Vì vậy đề tài “Nghiên cứu điều chế và khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao Diệp hạ châu đắng giàu geraniin” được thực hiện với các mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng gera
TỔNG QUAN
Tổng quan về Diệp hạ châu đắng
Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum et Thonn., Euphorbiaceae
Tên gọi khác: Chó đẻ răng cưa, chó đẻ thân xanh, cam kiềm, kiền đắng, cỏ trân châu, rút đất, trân châu thảo, lão nha châu, diệp hòa thái [3]
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [48], Diệp hạ châu đắng có vị trí phân loại như sau:
Giới (Regnum) Thực vật (Plantae)
Ngành (Division) Magnoliophyta (Ngọc lan)
Lớp (Class) Magnoliopsida (Ngọc lan)
Bộ (Ordo) Euphorbiales (Thầu dầu)
Họ (Familia) Euphorbiaceae (Thầu dầu)
Loài (Species) Phyllathus amarus Schum et Thonn
Phyllanthus amarus thuộc họ Euphorbiaceae Cây được mô tả lần đầu tiên năm
1737 bởi Linnaeus [8] Chi Phyllanthus có khoảng 1000 loài, có mặt ở các lục địa nhiệt đới và cận nhiệt đới như Châu Á, Châu Mỹ, Châu Phi và châu Úc [45],[17] Ở Châu Á, Diệp hạ châu đắng chủ yếu phân bố ở các nước Ấn Độ, Thái Lan, Lào, Campuchia, Philippin, Việt Nam, Malaysia và Indonesia, phía Nam Trung Quốc và cả ở vùng đảo Salawesi Tại Việt Nam, cây Diệp hạ châu đắng phân bố rải rác khắp nơi từ các tỉnh đồng bằng, ven biển, các đảo lớn đến các tỉnh trung du và miền núi có độ cao dưới 800m Diệp hạ châu đắng là cây ưa sáng, có thể hơi chịu bóng khi còn nhỏ hoặc mọc xen lẫn với các loài cây cỏ khác Cây thường mọc trong vườn, ruộng trồng hoa màu, ven đường đi hay trên nương rẫy, …[4]
Cây thảo cao 40-80 cm, thân tròn, bóng, màu xanh, phân nhánh đều, nhiều
Lá mọc so le xếp thành hai dãy sít nhau trông như lá kép hình lông chim Phiến lá hình bầu dục, dài từ 5 mm đến 10 mm, rộng 3 mm đến 6 mm, màu xanh thẫm ở mặt trên, màu xanh nhạt ở mặt dưới
Hoa đực và hoa cái mọc thành cụm Hoa đực có cuống ngắn 1 mm đến 2 mm, đài
5, có tuyến mật, nhị 3, chỉ nhị dính nhau Hoa cái có cuống dài hơn hoa đực
Quả nang, nhẵn, hình cầu, đường kính 1,8 mm đến 2 mm, có đài tồn tại Quả chứa
6 hạt hình tam giác, đường kính 1 mm, hạt có sọc dọc ở lưng [2]
1.1.4 Bộ phận dùng, gieo trồng, thu hái
Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Phyllanthi amari
Gieo trồng: Gieo hạt ở vườn ươm: tháng 1-2, trồng cây con: tháng 2-3, thu hoạch: tháng 4-5 (sau khi trồng 45-50 ngày) Nhìn chung, thời vụ trồng Diệp hạ châu đắng kéo dài cả mùa khô, tận dụng trời nắng để phơi
Thu hái: Sau khi trồng khoảng 45-50 ngày, cây Diệp hạ châu đắng cao 60-70 cm là thu hoạch Năng suất đạt 10-12 tấn tươi/ha/vụ Một năm có thể trồng 2 vụ Diệp hạ châu đắng là cây thuốc dễ trồng, cây không kén đất [3]
Phyllanthus amarus có chứa nhiều thành phần hoá học quan trọng như flavonoid, tanin, alcaloid, lignan, sterol, terpen, tinh dầu,… [8], [17], [26], [45] được tổng hợp như bảng sau:
Bảng 1 1 Thành phần hoá học trong Diệp hạ châu đắng
STT Nhóm chất Hoạt chất
1 Flavonoid rutin; quercetin-3-0-glucoside; quercetin; kaempferol; astragalin; quercitrin; gallic acid; (- )-epicatechin; (+)- gallocatechin; (-)-epigallocatechin; (-)-epicatechin 3-Ogallate and (-)-epigallocatechin 3-O-gallate
2 Tanin geraniin; amariin; repandusinic acid A; corilagin; isocorilagin, phyllanthusiin A, B, C, D; amarulone; furosin; melatonin; 1, 6- digalloylglucopyranose; 4-O galloylquinic acid
3 Alcaloid norsecurinine; securinine; epibubbialine; isobubbialine; dihydrosecurinine; tetrahydrosecurinine; securinol; 4-methoxy- nor-securinine 4-methoxy; dihydrosecurinine; 4- methoxytetrahydrosecurinine; 4 hydrosecurinine
4 Lignan phyllanthin; hypophyllanthin; niranthin; phyltetralin; nirtetralin; hinokinin; 5-dimethoxy-niranthin; 4-(3,4-diethoxy-phenyl)-1-(7- methoxybenzo[1,3]dioxol-5-yl)-2,3-bismethoxymethyl-butan-1- ol; nirphyllin; phyllnirurin; cubebin dimethyl ether; urinatetralin; isonirtetralin; lintetralin, isolintetralin; demethylenedioxy-niranthin
7 Triterpen phenazine and dẫn xuất phenazine (2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E- farnesyl farnesol); phyllanthenol; phyllanthenone; phyllantheol; oleanolic acid; ursolic acid
Công thức cấu tạo của một số thành phần hoá học chính trong DHCĐ: [26], [45]
Hình 1 1 Khung cấu trúc của flavonoid, alcaloid, sterol
Hình 1 2 Công thức hoá học một số hợp chất tanin
Hình 1 3 Công thức hoá học một số hợp chất lignan
Hình 1 4 Công thức hoá học của một số tinh dầu
Hình 1 5 Công thức hoá học của một số hợp chất terpenoid
- Kháng virus Sốt xuất huyết (Dengue):
Năm 2013, Sau Har Lee và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu dịch chiết methanol: nước từ bốn loài Phyllanthus (Phyllanthus amarus, Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria và Phyllanthus watsonii) và các hợp chất polyphenolic của chúng được xác định thông qua phân tích HPLC và LC-MS/MS; sau đó, sàng lọc hoạt tính
