đặng thị lành đánh giá tác dụng kháng biofilm staphylococcus aureus của các phân đoạn cao chiết nhục đậu khấu myristica fragrans houtt

: BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ LÀNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG

BIOFILM Staphylococcus aureus CỦA

CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT NHỤC

ĐẬU KHẤU (Myristica fragrans Houtt.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BIOFILM Staphylococcus aureus CỦA

CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT NHỤC

ĐẬU KHẤU (Myristica fragrans Houtt.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

2 HVCH Trần Thị Minh Thu

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Nguyễn Khắc Tiệp, người thầy đã hết sức tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, quan tâm và

động viên tôi trong quá trình nghiên cứu khoa học

đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Thanh Hương, T.S Trần Minh Đức, ThS Lê Ngọc Khánh, các anh chị kỹ thuật

viên bộ môn Công nghệ sinh học Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn quantâm, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường Đại học Dược Hà Nội đã tạođiều kiện thuận lợi, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập

Thị Như Quỳnh, Nguyễn Ngọc Ánh và những người bạn, người em đã cùng tôi thực

hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Dược, cảm ơn vì đã luônđồng hành, hỗ trợ và động viên tinh thần tôi trong suốt khoảng thời gian thực hiệnkhóa luận

Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, những người luôn là hậu

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Đặng Thị Lành

1.1 Tổng quan về biofilm của Staphylococcus aureus 2

1.1.1 Tổng quan về Staphylococcus aureus 2

1.1.2 Biofilm của S aureus 3

1.1.3 Biofilm và các thất bại trong điều trị nhiễm khuẩn 6

1.1.4 Một số mô hình biofilm và ứng dụng trong nghiên cứu 7

1.1.5 Cách đánh giá các chỉ tiêu thành phần của biofilm 7

1.2 Tổng quan về nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.) 8

1.2.1 Vị trí phân loại 8

1.2.2 Đặc điểm thực vật 9

1.2.3 Phân bố, sinh thái 9

1.2.4 Bộ phận dùng 10

1.2.5 Thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học đặc trưng 10

1.3 Một số nghiên cứu về tác dụng kháng biofilm S aureus của cao chiếtdược liệu 11

1.3.1 Nghiên cứu nước ngoài 11

1.3.2 Nghiên cứu trong nước 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.1 Vi sinh vật 14

2.1.2 Cao chiết 14

2.1.3 Hóa chất, thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương phápkhuếch tán trên đĩa thạch 17

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm của S aureus 17

2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm của cao dược liệu 18

2.3.4 Phương pháp thống kê 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

TÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT

Collection

Ngân hàng chủng chuẩn HoaKỳ

Mill Extract

Chiết xuất chứa hàm lượngflavonoid của táo tàu

sinh tiêu diệt một lượng xácđịnh VSV

Concentration

Nồng độ tối thiểu ức chế visinh vật

adhesin

Chất kết dính liên bàopolysaccharid

Poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine

glucosamin

VREX V zizanioides root extract chiết xuất rễ hương lau

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 15Bảng 2.2 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 16Bảng 3.1 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của biofilm sau khi tiếp xúc với caochiết nhục đậu khấu các phân đoạn 21Bảng 3.2 Lượng VSV trong biofilm (log10 CFU/mL) sau khi tiếp xúc với caochiết nhục đậu khấu các phân đoạn 22Bảng 3.3 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của biofilm sau khi tiếp xúc với cácphân đoạn NĐK1.1-NĐK1.7 25Bảng 3.4 Lượng VSV trong biofilm (log10 CFU/mL) sau khi tiếp xúc với cácphân đoạn NĐK1.1-NĐK1.7 25Bảng 3.5 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm sau khi tiếp xúc với các phânđoạn NĐK2.1-NĐK2.5 28Bảng 3.6 Lượng VSV trong biofilm (log10 CFU/mL) sau khi tiếp xúc với cácphân đoạn 2.1-2.5 29

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus Trái: hình ảnh trên kính hiển

vi; Phải: hình ảnh trên kính hiển vi điện tử 2

Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành biofilm của S aureus 3

Hình 1.3 Đặc điểm hình thái của Nhục đậu khấu 9

Hình 2.1 Sơ đồ chiết cao tổng và cao phân đoạn từ hạt nhục đậu khấu 15

Hình 2.2 Mô tả thiết kế thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 17

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình đánh giá các chỉ tiêu của biofilm 19

Hình 3.1 Hình ảnh vòng vô khuẩn của cao chiết nhục đậu khấu các phân đoạn 20Hình 3.2 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm sau khi tiếp xúc với cao chiếtnhục đậu khấu các phân đoạn 21

Hình 3.3 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF và số lượng VSV trong biofilm (log10CFU/ml) sau khi tiếp xúc với phân đoạn CH2Cl2 22

Hình 3.4 Sơ đồ phân lập các phân đoạn nhỏ của cao chiết diclomethan từ hạtnhục đậu khấu 23

Hình 3.5 Hình ảnh vòng vô khuẩn của các phân đoạn NĐK1.1-NĐK1.7 23

Hình 3.6 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm sau khi tiếp xúc với các phânđoạn NĐK1.1- NĐK1.7 24

Hình 3.7 Lượng VSV trong biofilm (log10 CFU/ml) sau khi tiếp xúc với phânđoạn CH2Cl2và các phân đoạn NĐK1.1, NĐK1.2 26

Hình 3.8 Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn NĐK 1.1, NĐK1.2 27

