.10 Đồ thi mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ carnosol
Hình 3.11 Đồ thi mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ acid carnosic
3.2.5 Độ lặp lại và độ chụm trung gian
- Tiến hành chạy sắc ký 6 mẫu thử chuẩn bị độc lập theo quy trình phân tích đã xây dựng Ghi lại sắc ký đồ, các thông số thời gian lưu, diện tích pic của acid carnosic và carnosol của mỗi dung dịch thử
- Kết quả đánh giá độ lặp lại được thể hiện trong bảng 3.8 và phụ lục 11A
- Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của hàm lượng acid carnosic và carnosol trong mẫu thử lần lượt là 1,4% (≤ 1,9%) và 1,1% (≤ 2,7%), 2 giá trị đều đạt yêu cầu về độ lặp lại theo AOAC
- Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại
Bảng 3.8 Kết quả thẩm định độ lặp lại
Bảng 3.9 Kết quả thẩm định độ chụm trung gian Đường chuẩn độ chụm trung gian:
STT Lượng cân mẫu thử (g)
- Tiến hành chạy sắc ký 6 mẫu thử chuẩn bị độc lập theo quy trình phân tích đã xây dựng nhưng thực hiện với kiểm nghiệm viên khác và ngày khác so với khi làm 6 mẫu thử thẩm định độ lặp lại Ghi lại sắc ký đồ, các thông số thời gian lưu, diện tích pic của acid carnosic và carnosol của mỗi dung dịch thử
- Kết quả đánh giá độ chụm trung gian được thể hiện trong bảng 3.9 và phụ lục 11B
- Nhận xét: Với kết quả 6 mẫu làm khác kiểm nghiệm viên và khác ngày, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của hàm lượng acid carnosic và carnosol trong mẫu thử lần lượt là 1,4% (≤ 1,9%) và 1,0% (≤ 2,7%) Theo bảng 3.12, kết quả độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của hàm lượng acid carnosic và carnosol trong mẫu thử của cả 2 kiểm nghiệm viên (n) lần lượt là 2,8% (≤ 3,0%) và 2,1% (≤ 4,0%) Các kết quả thu được đều đạt yêu cầu theo AOAC
- Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ chụm trung gian
- Tiến hành chạy sắc ký các dung dịch thử thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ là 50%, 100%, 150% so với nồng độ mẫu thử đã chuẩn bị theo quy trình xây dựng Ghi lại sắc ký đồ, các thông số thời gian lưu, diện tích pic của acid carnosic và carnosol tại mỗi mức nồng độ
- Kết quả đánh giá độ đúng được thể hiện trong bảng 3.10, bảng 3.11 và phụ lục 12
- Nhận xét: Độ thu hồi của phương pháp phân tích với carnosol là 97,5 – 102,2% (đạt yêu cầu trong khoảng 97 – 103%) và với acid carnosic là 98,8 – 100,6% (đạt yêu cầu trong khoảng 98 – 102%)
- Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng
Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ đúng với carnosol
Lượng chuẩn thêm vào (mg)
Bảng 3.11 Kết quả thẩm định độ đúng với acid carnosic
Lượng chuẩn thêm vào (mg)