7 kháng vi-rút trong ống nghiệm của dịch chiết xuất chống lại DENV2 Kết quả, đã xác định được một số hợp chất từ dịch chiết dược liệu bao gồm acid gallic, geraniin, syringin và corilagin Bốn loài Phyllanthus cho thấy hoạt động ức chế mạnh đối với DENV2 với việc giảm hơn 90% vi rút Tỷ lệ phần trăm của geraniin trong chiết xuất là cao nhất, do đó được dự đoán là sẽ phát huy hầu hết tác dụng chống virus [38]
Năm 2015, Ruchi Sood và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sàng lọc các dịch chiết thực vật cho hoạt động ức chế virus Dengue Kết quả cho thấy, dịch chiết methanol của toàn cây Diệp hạ châu đắng có tác dụng ức chế cả 4 type huyết thanh của virus Dengue, ngay cả khi virus đã xâm nhập vào tế bào [43]
- Kháng các loại virus khác:
Năm 2003, Ray Ling Huang và các cộng sự tiến hành nghiên cứu 25 hợp chất phân lập từ P amarus, cho thấy niranthin, nirtetralin, hinokinin và geraniin ở nồng độ không gây độc tế bào (50 μm) ức chế hiệu quả cả HBsAg và HbeAg Trong đó, niranthin cho thấy hoạt tính kháng HBsAg tốt nhất, và hinokinin cho hoạt tính kháng HbeAg mạnh nhất [16]
Dịch chiết nước của Phyllanthus amarus cho thấy hoạt tính kháng lại vi-rút gây hội chứng đốm trắng ở tôm ở nồng độ 150 mg/kg trọng lượng cơ thể động vật trong 30 ngày [9]
Dịch chiết rễ cây cho thấy sự ức chế đáng kể enzyme protease HCV-NS3; trong khi chiết xuất từ lá cho thấy sự ức chế đáng kể NS5B trong các thử nghiệm in vitro chống lại HCV [36]
Năm 2013, Tan W và cộng sự tiến hành nghiên cứu dịch chiết của Phyllanthus amarus, cho thấy dịch chiết dược liệu có hoạt tính kháng virus Herpes [49]
1.1.6.2 Bảo vệ gan và chống viêm gan B
Theo tác giả của “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, cao Diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan trên chuột cống trắng bị gây nhiễm độc gan bởi carbon- tetrachloride Trong mô hình gây xơ gan thực nghiệm trên chuột cống trắng, Diệp hạ châu đắng có tác dụng làm giảm hàm lượng colagen trong máu và làm giảm mức độ xơ gan ở động vật điều trị so với đối chứng [4]
Năm 1985, Syamasundara và các cộng sự của ông cho thấy tác dụng chống độc gan của P amarus trên tế bào gan chuột nuôi cấy sơ cấp Nhóm nghiên cứu đã chứng minh các đặc tính bảo vệ gan của các hợp chất lignan như: phyllanthin, hypophyllanthin và triacontanol đối với độc tính tế bào do carbon-tetrachloride và galactosamine gây ra [47]
8 Bằng cách đánh giá tổn thương gan do aflatoxin B1 gây ra ở chuột, nhóm nghiên cứu đã chứng minh được tác dụng bảo vệ gan của chiết xuất ethanol từ P amarus [29]
Các nghiên cứu in vitro và in vivo cho thấy tác dụng bảo vệ của chiết xuất nước từ P amarus đối với tổn thương gan chuột do ethanol gây ra [33]
Năm 2011, Surya Narayanan và cộng sự chứng minh được P amarus là một tác nhân chống xơ hóa hiệu quả, bằng cách phân tích tác dụng của dược liệu đối với hoạt động của metallicoproteinase (MMP), các chất ức chế mô của metallicoproteinase (TIMPs) trong ethanol và tác dụng trên chuột Wistar bạch tạng đực bị gây xơ gan do acid béo không no bị oxy hóa nhiệt (PUFA) [46]
Chiết xuất Geraniin từ Diệp hạ châu đắng
1.2.1.1 Cấu trúc và tính chất
Hình 1 6 Công thức cấu tạo của geraniin
Geraniin là một tanin thuỷ phân, được tạo thành từ một HHDP, một nhóm dehydrohexahydrodiphenoyl (DHHDP) gắn với gốc galloyl và một phân tử glucose
Công thức hóa học của geraniin là C41H28O27 với khối lượng phân tử 952,64 g/mol Khi kết tinh, geraniin tồn tại dưới dạng hydrat có công thức hóa học là C41H28O277H2O (Okuda et al 1982; Luger et al.1998)
Geraniin hòa tan trong nước và dễ dàng bị thủy phân khi có nước nóng, acid yếu và base yếu [15]
Geraniin tinh khiết cho thấy không ổn định khi đun nóng Tỷ lệ mất thoái hóa là 73,97% sau khi xử lý ở 100 o C trong 2 giờ Trong các sản phẩm thoái hóa của geraniin, acid gallic, corilagin, acid hexahydroxybiphthalic, axit brevifolin carboxylic, galloylbis-HHDP-glucose, acid ellagic và brevifolin được phát hiện dưới dạng phenol có khối lượng phân tử thấp hơn [53]
1.2.1.2 Tác dụng ức chế virus Dengue của Geraniin:
Dịch chiết hỗn hợp (dung dịch nước và metanol) từ toàn bộ mẫu cây (trừ rễ) của bốn loài Phyllanthus gộp lại khác nhau (Phyllanthus amarus, Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria và Phyllanthus watsonii) có nhiều hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau bao gồm acid gallic, geraniin, syringing và corilage và những thành phần này được cho là hoạt động phối hợp với nhau để chống DENV Tuy nhiên, tỷ lệ phần trăm của geraniin trong chiết xuất là cao nhất và do đó được dự đoán là sẽ phát huy hầu hết tác dụng chống vi-rút Bốn loài Phyllanthus cho thấy hoạt động ức chế mạnh nhất đối với DENV2 với khả năng giảm hơn 90% vi rút [38]