Hình 3.9 Sơ đồ tách phân đoạn NĐK1.2 từ hạt nhục đậu khấu 27

Hình 3.10 Hình ảnh vòng vô khuẩn của các phân đoạn NĐK2.1 - NĐK2.5 28

Hình 3.11 Lượng VSV trong biofilm (log10 CFU/ml) sau khi tiếp xúc với phânđoạn NĐK1.2 và phân đoạn 2.4, 2.5 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Staphylococcus aureus (S aureus) hay tụ cầu vàng là nguyên nhân hàng đầu

gây nhiễm trùng tại bệnh viện và cộng đồng Tụ cầu vàng có thể gây ra nhiều bệnhnhiễm trùng như nhiễm trùng da và mô mềm, viêm nội tâm mạc, viêm tủy xương,

nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi [28] Điều trị nhiễm trùng do S aureus gặp rất

nhiều khó khăn, không chỉ do sự đa dạng về các yếu tố độc lực và vi khuẩn khángthuốc kháng sinh, mà còn do khả năng hình thành biofilm của tụ cầu vàng [22]

Biofilm mà S aureus sản sinh trong quá trình lây nhiễm tạo điều kiện cho vi sinh

vật (VSV) gia tăng khả năng kháng thuốc kháng sinh và né tránh miễn dịch của vậtchủ [51] Vì vậy biofilm là yếu tố quan trọng quyết định sự tồn tại dai dẳng của nhiễm

trùng gây ra bởi S aureus Hầu hết các loại kháng sinh bị hạn chế tác dụng diệt khuẩn

trong điều trị các bệnh nhiễm trùng liên quan đến biofilm Các chiến lược mới như chếtạo bề mặt chống nhiễm trùng, tìm ra các hoạt chất mới có hoạt tính kháng biofilmmang lại nhiều tiềm năng trong việc điều trị nhiễm trùng liên quan đến biofilm [17].Ngoài ra còn có một số chiến lược phát triển các hợp chất kháng khuẩn, diệt khuẩnđược nghiên cứu như peptide kháng khuẩn, sử dụng trực khuẩn và lysin, enzyme phânhủy biofilm [51] Các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên từ thực vật đã trở thành lựa chọnthay thế quan trọng cho các kháng sinh truyền thống Sử dụng các chất chuyển hóa thứcấp từ thực vật, với đặc tính kháng khuẩn, chống biofilm là một phương pháp đầy hứahẹn để chống lại nhiễm trùng do vi khuẩn [36]

Kết quả sàng lọc của nhóm nghiên cứu cho thấy cao chiết nhục đậu khấu có

tiềm năng kháng biofilm S aureus [4] Do đó, đề tài đã lựa chọn nhục đậu khấu làm

đối tượng nghiên cứu, với mong muốn tạo tiền đề cho việc tìm ra hoạt chất mới có

hoạt tính kháng biofilm S aureus có nguồn gốc từ thực vật Chúng tôi thực hiện đề tài

“Đánh giá khả năng kháng biofilm Staphylococcus aureus của cao chiết nhục đậukhấu (Myristica fragrans Houtt.)” với các mục tiêu:

1 Đánh giá khả năng kháng biofilm S aureus của cao chiết nhục đậu khấu(Myristica fragrans Houtt.)

2 Đánh giá khả năng kháng biofilm S aureus của các phân đoạn nhỏ của caochiết nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.).

Trong đó các phân đoạn được lựa chọn để chiết xuất dựa trên cơ sở hoạt tínhdẫn đường

Giới: Procaryotae; Ngành: Firmicutes; Lớp: Firmibacteria; Họ: Microccocaceae; Chi:

Staphylococcus; Loài: Staphylococcus aureus [16].

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureusTrái: hình ảnh trên kính hiển vi; Phải: hình ảnh trên kính hiển vi điện tửS aureus là vi sinh vật Gram dương, không di động, không sinh bào tử [26] S.aureus được đặc trưng bởi các cầu khuẩn riêng lẻ có đường kính từ 0,5 đến 1,5 µm [28]

và có xu hướng sắp xếp thành cụm được mô tả là “giống như quả nho” [20] Tụ cầuvàng có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí, ở nhiệt độ từ 18°C đến

40°C [20], phát triển tối ưu ở 37°C trong pH 7,4 [28] S aureus có thể chịu được nồng

độ muối cao lên tới 15 % và nhiệt độ cao lên tới 60ºC trong vòng 30 phút [20]

Tụ cầu vàng là một trong những nguyên nhân chính gây trùng nhiễm trùng bệnhviện và cộng đồng Tụ cầu vàng có mức độ lây nhiễm phổ biến và khả năng gây ra cácbệnh nghiêm trọng dẫn tới tử vong như viêm tủy xương, viêm nội tâm mạc, nhiễm

khuẩn huyết, viêm màng não, hội chứng sốc nhiễm độc và ngộ độc thực phẩm S.aureus thường xâm nhập vào da và hầu họng, gây ra mối đe dọa chủ yếu cho những

bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch [45]

Theo mức độ nhạy cảm với thuốc kháng sinh, S aureus có thể được chia thànhStaphylococcus aureus nhạy cảm với methicillin (MSSA) và Staphylococcus aureus

kháng methicillin (MRSA) Fleming đã phát hiện ra penicillin vào những năm 1940và mở đầu kỷ nguyên sử dụng kháng sinh trong điều trị nhiễm trùng Vào thời điểm

đó, các bệnh truyền nhiễm do S.aureus gây ra đã được kiểm soát tốt Tuy nhiên, việcsử dụng rộng rãi penicillin đã dẫn đến sự xuất hiện của chủng S.aureus có thể sinh ra

penicillinase - enzyme thủy phân vòng β-lactam của penicillin, dẫn đến tình trạngkháng penicillin Sau đó, các nhà khoa học đã phát triển một loại penicillin bán tổnghợp khác có khả năng kháng penicillinase có tên là methicillin Methicillin đã giúp

kiểm soát hiệu quả sự lây nhiễm của S aureus kháng penicillin Tuy nhiên, chỉ 2

năm sau khi methicillin được sử dụng, đã có báo cáo phân lập được chủngMRSA Tính kháng này được gây ra bởi một gen mã hóa protein gắn với penicillin2a hoặc 2′ (PBP2a hoặc PBP2′) (mecA) được tích hợp vào thành phần nhiễm sắc thể

