Phương pháp này sàng lọc các hợp chất hóa học có hoạt tính tiềm năng thông qua việc dự đoán khả năng liên kết của protein và phối tử bằng phần mềm máy tính.. Trong quá trình nghiên cứu v
TỔNG QUAN
Tổng quan về Diệp hạ châu đắng
1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của Diệp hạ châu đắng
Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum et Thonn., Euphorbiaceae
Tên Việt Nam: Diệp hạ châu đắng, Chó đẻ thân xanh, Cam kiềm, Kiền đắng Đặc điểm thực vật:
Diệp hạ châu đắng là cây thân thảo sống hằng năm, phân nhánh nhiều, màu lục cao khoảng 30-60cm Lá mọc so le xếp thành hai dãy sít nhau trông như lá kép hình lông chim Lá có hình elip thuôn dài có màu xanh thẫm ở mặt trên, phía dưới màu xanh nhạt, dài từ 5 mm đến 10 mm, rộng 3 mm đến 6mm
Hoa màu lục nhạt, mọc ở nách lá, hoa đực có cuống ngắn 1 mm đến 2 mm, đài 5, có tuyến nhị mật, nhị 3, chỉ nhị dính nhau, xếp dưới hoa cái Hoa cái có cuống dài
Quả hình cầu giống như viên nang, nhẵn, hơi dẹt, đường kính 1,8 mm đến
2 mm, có đài Quả chứa 6 hạt hình tam giác, đường kính 1mm, có cạnh dọc và vân ngang [1]
Phân bố và sinh thái:
Diệp hạ châu đắng có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ và hiện nay phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới cổ Ở Châu Á, Diệp hạ châu đắng chủ yêu phân bố ở các nước Ấn Độ, vùng phía nam Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Philipin, Việt Nam, Malaysia và Indonesia Tại Việt Nam, cây diệp hạ châu đắng phân bố rải rác khắp nơi từ các tỉnh đồng bằng, ven biển, các đảo lớn đến các tỉnh trung du và miền núi có độ cao dưới 800m [5] Diệp hạ châu đắng là cây ưa ẩm, ưa sáng, không chịu được ngập úng Cây thường mọc ở đất
4 ẩm trong vườn, đất trồng hoa màu, nương rẫy Vòng đời của cây diệp hạ châu đắng chỉ kéo dài 3 - 4 tháng, cây thường xuất hiện vào cuối mùa xuân, phát triển mạnh vào 2 tháng mùa hè, sau đó cây ra quả và tàn lụi Cây tái sinh tốt từ hạt, hạt tồn tại trên mặt đất 7 - 8 tháng vẫn còn sức nảy mầm [6]
1.1.2 Thành phần hóa học của Diệp hạ châu đắng
Thành phần hóa học của Diệp hạ châu đắng bao gồm các nhóm chính: alcaloid, tannin và phenol, lignan, flavanoid, sterol, terpenoid, tinh dầu, Được trình bày ở bảng 1.1
Bảng 1.1.Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng
Nhóm Hoạt chất Tài liệu tham khảo
Alkaloid Epibubbialin, isobubbialin, norsecurinin, securinin, securinol, 4-methoxy-nor- securinin, dihydrosecurinin, allo-securin, tetrahydrosecurinin, 4-methoxy dihydrosecurinin, 4-hydrosecurinin, 4-methoxy tetrahydrosecurinin
Tannin và phenol Amariin, acid amariinic, amarulon, corilagin, geraniin, acid geranic, furosin, phyllanthusiin A, B, C và D, acid ellagic, acid repandusinic, elaeocarpusin, acid 4- galloyl quinic, acid gallic, gallocatechin, 1,6-digalloylglucopyranos, acid 4-O- galloylquinic, acid quicnic, acid geraniinic B, cidrepandusinic A, isocorilagin, melatonin
Nhóm Hoạt chất Tài liệu tham khảo
Lignan Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, phyltetralin, nirtetralin, isonirtetralin, hinokinin, lintetralin, isolintetralin, demethylenedioxy niranthin, 5- demethoxy-niranthin, 7′- oxocubebin dimethyl ether, (3-(3,4- dimethoxybenzyl)-4-(7- methoxybenzo[1,3]dioxol-5-yl-methyl)- dihydrofuran-2-on, và 4-(3,4- dimethoxyphenyl)-1-(7- methoxybenzo[1,3]dioxol-5-yl)- 2,3- bismethoxymethylbutan-1-ol
Flavonoid Quercetin, rhamnocitrin, rutin, apigenin, luteolin, kaempferol, allocatechin, astragalin, quercetin-3-O-glucosid, quercitrin, 4′,5,7-triethoxy-3,3′,6- trimethoxy flavon, phyllanthusiin
Sterol Amarosterol A, amarosterol B, cycloeucalenyl acetat, macdougallin, ergosta-5,7,22-trien-3-ol acetat, 17-(1,5- dimethylhexyl)-6-hydroxy-5-methylestr- 9-en-3-yl acetat, stigmasterol, β- sitosterol, daucosterol, stigmast-5-en-3-ol oleat, 6,7-epoxypregn-4-en-9,11,18-triol-
Nhóm Hoạt chất Tài liệu tham khảo
3,20-dion, 11,18-diacetat, bufalin, 3- acetoxy-7,8-epoxylanostan-11-ol
Terpenoid Phyllanosid, 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E- farnesyl farnesol, linalool, phytol, olean- 13(18)-en, methyl ursolat, barringenol R1, Phenazin và dẫn chất phenazin 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E-farnesyl farnesol, lupeol, phyllanthenol, phyllanthenon, phyllantheol, acid oleanolic, acid ursolic
Tinh dầu Linalool, phytol, hexahydrofarnesyl aceton, pentacosan, naphthalen
Các nhóm khác Acid cinnamic, acid 4-hydroxy-3- methoxy-benzoic, acid brevifolin carboxylic, rhodopin
Hình 1.1 Khung cấu trúc của alcaloid, flavanoid, sterol
Hình 1.2 Công thức hóa học một số hợp chất tannin và phenol
Hình 1.3 Công thức hóa học một số hợp chất lignan
Hình 1.4 Công thức hóa học một số hợp chất terpenoid
1.1.3 Tác dụng dược lý của Diệp hạ châu đắng
Diệp hạ châu đắng là một thảo dược đã được sử dụng làm thuốc từ lâu đời Thành phần hóa học của cây rất phong phú, đa dạng, có chứa nhiều nhóm chất như alcaloid, flavonoid, lignan, tannin thủy phân (ellagitannin), polyphenol, triterpen, sterol và tinh dầu [4] Diệp hạ châu đắng có nhiều tác dụng dược lý như tác dụng bảo vệ tế bào gan, trị viêm gan, hoạt tính kháng khối u, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và ký sinh trùng [6]
Bảng 1.2.Tác dụng sinh học của Diệp hạ châu đắng Tác dụng sinh học Tài liệu tham khảo
Tác dụng bảo vệ gan [5], [14], [15], [16]
Tác dụng hạ đường huyết [5], [17], [18], [19]
Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm [20], [21], [22]
Tác dụng chống oxy hóa [23], [24], [25]
1.1.3.1 Tác dụng bảo vệ gan
Cao diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan trên chuột cống trắng được gây nhiễm độc gan bằng carbon tetraclorid Trong mô hình gây xơ gan thực nghiệm trên chuột cống trắng, thuốc có tác dụng làm giảm hàm lượng colagen trong máu và làm giảm mức độ xơ gan ở động vật điều trị so với đối chứng [5]
Năm 2007, Farah Nazz và cộng sự đã đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao chiết Phyllanthus amarus trong ethanol đối với tổn thương gan do aflatoxin B1 gây ra ở chuột bằng cách sử dụng các thông số sinh hóa và nghiên cứu mô bệnh học khác nhau Kết quả cho thấy cao chiết Phyllanthus amarus có tác dụng bảo vệ gan bằng cách hạ thấp hàm lượng chất phản ứng với axit thiobarbituric (TBARS) [14]
Năm 2008, Toyin Y Faremi và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao chiết methanol từ Phyllanthus amarus chống lại tổn thương oxy hóa do ethanol gây ra trên chuột bạch tạng Wistar đực trưởng thành Kết quả cho thấy, khi sử dụng cao chiết methanol từ Phyllanthus amarus, Glutathione-S transferase (GST) đã giảm đi đáng kể Ngoài ra, cao chiết Diệp hạ châu đắng làm tăng đáng kể hoạt động của alanine transaminase (ALT) và aspartate transaminase (AST) ở gan cũng như phosphatase kiềm (ALP), đồng thời làm giảm đáng kể hoạt động trong huyết tương của các transaminase ở chuột bị nhiễm ethanol [15]