Phương pháp RT-PCR được sử dụng đã xác định sự giảm tổng hợp RNA của virus ở các tế bào Vero bị nhiễm bệnh khi được điều trị bằng geraniin Geraniin dường như mang lại tác dụng bảo vệ gan chuột BALB/c bị nhiễm bệnh khi được tiêm vào lúc
24 giờ trước và 24 giờ sau khi bị nhiễm bệnh Tuy nhiên, khi dùng thuốc vào thời điểm
72 giờ sau khi nhiễm bệnh, tổn thương gan nghiêm trọng dưới dạng hoại tử và xuất huyết chiếm ưu thế [5]
Geraniin thể hiện sự ức chế hình thành mảng bám DENV-2, với IC50 là 1,75 μM Geraniin làm giảm khả năng lây nhiễm của virus và ức chế DENV-2 gắn vào tế bào nhưng ít ảnh hưởng đến sự xâm nhập của nó Geraniin được cho là có hiệu quả nhất khi được bổ sung ở giai đoạn đầu khi nhiễm DENV-2 Kết quả từ các thí nghiệm cho thấy geraniin liên kết với protein DENV E, đặc biệt là ở vùng DIII, trong khi xét nghiệm liên kết cạnh tranh ELISA xác nhận sự tương tác của geraniin với rE-DIII có ái lực cao [6]
1.2.2 Chiết xuất geraniin từ Diệp hạ châu đắng
Năm 2013, Shibnath Ghosal và các cộng sự đã tiến hành chiết xuất bột
Phyllanthus amarus bằng phương pháp ngâm và tiến hành đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố như thời gian chiết (0, 2, 4, 6 giờ), nhiệt độ chiết (60 o C và 80 o C), các dung môi chiết (nước; methanol: nước tỉ lệ 50:50 và 30:70; ethanol: nước nước tỉ lệ 50:50 và 30:70), ảnh hưởng của áp suất (5atm và 10atm) và các điều kiện sấy khô (cô cách thuỷ, đông khô, sấy phun, cô dưới áp suất giảm) đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trong cây (geraniin, corilagin, nirurin và các tannoid thủy phân có trọng lượng phân tử thấp khác) Nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố khảo sát, kết quả cho thấy, khi chiết xuất ở nhiệt độ 60 o C, dung môi methanol: nước (50:50), 4 giờ, 5 atm, sấy bằng phương pháp đông khô cho hiệu suất geraniin cao hơn so với các điều kiện còn lại [41]
Năm 2021, Matou và cộng sự tiến hành chiết cả hai mẫu dược liệu P amarus khô và tươi theo hai phương pháp Phương pháp thứ nhất, tiến hành phương pháp ngâm nóng hai mẫu dược liệu với dung môi là nước, đun sôi trong 15 phút, với tỉ lệ DL/DM
14 là 30g/l và sau đó lọc lấy dịch chiết Phương pháp thứ hai, tiến hành phương pháp ngâm nóng hai mẫu dược liệu, với dung môi nước, đun sôi trong 8 phút với tỉ lệ DL/DM là 30g/l sau đó lọc bằng giấy Whatman Tất cả các mẫu dịch lọc sau đó đem cô quay chân không ở 40 o C để thu dịch chiết thô Geraniin được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cực cao-khối phổ có độ phân giải cao (UHPLC-HRMS) [27]
Các phương pháp định lượng Geraniin
Geraniin thường được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được tổng hợp như bảng sau:
Bảng 1 2 Các phương pháp định lượng geraniin
Pha tĩnh Cột pha đảo HiQ Sil C18 V
Cột Merck Chromolith Performan ce RP-18
220 nm 280 nm 254 nm 270nm 270nm
1 ml/phút 1 ml/phút 0,5 ml/phút 1,0 ml/phút 1 ml/phút
12,54 phút 8,75 phút 10,99 phút 17.569 phút 17,27 phút
Tiêu chuẩn Dược điển đối với cao Diệp hạ châu đắng
1.4.1 Tiêu chuẩn Dược điển đối với cao dược liệu [2]
Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp
Cao thuốc được chia làm 3 loại:
- Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng, trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chi dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc
- Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20 %
- Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5 %
1.4.1.2 Yêu cầu chất lượng Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và các yêu cầu chung sau đây: Độ tan: Cao lòng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều chế cao Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ
Mất khối lượng do làm khô:
Hàm lượng cồn: Đạt từ 90% đến 110% lượng ethanol ghi trên nhãn (áp dụng cho cao lỏng và cao đặc)
Kim loại nặng: Không được quá 20 phần triệu nếu không có chi dẫn khác
Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn – nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 10.14
Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 2.17 Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 13.6
1.4.2 Cao Diệp hạ châu đắng theo tiêu chuẩn dược điển
Theo như chuyên luận của Dược điển Việt nam V về cao Diệp hạ châu đắng [2], chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Cao thuốc” (Phụ lục 1.1) và các yêu cầu về:
- Mô tả: Thể chất mềm, dẻo, đồng nhất Màu nâu sẫm đến đen Mùi hăng đặc biệt
Định tính bằng các phản ứng hoá học: dương tính với các phản ứng Cyanydin, phản ứng với thuốc thử sắt (III) clorid 9 %, gelatin 1 %
Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp thì sắc ký đồ của cao DHCĐ phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rf của dược liệu chuẩn và phyllanthin chuẩn
- Mất khối lượng do làm khô: Không được quá 20,0% (PL 9.6, 1g, 85°C, 5 h)
- Tro toàn phần: Không được quá 10,0 % (PL 9.8)
- Tro không tan trong acid hydrocloric: Không được quá 0,15 % (PL 9.7)
- Cắn không tan trong nước: Không được quá 1,0 % tính theo chế phẩm khô kiệt
- pH: Dung dịch chế phẩm 1,0 % trong nước phải có pH từ 6,0 đến 7,0 (PL 6.2)
- Kim loại nặng: Không được quá 20 phần triệu (PL 9.4.8)
- Định lượng cao đặc diệp hạ châu đắng bằng phương pháp sắc ký lỏng với chuẩn đối chiếu là phyllanthin
Yêu cầu: Hàm lượng phyllanthin (C24H34O6) không được ít hơn 0,5 % tính theo chế phẩm khô kiệt
- Bảo quản: Bảo quản trong bao bì hút chân không, chống ẩm Để nơi khô, mát
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng (Herba Phyllanthii amari) được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Dược liệu Indochina, được chuyên gia giám định tên khoa học theo tiêu chuẩn mô tả đặc điểm hình thái trong chuyên luận Diệp hạ châu đắng của DĐVN
V (tập 2) và các tài liệu chuyên khảo thực vật về Phyllanthus amarus Schum et Thonn [1], [10] (Phụ lục 1)
- Các mẫu Diệp hạ châu đắng được thu hái tại Hà Nam, Bắc Ninh, Hải Dương, Thanh Hoá và được giám định tên khoa học, lưu mẫu tiêu bản tại Phòng tiêu bản – Trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục 1)
Bảng 2 1 Ký hiệu các mẫu cao
STT Nguồn gốc mẫu cao Tên mẫu cao
1 Thanh Liêm, Hà Nam Mẫu 1
2 Bình Lục, Hà Nam Mẫu 2
3 Thuận Thành, Bắc Ninh Mẫu 3
4 Gia Lộc, Hải Dương Mẫu 4
5 Hậu Lộc, Thanh Hoá Mẫu 5
- Phần thân trên mặt đất được sấy khô, bảo quản trong túi nilon kín, lưu trữ khô ráo, thoáng mát
- Chất chuẩn Geraniin (xuất xứ Trung Quốc, số lô CFN90256, độ tinh khiết 99,2%) (Phiếu COA ở phụ lục 2)
- Dung môi: acid phosphoric, acetonitril, nước cất 2 lần, ethanol 96, nước cất, methanol, toluen, n-buthanol, acid formic đạt tiêu chuẩn phân tích (Các dung môi dùng cho HPLC được mua của hãng Merck)
2.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị:
Bình nón dung tích 500 mL có nút mài
Bình khai tiển dung môi
Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: pipet, cốc có mỏ, đũa thuỷ tinh, giấy lọc, phễu lọc, quả bóp cao su,…
Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản)
Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ)
Bế siêu âm Elmasonic S100H (Đức)
Bể điều nhiệt WNE22 MEMMERT (Đức)
Cân xác định hàm ẩm AND MS - 70
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzu, Nhật Bản)
Máy thu hồi dung môi áp suất giảm IKA RV 8 (IKA, Đức)
Máy HPTLC Camag (Thuỵ Sĩ)
Máy đo Ph Eutech (Singapore)
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp định lượng Geraniin
Mẫu thử: Cân chính xác 20g dược liệu (bột thô) vào bình cầu dung tích 500 ml, chiết hồi lưu với 400 ml EtOH 30% trong 1 giờ ở nhiệt độ 70 o C Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, sau đó làm khô cao trong tủ sấy ở 45 o C trong 5h Toàn bộ mẫu cao được hoà tan bằng ethanol 70% rồi chuyển vào bình định mức 250 mL, bổ sung ethanol 70% đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm
Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 5,0 mg geraniin chuẩn vào bình định mức 5 mL, thêm khoảng 3ml EtOH 70%, siêu âm 10 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung EtOH 70% đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm Điều kiện sắc ký:
- Pha động: Acetonitril - Acid phosphoric 0,1%
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL
Pha động: Acetonitril - Acid phosphoric 0,1% triển khai theo chương trình sau: Thời gian Acetonitril (%) Acid phosphoric 0,1% (%)
Hàm lượng geraniin trong cao tính theo công thức:
X: hàm lượng geraniin chiết được từ dược liệu (%)
S: diện tích pic geraniin trong sắc ký đồ (mAU.s) b: hệ số chắn của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ geraniin và diện tích pic
V: thể tích dung dịch thử (ml) (V = 250 ml) a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ geraniin và diện tích pic m: khối lượng dược liệu (g)
A: hàm ẩm của dược liệu (%)
2.2.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng
Phương pháp định lượng được thẩm định đầy đủ về tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo AOAC [20]
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn pha trong ethanol 70% có nồng độ lần lượt là: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 (mg/ml)
20 Cân 50 mg chất đối chiếu geraniin vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 15 ml EtOH 70%, siêu âm 10 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung EtOH 70% đến vạch, lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 2,5 mg/ml