(SCCmec) của S.aureus nhạy cảm với methicillin MRSA đã nhanh chóng trở thành

mầm bệnh kháng thuốc xảy ra thường xuyên nhất được phân lập ở nhiều nơi trên thếgiới, bao gồm Châu Âu, Hoa Kỳ, Bắc Phi, Trung Đông và Đông Á [28]

1.1.2 Biofilm của S aureus

Biofilm được định nghĩa là một quần thể vi sinh vật (VSV) gồm các tế bào nằmtrong chất nền chứa các hợp chất cao phân tử ngoại bào mà chúng tự sản sinh ra Chấtnền này được cấu tạo bởi các polysaccharid, ADN ngoại bào (eDNA) và protein vớicấu trúc sắp xếp, tỷ lệ phần trăm, số lượng phụ thuộc nhiều vào điều kiện hình thành[38], [50]

Sự hình thành biofilm của S aureus có thể được chia thành ba giai đoạn chính: (1)

gắn ban đầu, (2) tăng sinh tế bào và sản xuất chất nền ngoại bào, (3) tách tế bào vàhình thành biofilm mới

Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành biofilm của S aureus [51]Giai đoạn gắn ban đầu: S aureus có thể bám dính lên các bề mặt sinh học để hìnhthành biofilm Sự gắn kết của tế bào S aureus với bề mặt xảy ra thông qua các protein

bề mặt liên kết với các protein nền trên vật chủ (fibrinogen, fibronectin, vitronectin…)

hoặc các tương tác kỵ nước với bề mặt nhân tạotương ứng [42], [51].Giai đoạn tăng sinh tế bào và sản xuất chất nền ngoại bào: Trong giai đoạn này,các VSV sau khi bám dính sẽ tăng sinh nhanh chóng Ngoài ra, tế bào còn tiết ra cácchất cao phân tử bao gồm các polysaccharide và protein Đáng chú ý nhất trong số đó

là protein và ADN, sau khi giải phóng từ các tế bào chết được gọi là ADN ngoại bào(eDNA) [42], [51].

Giai đoạn hình thành biofilm và tách tế bào: VSV phát triển, cấu trúc và hìnhthành nên biofilm Sau đó, sự tách tế bào diễn ra do sự thoái hóa của chất nền biofilmdo nuclease và protease và sự phá vỡ biofilm bởi các chất hoạt động bề mặt [42] Sựphá vỡ, tách rời của biofilm giúp phần VSV được tách ra có thể di chuyển, bám dính ởvị trí mới và sản sinh những biofilm mới [51] [56]

Biofilm của S aureus là một quần thể vi sinh vật S aureus, nằm trong chất nền

chứa các hợp chất cao phân tử ngoại bào bao gồm polysaccharid (như acetyl-D-glucosamin - PNAG), ADN ngoại bào (eDNA) và protein có nguồn gốc từ sựly giải các tế bào vi khuẩn chết [11]

poly-β1,6-N-Poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamin (PNAG): còn được gọi là chất kết dính liênbào polysaccharid (PIA), là thành phần chính của các chất cao phân tử ngoại bào PIAlà một poly-β(1-6)-N-acetylglucosamine (PNAG), bị khử acetyl một phần, mang điện

tích dương, quá trình tổng hợp thông qua trung gian locus ica ADBC Khử acetyl là

giai đoạn quan trọng để hình thành biofilm và còn đóng vai trò tăng khả năng khángcác peptide kháng khuẩn (AMP) và thực bào của bạch cầu trung tính Việc sản xuất

PIA phụ thuộc vào yếu tố operon kết dính nội bào (ica), bao gồm các gen icaA, icaD,icaB và icaC Trong đó icaA là N-acteylglucosamin transferase, cùng với icaD tham

gia tạo ra oligomer N -acetylglucosamin Sự phát triển của chuỗi PIA phụ thuộc vào sự

hiện diện của icaC - một protein màng, với vai trò vận chuyển PIA ra ngoài màng tếbào Mặt khác icaB, nằm trên bề mặt vi khuẩn - là PIA deacetylase, với vai trò gắn

PIA vào màng tế bào PIA đóng vai trò quan trọng trong quá trình bám dính, hìnhthành biofilm và né tránh miễn dịch, đề kháng với các chất kháng khuẩn [11], [44],[51]

Protein: nhiều protein được coi là thành phần quan trọng trong quá trình gắn kếtvà phát triển chất nền biofilm Chúng bao gồm các protein liên kết bề mặt như protein

A, protein liên kết fibrinogen (như FnBPA và FnBPB), protein bề mặt S aureus

(SasG), protein liên kết biofilm (Bap) và yếu tố đông tụ B (ClfB) [56]

eDNA: eDNA trong chất nền biofilm của S aureus có chức năng cung cấp sự ổn

định cho biofilm eDNA này có nguồn gốc từ quá trình ly giải các tế bào vi khuẩn chết[38] Do đặc tính cao phân tử và anion của ADN, eDNA dễ dàng tương tác với nhiềuphân tử bề mặt khác, góp phần hình thành chất nền ngoại bào [56]

Trong những thập kỷ qua, do sự phát triển của vi khuẩn và tình trạng lạm dụng

kháng sinh, tình trạng kháng thuốc của S aureus ngày càng tăng, tỷ lệ nhiễm MRSA

tăng trên toàn thế giới và việc điều trị nhiễm trùng gây ra bởi MRSA ngày càng trởnên khó khăn hơn [42].

Nhiễm trùng thiết bị cấy ghép

Các thiết bị y tế đặc biệt dễ bị nhiễm trùng bao gồm ống thông thẩm phân phúcmạc, ống thông tiểu và tĩnh mạch trung tâm, ống nội khí quản, van tim cơ học, máy

điều hòa nhịp tim và các khớp giả S.aureus là nguyên nhân gây nhiễm trùng thườnggặp nhất trên các thiết bị y tế bên trong cơ thể Điều này chủ yếu là do S aureus là vi

khuẩn chiếm ưu thế trong việc gây nhiễm trùng nội mạch và nhiễm trùng thiết bị nhântạo [11], [44], [51], [56]

Nhiễm khuẩn huyết

S.aureus là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm khuẩn huyết Trong những năm gầnđây, tỷ lệ mắc nhiễm khuẩn huyết do S.aureus tăng mạnh do sự gia tăng của tần suất

thực hiện các thủ thuật xâm lấn, số lượng bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch và sự gia

tăng sức đề kháng của các chủng S aureus đối với các loại kháng sinh [60].