Năm 2011, K Arun đã nghiên cứu đối chiếu về hoạt động bảo vệ gan của
Phyllanthus amarus và Eclipta prostrata ở chuột bạch tạng bị nhiễm độc ethanol
Kết quả cho thấy việc sử dụng bột Phyllanthus amarus và bột lá Eclipta prostrata để điều trị làm thay đổi đáng kể các thông số sinh hóa ở những con chuột bị ngộ độc ethanol và duy trì tốt ở mức bình thường Những kết quả này cho thấy cả hai loài này có giá trị bảo vệ gan rất lớn [16]
1.1.3.2 Tác dụng hạ đường huyết
Cao nước Diệp hạ châu đắng có tác dụng hạ đường huyết ở thỏ bình thường và thỏ gây đái tháo đường với alloxan Cao làm hạ đường huyết ngay cả khi cho thỏ uống một giờ sau khi cho uống glucose, và hoạt tính hạ đường huyết của diệp hạ châu đắng cao hơn colbutanmid [5]
Năm 2006, A.A Adeneye và cộng sự đã nghiên cứu hoạt động hạ đường huyết của dịch chiết nước lá của Phyllanthus amarus Kết quả cho thấy dịch chiết nước từ lá Phyllanthus amarus tạo ra sự giảm phụ thuộc vào liều lượng glucose và cholesterol trong huyết tương lúc đói, đồng thời làm giảm trọng lượng con chuột đực được điều trị bằng dịch chiết nước từ lá của Phyllanthus amarus [17]
Năm 2014, Adeolu A Adedapo và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá Phyllanthus amarus trên chuột Kết quả cho thấy, dịch chiết lá Phyllanthus amarus ở mức liều 200mg/kg và 400mg/kg trọng lượng cơ thể làm giảm đáng kể lượng đường trong máu lúc đói, thay đổi đáng kể trong thử nghiệm dung nạp glucose đường uống, tác dụng rõ rệt trong thử nghiệm hoạt động hạ đường huyết và giảm rõ rệt glucose, cholesterol và triglycerid [18]
Năm 2015, I Oluwole Oyewole và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá hiệu quả hạ đường huyết của cao chiết methanol từ cây Phyllanthus amarus ở chuột mắc bệnh tiểu đường Kết quả cho thấy cao chiết đã đảo ngược được tình trạng tăng đường huyết do alloxan gây ra ở chuột vì đã làm giảm đáng kể lượng đường trong máu Ngoài ra mức độ protein toàn phần trong huyết thanh cũng giảm đáng kể ở những con chuột được điều trị bằng hai dịch chiết [19]
1.1.3.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Tổng quan về virus Dengue và bệnh sốt xuất huyết
1.2.1 Khái quát về virus Dengue và bệnh sốt xuất huyết Dengue (SXHD)
Virus Dengue thuộc chi Flavivirus, họ Flavivirides, thuộc nhóm virus gây bệnh thông qua động vật chân khớp bao gồm 4 type huyết thanh chính (DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4) trên cơ sở tương tác khác nhau với kháng thể trong huyết thanh người, tuy nhiên biểu hiện lâm sàng của người bệnh khi nhiễm các type huyết thanh khác nhau là tương tư nhau [29]
Virus Dengue được lây truyền từ người bệnh sang người lành chủ yếu do vết đốt của muỗi cái nhiễm bệnh thuộc chi Aedes, trong đó trung gian truyền bệnh chủ yếu là muỗi Aedes aegypti Hiện nay trên thế giới chưa có thuốc đặc trị cho bệnh nhân sốt xuất huyết, do đó các phác đồ đưa ra chỉ tập trung chủ yếu vào điều trị triệu chứng cho người bệnh
Bệnh SXHD là mối quan ngại lớn với sức khỏe toàn cầu, trải rộng từ khu vực nhiệt đới tới bán nhiệt đới, số ca mắc hàng năm trên toàn cầu lên tới khoảng 50-100 triệu người, số tử vong do SXHD được báo cáo là khoảng 20.000 ca hàng năm
Vaccin sốt xuất huyết đã được nghiên cứu và phát triển trong nhiều năm, hiện nay trên thế giới đang lưu hành 2 loại vaccin là Dengvaxia (Sanofi Pasteur - Pháp, được FDA Hoa Kỳ chính thức thông qua vào tháng 5/2019) và QDENGA (Takeda - Nhật, chính thức được phép dùng ở EU vào 8/12/2022) Tuy nhiên, 2
16 loại vaccin này đều chưa được đưa vào sử dụng ở nước ta Việc chưa có bất kì vaccin hay thuốc đặc hiệu nào dẫn tới việc nghiên cứu phát triển thuốc cho căn bệnh này là vô cùng cần thiết
1.2.2 Cấu trúc virus Dengue và các mục tiêu phân tử của virus Dengue
Virus Dengue là virus hình cầu, có vỏ bọc, đường kính khoảng 50nm, chứa vật chất di truyền là một sợi ARN duy nhất có chiều dài khoảng 11 kb Bộ gen của virus mã hóa 3 protein cấu trúc (capsid [C], tiền màng [PrM] và protein vỏ [E]) và bảy protein phi cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B và NS5) [30]
❖ Các mục tiêu phân tử của virus Dengue
- Protein C: Protein capsid chứa 112-113 acid amine Protein C cũng có vai trò thúc đẩy sự trưởng thành của protein M và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nhân lên của virus [29]
- Protein M: Tiền thân của protein màng, có ảnh hưởng quan trọng đến sự trưởng thành của virus trong chu trình nhân lên Tuy nhiên, protein M có tính sinh miễn dịch không mạnh, do đó nó luôn được kết hợp protein E trong phát triển vaccin [29]
- Protein E: Là một glycoprotein thuộc protein tổng hợp màng virus loại II, gồm 493-495 acid amin, có vai trò quan trọng để virus gắn trên màng tế bào và xâm nhập vào tế bào chủ Đây là mục tiêu tiềm năng để nghiên cứu phát triển các vaccin sốt xuất huyết [29]
- Protein NS1: là glycoprotein, kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm virus Protein NS1 có trọng lượng phân tử khoảng 43-48 kDa [29]
- Protein NS2A: là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ NS2A hoạt động phối hợp với NS4B trong hoạt động ức chế miễn dịch do làm tăng tác dụng của virus trong tế bào vật chủ bằng cách cách ức chế quá trình phosphoryl hóa TANK binding kinase [29]
- Protein NS2B: là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ Vùng trung tâm của NS2B như là đồng yếu tố của protein NS3 có hoạt tính serine protease [29]
- Protein NS3: là protein có hoạt tính serin-protease và helicase Mã amin cuối cùng của NS3 là serine protease, cần thiết cho quá trình sao chép của virus [29]
- Protein NS4A: là protein ER xuyên màng khoảng 16kDa và rất cần thiết trong quá trình nhân lên của virus NS4A cũng có tác dụng ức chế autophagy (một cơ chế bảo vệ tế bào trong đó tế bào tự phân hủy để chống nhiễm virus) do tạo ra các thay đổi trong màng tế bào chủ theo cách là vật chứa sự hình thành phức hợp sao chép virus, do đó thúc đẩy sự lây nhiễm virus [29]
- Protein NS4B: giống như NS4A, NS4B cũng là một protein DENV kỵ nước, xuyên màng, có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus [29]
- Protein NS5: là protein lớn nhất, khoảng 103 kDa do DENV sản xuất NS3 và NS5 được cho là các enzyme xúc tác chính của phức hợp sao chép vì cả hai đều tham gia chủ yếu vào quá trình sao chép bộ gen của virus [29]
1.2.3 Các mục tiêu phân tử tiềm năng đối với nghiên cứu phát triển thuốc mới
Dựa trên các đặc điểm sinh lý trên của DENV, các mục tiêu của thuốc chống DENV chủ yếu bao gồm các mục tiêu protein của virus NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B và NS5, cũng như các mục tiêu của enzyme virus là NS2B/NS3,
NS3-helicase, NS5-RNA phụ thuộc polymerase và NS5-methyltransferase Bên cạnh đó, các protein cấu trúc chủ yếu tham gia vào quá trình xâm nhập của virus vào tế bào chủ và lắp ráp các hạt virus cũng là mục tiêu tiềm năng để phát triển các loại thuốc chống sốt xuất huyết Dengue [31].