Tiếp theo, lần lượt hút chính xác 4,0; 3,0; 2,0 và 1,0 ml dung dịch đối chuẩn gốc vào bình định mức 5ml, bổ sung EtOH 70% đến vạch, lắc đều thu được dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 2,0; 1,5; 1,0 và 0,5 mg/ml Sau đó tiến hành lọc qua màng lọc 0,45 μm thu được dãy dung dịch chuẩn đem tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính
- Tiến hành sắc kí các dung dịch sau: mẫu trắng (ethanol 70%), dung dịch mẫu chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn
- Ghi lại sắc kí đồ, thời gian lưu, phổ UV của pic chất chuẩn trong sắc kí đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử, và mẫu thử thêm chuẩn
Sắc kí đồ của mẫu trắng không xuất hiện trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic trên sắc kí đồ Nếu có đáp ứng pic phải 1.0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn
Sắc kí đồ của dung dịch thử cho các pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn Trên sắc kí đồ dung dịch thử, nếu xuất hiện thêm các pic khác không phải là pic của chất chuẩn thì phải tách hoàn toàn khỏi pic và đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc kí lỏng được quy định trong Dược điển
Tính phù hợp hệ thống
- Tiêm lặp lại dung dịch chuẩn 6 lần
- Tiến hành sắc kí, ghi lại sắc kì đồ và giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng
- Yêu cầu: Giá trị RSD của thời gian lưu 2,0%, của diện tích pic 2,0%
- Tiến hành xác định độ đúng bằng phương pháp mẫu thử thêm chuẩn Thêm một lượng đã biết chất chuẩn hoặc chất đối chiếu tương ứng với 30%, 50% và 70% vào mẫu thử ở mức 50% để thu được dung dịch với các nồng độ geraniin bằng 80%, 100%, 120% so với nồng độ geraniin trong mẫu thử Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và khai triển sắc ký theo điều kiện được chọn, mỗi nồng độ tiến hành 3 lần Xác định tỷ lệ thu hồi (%) so với nồng độ ban đầu Công thức tính độ thu hồi:
R (%) =m chất đối chiếu thu hồi m chất đối chiếu thêm x 100
- Yêu cầu: Tỉ lệ phục hồi trung bình (%) của mức nồng độ nằm trong khoảng 95%
- Độ lặp lại trong ngày:
Tiến hành định lượng 6 mẫu thử Xác định độ lệch chuẩn tương đối RSD % của kết quả định lượng
- Độ chính xác trung gian:
Tiến hành: Phân tích mẫu trong 2 ngày khác nhau, mỗi ngày pha 6 mẫu thử riêng biệt Độ chính xác trung gian được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích trong 2 ngày
Yêu cầu: Giá trị RSD (%) của kết quả định lượng ≤ 2,7%
Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện (LOD): Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn và sắc kí Đến khi tín hiệu của định phân tích trên sắc kí đồ thu được có tỉ lệ S/N (tín hiệu trên nhiễu) bằng 3 Nồng độ xác định được gọi là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với từng chất định phân tích
- Giới hạn định lượng (LOQ): Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn và sắc kí Đến khi tín hiệu của định phân tích trên sắc kí đồ thu được có tỉ lệ S/N (tín hiệu trên nhiễu) bằng 10 Nồng độ xác định được gọi là giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp ứng với từng chất định phân tích
2.2.2.1 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
- Phương pháp chiết: Chiết hồi lưu
Dược liệu: mẫu dược liệu dược cung cấp bởi Công ty Cổ phần Dược liệu Indochina
Cân chính xác khoảng 20 (g) dược liệu đã được xay nhỏ (bột thô), đã xác định hàm ẩm, cho vào bình cầu có nút mài dung tích 500 mL
Thời gian chiết: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút
Tỉ lệ dung môi/ dược liệu (ml/g): 30/1, 25/1, 20/1, 15/1, 10/1, 5/1
Dung môi chiết xuất (nồng độ dung môi ethanol): ethanol 30, 50, 70, 90 (%)
Dịch chiết được lọc, thu hồi dung môi thu được cao tổng Làm khô cao tổng ở
Bảo quản cao trong tủ lạnh
+ Hàm lượng geraniin trong dược liệu (lí thuyết): Tiến hành chiết nhiều lần tới khi lượng geraniin thu được là không đáng kể Hàm lượng geraniin (%) trong dược liệu (lí thuyết) được xác định bằng tổng hàm lượng geraniin thu được ở các lần chiết
+ Hàm lượng geraniin trong dược liệu (thực tế) được tính theo công thức:
X: hàm lượng geraniin chiết được từ dược liệu (%)
S: diện tích pic geraniin trong sắc ký đồ (mAU.s) b: hệ số chắn của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ geraniin và diện tích pic
V: thể tích dung dịch thử (ml) (V = 250 ml) a: hệ số góc của đường chuẩn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ geraniin và diện tích pic m: khối lượng dược liệu (g)
A: hàm ẩm của dược liệu (%)
2.2.2.2 Phương pháp khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu để chiết xuất Diệp hạ châu đắng
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất diệp hạ châu đắng được khảo sát bằng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) kết hợp phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
- Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu tối ưu hoá chiết xuất geraniin từ Diệp hạ châu đắng
3.2.1 Kết quả khảo sát đơn biến
3.2.1.1 Định lượng geraniin trong dược liệu
- Tiến hành chiết nhiều lần tới khi lượng geraniin thu được là không đáng kể Hàm lượng geraniin (%) trong dược liệu được xác định bằng tổng hàm lượng geraniin thu được ở các lần chiết
- Tiến hành chiết mẫu dược liệu 4 lần liên tiếp, thu được kết quả ở bảng:
Bảng 3 6 Phần trăm geraniin trong dược liệu
Nhận xét: Hàm lượng geraniin trong dược liệu được xác định là 3,68% Kết quả này phục vụ quá trình tính hiệu suất chiết geraniin của các thí nghiệm tiếp theo trong đề tài
3.2.1.2 Khảo sát tỉ lệ dược liệu/dung môi
Chiết dược liệu với tỉ lệ dung môi/dược liệu khác nhau: 5/1, 10/1, 15/1, 20/1, 25/1, 1/30 Các thông số khác được cố định cụ thể như sau: nhiệt độ: 70 o C; thời gian: 1,5h; nồng độ ethanol 70% Kết quả được trình bày trong biểu đồ
Hình 3 6 Biểu đồ thể hiện hiệu suất chiết geraniin theo tỉ lệ DL/DM
Khi tỉ lệ dược liệu/dung môi giảm từ 1/5 (g/ml) đến 1/15 (g/ml) thì hiệu suất chiết geraniin thay đổi không nhiều Khi tỉ lệ dược liệu/dung môi giảm từ 1/15 (g/ml) đến 1/25 (g/ml), thì hiệu suất chiết geraniin tăng dần từ 48,10% đến 67,12% Tuy nhiên khi
Tên mẫu Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng geraniin/DL (%)
32 tiếp tục giảm tỉ lệ dược liệu/dung môi từ từ 1/25 (g/ml) đến 1/30 (g/ml), thì hiệu suất chiết geraniin giảm từ 67,12% xuống còn 52,45%
Nhận thấy, khi tỉ lệ dung môi/dược liệu là 1/25 (g/ml), hiệu suất chiết geraniin đạt giá trị cao nhất Vì vậy, khoảng giá trị được lựa chọn để đưa vào mô hình của phương pháp bề mặt đáp ứng là từ 1/15 (g/ml) đến 1/30 (g/ml)
3.2.1.3 Khảo sát nồng độ dung môi
Chiết dược liệu với nồng độ ethanol khác nhau (%): 30, 50, 70, 90 Các thông số khác được cố định cụ thể như sau: thời gian: 1,5h; tỉ lệ dược liệu/dung môi: 1/10; nhiệt độ: 70 o C Kết quả được trình bày trong biểu đồ
Hình 3 7 Biểu đồ thể hiện hiệu suất chiết geraniin theo nồng độ dung môi
Khi tăng nồng độ cồn từ 30% đến 50%, hiệu suất chiết geraniin tăng từ 49,18% đến 53,53% Tuy nhiên, khi tăng nồng độ cồn từ 50% đến 90%, hiệu suất chiết geraniin giảm dần từ 53,53% xuống còn 24,73%
Nhận thấy, khi dung môi chiết là cồn 50%, hiệu suất chiết geraniin đạt giá trị cao nhất (53,53%) Do đó, khoảng giá trị được lựa chọn để đưa vào mô hình của phương pháp bề mặt đáp ứng là từ 30% đến 70%
3.2.1.4 Khảo sát thời gian chiết xuất
Chiết dược liệu với 5 khoảng thời gian chiết khác nhau (giờ): 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5;
3 Các thông số khác được cố định cụ thể như sau: tỉ lệ dược liệu/dung môi: 1/10; nhiệt độ chiết xuất: 70 o C; nồng độ ethanol: 70% Kết quả được trình bày trong biểu đồ
Hình 3 8 Biểu đồ thể hiện hiệu suất chiết geraniin theo thời gian
Khi thời gian chiết tăng từ 0,5 giờ lên đến 1 giờ thì hiệu suất chiết geraniin không có sự thay đổi (hiệu suất chiết 47,82%) Khi thời gian chiết tăng từ 1 giờ đến 2 giờ, hiệu suất chiết geraniin tăng dần từ 47,82% đến 50,54% Tuy nhiên, khi tăng thời gian chiết từ 2 giờ đến 3 giờ, hiệu suất chiết geraniin lại giảm dần từ 50,54% đến 36,41%
Nhận thấy, khi thời gian chiết là 2 giờ, hiệu suất chiết geraniin đạt giá trị cao nhất (50,54%) Do vậy, khoảng giá trị được lựa chọn để đưa vào mô hình của phương pháp bề mặt đáp ứng là từ 1 giờ đến 2,5 giờ
3.2.1.5 Khảo sát nhiệt độ chiết
Chiết dược liệu với nhiệt độ chiết khác nhau ( o C): 70 o , 80 o , 90 o Các thông số khác được cố định cụ thể như sau: thời gian chiết xuất: 1,5 giờ; tỉ lệ dược liệu/dung môi: 1/10; nồng độ ethanol: 70% Kết quả được trình bày trong biểu đồ:
Hình 3 9 Biểu đồ thể hiện hiệu suất chiết geraniin theo nhiệt độ
Khi tăng nhiệt độ chiết xuất từ 70 ( o C) đến 80 ( o C), hiệu suất chiết garaniin tăng dần từ 46,47% đến 47,83% Tuy nhiên khi tăng nhiệt độ từ 80 ( o C) đến 90 ( o C) Hiệu suất chiết giảm từ 47,83% xuống còn 45,11%
Nhận thấy, khi chiết ở nhiệt độ 80 ( o C), hiệu suất chiết geraniin đạt giá trị cao nhất (47,83%) Do đó, khoảng giá trị được lựa chọn để đưa vào mô hình của phương pháp bề mặt đáp ứng là từ 70 ( o C) đến 90 ( o C)
3.2.2 Kết quả khảo sát đa biến:
Các biến độc lập và mức độ của chúng được sử dụng cho thiết kế tổ hợp trung tâm CCD của geraniin
Bảng 3 7 Các biến độc lập và mức độ của chúng được sử dụng cho mô hình phức hợp trung tâm của geraniin
Các biến độc lập Mức độ
Tỉ lệ DL/DM (g/ml) 1/15 1/22,5 1/30
Các thông số của quá trình chiết xuất geraniin được tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM), với các biến đầu vào là nhiệt độ chiết (X1), thời gian chiết (X2), tỉ lệ DL/DM (X3) và nồng độ cồn (X4) với các khoảng khảo sát đã mã hóa thành khoảng [-1; 1] như đã trình bày ở mục 2.2.3 Thiết kế 28 thí nghiệm theo mô hình phức hợp trung tâm, mỗi thí nghiệm thực hiện định lượng bằng phương pháp HPLC 3 lần, lấy giá trị trung bình Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.8