Viêm nội tâm mạc (Infective endocarditis - IE)

S.aureus là nguyên nhân phổ biến hàng đầu gây IE ở các nước trên thế giới.Thông qua dòng máu S.aureus phát tán gây ra nguy cơ cao trong lây nhiễm IE [60].

Viêm nội tâm mạc nhiễm trùng van tin nhân tạo là nhiễm trùng IE nguy hiểm nhất vớinguy cơ tử vong ước tính từ 40% đến 80% [25]

Nhiễm trùng da và mô mềm (SSTI)

S.aureus gây ra nhiều loại SSTI, từ lành tính (như bệnh chốc lở) đến đe dọa tính

mạng Đây là mầm bệnh phổ biến nhất được phân lập từ các nhiễm trùng vết mổ, áp xeda Dữ liệu dịch tễ học toàn cầu cho thấy tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm trọng của SSTI

ngày càng tăng liên quan đến S.aureus kháng methicillin (MRSA) và đòi hỏi cần can

thiệp y tế và sử dụng kháng sinh phổ rộng, do đó gây gia tăng gánh nặng chi phí y tế[46], [60]

Nhiễm trùng xương khớp

S aureus là tác nhân gây nhiễm trùng xương khớp phổ biến nhất, ở cả 3 nhóm

bệnh chính cụ thể là viêm tủy xương viêm khớp, nhiễm trùng tự nhiên và nhiễm trùng

khớp giả S.aureus sản xuất ra các yếu tố tương tác với xương như chất kết dính với

nhiều phân tử của vật chủ (như fibrinogen, fibronectin, collagen, ) Khi ở trong

xương, S aureus bám vào các khu vực tổn thương và tăng sinh để tạo thành biofilm

[53], [60]

Viêm tủy xương

S aureus là nguyên nhân gây ra phần lớn các trường hợp viêm tủy xương Vi

khuẩn có thể được đưa vào qua đường máu hoặc khi phẫu thuật, chấn thương hoặc

nhiễm khuẩn Khi ở trong máu, S aureus tăng cường sản xuất chất kết dính với nhiều

phân tử của vật chủ (như fibrinogen, fibronectin, collagen, ) [60].

Nhiễm trùng biofilm đa vi sinh vật

Candida albicans và S aureus được được phát hiện đồng thời trong bề mặt niêm

mạc miệng và âm đạo, cả hai chủng đều thể hiện khả năng tạo biofilm Một số nghiên

cứu đã chứng tỏ khả năng liên kết của S aureus với dạng sợi nấm của C albicans vàphát triển biofilm Sợi nấm C albicans có thể xâm nhập vào các tế bào biểu mô củavật chủ, tạo lối vào cho S aureus gây ra các nhiễm trùng tại chỗ và toàn thân [10].

1.1.3 Biofilm và các thất bại trong điều trị nhiễm trùng

Biofilm không chỉ giúp bảo vệ cho VSV tránh khỏi sự thay đổi pH, nhiệt độ, sựkhan hiếm chất dinh dưỡng… mà còn góp phần to lớn trong việc ngăn chặn sự tiếp cậncủa vi khuẩn trong biofilm khỏi tế bào miễn dịch của vật chủ và thuốc kháng sinh [63].Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng VSV trong biofilm có thể chịu được nồng độkháng sinh cao gấp từ 10-1000 lần so với tế bào ở dạng tự do [39]

Sự kém đáp ứng với kháng sinh của vi khuẩn trong biofilm có liên quan đếnmột số nguyên nhân, trong đó có thể phân thành hai yếu tố liên quan đến dược độnghọc (PK) và dược lực học (PD) của thuốc

Các yếu tố về dược động học ảnh hưởng đến nồng độ kháng sinh

Chất nền polysaccharid và cấu trúc biofilm làm giảm khả năng khuếch tán củakháng sinh vào biofilm, ngăn cản sự xâm nhập của các kháng sinh Bên cạnh đó, cácthành phần của biofilm có thể phản ứng lại với kháng sinh eDNA – là thành phần củachất nền ngoại bào có khả năng tạo phức chelat với kháng sinh Thành phần protein vàpolysaccharid cũng đã được chứng minh là có khả năng phản ứng với một số khángsinh [39] Các yếu tố này làm cho nồng độ kháng sinh khi tiếp xúc với vi khuẩn thấp,dẫn tới không đạt được hiệu quả diệt VSV

Các yếu tố về dược lực học ảnh hưởng đến hoạt lực kháng sinh

Có nhiều yếu tố gây tác động đến các yếu tố dược lực học của kháng sinh vớiVSV trong biofilm, trong đó có sự chuyển đổi sang các kiểu hình dai dẳng và dungnạp kháng sinh cũng như là tăng khả năng xuất hiện kiểu hình kháng kháng sinh