Tổng quan về kỹ thuật in silico và phương pháp docking phân tử
1.3.1 Mô hình in silico - Sự trợ giúp của máy tính trong sàng lọc ảo
Nghiên cứu phát triển thuốc mới là một quá trình trải qua nhiều giai đoạn, từ xác định mục tiêu, sàng lọc các hợp chất tiềm năng cho đến nghiên cứu lâm sàng và đưa ra thị trường Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ phần mềm và lĩnh vực tin sinh học, quá trình này đã được tối ưu hóa cả về thời gian và chi phí Việc sử dụng máy tính để hỗ trợ tìm kiếm cũng như mô phỏng các quá trình tương tác nói chung thông qua tính toán được gọi chung là “in silico” Một trong những ứng dụng quan trọng của phương pháp in silico trong lĩnh vực nghiên cứu phát triển thuốc là phát hiện thuốc dựa trên cấu trúc [32] Áp dụng phương pháp sàng lọc in silico dựa trên cấu trúc đã được chứng minh là hiệu quả hơn nhiều so với cách khám phá truyền thống vì nó dựa trên bản chất tương tác giữa các cấu trúc không gian ba chiều của phân tử [32]
Trong sàng lọc ảo, các cơ sở dữ liệu về cấu trúc các hợp chất hóa học đã biết được mô phỏng tương tác với mục tiêu đã biết nhằm đánh giá khả năng tương tác thông qua các giá trị năng lượng khác nhau Từ đó có thể đưa ra những nhận xét ban đầu về tiềm năng của những hợp chất đó với đích mong muốn
1.3.2 Kỹ thuật mô phỏng gắn kết phân tử (Molecular docking)
Mô phỏng tương tác phân tử là một phương pháp dự đoán khả năng tương tác giữa protein và phối tử thông qua giá trị năng lượng liên kết Có nhiều mô hình được đề xuất trong quá trình gắn kết, điển hình như mô hình gắn kết cứng (Docking rigid) và mô hình gắn kết linh hoạt (Docking flexible)
Mô hình lắp ghép cứng được đề xuất đầu tiên, dựa trên nguyên tắc “ổ khóa
- chìa khóa”, đề cập đến việc lắp ghép cứng nhắc các phối tử (ligand) vào trung tâm hoạt động của protein (active site) theo nhiều hướng khác nhau trong không gian nhằm tìm ra phức hợp ligand - protein bền nhất về mặt năng lượng Tuy nhiên, trong tự nhiên, quá trình tương tác giữa phối tử và protein diễn ra một cách hoàn toàn linh hoạt và chúng có thể phải thay đổi hình dạng để phù hợp nhất với nhau Do đó, dựa trên nguyên tắc bổ sung hình học “chìa khóa - ổ khóa”, các nhà khoa học đề xuất mô hình lắp ghép linh hoạt có khả năng tiếp cận nhất trạng thái tồn tại của phân tử trong tự nhiên và dự đoán được trạng thái phức hợp ổn định nhất [33]
Phương pháp này cho phép mô tả hoạt động của phối tử trong vùng hoạt động của protein (đã được xác định tọa độ) mục tiêu cũng như làm sáng tỏ các quy trình hóa sinh cơ bản ở mức độ phân tử Quá trình lắp ghép bao gồm 2 bước cơ bản: dự đoán cấu hình, vị trí và hướng của phối tử trong vùng hoạt động (trạng thái của phối tử) và đánh giá mức độ liên kết [34] Kết quả quá trình mô phỏng gắn kết phân tử thể hiện dựa qua giá trị năng lượng liên kết “binding energy”
Phối tử ở các trạng thái được mô phỏng quá trình gắn kết với protein, sau đó năng lượng ứng với các quá trình được xếp hạng và từ đó tìm ra được trạng thái bền nhất Năng lượng liên kết được tính toán dựa trên các tương tác khác nhau như Van der waals, tĩnh điện, liên kết hydro và tương tác kỵ nước [34]
Quá trình mô phỏng tương tác phân tử
Quá trình mô phỏng tương tác phân tử bao gồm ba bước là chuẩn bị protein, chuẩn bị phối tử và mô phỏng tương tác [35]
Nếu các protein mục tiêu đã được xây dựng thì có thể khai thác bằng cách tải xuống từ CSDL PDB http://www.rcsb.org ở cấu trúc 3D dưới định dạng PDB
Sau đó, protein được tối ưu hóa bằng cách loại nước và các cấu tử khác (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực Kollman và lưu dưới định dạng pdbqt để chuẩn bị cho quá trình docking
Cần xác định chính xác vùng trung tâm hoạt động của protein để khoanh vùng và xác định Grid box Grid box được xác định sao cho vừa bao phủ hoàn toàn được trung tâm hoạt động của protein, vừa không quá rộng để tránh tốn thời gian khi mô phỏng
Phối tử thường có sẵn và được tải xuống từ CSDL Pubchem, eMolecules và ZINC dưới dạng cấu trúc 3D [36] Nếu phối tử không có sẵn thì có thể tự xây dựng bằng các phần mềm khác nhau như Chemdraw (phiên bản dùng thử), …
Quy tắc 5 điểm Lipinski hỗ trợ phân biệt các hợp chất có và không có tính chất thuốc, thông qua các tiêu chí: Khối lượng phân tử nhỏ hơn 500 Dalton, tính ưa dầu cao (chỉ số LogP nhỏ hơn 5), có ít hơn 5 gốc cho liên kết hydro, ít hơn 10 gốc nhận liên kết hydro và chỉ số độ khúc xạ mol trong khoảng 40-130
Protein và phối tử được tính toán mức độ gắn kết bằng phần mềm mô phỏng tương tác, sau đó phần mềm thực hiện các tính toán và đưa ra xếp hạng các giá trị năng lượng khác nhau Phần mềm sử dụng là AutoDock Phần mềm AutoDock được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật mô phỏng gắn kết phân tử nhỏ lên các phân tử lớn đã được nhiều nhóm nghiên cứu quốc tế sử dụng và công bố các công trình liên quan [50]
Một nghiên cứu đã so sánh năng lượng liên kết của protein - phối tử đối chiếu đã biết nhằm dự đoán mức độ ý nghĩa của tương tác “Ngưỡng năng lượng tương tác” có ý nghĩa trong phần mềm Autodock được ước lượng ở mức -7,00
21 kcal/mol Ở ngưỡng này, mức độ liên kết giữa phối tử và protein là mạnh, đáng kể so với những liên kết yếu và không đặc hiệu khác Hơn thế nữa, ngưỡng năng lượng -7.0 kcal/mol có thể nắm bắt gần 98% các tương tác chất ức chế đã biết trong khi loại bỏ hơn 95% tương tác không ức chế bị nghi ngờ [37].