Bảng 3 8 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm
Tỉ lệ DL/DM (g/ml)
3.2.3 Kết quả tối ưu chiết xuất
Khảo sát hiệu suất chiết và một số chỉ tiêu của cao Diệp hạ châu đắng
Kết quả chiết xuất 5 mẫu cao DHCĐ được trình bày trong bảng 3.11
Bảng 3 11 Kết quả xác định hiệu suất chiết cao
Tên mẫu cao Khối lượng dược liệu đem chiết
Hàm ẩm Khối lượng cao thu được
Nhận xét: Từ 100g bột dược liệu của 5 mẫu khảo sát đem chiết xuất theo phương pháp tối ưu, thu được kết quả:
3.3.2 Khảo sát các chỉ tiêu định tính
3.3.2.1 Định tính bằng phản ứng hoá học
5 mẫu cao lần lượt được tiến hành phản ứng với thuốc thử gelatin 1% và thuốc thử FeCl3 5%, kết quả định tính được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3 12 Kết quả định tính bằng phản ứng hoá học của cao DHCĐ
Hình 3 10 Hình ảnh trước và sau phản ứng với gelatin 1%
Hình 3 11 Hình ảnh trước và sau phản ứng với FeCl 3 5%
Nhận xét: 5 mẫu cao đều cho phản ứng dương tính với thuốc thử gelatin 1% và
FeCl3 5%, cho thấy trong các mẫu cao đều chứa tanin
Tiến hành sắc ký lớp mỏng theo mục 2.2.3.1.b, kết quả được trình bày trình bày trong hình 3.12 và 3.13
Tên mẫu cao Tt gelatin 1% TT FeCl 3 5%
Hình 3 12 Sắc kí đồ quan sát ở bước sóng 254 nm
Hình 3 13 Sắc kí đồ quan sát ở bước sóng 365 nm
1: Chuẩn geraniin; 2: Mẫu cao 1; 3: Mẫu cao 2; 4: mẫu cao 3; 5: mẫu cao 4; 6: mẫu cao 5
Nhận xét: Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử của 5 mẫu cao có vết cùng màu sắc và giá trị Rf với vết trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn geraniin
3.3.3 Khảo sát về chỉ tiêu hàm ẩm
Kết quả xác định hàm ẩm của cao đặc bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô được trình bày ở bảng 3.13
Bảng 3 13 Kết quả xác định hàm ẩm của cao Tên mẫu cao Khối lượng cao (g) Hàm ẩm (%)
Nhận xét: Cả 5 mẫu cao đều có mất khối lượng do làm khô không quá 20%, thỏa mãn tiêu chuẩn về mất khối lượng do làm khô của cao đặc theo Dược điển Việt Nam V
Dự kiến: Mất khối lượng do làm khô của cao DHCĐ không quá 20,0%
3.3.4 Khảo sát về chỉ tiêu pH
Kết quả xác định pH của 5 mẫu cao DHCĐ được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3 14 Kết quả xác định pH của cao
Nhận xét: Cao đặc DHCĐ có tính acid yếu pH của dung dịch cao 1% trong nước
(khối lượng/thể tích) là 4,98 ± 0,03
Dự kiến: Dung dịch cao Diệp hạ châu đắng 1% trong nước (khối lượng/thể tích) phải có pH từ 4,5 đến 5,5
3.3.5 Khảo sát về chỉ tiêu tro toàn phần
Kết quả đo tro toàn phần của 5 mẫu cao được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3 15 Kết quả xác định tro toàn phần của cao DHCĐ
Tên mẫu cao Khối lượng cao (g) Tỉ lệ tro toàn phần (%)
Nhận xét: Tỉ lệ tro toàn phần trong 5 mẫu cao trung bình đạt 16,41%, không mẫu cao nào có quá 18% lượng tro toàn phần
Dự kiến: Tỉ lệ tro toàn phần trong cao DHCĐ không quá 18%
3.3.6 Khảo sát về chỉ tiêu cắn không tan trong nước
Tiến hành khảo sát hàm lượng cắn không tan trong nước của 5 mẫu cao thu được kết quả như sau:
Bảng 3 16 Kết quả xác định hàm lượng cắn không tan trong nước của cao
DHCĐ Tên mẫu cao Khối lượng cao (g) Hàm lượng cắn không tan trong nước (%)
Nhận xét: Kết quả từ bảng 3.16 cho thấy hàm lượng cắn không tan trong nước trong 5 mẫu cao trung bình đạt 20,69% (không mẫu cao nào quá 22%)
Dự kiến: Hàm lượng cắn không tan trong nước của cao DHCĐ không quá 22%
3.3.7 Khảo sát về chỉ tiêu định lượng
Hàm lượng geraniin trong các mẫu cao được định lượng bằng phương pháp HPLC, mỗi mẫu cao được tiến hành định lượng 3 lần, lấy kết quả trung bình Kết quả định lượng được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3 17 Kết quả định lượng geraniin trong cao DHCĐ
Diện tích pic (mAU.s) RSD Hàm lượng geraniin/cao (%) TB RSD
Nhận xét: Hàm lượng geraniin trong các mẫu cao có sự khác biệt rất lớn nên chưa thể đưa ra mức giới hạn cho chỉ tiêu định lượng geraniin trong cao Nguyên nhân có sự khác biệt này có thể do sự khác biệt về điều kiện sinh thái, tuổi của cây,…
BÀN LUẬN
Về thẩm định phương pháp định lượng geraniin
Phương pháp định lượng mà nghiên cứu đã xây dựng được thẩm định theo tiêu chí của AOAC và đã đáp ứng các tiêu chí như: khoảng tuyến tính, tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, độ đúng, độ lặp lại, xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Đảm bảo phù hợp để định lượng geraniin cho các mẫu cao chiết xuất trong các điều kiện khác nhau Phương pháp đã xây dựng có tính ổn định để áp dụng vào việc định lượng geraniin trong các mẫu cao Diệp hạ châu đắng khác nhau.