Sự chuyển đổi sang kiểu hình dai dẳng và dung nạp kháng sinh: Môi trườngkhắc nghiệt ở trong biofilm làm thúc đẩy các vi khuẩn chuyển sang các kiểu hình gâygiảm đáp ứng với kháng sinh Các VSV trong biofilm thường có xu hướng chuyểnsang kiểu hình “dai dẳng” hoặc “dung nạp”, đặc trưng cho một phần hoặc tất cả quầnthể vi khuẩn không đáp ứng với việc điều trị bằng kháng sinh Đây chính là hai kiểuhình tiền đề cho việc hình thành kiểu hình “kháng kháng sinh” [32] Kiểu hình dungnạp kháng sinh được đặc trưng bởi sự gia tăng khả năng sống sót của toàn bộ quần thểVSV khi tiếp xúc với kháng sinh diệt khuẩn ở nồng độ cao mà không liên quan đến sựthay đổi nồng độ ức chế tối thiểu (MIC- minimum inhibitory concentration) Kiểu hình

dai dẳng kháng sinh chính là kiểu hình của một quần thể VSV không đồng nhất, trongđó có một tiểu quần thể VSV có kiểu hình dai dẳng, phần còn lại vẫn còn có kiểu hìnhnhạy cảm với kháng sinh, sự khác biệt này được đánh giá thông qua thông số thời giantối thiểu để kháng sinh tiêu diệt một lượng xác định VSV (MDK- minimum durationfor killing) Dưới tác dụng của các kháng sinh diệt khuẩn, quần thể VSV sẽ được phânchia thành hai nhóm, một tiểu quần thể VSV còn dung nạp kháng sinh (giá trị MDKtăng), phần còn lại là những VSV đã nhạy cảm với kháng sinh (giá trị MDK khôngtăng) [14].

Tăng khả năng xuất hiện kiểu hình kháng kháng sinh: về mặt cấu trúc và sinh lýđặc biệt của biofilm có thể tạo điều kiện thuận lợi tới sự phát triển tính kháng đột biếntrong quá trình điều trị kháng sinh, điều này đặc biệt được ưa chuộng ở các chủng độtbiến, vốn rất phổ biến trong các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp mạn tính [39] Ngoàira, mật độ VSV cao trong biofilm cho phép chuyển gen kháng thuốc theo chiều nganggiữa các vi khuẩn, đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển gia tăng khả năngkháng thuốc kháng sinh [56]

1.1.4 Một số mô hình biofilm và ứng dụng trong nghiên cứu

Mô hình biofilm trên đĩa 96 giếng là phương pháp hiện được sử dụng phổ biếnnhất để nuôi cấy và nghiên cứu về biofilm với nhiều ưu điểm như khả năng sàng lọccao, đơn giản, với chi phí thấp và dễ dàng xử lý [59] Mô hình này cho phép sàng lọcđược tác dụng của nhiều mẫu, với nhiều điều kiện cùng một lúc, có thể đánh giá đanồng độ kháng sinh trên biofilm và thường được dùng làm tiền thân cho các nghiên

cứu in vivo sau này [37].

Ngoài ra còn có mô hình biofilm trên lá kính giúp quan sát biofilm dưới kínhhiển vi; các mô hình biofilm trên miếng nhựa, miếng kim loại, silicon cũng giúp đánhgiá khả năng tạo biofilm trên các bề mặt [54]

Chuột và thỏ là những loài động vật thường sử dụng để tiến hành thực hiện các

mô hình biofilm in vivo Một số mô hình biofilm in vivo hiện đã được phát triển như là

mô hình catheter gắn trên chuột và thỏ, các mô hình khác như nhiễm trùng đường tiếtniệu, mô hình nghiên cứu biofilm liên quan đến các bệnh nhiễm trùng tai mũi họng, Các mô hình này đều được sử dụng để chứng minh về tầm quan trọng của việc hìnhthành biofilm trong các nhiễm trùng đồng thời đánh giá tác dụng của các chất khángkhuẩn trên biofilm [19]

1.1.5 Cách đánh giá các chỉ tiêu thành phần của biofilm

Trong những thập kỷ qua, có nhiều mô hình in vitro đã được mô tả để nghiên

cứu về sự hình thành và phát triển biofilm Trong hầu hết các mô hình này, việc định

lượng biofilm được thực hiện bởi phương pháp đếm, tốn nhiều công sức và thời gian.Trong những năm gần đây, một số phương pháp hiện đại hơn đã và đang được sử dụngđể định lượng các chỉ tiêu thành phần biofilm [52].

Đánh giá tổng sinh khối biofilm bằng nhuộm với tím tinh thể

Nhuộm tím tinh thể (Crystal violet - CV) lần đầu tiên được mô tả vào năm 1985do Christensen và cộng sự Kể từ đó, phương pháp này đã được cải thiện để làm tăngđộ chính xác và cho phép định lượng tổng sinh khối biofilm CV là một chất nhuộmmàu có khả năng liên kết với các phân tử bề mặt tích điện âm và polysaccharid trongchất nền ngoại bào CV phù hợp để đánh giá tổng sinh khối biofilm, vì các tế bào(sống và chết), cũng như chất nền ngoại bào đều bị nhuộm màu bởi tím tinh thể (CV).Tuy nhiên, CV lại kém thích hợp để đánh giá hiệu quả tiêu diệt các tế bào trongbiofilm [52]

Định lượng VSV sống trong biofilm bằng chuyển hóa resazurin

Resazurin là một loại thuốc nhuộm tan trong nước, không độc hại, bị khử bởicác phản ứng chuyển điện tử liên quan đến hô hấp để sản xuất resorufin (RF) pháthuỳnh quang Lượng RF được tạo ra có liên quan đến số lượng tế bào sống sót hiện có[62] Giai đoạn đầu tiên của quá trình khử resazurin màu xanh thành RF màu hồng là

do sự mất đi một nguyên tử oxy liên kết lỏng lẻo với nitơ của nhân phenoxazin Giaiđoạn thứ hai của sự khử tạo thành trạng thái không màu [27]

Trong những năm gần đây, lượng vi sinh vật trong biofilm được địnhlượng gián tiếp vi sinh vật trong biofilm bằng cách đo sản phẩm resorufin hòa tantrong nước thông qua đánh giá khả năng chuyển hóa resazurin (không huỳnh quang)thành resorufin (phát huỳnh quang) [40] Tín hiệu huỳnh quang được đo với bước sóngkích thích và phát xạ tương ứng là 560/590 nm [27], [40]