Tổng quan về phương pháp tối ưu hóa chiết xuất
Trong nghiên cứu và điều chế cao dược liệu, để đạt được những mục tiêu nhất định về thành phần các hoạt chất cần phải tối ưu được các thông số trong quá trình chiết xuất Thông thường có hai phương pháp tối ưu được ứng dụng là phương pháp thay đổi một yếu tố - One factor at a time (OFAT) và phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology - RSM)
1.4.1 Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
OFAT là phương pháp thường được sử dụng để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất Nguyên tắc của phương pháp là thay đổi giá trị của một thông số trong khi giữ cố định tất cả các yếu tố khác để đánh giá ảnh hưởng của từng thông số lên đáp ứng của một quá trình Đối với các thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp này, yếu tố cần khảo sát phải được cô lập, tất cả các yếu tố còn lại giữ cố định và kiểm soát để không gây nhiễu giữa các thí nghiệm; ảnh hưởng của các yếu tố giữ cố định này đến quy trình được chuẩn hóa, loại trừ hoặc đảm bảo không đổi giữa các thí nghiệm và thường các yếu tố cố định này là các thông số tối ưu ở điều kiện khảo sát trước đó Ưu điểm của phương pháp OFAT là không phải xử lý thống kê phức tạp, thường được sử dụng trong khảo sát các yếu tố của một quá trình mà lượng yếu tố cần khảo sát ít và các yếu tố này hoàn toàn độc tập với nhau [38]
Tuy nhiên, khi cần khảo sát ảnh hưởng của nhiều yếu tố lên quá trình thì số lượng thí nghiệm thiết kế theo phương pháp này cần phải tiến hành nhiều; để lựa chọn được điều kiện tối ưu trong tập hợp các thí nghiệm tiến thành thì phải tiến hành số lượng lớn thí nghiệm và chỉ có thể lựa chọn trong tập hợp các thí nghiệm
22 đó Ngoài ra, phương pháp này còn không thể đánh giá được ảnh hưởng của sự tương tác giữa các yếu tố lên quá trình do coi các yếu tố khảo sát là độc lập với nhau [38]
1.4.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Hiện nay, nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên các nguyên tắc về thống kê (Design of Experiments) đã được ứng dụng để xác định điều kiện tối ưu, một trong số đó là phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology - RSM)
Phương pháp đáp ứng bề mặt được phát triển bởi Box-Behnken và các cộng sự vào những năm 1950 [39] RSM bao gồm một loạt các kỹ thuật toán học/thống kê để xây dựng mô hình thực nghiệm và khai thác mô hình Bằng phương tiện thiết kế và phân tích thí nghiệm phù hợp, RSM tìm cách liên hệ một phản ứng với các mức độ của một số biến đầu vào hoặc các yếu tố ảnh hưởng đến nó [40] Phương pháp này sẽ đưa ra một mối quan hệ toán học để dự đoán các yếu tố đầu ra mong muốn [41] Để áp dụng RSM cần có 6 bước như sau [39]:
Bước 1: Lựa chọn các biến đầu vào và biến đầu ra
Bước 2: Thiết kế thí nghiệm và tiến hành thí nghiệm
Bước 3: Xử lý thống kê toán học
Bước 4: Đánh giá sự phù hợp của mô hình
Bước 5: Xác minh sự cần thiết và khả năng thực hiện chuyển dịch theo hướng tới vùng tối ưu
Bước 6: Xác định giá trị tối ưu cho từng biến nghiên cứu
Nhiều biến có thể ảnh hưởng đến phản ứng của hệ thống được nghiên cứu và thực tế là không thể xác định và kiểm soát những thay đổi nhỏ của tất cả biến
Do đó, cần phải chọn những biến có ảnh hưởng lớn Các thiết kế sàng lọc nên được thực hiện để xác định biến nào trong số các biến thử nghiệm và tương tác của chúng có tác động đáng kể hơn Các thiết kế giai thừa hai cấp đầy đủ hoặc phân số có thể được sử dụng cho mục tiêu này chủ yếu vì chúng hiệu quả và kinh tế [39]
Thiết kế thực nghiệm phải đảm bảo tất cả các biến nghiên cứu được thực hiện ở ít nhất 3 mức giá trị Trong số các thiết kế đối xứng bậc hai được biết đến nhiều hơn là thiết kế giai thừa ba cấp, thiết kế Box-Behnken, thiết kế phức hợp trung tâm và thiết kế Doehlert Các thiết kế đối xứng này khác nhau về lựa chọn điểm thử nghiệm, số cấp cho các biến, số lần chạy và khối [39]
Trong đó mô hình phức hợp trung tâm (Central Composite Design - CCD) là một trong những mô hình thông dụng nhất
Một thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của k yếu tố theo phương pháp này là sự phối hợp của ba nhóm nghiệm thức sau [40]:
- Các nghiệm thức theo cách thiết kế kết hợp yếu tố (có thể là kết hợp đủ 2 k hay kết hợp giảm 2 k−p , trong đó mỗi yếu tố được thử nghiệm ở hai mức, mức thấp và mức cao hay còn được mã hóa thành khoảng giá trị [-1;1] Như vậy nếu có k yếu tố kết hợp đủ sẽ có 2 k nghiệm thức thuộc nhóm này
- Các nghiệm thức “sao” (hay nghiệm thức trục): các nghiệm thức trong nhóm này, thường được ký hiệu là "*", có giá trị của (k–1) yếu tố là giá trị tâm, yếu tố còn lại có giá trị đã được mã hóa là –α hay α với α ≥1 Như vậy sẽ có 2 k nghiệm thức thuộc nhóm này Giá trị α còn được gọi là giá trị trục, giá trị “sao”, hay cánh tay đòn
- Nghiệm thức tâm: giá trị của tất cả các yếu tố đều ở mức 0 Trong khi thực hiện thí nghiệm, các nghiệm thức thuộc nhóm 1 và 2 đều không cần lặp lại, riêng nghiệm thức tâm được lặp lại n lần Như vậy một thí nghiệm thiết kế theo phương pháp phối hợp có tâm để khảo sát ảnh hưởng của k yếu tố sẽ gồm 2 k + 2k + 1 nghiệm thức, và nếu chỉ lặp ở nghiệm thức tâm sẽ gồm 2 k + 2k + n đơn vị thí nghiệm (khi dùng kết hợp đủ) [39].
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu - thiết bị
- Mẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng (Herba Phyllanthii amari) được chuyên gia giám định tên khoa học theo tiêu chuẩn mô tả đặc điểm hình thái trong chuyên luận Diệp hạ châu đắng của DĐVN V (tập 2) và các tài liệu chuyên khảo thực vật về Phyllanthus amarus Schum et Thonn (Phụ lục 1)
- Mẫu được bảo quản trong túi nilon kín, lưu trữ nơi khô ráo, thoáng mát
- Hóa chất chiết dược liệu: Ethanol (EtOH) công nghiệp tuyệt đối, nước cất
- Chất chuẩn: Geraniin (Chemfaces, CFN90256, độ tinh khiết 99,20%) (Phiếu COA ở phụ lục 2)
2.1.3 Máy móc, thiết bị, dụng cụ
• Chuẩn bị mẫu cao dược liệu:
- Cân, máy xay, máy đo hàm ẩm, rây, bể điều nhiệt, máy siêu âm
- Bình cầu, bình nón dung tích 500 mL có nút mài, sinh hàn
- Máy thu hồi dung môi áp suất giảm
- Cốc có mỏ, phễu lọc, giấy lọc, đũa thủy tinh
- Thiết bị nghiên cứu là máy tính được cài đặt các phần mềm Auto dock 4.2.6, AutodockTools 1.5.6, Open Babel GUI
- Cấu hình máy tính: + RAM: 8GB
+ Ổ cứng: 500GB HDD và 128GB SSD + Chip CPU: Intel Core i5-3470
Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu in-silico mối tương tác giữa thành phần hóa học có tác dụng ức chế virus Dengue
2.2.1.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hoá học DHCĐ phục vụ sàng lọc in silico tác dụng ức chế virus Dengue
- Thành phần hóa học của DHCĐ sẽ được thu thập từ cơ sở dữ liệu Google Scholar, Pubmed, Sciencedirect, Elsevier với từ khóa tìm kiếm là “medicinal constituents of Phyllanthus amarus”, “medicinal composition of Phyllanthus amarus”, “phytochemical of Phyllanthus amarus”, “Chemistry of Phyllanthus
Cao tối ưu Đạt tiêu chuẩn Dược điển Chiết xuất Đánh giá
Tối ưu hóa chiết xuất
27 amarus ”, “isolated from Phyllanthus amarus”, sau đó lưu trữ thành cơ sở dữ liệu về DHCĐ Cơ sở dữ liệu gồm các trường thông tin: tên chất và công thức Pubchem Smiles 2.1.4
- Sàng lọc các hợp chất đạt yêu cầu về SKD đường uống và phù hợp với quy tắc của Lipinski
Các hợp chất hóa học thu thập được sẽ được sàng lọc phù hợp với điều kiện sinh khả dụng đường uống và quy tắc của Lipinski
Các hợp chất hóa học tìm kiếm được sẽ được đưa vào CSDL Pubchem, thu thập thông tin về công thức Canonical SMILES (loại bỏ các hợp chất hóa học không có trên CSDL Pubchem, không có công thức Canonical SMILES, không có công thức 3D và các hợp chất hóa học trùng nhau); tạo thành một cơ sở dữ liệu công thức SMILES
Các công thức SMILES này được đưa vào Website SwissADME SwissADME là một trang web cho phép tính toán các mô hình hóa lý cũng như dự đoán các thông số ADME (hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ), đặc tính dược động học và tính giống thuốc (dự đoán một cấu trúc hóa học có khả năng nghiên cứu phát triển thành thuốc hay không) của một hợp chất [SIB, accessed 27/04-2023, from http://www.swissadme.ch/index.php] Kết quả dự đoán từ SwissADME được xuất ra file Excel, lấy hai giá trị là GI absorption (SKD đường uống) và Lipinski’5 violation (số lượng tiêu chí của quy tắc Lipinski bị vi phạm) và thống kê lại
Các hợp chất thỏa mãn 2 chỉ số GI absorption (High) và Lipinski (0 violation) hoặc một số chất không thỏa mãn chỉ số GI absorption (High) hay Lipinski (0 violation) nhưng đã có dữ liệu chứng minh tác dụng kháng Dengue trước đó sẽ được thống kê lại và tạo thành một cơ sở dữ liệu chuẩn bị cho quá trình Docking
- Sàng lọc các protein từ các chủng virus Dengue 1 - 4 Lựa chọn 1 - 2 protein có vai trò tương đối quan trọng và phổ biến trong quá trình hoạt động của virus
Các mục tiêu phân tử tiềm năng trong nghiên cứu phát triển thuốc kháng Virus Dengue là những mục tiêu phân tử có vai trò quan trọng trong vòng đời và quá trình nhân lên của virus Đồng thời, protein này cần có cấu trúc 3D sẵn có được công bố, để làm mục tiêu phân tử trong sàng lọc in silico
2.2.1.3 Mô phỏng tương tác phân tử (Molecular docking) của các hợp chất tiềm năng với protein của virus Dengue
Tiến hành quá trình mô phỏng tương tác phân tử giữa các hợp chất hóa học trong cơ sở dữ liệu 2 và các mục tiêu phân tử tiềm năng của virus Dengue Quá trình mô phỏng tương tác được thực hiện qua 4 bước như sau:
• Chuẩn bị protein : Các phân tử protein của virus với cấu trúc xác định được thu thập từ Protein Data Bank (PDB) [RCSB PDB, https://www.rcsb.org/, accessed 27/04/2023-2023] PDB là một cơ sở dữ liệu cho phép thu thập cấu trúc 3D của nhiều hợp chất sinh học, trong đó có protein Lựa chọn cấu trúc protein với độ phân giải (Resolution) dưới 2.5 nếu có thể [35] Cấu trúc 3D của protein, được tải xuống từ CSDL PDB dưới định dạng PDB, sau đó tiến hành loại các phối tử trong cấu trúc (nếu có), loại nước, thêm hydro, gắn trường lực Kollman và làm tròn điện tích Protein cuối cùng sau xử lý được lưu dưới định dạng PDBQT
• Chuẩn bị phối tử : Các phối tử phù hợp ở cấu trúc 3D được thu thập từ CSDL
Pubchem dưới định dạng SDF Sau đó, các phối tử được đưa vào phần mềm Open Babel GUI để chuyển từ định dạng SDF sang định dạng PDBQT nhằm chuẩn bị cho quá trình Docking
• Mô phỏng tương tác giữa protein và hợp chất hóa học (Protein-ligand docking):
Quy trình mô phỏng tương tác phân tử protein - phối tử (protein - ligand interaction) được thực hiện bởi AutodockTools 1.5.6 và Auto Dock phiên bản 4.2.6
Gridbox (hộp) được cài đặt sao cho bao trùm được trung tâm hoạt động (active site) của protein virus
Các phối tử được mô phỏng các trạng thái tương tác với vùng grid box đã chọn và cho các giá trị năng lượng liên kết khác nhau
• Đánh giá kết quả : Kết quả mô phỏng tương tác được đánh giá dựa trên giá trị năng lượng liên kết (binding energy) giữa phối tử và protein Năng lượng liên kết càng nhỏ (càng âm) đồng nghĩa giá trị năng lượng liên kết giữa phối tử - protein càng lớn, tương tác càng có ý nghĩa
2.2.2 Xây dựng quy trình chiết xuất
2.2.2.1 Phương pháp chiết xuất cao
➢ Chiết xuất cao toàn phần trong ethanol 96%
- Phương pháp chiết: Chiết siêu âm
- Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 20 (g) dược liệu đã được xay nhỏ (kích thước 355 - 2000 àm), cho vào bỡnh nún cú nỳt mài dung tớch 500 mL và thấm ẩm với lượng dung môi EtOH 96% tối thiểu Ngâm dược liệu đã được thấm ẩm với dung môi EtOH 96% và tiến hành chiết siêu âm Ngâm dịch chiết qua đêm ở nhiệt độ phòng
• Chiết 2 lần, mỗi lần 0,5 giờ
• Tỉ lệ DL/DM (g/ml): 1/10
➢ Chiết xuất cao tối ưu
- Phương pháp chiết: Chiết hồi lưu
• Cõn chớnh xỏc khoảng 20 (g) dược liệu đó được xay nhỏ (355 - 2000 àm), đã xác định hàm ẩm, cho vào bình cầu có nút mài dung tích 500 mL
• Chiết 1 lần, thời gian (0,5 giờ - 3 giờ)
• Tỉ lệ DL/DM (g/ml): (1/5 - 1/30)
• Dịch chiết được lọc, thu hồi dung môi thu được cao tổng Làm khô cao tổng ở 45 0 C trong 5h
• Cân lượng cao toàn phần thu được và bảo quản trong tủ lạnh
2.2.2.2 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
❖ Lựa chọn yếu tố khảo sát và thông số đánh giá
- Thời gian chiết: 0,5 giờ; 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ; 2,5 giờ; 3 giờ
- Tỉ lệ dung môi/ dược liệu (ml/g): 30/1 – 5/1
- Dung môi chiết xuất (nồng độ dung môi ethanol): ethanol 30-90 %
Hàm lượng geraniin trong dược liệu được tính theo công thức:
St, Sc: Diện tích pic geraniin của mẫu thử và mẫu chuẩn
Vt: Thể tích dung dịch chiết m: Khối lượng dược liệu
Cc: Nồng độ của mẫu chuẩn
C%: Độ tinh khiết của chất chuẩn (%) a: độ ẩm của dược liệu (%)
❖ Phương pháp khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu để chiết xuất cao Diệp hạ châu đắng