Nghiên cứu tối ưu hoá chiết xuất
4.2.1 Về xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hiệu suất chiết geraniin
Sự tác động tương tác lẫn nhau giữa các biến ảnh hưởng đến hiệu suất chiết geraniin được mô tả bởi các biểu đồ 3D Hai trục Ox và Oy biểu thị 2 trong 4 yếu tố ảnh hưởng, trục Oz biểu thị hiệu suất chiết geraniin Các đường cong bề mặt 3 chiều của mỗi cặp yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu được minh họa bằng cách giữ các yếu tố còn lại ở mức bằng 0 Dựa vào các biểu đồ 3D này có thể xác định được giá trị tối ưu của từng cặp yếu tố ảnh hưởng đến đến giá trị của hiệu xuất chiết geraniin
Biểu đồ 3D-1 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và nhiệt độ chiết xuất đến hiệu suất chiết geraniin Khi nhiệt độ chiết xuất càng tiến dần về mức giá trị -1 thì hiệu suất chiết đạt giá trị càng lớn, tương tự khi thời gian chiết xuất càng tiến về giá trị 1 thì hiệu suất chiết càng tiến về giá trị cực đại
Biểu đồ 3D-2 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của nhiệt độ chiết xuất và tỉ lệ DL/DM đến hiệu suất chiết geraniin Từ biểu đồ cho thấy, khi tỉ lệ DL/DM càng thấp thì hiệu suất chiết geraniin càng tiến về giá trị cực tiểu Điều này cho thấy lượng dung môi sử dụng để chiết xuất ảnh hưởng đến mức độ hòa tan của geraniin Bên cạnh đó, khi nhiệt độ chiết xuất càng cao thì hiệu suất chiết geraniin càng thấp, điều này có thể giải thích là do ở nhiệt độ cao geraniin có thể không bền và biến đổi thành chất khác
Biểu đồ 3D-3 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ dung môi chiết - ethanol đến hiệu suất chiết geraniin Từ biểu đồ cho thấy, nhiệt độ chiết xuất càng cao thì hiệu suất chiết geraniin càng thấp Biến nồng độ dung môi chiết có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hiệu xuất chiết Điều này phù hợp với sự giải thích về mối liên hệ giữa khả năng chiết geraniin và độ phân cực của dung môi chiết đã giải thích ở phần kết quả khảo sát đơn biến
Biều đồ 3D-4 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của tỉ lệ DL/DM và thời gian chiết đến hiệu suất chiết geraniin Khi tỉ lệ DL/DM càng lớn, đồng thời thời gian chiết càng nhỏ thì hiệu suất chiết geraniin càng tiến về cực đại
Biều đồ 3D-5 cho thấy xu hướng ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và nồng độ dung môi chiết xuất đến hiệu suất chiết geraniin Từ biểu đồ cho thấy, khi thời gian chiết xuất càng ngắn và nồng độ ethanol càng tiến về giá trị cực đại thì hiệu suất chiết geraniin càng tiến về giá trị cực đại
Biểu đồ 3D-6 cho thấy cho thấy độ cong của đồ thị là không nhiều, điều đó cho thấy sự tương tác giữa 2 yếu tố này không có sự ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết geraniin Ngoài ra, tỉ lệ DL/DM càng lớn thì giá trị hiệu suất chiết càng tiến về giá trị cực đại, điều này phù hợp với giải thích trước đó
4.2.2 Về kết quả chọn phương án chiết xuất tối ưu
Kết quả phân tích của phần mềm Design Expert đã đưa ra những kết quả tối ưu hiệu suất chiết geraniin với các yếu tố thí nghiệm nằm trong phạm vi khảo sát
Xét về khía cạnh kinh tế, khi áp dụng vào quy mô lớn Một trong những mục tiêu quan trọng nhất là tiết kiệm dung môi và thời gian nhằm nâng cao hiệu quả khai thác và giảm thiểu tiêu hao năng lượng dùng để thu hồi Giải pháp tối ưu được lựa chọn với kết quả sau:
Kết quả thẩm định lại mô hình cho thấy có sự chênh lệch ít giữa thực nghiệm và dự đoán Giá trị RSD giữa 5 lần chiết là 0,63% cho thấy sự tập trung của kết quả thu được.
Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao Diệp hạ châu đắng
Khoá luận đã tiến hành xây dựng được dự thảo tiêu chuẩn cơ sở của cao Diệp hạ châu đắng được điều chế theo phương pháp tối ưu, gồm có các chỉ tiêu: định tính, mất khối lượng do làm khô, pH, tro toàn phần và cắn không tan trong nước
50 Chỉ tiêu định lượng đã được tiến hành đánh giá, tuy nhiên kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng geraniin trong các mẫu cao có sự khác biệt rất lớn nên chưa thể đưa một mức chỉ tiêu định lượng chung vào dự thảo Cần tiến hành xem xét đánh giá thêm các yếu tố có thể ảnh hưởng đến hàm lượng geraniin như điều kiện sinh thái, tuổi của cây,… sau đó mới tiến hành đánh giá lại chỉ tiêu này
Trong một vài nghiên cứu trước đây về chiết xuất geraniin từ P amarus [27], [41], hàm lượng geraniin trong cao cao nhất đạt được là khoảng 20% [41] Và theo như kết quả thu được trong khoá luận này, khi điều chế cao theo các điều kiện tối ưu đã xây dựng, hàm lượng geraniin trong cao đạt được có thể lên tới 32,40%, nghiên cứu đã đưa ra được phương pháp bào chế mẫu cao giàu geraniin hơn so với những nghiên cứu trước đó
Qua chỉ tiêu định tính thấy rằng trong các mẫu cao đều chứa nhóm tanin Thông qua việc tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng cũng phần nào xác định và so sánh được hàm lượng geraniin trong các mẫu cao với nhau Đo pH cho thấy các mẫu cao có tính acid trung bình Đây là một yếu tố cần xem xét, do geraniin dễ bị thuỷ phân trong môi trường acid yếu, mẫu cao thu được có thể không ổn định Do vậy cần đánh giá thêm độ ổn định của các mẫu cao tối ưu và có biện pháp điều chỉnh pH của cao trong quá trình điều chế cao nếu cần (khi mẫu cao kém ổn định tại khoảng pH đang dự kiến)