Nhuộm – quan sát biofilm với Syto9/propidium iod

Hệ nhuộm Syto9/propidium iod được sử dụng rất thường xuyên ở các nghiêncứu quan sát biofilm với kính hiển vi đồng tiêu Hệ thuốc nhuộm này giúp đánh giáđược tình trạng sống/chết của VSV trong biofilm Trong đó thuốc nhuộm syto9 có khảnăng khuếch tán thụ động qua màng tế bào và liên kết với ADN của cả tế bào sống vàchết Syto9 phát huỳnh quang màu xanh lá, được quan sát tại bước sóng kích thích vàbược sóng phát xạ tương ứng là 505 và 515nm Thuốc nhuộm này sẽ được kết hợp vớipropidium iod, một thuốc nhuộm bắt màu với tế bào chết, cho màu đỏ huỳnh quang,khi quan sát với bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng là 600 và 610nm [52]

1.2 Tổng quan về nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.)

1.2.1 Vị trí phân loại

Theo Flowering Plants (2009), vị trí phân loại của nhục đậu khấu được tóm tắt nhưsau [12]:

Giới thực vật - PlantaeNgành Ngọc Lan - Magnoliophyta

Lớp Ngọc Lan - MagnoliopsidaPhân lớp Ngọc Lan - Magnoliidae

Bộ MyristicalesHọ Nhục đậu khấu - Myristicaceae

Chi: MyristicaLoài: Myristica fragrans Houtt.

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Hình 1.3 Đặc điểm hình thái của Nhục đậu khấu [5]

Nhục đậu khấu là một cây gỗ to, cao 8-10m Toàn thân nhẫn Lá mọc so le,xanh tươi quanh năm, phiến lá hình mác rộng, lá dài 5-15cm, rộng 3-7cm, mép nguyên,cuống lá dài 7-12mm mặt trên nhẵn, mặt dưới phủ đầy lông tơ dày hơn lá non và gânnổi lên rất rõ Hoa khác gốc mọc thành xim ở kẽ lá, có dạng tán Màu hoa vàng trắng.Cụm hoa đực dài 1-3 cm gồm 3 -20 hoa, bao hoa hình trứng, có lông, chia thành 3thùy, nhị xếp thành cột có đế dày, nhẵn Cụm hoa cái mọc ở kẽ lá gồm 1-2 hoa, baohoa hình trứng rộng, có lông ở mặt ngoài chia 3 thùy ở đầu, bầu có lông mịn một ô.Quả hạch, hình cầu hay quả lê, màu vàng, đường kính 5-8cm, khi chín nở theo chiềudọc thành 2 mảnh, trong có một hạt có vỏ dày cũng, bảo bọc bởi một áo hạt bị rách,màu hồng Quả thường đơn độc có cuống ngắn đôi khi mang bao hoa tồn tại Mùa quảtừ tháng 4 đến tháng 8 [1]

1.2.3 Phân bố, sinh thái

Nhục đậu khấu có nguồn gốc ở vùng đảo Molucca ở Thái Bình Dương, đượcnhập và trồng vào đất liền ở khắp vùng nhiệt đới Nam Á và Đông – Nam Á Ở Việt

Nam cây chủ yếu được trồng ở các tỉnh phía nam Nhục đậu khấu là cây nhiệt đới, cókhả năng thích nghi cao với điều kiện khí hậu nóng và ẩm, lượng mưa hàng năm từ1500 – 3000mm Cây sinh trưởng tốt ở vùng thấp, không thích hợp với vùng núi caotrên 750m, rụng lá vào mùa khô, thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng Khi quả chín lấy hạttươi gieo ngay, đạt tỷ lệ nảy mầm từ 92 – 98% Sau 2 tháng tỷ lệ này giảm xuống chỉcòn 7% Cây con ở vườn ươm sau một năm mới đem trồng [1].

Nhục đậu khấu trong gieo trồng tự nhiên hoa đực bao giờ cũng nhiều hơn hoacái Nhục đậu khấu cho thời gian thu hoạch kéo dài đến 70 - 80 năm [1]

1.2.4 Bộ phận dùng

Sử dụng các bộ phận là nhân hạt và áo hạt phơi khô Mỗi năm thu hái 2 lần vàotháng 5 đến tháng 6 và tháng 11 đến tháng 12 Sau khi hái quả, bóc bỏ vỏ lấy riêng áohạt ngâm nước rồi phơi sấy khô thu được nhục quả Hạt đem sấy ở 80 độ C cho đếnlúc có tiếng lọc cọc thì đập mang lấy nhân [43], [47] và đem chế biến tiếp [1]

1.2.5 Thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học đặc trưng

Myristica fragrans được đặc trưng bởi một số thành phần hóa học bao gồm

lignans, neolignans, diphenylalkanes, phenylpropanoit, terpenoit, ankan, axit béo, estecủa axit béo và một vài thành phần nhỏ khác như steroid, saponin, triterpenoid vàflavonoid Dịch chiết suất từ nhục đậu khấu và các thành phần hóa học của nó có nhiềutác dụng sinh học khác nhau, như chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, khángnấm, chống béo phì, giảm đau, bảo vệ tim mạch [30]

Các chất chuyển hóa sơ cấp (carbohydrate, lipid/axit béo và protein) chiếm tới80% trọng lượng của hạt nhục đậu khấu khô trong khi phần còn lại bao gồm các chấtchuyển hóa thứ cấp có bản chất hóa học đa dạng Chúng bao gồm các loại tinh dầu(terpen và phenylpropanoid) và các hợp chất phenolic (axit caffeic, ferulic vàprotocatechuic, lignans/neolignans, và diarylalaknes) là thành phần chính Polyphenolvà sắc tố (catechin, epicatechin, falvonoid và cyanidin) cũng có mặt [6], [30]

Thành phần hóa học chính của tinh dầu Myristica fragrans (Myristica fragrans

essential oil - MFEO) là sabinene, eugenol, myristicin, caryophyllene, β-myrcene và pinene Các nghiên cứu lâm sàng và thực nghiệm đã xác nhận các hoạt động chốngoxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm, chống sốt rét, chống co giật, bảo vệ gan, chống kýsinh trùng, diệt côn trùng của MFEO [13]