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao Diệp hạ châu đắng được khảo sát bằng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) kết hợp phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
* Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
Các yếu thời gian chiết, dung môi chiết, nhiệt độ chiết, tỉ lệ dược liệu/dung môi được khảo sát bằng cách tiến hành các thí nghiệm có sự thay đổi các mức khảo sát của một yếu tố trong khi tất cả các yếu tố còn lại được giữ nguyên Từ các kết quả khảo sát trước, điều kiện tốt nhất sẽ được lựa chọn để cố định và thực hiện các thí nghiệm khảo sát tiếp theo
* Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)
1 Lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra
Các biến đầu vào là nhiệt độ chiết xuất (X1), thời gian chiết xuất (X2), tỉ lệ DL/DM (X3) và dung môi chiết xuất hay nồng độ dung môi ethanol (X4) được
32 mã hóa thành các giá trị tương ứng trong đoạn [-1,1] Các khoảng khảo sát của các biến đầu vào trên được lựa chọn dựa trên kết quả khảo sát của từng biến bằng phương pháp OFAT Biến đầu ra được lựa chọn là hàm lượng geraniin trong cao đặc (Y)
Sử dụng phần mềm Design Expert 13 (phiên bản miễn phí) để thiết kế các thí nghiệm theo mô hình phức hợp trung tâm (CCD - Central Composite Design) kiểu hướng mặt (face centered, α=1) thu được dãy các thí nghiệm với các điều kiện tiến hành khác nhau Tổng số thí nghiệm cần tiến hành là N = 2 4 + 2.4 + 4 28, vì có 4 biến cần khảo sát, đồng thời tiến hành 4 thí nghiệm tại tâm nhằm đảm bảo độ lặp lại của quá trình chiết xuất
3 Tối ưu hóa quá trình chiết xuất
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Lựa chọn marker có hoạt tính ức chế virus Dengue từ Diệp hạ châu đắng dựa trên sàng lọc in silico
3.1.1 Lập cơ sở dữ liệu thành phần hoá học của DHCĐ
- Sàng lọc phối tử: Các hợp chất hóa học từ DHCĐ sẽ được sàng lọc dựa trên chỉ tiêu là sinh khả dụng và quy tắc Lipinski hoặc đã có dữ liệu chứng minh tác dụng kháng Dengue trước đó Hình ảnh minh họa quá trình sàng lọc phối tử ở phụ lục
Bảng 3.1.Kết quả tìm kiếm các hợp chất hóa học sau sàng lọc
Nhận xét: Từ hơn 100 hợp chất hóa học trong cây Diệp hạ châu đắng, qua quá trình sàng lọc, đã tìm ra được 52 hợp chất đạt yêu cầu về SKD đường uống và quy tắc Lipinski hoặc đã có dữ liệu chứng minh tác dụng kháng Dengue trước đó
3.1.2 Lựa chọn đích protein của virus Dengue
Hai mục tiêu phân tử tiềm năng được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu là NS2B/NS3 (Serine protein) và NS5 RdRp
Cấu trúc 3D của NS2B/NS3 (PDB ID: 2FOM) và NS5 RdRp (PDB ID: 6IZZ) được tải xuống từ CSDL Protein Data Bank
Hình 3.1.Cấu trúc 3D của protein 6IZZ được tải về từ CSDL Protein Data
44 Hình 3 2.Cấu trúc 3D của protein 2FOM được tải về từ CSDL Protein Data
• Gridbox của 2FOM: kích thước [x: 52,1952, y: 56,6277 z: 46,8960] với girdbox center là [x: -0,4637; y: -15,1662; z: 16,1087] [42]
• Grid box của 6IZZ: kích thước [x: 40, y:40, z:40] với gridbox center [x:
3.1.3 Docking lựa chọn các chất tiềm năng ức chế Dengue
- Tiến hành mô phỏng tương tác protein và phối tử Kết quả được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2.Kết quả mô phỏng tương tác phân tử của 52 hợp chất hóa học
Năng lượng liên kết tự do (kcal/mol)
Năng lượng liên kết tự do (kcal/mol)
6,7-Epoxypregn-4-en- 9,11,18-triol-3,20-dion, 11,18-diacetat
Năng lượng liên kết tự do (kcal/mol)
Năng lượng liên kết tự do (kcal/mol)
Năng lượng liên kết tự do (kcal/mol)
Nhận xét: Từ kết quả trên, có 10 hợp chất có tiềm năng kháng virus Dengue (với giá trị năng lượng liên kết với cả 2 đích NS2B/NS3 và NS5 RdRP 0,99 Vì vậy có thể chọn khoảng phân tích này để tiến hành định lượng geraniin trong cao DHCĐ
Phân tích trong cùng điều kiện và so sánh sự đáp ứng của 4 mẫu: mẫu dung môi ethanol 70%, mẫu dung dịch chuẩn geraniin, mẫu dung dịch thử và mẫu dung dịch thử thêm chuẩn Thu được 4 sắc kí đồ như hình bên dưới:
Hình 3.4.Sắc kí đồ của mẫu trắng
Hình 3.5.Sắc kí đồ mẫu chuẩn
52 Hình 3.6.Sắc kí đồ mẫu thử
Hình 3.7.Sắc kí đồ mẫu thử thêm chuẩn
Nhận xét: Mẫu dung môi không có tín hiệu của chất phân tích tại thời gian lưu trùng với thời gian lưu của geraniin trong mẫu chuẩn
3.2.1.3 Tính thích hợp hệ thống
Tiêm 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc kí ở điều kiện đã chọn Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5.Kết quả thẩm định tính thích hợp hệ thống
Nhận xét: Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu và diện tích pic của các mẫu đều thấp hơn 2,0% Điều đó cho thấy các điều kiện sắc kí đã chọn và hệ thống sắc kí HPLC đã sử dụng là ổn định, phù hợp để định lượng geraniin trong cao DHCĐ
Tiêm lần lượt 6 mẫu thử vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc kí ở điều kiện đã chọn Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6.Kết quả thẩm định độ lặp lại
(μAU.s) Thời gian lưu (phút)
(μAU.s) Thời gian lưu (phút)
Nhận xét: Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu và diện tích pic của các mẫu đều thấp hơn 3,7%
Tiến hành xác định độ đúng bằng phương pháp mẫu thử thêm chuẩn Chuẩn bị 9 mẫu thử thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với mức nồng độ định lượng Kết quả được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng
STT Nồng độ Diện tích pic (mAU.)
Chất chuẩn thêm vào (mg)
Chất chuẩn thu hồi (mg) Độ phục hồi (%)
Nhận xét: Phần trăm tìm lại của geraniin từ 95,400% đến 100,040% Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng
3.2.1.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOD)
Tiến hành hành sắc kí các dung dịch chuẩn pha loãng để tìm LOD và LOQ Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.8
Bảng 3.8.Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
LOD (mg/ml) LOQ (mg/ml)
Nhận xét: Dung dịch có nồng độ 0,01 mg/ml cho đáp ứng pic gấp 3 lần so với độ nhiễu đường nền, dung dịch có nồng độ 0,025 mg/ml cho đáp ứng pic gấp 10 lần so với độ nhiễu đường nền
3.2.2 Định lượng geraniin trong dược liệu
- Tiến hành chiết nhiều lần tới khi lượng geraniin thu được là không đáng kể Hàm lượng geraniin (%) trong dược liệu được xác định bằng tổng hàm lượng geraniin thu được ở các lần chiết
- Tiến hành chiết mẫu dược liệu 4 lần liên tiếp, thu được kết quả ở bảng:
Bảng 3.9 Phần trăm geraniin trong dược liệu
Tên mẫu Diện tích pic
Nhận xét: Hàm lượng geraniin trong dược liệu được xác định là 3,68% Kết quả này phục vụ quá trình tính hiệu suất chiết geraniin của các thí nghiệm tiếp theo trong đề tài
3.2.3 Khảo sát các yếu tố đơn biến
3.2.3.1 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất
- Chiết dược liệu với nhiệt độ chiết khác nhau ( o C): 50 o , 60 o , 70 o , 80 o , 90 o Các thông số khác được cố định cụ thể như sau: thời gian chiết xuất: 1,5 giờ; tỉ lệ dược liệu/dung môi: 1/10; nồng độ ethanol: 70% Kết quả được trình bày trong biểu đồ 3.8
Hình 3.8.Biểu đồ thể hiện hiệu suất chiết geraniin theo nhiệt độ
Khi tăng nhiệt độ chiết xuất từ 50 ( o C) đến 80 ( o C), hiệu suất chiết garaniin tăng dần từ 30,16% đến 47,83% Tuy nhiên khi tăng nhiệt độ từ 80 ( o C) đến 90 ( o C) Hiệu suất chiết giảm từ 47,83% xuống còn 45,11%
Nhận thấy, khi chiết ở nhiệt độ 80 ( o C), hiệu suất chiết geraniin đạt giá trị cao nhất (47,83%) Do đó, khoảng giá trị được lựa chọn để đưa vào mô hình của phương pháp bề mặt đáp ứng là từ 70 ( o C) đến 90 ( o C)
3.2.3.2 Khảo sát thời gian chiết xuất
- Chiết dược liệu với 5 khoảng thời gian chiết khác nhau (giờ): 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5;
3 Các thông số khác được cố định cụ thể như sau: tỉ lệ dược liệu/dung môi: 1/10; nhiệt độ chiết xuất: 70 o C; nồng độ ethanol: 70% Kết quả được trình bày trong biểu đồ 3.9
Hình 3.9.Biểu đồ thể hiện hiệu suất chiết geraniin theo thời gian
Khi thời gian chiết tăng từ 0,5 giờ lên đến 1 giờ thì hiệu suất chiết geraniin không có sự thay đổi (hiệu suất chiết 47,82%) Khi thời gian chiết tăng từ 1 giờ đến 2 giờ, hiệu suất chiết geraniin tăng dần từ 47,82% đến 50,54% Tuy nhiên, khi tăng thời gian chiết từ 2 giờ đến 3 giờ, hiệu suất chiết geraniin lại giảm dần từ 50,54% đến 36,41%
Nhận thấy, khi thời gian chiết là 2 giờ, hiệu suất chiết geraniin đạt giá trị cao nhất (50,54%) Do vậy, khoảng giá trị được lựa chọn để đưa vào mô hình của phương pháp bề mặt đáp ứng là từ 1 giờ đến 2,5 giờ
3.2.3.3 Khảo sát tỉ lệ dung môi/dược liệu
- Chiết dược liệu với tỉ lệ dược liệu/dung môi khác nhau: 1/5, 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, 1/30 Các thông số khác được cố định cụ thể như sau: nhiệt độ: 70 o C; thời gian: 1,5h; nồng độ ethanol 70% Kết quả được trình bày trong biểu đồ 3.10
Hình 3.10.Biểu đồ thể hiện hiệu suất chiết geraniin theo tỉ lệ DL/DM
Đánh giá in vitro tác dụng ức chế Dengue cao DHCĐ tối ưu hóa
Cao DHCĐ chiết bằng ethanol 96% và cao chiết trong điều kiện tối ưu hoá đã được định lượng để xác định hàm lượng geraniin bằng phương pháp xây dựng và thẩm định ở mục 3.2 Các mẫu cao này được đánh giá khả năng ức chế virus
Dengue bằng phương pháp trung hòa đám hoại tử Kết quả được trình bày trong bảng 3.14
Bảng 3.14 Kết quả thử hoạt tính của hai loại cao DHCĐ trên các chủng virus Dengue 1 – 4
Nhận xét: Cả hai mẫu cao DHCĐ đều có tác dụng ức chế tốt trên cả 4 chủng của virus Dengue Đặc biệt cao DHCĐ giàu geraniin thể hiện khả năng ức chế tốt hơn so với cao DHCĐ / EtOH 96% trên cả 4 typ DENV với các giá trị PNRT50 vượt trội hơn
Hình 3.13 Phiến đồ nuôi cấy in vitro mẫu thử với virus DENV-1
Hình 3.14 Phiến đồ nuôi cấy in vitro mẫu thử với virus DENV-2
Hình 3.15 Phiến đồ nuôi cấy in vitro mẫu thử với virus DENV-3
Hình 3.16 Phiến đồ nuôi cấy in vitro mẫu thử với virus DENV-4
Chú thích: Từ trái sang phải: Virus Dengue typ 1-4; Mẫu chứng âm; Dãy nồng độ 0,00125 mg/ml, 0,0025 mg/ml, 0,0049 mg/ml, 0,0098 mg/ml, 0,0195 mg/ml, 0,039 mg/ml Lặp lại 2 lần theo cùng thứ tự.
BÀN LUẬN
Về kết quả lựa chọn marker
Đề tài đã sàng lọc từ dữ liệu thành phần hóa học của Diệp hạ châu đắng được 52 hợp chất hóa học đạt yêu cầu về SKD đường uống và quy tắc Lipinski hoặc đã có dữ liệu chứng minh tác dụng kháng Dengue trước đó
Các mục tiêu phân tử tiềm năng trong nghiên cứu phát triển thuốc kháng virus Dengue là những mục tiêu phân tử đóng vai trò quan trọng trong vòng đời và quá trình nhân lên của virus Ức chế hoạt động của enzym virus đã được chứng minh là phương pháp thành công [45] Do đó, 2 mục tiêu phân tử tiềm năng nhất được chọn là NS2B/NS3 và NS5 RdRp Đây là 2 đích phân tử phổ biến có thể gặp ở cả 4 type Dengue
Quá trình mô phỏng tương tác cho kết quả là giá trị năng lượng liên kết tự do giữa 2 protein virus Dengue (NS2B/NS3 và NS5 RdRp) và 52 hợp chất hóa học đã được sàng lọc từ cây Diệp hạ châu đắng Với điều kiện giá trị tuyệt đối năng lượng liên kết với 2 đích protein của virus lớn hơn 7, kết quả Docking thu được 10 hợp chất hóa học thỏa mãn điều kiện này Năng lượng liên kết với đích protein virus có giá trị âm càng nhỏ thì tiềm năng tác dụng ức chế càng lớn Geraniin là một hợp chất có năng lượng liên kết với 2 đích NS2B/NS3 và NS5 RdRp tương ứng là -11,93 và -11,08, thuộc nhóm 3 chất có năng lượng liên kết có giá trị âm nhỏ nhất
Các nghiên cứu trên thế giới mới chỉ tiến hành đối với duy nhất serotype 2 của virus Dengue Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Shamala Devi Sekaran và cộng sự đã nghiên cứu cao chiết nước và methanol chứa các chất polyphenol từ 4 loài Phyllanthus ở Malaysia có tác dụng ức chế virus Dengue type 2, trong đó geraniin có hàm lượng lớn nhất trong cả hai loại cao chiết [3] Năm 2017, theo nghiên cứu của Sharifah Syed Hassan và cộng sự, trong nghiên cứu in silico và in vitro, geraniin từ loài Nephelium lapaceum có khả năng gắn kết với protein vỏ E
70 glycoprotein của virus Dengue type 2 và ức chế giai đoạn sớm của quá trình nhân lên của serotype này [48] Tiếp đó, năm 2019, nhóm nghiên cứu này cũng đã đánh giá hiệu quả bảo vệ của geraniin trên chuột nhắt nhiễm DENV-serotype 2 Kết quả cho thấy khi cho chuột uống geraniin, hàm lượng virus giảm đáng kể sau 72h nhiễm virus [49] Mặc dù các đích protein trong nghiên cứu in silico của chúng tôi không giống với nghiên cứu của Sharifah Syed Hassan và cộng sự, nhưng kết quả docking trong nghiên cứu trên 2 đích NS2B/NS3 và NS5 RdRp cũng cho thấy sự phù hợp về khả năng ức chế serotype 2 và triển vọng tiềm năng ức chế của geraniin trên các seroptype khác của virrus Dengue Kết quả docking trên 2 đích NS2B/NS3 và NS5 RdRp là căn cứ để lựa chọn đánh giá tác dụng của cao chiết giàu geraniin trên đồng thời cả 4 serotype Dengue
Do đó, geraniin đã được lựa chọn làm marker đầu tiên để nghiên cứu tối ưu hoá chiết xuất cao giàu hoạt tính.