α-Nghiên cứu tài liệu cho thấy sự hiện diện của myristicin, D-limonene, β-myrcene,

sabinene, α-pinene, β-pinene là thành phần chính trong tinh dầu trong M fragrans [23],

[33]Một nghiên cứu cho thấy các thành phần trong hạt nhục đậu khấu được trồng ởNam Ấn Độ có chứa hoạt chất với hàm lượng bao gồm α-phellandrene (1,9%), γ-asarone (1,4%), p-cymene (1,1%), α-thujene (1,0%), methyleugenol (0,6%) ,

caryophyllene (0,5%), α-terpineol (0,4%), eugenol (0,4%), copaene (0,4%), β-linalool(0,3%), germanacrene-D (0,3%), β-terpineol (0,2%) , và γ-elemene (0,2%), trong khidầu hạt nhân có 3-carene (1,8%), terpinen-4-ol (1,7%), copaene (1,7%), α-thujene(1,5%), isoterpinolene (1,3%) ), γ–terpinene (1,2%), β-terpineol (0,8%), γ-asarone(0,8%), α-phellandrene (0,8%), γ-elemene (0,7%), myristicin (0,7%), p- cymene(0,7%), 4-carene (0,7%), caryophyllene (0,5%), p-menth-8-en-1-ol (0,5%), safrole(0,5%), α-terpinyl axetat (0,4%) , β-phellandrene (0,3%), camphene (0,3%) và α-cubebene (0,3%) Ngoài ra, các thành phần trong tinh dầu hạt nhục đậu khấu có chứahàm lượng là terpinen-4-ol (2,4%), copaene (2,4%), γ-asarone (2,3%), β-phellandrene(2,2%), myristicin (1,9%), α -thujene (1,3%), 3-carene (1,2%), β-terpineol (1,1%), γ-terpinene (1,0%), isoterpinolene (0,9%), p-menth-8-en-1-ol (0,9) %), γ-elemene(0,8%), safrole (0,7%), methyleugenol (0,7%), 4-carene (0,7%), p-cymene (0,7%), α-bergamotene (0,6%), α-phellandrene (0,5%), camphene (0,4%) và α-terpinyl axetat(0,4%) [13].

1.3 Một số nghiên cứu về tác dụng kháng biofilm S aureus của cao chiết dược

liệu1.3.1 Nghiên cứu nước ngoài

Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu về tác dụng kháng biofilm S aureus của

cao chiết dược liệu.Kannappan A và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng biofilm MRSA của chiết

xuất rễ Vetiveria zizanioides (V zizanioides root extract – VREX) Biofilm của MRSA

được tạo trên các phiến kính (1×1cm) trong các trên đĩa 24 giếng chứa 1ml TSB ở 37°Ctrong 24 giờ Kết quả được phân tích bởi kính hiển vi điện tử quét (SEM) sau khi cốđịnh biofilm trên lam kính trong 2 giờ, rửa phiến kính bằng nước cất sau đó được khửnước bằng ethanol ở nồng độ tăng dần (20%, 40%, 60%, 80% và 100%) trong 2 lần.Các phiến kính chứa biofilm cố định được phủ vàng và được kiểm tra bằng SEM Kết

quả thu được cho thấy chiết xuất rễ cây V zizanioides (VREX) làm giảm rõ rệt sự hình

thành biofilm phụ thuộc vào nồng độ mà không ảnh hưởng đến tỉ lệ sống sót của cácchủng được thử nghiệm Hinh ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển viquét laser đồng tiêu (CLSM) cho thấy tác dụng phá biofilm của VREX [35]

Miao W và cộng sự đã đánh giá tác dụng kháng biofilm S aureus của dịch chiếtZiziphus jujuba Mill chiết xuất chứa hàm lượng flavonoid (flavonoids-rich Ziziphusjujuba Mill Extract - FZM ) Biofilm của các chủng MSSA lâm sàng được tạo trên đĩa96 giếng Thêm vào đĩa 96 dịch chiết Ziziphus jujuba Mill vào các giếng ở các nồng

độ: 1,41, 2,81, 5,63, 11,3, 22,5 và 45,0 μg/mL Sử dụng ethanol làm chứng âm, chứngdương là ampicillin nồng độ 0,25 mg/mL, ủ ở 37°C trong 24 giờ Đánh giá biofilm

thông qua phương pháp nhuộm tím tinh thể (CV), soi kính hiển vi điện tử quét laserđồng tiêu (CLSM), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi quang học Kếtquả nhuộm CV cho thấy sự có mặt của FZM làm giảm tốc độ hình thành biofilm Sựhình thành biofilm giảm khi nồng độ FZM tăng và khi nồng độ FZM ở mức 11,3 μg/m,tỷ lệ ức chế đạt tối đa là 88,3% So với nhóm đối chứng, những kết quả này có sự khácbiệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Hình ảnh dưới kính hiển vi quang học cho thấy ởnhóm chứng có mật độ VSV cao Ở nồng độ 2,81 mg/mL FZM, biofilm bắt đầu bongra nhưng vẫn còn khả năng bám dính, một số biofilm đã bị phá hủy Ở nồng độ 5,63μg/mL FZM, mức độ bám dính giảm và biofilm trong suốt hơn Hình ảnh dưới kínhhiển vi điện tử quét laser đồng tiêu (CLSM) cho thấy tất cả các nồng độ đều ảnh hưởng

đến sự hình thành biofilm của S aureus và độ dày biofilm giảm khi tăng nồng độ FZM.

Ở nồng độ 45 μg/mL FZM (6,30 ± 0,48 μm), quan sát được biofilm mỏng nhất, sốlượng VSV sống giảm đáng kể Cường độ huỳnh quang của VSV tai nồng độ 11,3μg/mL FZM (10,1 ± 0,03 μm) có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với kết quả củanhóm đối chứng (p < 0,05) Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho thấyFZM nồng độ 11,3 μg/mL có tác dụng phá biofilm Kết quả cho thấy tăng nồng độ

FZM làm tăng tác dụng kháng biofilm S aureus [41].