Về xây dựng quy trình chiết xuất
4.2.1 Về thẩm định phương pháp định lượng geraniin
Phương pháp định lượng mà nghiên cứu đã xây dựng được thẩm định theo tiêu chí của AOAC và đã đáp ứng các tiêu chí như: khoảng tuyến tính và đường chuẩn, tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, độ thu hồi, độ lặp lại, xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Đảm bảo phù hợp để định lượng geraniin cho các mẫu cao chiết xuất trong các điều kiện khác nhau Phương pháp đã xây dựng có tính ổn định để áp dụng vào việc định lượng geraniin trong các mẫu cao Diệp hạ châu đắng khác nhau
4.2.2 Về kết quả thực nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao Diệp hạ châu đắng
4.2.2.1 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất
Khảo sát thấy, nhiệt độ để hỗn hợp dung môi ethanol-nước có thể hồi lưu được là từ 50 o C Tiến hành khảo sát thăm dò cho thấy, khi nhiệt độ tăng lên đến
90 o C thì hiệu suất chiết geraniin bắt đầu giảm rõ rệt Do đó khoảng nhiệt độ từ
50 o C đến 90 o C được lựa chọn để khảo sát các đơn biến
4.2.2.2 Khảo sát thời gian chiết xuất
Qua khảo sát ban đầu, cho thấy thời gian chiết xuất 0,5 giờ, 1 giờ cho thấy hiệu suất chiết geraniin không có sự khác biệt lớn Ngoài ra khi tăng thời gian chiết lên 3 giờ thì hiệu suất chiết geraniin lại giảm rõ rệt Do đó khoảng thời gian chiết từ 0,5 giờ đến 3 giờ được chọn để khảo sát đơn biến
4.2.2.3 Khảo sát tỉ lệ DL/DM
Tỉ lệ DL/DM (g/ml) = 1/5 là mức dung môi tối thiểu để đủ ngập toàn bộ dược liệu trong quá trình chiết Quá trình khảo sát cho thấy, ở mức DL/DM (mg/ml) = 1/30 thì hiệu suất chiết geraiin bắt đầu giảm rõ rệt Ngoài ra, khi thể tích dung môi dùng để chiết xuất càng cao thì thời gian cô cao dài, gây tăng chi phí và khó khăn khi áp dụng với quy mô lớn trong công nghiệp
Do đó, khoảng tỉ lệ DL/DM (g/ml) được lựa chọn để nghiên cứu là từ 1/5 đến 1/30
4.2.2.4 Khảo sát nồng độ dung môi
Qua khảo sát ban đầu, khi sử dụng dung môi nước hoặc ethanol thấp độ (ethanol dưới 30%) hiệu suất chiết geraniin rất thấp, có thể geraniin ít tan trong nước và ethanol thấp độ
Ngoài ra, khi chiết ở ethanol 96% thì hầu như không có sự xuất hiện của geraniin Điều này có thể dự đoán mức độ hòa tan của geraniin phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi Khi trộn lẫn ethanol với nước sẽ tạo ra hỗn hợp ethanol- nước có độ phân cực khác nhau Có thể đối với dung môi ethanol 96%, do tỉ lệ ethanol/nước rất cao nên độ phân cực của dung môi ethanol 96% thấp hơn rất nhiều so với ethanol 90% trở xuống Do đó giảm độ hòa tan của geraniin vào dung môi
Vì vậy, để hiệu suất chiết geraniin đạt khoảng tối ưu Khoảng nồng độ ethanol được lựa chọn để nghiên cứu là từ 30% - 90%
4.2.3 Về xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hiệu suất chiết geraniin
Sự tác động tương tác lẫn nhau giữa các biến ảnh hưởng đến hiệu suất chiết geraniin được mô tả bởi các biểu đồ 3D Hai trục ox và oy biểu thị 2 trong 4 yếu tố ảnh hưởng, trục oz biểu thị hiệu suất chiết geraniin Các đường cong bề mặt 3 chiều của mỗi cặp yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu được minh họa bằng cách giữ các yếu tố còn lại ở mức bằng 0 Dựa vào các biểu đồ 3D này có thể xác định được giá trị tối ưu của từng cặp yếu tố ảnh hưởng đến đến giá trị của hiệu xuất chiết geraniin
Biểu đồ 3D-1 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và nhiệt độ chiết xuất đến giá trị hiệu suất chiết geraniin Có thể thấy rằng hai yếu tố này đều có ảnh hưởng lớn Khi nhiệt độ chiết xuất càng tiến dần về mức giá trị -1 thì hiệu suất chiết đạt giá trị càng lớn, tương tự khi nhiệt độ chiết xuất càng tiến về giá trị 1 thì hiệu suất chiết càng tiến về giá trị cực đại
Biểu đồ 3D-2 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của nhiệt độ chiết xuất và tỉ lệ DL/DM đến hiệu suất chiết geraniin Từ biểu đồ cho thấy, khi tỉ lệ DL/DM càng thấp thì hiệu suất chiết geraniin càng tiến về giá trị cực tiểu Điều này cho thấy lượng dung môi sử dụng để chiết xuất ảnh hưởng đến mức độ hòa tan của geraniin Ngoài ra, nhiệt độ chiết xuất cũng có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết geraniin, bằng chứng cho thấy khi nhiệt độ chiết xuất càng cao thì hiệu suất chiết geraniin càng thấp, điều này có thể giải thích là do ở nhiệt độ cao geraniin có thể không bền và biến đổi thành chất khác
Biểu đồ 3D-3 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ dung môi chiết - ethanol đến hiệu suất chiết geraniin Từ biểu đồ cho thấy, biến nồng độ dung môi chiết có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hiệu xuất chiết Điều này phù hợp với sự giải thích về mối liên hệ giữa khả năng chiết geraniin và độ phân cực của dung môi chiết đã giải thích ở phần kết quả khảo sát đơn biến
Biều đồ 3D-4 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của tỉ lệ DL/DM và thời gian chiết đến hiệu suất chiết geraniin Khi tỉ lệ DL/DM càng lớn, đồng thời thời gian
75 chiết càng nhỏ thì hiệu suất chiết geraniin càng tiến về cực đại Điều này phù hợp với các giải thích ở trên
Biều đồ 3D-5 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và nồng độ dung môi chiết xuất đến hiệu suất chiết geraniin Từ biểu đồ cho thấy, khi thời gian chiết xuất càng ngắn và nồng độ ethanol càng tiến về giá trị cực đại thì hiệu suất chiết geraniin càng tiến về giá trị cực đại
Biểu đồ 3D-6 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của tỉ lệ DL/DM và nồng độ dung môi chiết xuất Từ biểu đồ 3D cho thấy độ cong của đồ thị là không nhiều, điều đó cho thấy sự tương tác giữa 2 yếu tố này không có sự ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết geraniin Ngoài ra, tỉ lệ DL/DM càng lớn thì giá trị hiệu suất chiết càng tiến về giá trị cực đại, điều này phù hợp với giải thích trước đó
4.2.4 Về kết quả chọn phương án chiết xuất tối ưu
Kết quả phân tích của phần mềm Design Expert 13 đã đưa ra những kết quả tối ưu hiệu suất chiết geraniin với các yếu tố thí nghiệm nằm trong phạm vi khảo sát
Xét về khía cạnh kinh tế, khi áp dụng vào quy mô lớn Một trong những mục tiêu quan trọng nhất là tiết kiệm dung môi và thời gian nhằm nâng cao hiệu quả khai thác và giảm thiểu tiêu hao năng lượng dùng để thu hồi Giải pháp tối ưu được lựa chọn với kết quả sau:
Về kết quả thử nghiệm tác dụng sinh học
Mẫu cao DHCĐ tối ưu thể hiện khả năng ức chế virus Dengue trên cả 4 type vượt trội hơn so với cao DHCĐ / EtOH 96% Đặc biệt, nếu so với khả năng ức chế virus Dengue của cao phân đoạn n-hexan trên cùng mô hình [46], giá trị PNRT50 cũng vượt trội hơn hẳn Giá trị PNRT50 ứng với DENV 1-4 của cao phân đoạn n-hexan lá Đu đủ lần lượt là: 15,6 μg/ml; 15,6 μg/ml; 15,6 μg/ml; 31,3 μg/ml
Trong khi đó giá trị PNRT50 ứng với DENV 1-4 của cao DHCĐ giàu geraniin lần lượt là: 9,8 μg/ml; 9,8 μg/ml; 4,9 μg/ml; 9,8 μg/ml
78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Sau thời gian thực hiện, đề tài đã được hoàn thành được các mục tiêu đề ra với các kết quả cụ thể như sau:
1 Từ hơn 100 hợp chất hóa học trong cây Diệp hạ châu đắng, đã sàng lọc ra 52 hợp chất đảm bảo SKD đường uống và quy tắc Lipinski hoặc đã có dữ liệu chứng minh tác dụng kháng Dengue trước đó Từ 52 hợp chất này qua sàng lọc in sillico với 2 đích NS2/NS3 và NS5 RdRp của virus Dengue đã tìm ra được 10 hợp chất có tiềm năng kháng virus Dengue với giá trị năng lượng liên kết đều nhỏ hơn -
7,00 kcal/mol Geraniin là hợp chất có giá trị năng lượng liên kết tương ứng trên
2 đích là -11,93 kcal/mol và -11,08 kcal/mol được chọn làm marker để tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất
2 Đã khảo sát các yếu tố đơn biến: nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỉ lệ DL/DM và nồng độ dung môi chiết ảnh hưởng đến quá trình chiết geraniin từ cây Diệp hạ châu đắng Bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, đã lựa chọn được các điều kiện chiết xuất tối ưu cao DHCĐ giàu geraniin với các thông số như sau:
Hàm lượng geraniin trong cao tối ưu là 15,71%
3 Cao DHCĐ giàu geraniin thể hiện khả năng ức chế trên cả 4 typ (DENV 1; DENV 2; DENV 3; DENV 4) với các giá trị PNRT50 lần lượt là: 9,8 μg/ml; 9,8 μg/ml; 4,9 μg/ml; 9,8 μg/ml
- Chiết xuất cao theo công thức chiết tối ưu với quy mô lớn Tiến hành xây dựng các tiêu chuẩn của cao Diệp hạ châu đắng giàu hoạt chất geraniin.