Chusri S và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng biofilm của chiết xuất từ

Quercusinfectoria G Olivier và thành phần chính của nó, acid tannic trên các chủngS.aureus kháng methicillin (MRSA) và S aureus nhạy cảm với methicillin (MSSA)

phân lập được trên lâm sàng Biofilm được nuôi cấy 24h ở 37 độ C trên đĩa 96 giếng

Đánh giá biofilm của S aureus được sử dụng bằng phương pháp nhuộm với tím tinh

thể (CV) Thực hiện đánh giá và thu kết quả cho thấy ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC;0,25 mg/ml) đã làm giảm sự hình thành biofilm của các chủng phân lập có ý nghĩa

thống kê (p < 0,05) Chiết xuất Quercusinfectoria G Olivier và thành phần chính của

nó, acid tannic đã tác động lên đặc tính kỵ nước bề mặt VSV và có hoạt tính khángbiofilm Chỉ số kỵ nước của tất cả các chủng vi khuẩn phân lập đều tăng sau khi xử lývới nồng độ trên MIC, MIC và dưới MIC của dịch chiết và acid tannic Kết quả chỉ ra

rằng chiết xuất Quercusinfectoria G Olivier và acid tannic làm giảm hình thành

biofilm của tụ cầu [18]

1.3.2 Nghiên cứu trong nước.

Mai Thị Ngọc Lan Thanh và cộng sự đã tiến hành đánh giá hoạt tính kháng

biofilm S aureus của cao chiết Trâm Tròn và Cò Ke Kết quả mang lại là cao phân

đoạn ethyl acetat Trâm Tròn cho hoạt tính ức chế biofilm trên hai chủng vi khuẩn

Staphylococcus aureus nhạy và kháng methicillin, với nồng độ là 0,25 mg/mL [2].

Phân đoạn ethyl acetat Cò Ke cho hoạt tính ức chế biofilm trên chủng MRSA với nồngđộ 0,2513 mg/mL [3]

Nghiên cứu của Nguyễn Khắc Tiệp và cộng sự đã thực hiện sàng lọc tác dụng

kháng biofilm S aureus với các mẫu cao dược liệu khác nhau ở Việt Nam, được thực

hiện trong các điều kiện: (i) ở dạng đơn, với nồng độ 100 mg/L, (ii) kết hợp với khángsinh moxifloxacin nồng độ 1,5 mg/L, (iii) kết hợp với kháng sinh vancomycin nồng độ20 mg/L Các mẫu có sự giảm > 25% giá trị RF (đánh giá mức độ chuyển hóa củaVSV sống) so với mẫu chứng dương ở cùng điều kiện được coi như mẫu có khả năng

diệt S aureus trong biofilm Kết quả cho thấy trong 300 mẫu mang thực hiện sàng lọc,có 11 mẫu, chiếm tỷ lệ 3,6%, có khả năng diệt S aureus trong biofilm, ở dạng đơn lẻhoặc kết hợp với kháng sinh Trong đó, có 5 mẫu có khả năng diệt S aureus trong

biofilm ở dạng đơn lẻ Khi kết hợp với kháng sinh, gần như tất cả các mẫu trên đềutăng cường khả năng diệt khuẩn [4]

Có thể thấy rằng, dược liệu đang là nguồn cung cấp các hoạt chất kháng biofilm

rất tiềm năng Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tác dụng kháng biofilm S aureus hiện

còn rất hạn chế Do đó, đề tài này được thực hiện với mục tiêu tìm ra phân đoạn của

nhục đậu khấu có tác dụng kháng biofilm S aureus Từ đó tạo tiền đề cho việc tìm racác hoạt chất mới có hoạt tính kháng biofilm của S aureus.

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Vi sinh vật

Vi sinh vật: Staphylococcus aureus ATCC 33591.

Chủng chuẩn ATCC được cung cấp bởi Phòng nghiên cứu dược lý phân tử và tếbào (FACM) - Đại học công giáo Louvain, Vương quốc Bỉ Chủng được lưu trữ trongtủ -80ºC tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.2 Cao chiết

Nhục đậu khấu được sử dụng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ Trung Quốc,nhập khẩu bởi công ty TNHH Đông Dược Tân Lợi Nhục đậu khấu đạt các chỉ tiêuchất lượng của Dược điển Trung Quốc 2015 bộ 1, bộ 4 (Phụ lục 1)

Cao nhục đậu khấu, các phân đoạn từ cao nhục đậu khấu được chiết xuất tại Bộmôn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất – Trường Đại học Dược Hà Nội

Mẫu dược liệu (hạt nhục đậu khấu) được mang đi rửa sạch, sấy khô và nghiềnnhỏ đến kích thước phù hợp Bột dược liệu được chiết với ethanol 96% bằng phươngpháp ngâm nóng thu dịch chiết ethanol Dịch ethanol được cất thu hồi dung môi dướiáp suất giảm thu cao ethanol tổng Phân tán cao ethanol tổng trong một lượng nướcthích hợp và chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phâncực tăng dần thu các cao phân đoạn tương ứng

Sơ đồ chiết xuất thu cao tổng và chiết phân bố các cao phân đoạn của mẫu hạtnhục đậu khấu được thể hiện trong hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ chiết cao tổng và cao phân đoạn từ hạt nhục đậu khấuSau khi thử hoạt tính kháng biofilm S aureus của các mẫu cao chiết và các

phân đoạn, phân đoạn có hoạt tính tốt sẽ được chiết xuất thành các phân đoạn nhỏ đểtiếp tục tiến hành thử hoạt tính

2.1.3 Hóa chất, thiết bị

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Thành phần các môi trường:

Môi trường TGN (g/L)

TSBGlucoseNaCl

30.010.020.0

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu