Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ diệp hạ châu đắng (phyllanthus amarus schum et thonn , euphorbiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHẠM VĂN SƠN THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HYPOPHYLLANTHIN, NIRANTHIN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLANTHUS AMARUS SCHUM ET THONN., EUPHORBIACEAE) Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 62720410 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2021 Cơng trình hồn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN NGỌC VINH Phản biện 1: PGS TS TRỊNH VĂN LẨU Phản biện 2: PGS TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN Phản biện 3: PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào hồi 30 ngày 06 tháng 12 năm 2021 Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP Hồ Chí Minh - Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phạm Văn Sơn, Lữ Thị Kim Chi, Phan Nguyễn Trường Thắng, Nguyễn Ngọc Vinh (2017), “Nghiên cứu phân cứu lập hypophyllanthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum Et Thonn.) làm chất đối chiếu”, Tạp chí Dược học, 491 (57), tr 55-58 Phạm Văn Sơn, Phương Tráng Quân, Nguyễn Đăng Lâm, Nguyễn Ngọc Vinh (2017), “Nghiên cứu phân lập niranthin làm chất đối chiếu từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.)”, Tạp chí Dược học, 498 (57), tr 32-35 Pham Van Son, Tran Long Thai, Chuong Ngoc Nai, Pham Thi Thanh Thao, Nguyen Duc Tuan, Tran Viet Hung, Nguyen Ngoc Vinh (2020), “Simultaneous determination of phyllanthin, hypophyllanthin and niranthin in rabbit plasma by LC-MS/MS”, International Journal of Pharmaceutical Research, 12 (4), pp 1974-1980 Phạm Văn Sơn, Trần Long Thái, Phan Nguyễn Trường Thắng, Nguyễn Ngọc Vinh (2020), “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin nirtetralin Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.)” phương pháp HPLC, Tạp chí Y Dược học – Dược học; số tháng - 2020, tr 144 - 148 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn., Euphorbiaceae) (DHCĐ) dược liệu sử dụng phổ biến với tác dụng cải thiện chức gan, đặc biệt viêm gan B Hiện nay, thị trường nhiều sản phẩm từ DHCĐ, chủ yếu bào chế từ nguyên liệu cao toàn phần Đa số, tiêu chuẩn sở thành phẩm xây dựng dựa việc định lượng hỗn hợp toàn phần phương pháp không đặc hiệu, không đưa tiêu định lượng hợp chất có hoạt tính sinh học chưa xác định mức hàm lượng cho chất có hoạt tính liều điều trị thiếu chất chuẩn đối chiếu chưa có nghiên cứu về dược động học chất có hoạt tính sinh học cho sản phẩm từ dược liệu Trong tác dụng sinh học DHCĐ không phyllanthin mà cịn có hypophyllanthin, niranthin Các chất có vai trị quan trọng tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, chống ung thư Bên cạnh đó, cơng tác tiêu ch̉n hóa dược liệu hay sản phẩm từ dược liệu còn tương đối khó khăn còn bỏ ngõ lĩnh vực kiểm nghiệm thiếu phương pháp thử, chất chuẩn đối chiếu (CĐC), cao chuẩn đối chiếu, Mặt khác, chất chuẩn đối chiếu chưa sẵn có giá thành cao; phương pháp thử cần xây dựng cho phù hợp với trình độ khoa học kỹ thuật chung giới để nâng cao chất lượng sản phẩm Ngoài ra, nghiên cứu sinh khả dụng nhằm đánh giá thông số dược động học chế phẩm từ DHCĐ sẽ giúp minh chứng hỗ trợ điều trị bảo vệ gan hiệu Do đó, việc phân lập chất có hoạt tính sinh học làm chất đối chiếu, tiêu chuẩn hóa cao DHCĐ xác định sinh khả dụng chế phẩm để làm sở cho việc đánh giá chất lượng ước định liều dùng cho sản phẩm từ DHCĐ cần thiết Từ lý trên, đề tài “Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin đánh giá số thông số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn., Euphorbiaceae)” thực với mục tiêu cụ thể sau: - Chiết xuất, phân lập, tinh chế hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) - Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) - Điều chế tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) - Đánh giá số thông số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) Tính cấp thiết đề tài DHCĐ loài mọc tự nhiên rộng rãi khắp nơi, trồng quy mơ lớn có tác dụng tốt điều trị bệnh lý về gan DHCĐ sử dụng rộng rãi từ lâu, sản phẩm đa dạng, phong phú làm cho thầy thuốc người sử dụng vui mừng, lo ngại về giá trị chất lượng sản phẩm chưa có quy định quan nhà nước về tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm Năm 2017, DĐVN V có chuyên luận về dược liệu DHCĐ, chưa có quy định về chất lượng chế phẩm từ DHCĐ tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm cao từ dược liệu Từ lý trên, đề tài thực để thiết lập CĐC chất có hoạt tính sinh học phân lập để phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu chế phẩm từ dược liệu; đề xuất tiêu chuẩn chất lượng cao chuẩn hóa DHCĐ sở cho việc quy định chất lượng chế phẩm từ dược liệu này; khảo sát nghiên cứu đánh giá số thông số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ DHCĐ 3 Những đóng góp luận án Về mặt hóa học chiết xuất, phân lập, tinh chế: Lần đầu tiên, phân lập đồng thời hợp chất lignan DHCĐ Phyllanthus amarus gồm phyllanthin (PLT), hypophyllanthin (HPL), niranthin (NRT), nirtetralin (NTT) phyltetralin (PTT) kèm liệu phổ nghiệm đầy đủ chất đạt độ tinh khiết cần thiết để thiết lập chất đối chiếu phục vụ công tác kiểm nghiệm nguyên liệu chế phẩm từ thuốc Về mặt thiết lập chất đối chiếu: Lần đầu tiên, xây dựng hồ sơ hoàn chỉnh để thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin niranthin Về mặt điều chế tiêu chuẩn hóa cao khơ DHCĐ: Đã sử dụng phương pháp HPLC-PDA để định tính định lượng đồng thời lignan: phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin nirtetralin DHCĐ phương pháp chưa công bố tài liệu Lần đầu tiên, công bố nghiên cứu khảo sát điều chế cao giàu lignan để dùng làm cao đối chiếu có chất lượng tương đương cao chuẩn Phyllanthus amarus USP ứng dụng kiểm nghiệm chất lượng dược liệu chế phẩm từ dược liệu DHCĐ Về mặt đánh giá số thông số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ DHCĐ: Quy trình định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin niranthin huyết tương thỏ phương pháp LC-MS/MS xây dựng thẩm định, chưa công bố tài liệu Bước đầu xác định thông số dược động học lignan chính: phyllanthin, hypophyllanthin niranthin sau cho thỏ uống cao khô DHCĐ ch̉n hóa với mục đích dùng làm ngun liệu sản xuất thành phẩm dạng thuốc rắn phân liều, chưa công bố tài liệu Bố cục luận án Luận án gồm 148 trang: Mở đầu trang, tổng quan 33 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 28 trang, kết nghiên cứu 49 trang, bàn luận 32 trang, điểm luận án trang, kết luận trang kiến nghị trang Luận án có 72 bảng, 48 hình, sơ đồ, 105 tài liệu tham khảo gồm 10 tài liệu tiếng Việt 95 tài liệu tiếng Anh, 16 phụ lục thể kết thực nghiệm Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trình bày vấn đề sau: 1.1 Tổng quan Diệp hạ châu đắng 1.2 Các phương pháp nghiên cứu về chiết xuất, phân lập, tinh chế hợp chất lignan từ Diệp hạ châu đắng 1.3 Các phương pháp định lượng hợp chất lignan Diệp hạ châu 1.4 Cao đối chiếu 1.5 Tổng quan về đánh giá sinh khả dụng thuốc Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Mẫu nghiên cứu giám định tên khoa học Phyllanthus amarus Schum et Thonn., Euphorbiaceae Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh 2.1.2 Chất đối chiếu: Phyllanthin, diazepam, carbamazepin cung cấp Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Cao chuẩn Phyllanthus amarus (số lô F0K140, g) USP 2.1.3 Hóa chất dung mơi: Đều đạt độ tinh khiết dùng cho phân tích sắc ký 2.1.4 Động vật thử nghiệm: Thỏ thí nghiệm khỏe mạnh, trọng lượng  0,5 kg cung cấp Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh 2.1.5 Trang thiết bị, vật tư sử dụng nghiên cứu: Các thiết bị phân tích dụng cụ thủy tinh xác hiệu chuẩn đạt yêu cầu mục đích sử dụng Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh 2.1.6 Nơi thực nghiên cứu: Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh đạt tiêu chuẩn GLP-WHO ISO/IEC 17025 Công ty Cổ phần BV Pharma đạt tiêu chuẩn GMP-WHO 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc, độ tinh khiết chất phân lập 2.2.1.1 Kiểm tra chất lượng dược liệu nghiên cứu: theo DĐVN IV định danh dược liệu phương pháp sinh học phân tử DNA 2.2.1.2 Chiết xuất cao toàn phần: Khảo sát loại dung môi: dicloromethan, cloroform, aceton, ethyl acetat, ethanol 96%, ethanol 70% phương pháp ngâm nhiệt độ phịng để chọn dung mơi dùng chiết có hiệu 2.2.1.3 Phân lập cao toàn phần sắc ký cột: Từ cao toàn phần tiến hành sắc ký cột nhằm thu phân đoạn đơn giản Thực với cột thủy tinh có lưới xốp G-3, chứa silica gel cỡ hạt 40-60 μm (Davisil), nhồi vào cột với dung môi n-hexan 2.2.1.4 Phân lập hợp chất từ cao phân đoạn: Sử dụng phương pháp kết tinh phân đoạn từ phân đoạn chứa chủ yếu vết; phương pháp sắc ký cột hoặc sắc ký điều chế từ phân đoạn chứa hoặc nhiều vết 2.2.1.5 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập được: Bằng phương pháp SKLM, HPLC/PDA, DSC 2.2.1.6 Xác định cấu trúc chất phân lập được: Bằng kỹ thuật phổ nghiệm: UV, IR, MS, NMR (13C-NMR, 1H-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY) đối chiếu với liệu phổ công bố 2.2.2 Xác định chất lượng thiết lập chất đối chiếu 2.2.2.1 Xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu: Bằng phương pháp HPLC quy về 100% diện tích pic sắc ký đồ thẩm định theo hướng dẫn ICH 2.2.2.2 Thiết lập chất đối chiếu: Đánh giá thiết lập CĐC theo tài liệu hướng dẫn WHO ASEAN Đánh giá độ đồng lọ Đánh giá so sánh liên phòng ba phòng thí nghiệm (PTN) độc lập đạt tiêu chuẩn GLP ISO 17025 Xác định giá trị ấn định - giá trị công bố theo hướng dẫn ISO 13528 2.2.3 Điều chế tiêu chuẩn hóa cao diệp hạ châu đắng 2.2.3.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời hợp chất lignan Diệp hạ châu đắng phương pháp HPLC: Tiến hành theo quy trình USP, khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp khảo sát điều kiện chiết kiệt hoạt chất từ dược liệu Sau đó, tiến hành thẩm định quy trình định lượng theo hướng dẫn AOAC ICH; ứng dụng quy trình để định lượng đồng thời hợp chất lignan dược liệu cao chiết từ DHCĐ 2.2.3.2 Điều chế cao chuẩn hóa Diệp hạ châu đắng Khảo sát điều kiện thích hợp cho q trình chiết cao DHCĐ tiến hành điều kiện sau: - Khảo sát dung môi: ethanol 30%, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96% với tỉ lệ dược liệu : dung môi (tỉ lệ DL : DM) = (1 : 15) - Khảo sát thời gian ngâm: ngày, ngày, ngày, ngày - Khảo sát tỉ lệ dược liệu : dung môi: (1 : 20), (1 : 15), (1 : 10), (1 : 5), (1: 4) - Khảo sát số lần chiết: lần, lần, lần, lần Chọn điều kiện thích hợp cho trình chiết cao DHCĐ để tiến hành chiết cao thực nghiệm Khảo sát điều kiện chiết quy mơ phịng thí nghiệm quy mơ pilot So sánh tổng hàm lượng PLT HPL (quy về hàm lượng dược liệu) dung môi chiết, quy trình chiết xuất cao quy mơ phịng thí nghiệm quy mô pilot 2.2.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao khô Diệp hạ châu đắng: Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao khô DHCĐ bao gồm tiêu sau: Tính chất, định tính, khối lượng làm khơ, tro tồn phần, giới hạn kim loại nặng, định lượng, giới hạn nhiễm khuẩn 10 Các hợp chất chọn đủ khối lượng độ tinh khiết lớn 95% để thiết lập CĐC gồm: phyllanthin (PLT - 1500 mg); hypophyllanthin (HPL - 300 mg), niranthin (NRT - 180 mg) nirtetralin (NTT - 50 mg) Do hợp chất PLT thiết lập CĐC [3] nên luận án thiết lập CĐC HPL NRT Đối với NTT xác định độ tinh khiết để ứng dụng định lượng lignan DHCĐ 3.2.1 Xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập CĐC: Bằng phương pháp HPLC quy về 100% diện tích pic sắc ký đồ thẩm định theo hướng dẫn ICH 3.2.2 Thiết lập chất đối chiếu: Đánh giá thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin niranthin theo tài liệu hướng dẫn WHO ASEAN Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin: Giá trị cơng bố tính từ kết phân tích (n = 18): Độ tinh khiết sắc ký 97,89% tính theo nguyên trạng, RSD = 0,64% Độ khơng đảm bảo đo µ = 0,189% Thiết lập chất đối chiếu niranthin: Giá trị cơng bố tính từ kết phân tích (n = 18): Độ tinh khiết sắc ký 99,78% tính theo nguyên trạng, RSD = 0,034% Độ khơng đảm bảo đo µ = 0,01% 3.2.3 Xác định độ tinh khiết chất nirtetralin sau tinh chế Tiến hành xác định độ tinh khiết nirtetralin theo phương pháp HPLC xây dựng Độ tinh khiết nirtetralin 97,02% 3.3 Điều chế tiêu chuẩn hóa cao diệp hạ châu đắng 3.3.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời hợp chất lignan DHCĐ phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký thích hợp: Cột sắc ký: Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; μm) Pha động: Methanol – acid phosphoric 0,1% (56 : 44) Tốc độ dòng: mL/phút Nhiệt độ cột: 25 oC Đầu dị: PDA, bước sóng phát 230 nm Thể tích tiêm: 10 μL 11 Kết thẩm định cho thấy phương pháp đạt tất yêu cầu về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ đúng theo qui định AOAC ICH 3.3.2 Điều chế cao chuẩn hóa Diệp hạ châu đắng 3.3.2.1 Khảo sát điều kiện thích hợp cho q trình chiết xuất cao: Điều kiện thích hợp chiết xuất thực nghiệm sau: Phương pháp chiết: ngâm Dược liệu: kg bột dược liệu rây qua rây 355 µm Dung mơi: ethanol 96% với tỉ lệ dược liệu : dung môi (1 : 5) Thời gian chiết: 48 giờ, chiết lần Tiến hành lô Phương pháp điều chế cao đặc: cô quay chân không Nhiệt độ: 35-40 oC Áp suất: 50-130 atm 3.3.2.2 Quy mơ phịng thí nghiệm: Tiến hành theo điều kiện để chiết kg bột dược liệu với dung môi khảo sát: nước, ethanol 20%, ethanol 30%, ethanol 40%, ethanol 50%, ethanol 60%, ethanol 70%, ethanol 80%, ethanol 96% Sau đó, dịch chiết lọc qua màng lọc để loại tạp học, thu dịch lọc Dịch lọc cô áp suất giảm Thực SKLM HPLC để kiểm tra hàm lượng PLT HPL cao thu Nhận xét: Khi chiết nước hàm lượng PLT HPL cao thấp Chiết ethanol từ ethanol 20% đến ethanol 30%, hàm lượng hoạt chất chiết tăng nhanh (hàm lượng PLT HPL cao gấp 4,5 lần so với nước), từ ethanol 30% đến ethanol 80%, hàm lượng hoạt chất tăng không đáng kể, ethanol 96% cho hàm lượng hoạt chất chiết cao (hàm lượng PLT HPL cao gấp 1,3 lần so với ethanol 30%) 3.3.2.3 Điều chế cao khô quy mô pilot: Tiến hành quy mô pilot để chiết 20 kg bột dược liệu với dung môi khảo sát: nước, ethanol 30%, ethanol 40%, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96% phun sấy khô dịch chiết mẫu cao khơ Chọn dung mơi thích hợp để sản xuất lô, lô mẫu thử Q trình sản xuất quy mơ pilot tiến hành nhà máy Công ty Cổ phần BV Pharma với hệ thống 12 chiết xuất đa Thực SKLM HPLC để kiểm tra hàm lượng PLT HPL Nhận xét: Khi chiết nước hàm lượng hoạt chất PLT HPL cao thấp Khi chiết ethanol ethanol 30% cho hàm lượng hoạt chất cao cao (cao gấp 9,0 lần so với nước), từ ethanol 50% đến ethanol 96% hàm lượng hoạt chất cao giảm dần Vì thế, ethanol 30% chọn làm dung môi chiết xuất dược liệu quy mô pilot 3.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao khô Diệp hạ châu đắng Bảng 3.43 Kết kiểm nghiệm cao khô Diệp hạ châu đắng Chỉ tiêu Tính chất Định tính Sắc ký lớp mỏng HPLC Mất khối lượng làm khơ Tro tồn phần Kim loại nặng Định lượng Phyllanthin Hypophyllanthin Độ nhiễm khuẩn Tổng số vi khuẩn hiếu khí Tổng số nấm men nấm mốc Vi khuẩn Gram âm Salmonella spp Escherichia coli Staphylococcus aureus Mức chất lượng Bột màu nâu đồng mùi dược liệu, vị đắng, dễ hút ẩm Kết Đạt Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) Không 5% Không 10% Không 20 ppm Đúng Đúng Đạt (3,6%) Đạt (7,3%) Đạt Hàm lượng phyllanthin (C24H34O6) khơng 0,8% tính chế phẩm khơ Hàm lượng hypophyllanthin (C24H30O7) khơng 0,3% tính chế phẩm khô Đạt (1,83%) Không 104 cfu/g Không 102 cfu/g Khơng q 102 cfu/g Khơng có/10 g Khơng có/g Khơng có/g Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt (0,75%) 3.3.4 Ứng dụng điều chế cao giàu lignan dùng làm cao đối chiếu Diệp hạ châu đắng 13 Sơ đồ 3.6 Quy trình điều chế cao giàu lignan 3.3.5 Ứng dụng định lượng lignan Diệp hạ châu đắng 3.3.5.1 Định lượng lignan số mẫu dược liệu Bảng 3.44 Kết hàm lượng (%) hợp chất lignan mẫu dược liệu Mẫu dược liệu Cần Thơ Cà Mau Trà Vinh PLT (%) 0,08 0,25 0,22 HPL (%) 0,04 0,08 0,05 NRT (%) 0,07 0,15 0,14 NTT (%) 0,06 0,13 0,1 3.3.5.2 Định lượng mẫu cao khô Diệp hạ châu đắng Bảng 3.45 Kết hàm lượng (%) hợp chất lignan loại cao khô Mẫu thử Cao ethanol 30% Cao ethanol 40% Cao ethanol 50% Cao ethanol 60% Cao ethanol 70% Cao nước Cao giàu lignan điều chế PLT (%) 1,45 0,83 1,17 0,91 0,77 0,18 8,37 HPL (%) 0,52 0,30 0,43 0,32 0,28 0,04 0,91 NRT (%) 0,59 0,40 0,59 0,43 0,38 0,04 1,29 NTT (%) 0,61 0,42 0,61 0,45 0,39 0,03 1,12 3.4 Đánh giá số thông số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ diệp hạ châu đắng 3.4.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin niranthin huyết tương thỏ 14 Điều kiện khối phổ tối ưu: Kiểu ion hóa ESI (+) Tốc độ dòng khí phun: L/phút Tốc độ dòng khí khơ: 15 L/phút Nhiệt độ hóa dung mơi: 250 oC Nhiệt độ buồng ion hóa: 400 oC Áp suất khí phun: 25 psi Chế độ ghi phổ: MRM Điện mao quản: 4500 V Thời gian chờ ghi nhận tín hiệu: 100 ms Thế phân mảnh sau: Chất ESI Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin Diazepam (+) (+) (+) (+) m/z 436,00 261,20 449,95 285,00 → → → → 151,10 231,10 369,20 154,05 Q1 (eV) CE (eV) Q3 (eV) -22 -18 -23 -21 -33 -14 -18 -28 -29 -16 -25 -30 Tỷ lệ (%) 100 100 100 100 Điều kiện sắc ký thích hợp: Pha động: Methanol – dung dịch đệm amoni format mM (63 : 37) Cột sắc ký: Gemini C18 (100  mm; µm) Nhiệt độ cột: 40 oC Nhiệt độ autosampler: oC Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút Thể tích tiêm: µL Phát hiện: Đầu dò khối phổ, ESI Phương pháp xử lý mẫu: Lấy xác 200 µL huyết tương thỏ có chứa chất phân tích cho vào ống nghiệm Thêm 10 µL dung dịch chuẩn nội diazepam nồng độ 1000 ng/mL methanol, lắc 10 giây Chiết lần với n-hexan, lần 2,5 mL, lắc xoáy phút, lắc 300 vòng/phút phút, ly tâm 4000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng, lấy dịch trong, gộp dịch chiết bốc dung môi tới cắn khí nitơ 40 oC Hịa tan cắn 200 µL methanol, lắc xoáy phút, siêu âm phút, ly tâm 4000 vòng/phút phút nhiệt độ °C, lọc qua màng lọc 0,22 µm Bảng 3.60 Nồng độ hoạt chất huyết tương thỏ Chất S-1 (LLOQ) PLT 0,1 HPL 0,1 NRT 0,1 IS Nồng độ hoạt chất huyết tương (ng/mL) S-2 S-3 0,2 0,2 0,2 0,5 0,5 0,5 S-4 S-5 1 5 S-6 S-7 S-8 10 10 10 50 20 20 20 50 50 50 LQC MQC HQC 0,3 0,3 0,3 25 25 25 40 40 40 15 Bảng 3.61 Tóm tắt kết thẩm định phương pháp STT Chỉ tiêu Tính đặc hiệu (n = 6) Giới hạn định lượng (n = 6) Đường chuẩn khoảng tuyến tính (n = 8) Độ đúng độ xác ngày khác ngày (n = 18) Hiệu suất chiết (n = 6) Độ ổn định (n = 6) Ảnh hưởng nền mẫu (n = 6) Lượng mẫu tồn dư (n = 6) Kết Mẫu LLOQ có pic PLT (6,735 phút), HPL (6,145 phút), NRT (9,048 phút) IS (3,813 phút) Mẫu huyết tương trắng không xuất pic thời gian lưu PLT, HPL, NRT IS Tín hiệu đáp ứng mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu PLT, HPL NRT khơng vượt q 20 % tín hiệu đáp ứng chất phân tích nồng độ LLOQ Tín hiệu đáp ứng mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu chuẩn nội không vượt % tín hiệu đáp ứng chuẩn nội mẫu LLOQ Ở nồng độ 0,1 ng/mL (PLT, HPL NRT) đều cho tỷ số S/N lớn 5, đạt độ xác độ đúng theo qui định, diện tích chất phân tích lớn lần so với mẫu trắng thời điểm, nồng độ chấp nhận giới hạn định lượng (LLOQ) Phương trình hồi quy tuyến tính với trọng số 1/x2: - PLT (0,1-50 ng/mL): y = 0,0534x + 0,00099; R2 = 0,9920 - HPL (0,1-50 ng/mL): y = 0,0146x + 0,00006; R2 = 0,9917 - NRT (0,1-50 ng/mL): y = 0,0413x + 0,00017; R2 = 0,9851 Ở mức nồng độ LLOQ, LQC, MQC HQC: - PLT (98,27% - 111,41%; CV: 1,62% - 13,25%) - HPL (97,33% - 108,57%; CV: 2,24% - 13,14%) - NRT (97,19% - 109,92%; CV: 2,17% - 15,78%) Ở mức nồng độ LQC, MQC HQC: - PLT (94,30% - 96,27%; CV: 1,84% - 2,49%) - HPL (91,54% - 96,11%; CV: 1,64% - 3,22%) - NRT (97,53% - 98,63%; CV: 2,10% - 2,82%) - IS (96,55% - 98,78%; CV: 2,66% - 2,83%) Dung dịch chuẩn gốc ổn định -20 oC 30 ngày Chất phân tích huyết tương ổn định nhiệt độ phòng 25 o C giờ, buồng tiêm mẫu oC 24 giờ, sau chu kỳ đông - rã đông -70 oC vòng 30 ngày Giá trị ‘IS-normalized matrix factor’ PLT, HPL, NRT mức nồng độ LQC HQC có giá trị CV 2,05% 4,40%; 8,15% 3,07%; 5,74% 3,32% Phương pháp phân tích có bị ảnh hưởng nền mẫu nằm mức cho phép Tiêm lặp lại lần mẫu có nồng độ cao (ULOQ) mẫu trắng, sau tiêm lần mẫu có nồng độ LLOQ Kết cho thấy khơng có ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư PLT, HPL, NRT IS 16 3.4.2 Đánh giá số thông số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng Tiến hành phân tích mẫu huyết tương thỏ theo quy trình thẩm định Phân tích dược động học dựa liệu 12 Từ nồng độ chất phân tích huyết tương thời điểm, tính tốn thơng số dược động học cá thể dược động học trung bình Bảng 3.62 Các thơng số dược động học trung bình chất phân tích Thơng số Tmax (giờ) Cmax (ng/mL) AUC0-t (ng.giờ/mL) AUC0-∞ (ng.giờ/mL) T1/2 (giờ) AUC0-t/AUC0-∞ (%) Phyllanthin (TB ± SD) 0,24 14,625 ± 1,88 9,694 ± 0,71 10,150 ± 0,61 1,78 95,51 Hypophyllanthin (TB ± SD) 0,26 5,913 ± 0,82 4,172 ± 0,39 4,503 ± 0,42 1,17 92,65 Niranthin (TB ± SD) 0,24 4,408 ± 0,45 3,135 ± 0,24 3,497 ± 0,38 1,41 89,66 Chương BÀN LUẬN 4.1 Chiết xuất, phân lập, tinh chế xác định cấu trúc, độ tinh khiết chất phân lập Việc thăm dò chiết cao tồn phần với loại dung mơi có độ phân cực tăng dần khảo sát DCM, cloroform, aceton, ethyl acetat, ethanol 96% ethanol 70%, kết DCM lựa chọn Khi khảo sát SKLM, cao DCM cho vết tách rõ, hiệu suất chiết cao độc so với cloroform Khi khảo sát sắc ký cột cao DCM có nhiều vết phân đoạn tách rõ ràng so với cao ethyl acetat cao ethanol 96% Mặt khác, để xác định xác khả chiết xuất chất cần nghiên cứu, tiến hành định lượng HPLC, kết cho thấy lượng PLT HPL chiết cao hai dung môi ethyl acetat ethanol 96% Việc sử dụng DCM từ 1000 g dược liệu, thu 60 g cao DCM với hiệu suất 6% so với nghiên cứu trước sử dụng ethanol 96% với hiệu suất chiết 12% từ 10 kg dược liệu Việc phân lập tiến hành dựa sắc ký cột để tách phân đoạn chất tinh khiết Tiếp theo cơng trình nghiên cứu nhóm tác giả 17 Lữ Thị Kim Chi, Nguyễn Ngọc Vinh, sử dụng hệ dung môi rửa giải nhexan – ethyl acetat với độ phân cực tăng dần điều chỉnh tỉ lệ thay đổi từ (100 : 0) đến (80 : 20) thu 13 phân đoạn, phân đoạn IV có vết hai vết phụ, phân đoạn VII có hai vết chính, phân đoạn X có vết màu đỏ nâu, phân đoạn XII có hai vết phân đoạn XIII có vết màu xanh Số phân đoạn thu nhiều số phân đoạn nhóm tác giả trên, điều giúp cho việc tách chất cần phân lập thuận lợi Với kỹ thuật sắc ký cột, thu hợp chất PA1 (10 mg) từ phân đoạn IV Với kỹ thuật sắc ký điều chế cột pha thuận phân đoạn VII tách hai hợp chất PA2 PA3; cột pha đảo phân đoạn XII tách hai hợp chất PA5 PA6 Kết tinh lại sau sắc ký cột cổ điển thu hợp chất PA4 từ phân đoạn X hợp chất PA7 từ phân đoạn XIII Các hợp chất PA2, PA3 PA4, PA5 PA6 có độ tinh khiết sau phân lập cao từ 95,07% - 99,76% Với độ tinh khiết này, việc xác định cấu trúc dễ dàng Lượng mẫu PA1 tách không nhiều (10 mg) độ tinh khiết khơng cao (89,24%), chưa tiến hành xác định cấu trúc thử nghiệm khác 4.2 Xác định chất lượng thiết lập chất đối chiếu PLT HPL phân lập sau triển khai qua cột kết tinh ethanol tuyệt đối NRT, NTT PTT phân lập sắc ký điều chế sau triển khai qua sắc ký cột Các hợp chất lignan phân lập đều có độ tinh khiết sắc ký lớn 95%, đáp ứng yêu cầu dùng làm CĐC Dựa vào khối lượng chất tinh khiết phân lập được, HPL NRT thiết lập dùng làm CĐC đánh giá chất lượng so sánh liên phòng PTN đạt GLP, ISO 17025 Ngoài ra, lượng nirtetralin phân lập không nhiều giá thành chất chuẩn nirtetralin thương mại cao (hơn 500 USD/ mg) nên xác định độ tinh khiết sắc ký PTN để dùng làm CĐC phạm vi nội dung nghiên cứu đề tài cho phần khảo sát qui trình định lượng đồng thời bốn lignan DHCĐ 18 Lượng PTT phân lập (60 mg) độ tinh khiết đạt 95,07% nên chưa khảo sát So với mục tiêu nghiên cứu đề tài đạt thiết lập HPL NRT dùng làm CĐC 4.3 Điều chế tiêu chuẩn hóa cao khơ Diệp hạ châu đắng 4.3.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời hợp chất lignan DHCĐ phương pháp HPLC Ngồi PLT, HPL NRT NTT thành phần lignan DHCĐ Do đó, tiến hành định tính, định lượng thêm NRT NTT với PLT, HPL Tiến hành phương pháp HPLC-PDA để định tính định lượng đồng thời lignan PLT, HPL, NRT NTT dựa vào chất đối chiếu lignan Tuy nhiên, điều kiện sắc ký khảo sát cải tiến khả phân tách pic so với điều kiện sắc ký công bố Nghiên cứu sử dụng cột pha đảo Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; m), pha động methanol – acid phosphoric 0,1% với chương trình đẳng dịng (56 : 44), tốc độ dòng mL/phút Với điều kiện sắc ký này, có ưu điểm là: sử dụng pha động khơng chứa hệ đệm có muối vơ (KH2PO4) giúp hạn chế nhiễm bẩn cột nên tiêm nhiều mẫu giúp bảo vệ cột phân tích, kéo dài tuổi thọ cột; tốc độ dòng nên lượng dung mơi pha động tiêu thụ hơn; giá thành methanol thấp lần so với acetonitril nên kinh tế so với USP Phương pháp thẩm định đạt yêu cầu thông số quy trình định lượng: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại (độ xác) độ đúng 4.3.2 Điều chế cao khô Diệp hạ châu đắng Mục đích đề tài nghiên cứu cách hệ thống điều chế cao chuẩn hóa DHCĐ có hàm lượng hoạt chất cao giúp giảm khối lượng thành phẩm chứa cao Do đó, việc đánh giá lựa chọn thơng số quy trình dựa hàm lượng phần trăm cao dược liệu mang tính khoa học thể xác chất lượng cao cần nghiên cứu Cao dược liệu 19 sử dụng để bào chế thành phẩm thuốc dùng cho người, dung mơi sử dụng phải gây độc cho thể người Đồng thời, với quy mô sản xuất cơng nghiệp dung mơi chiết xuất sử dụng thường dung môi rẻ tiền, thân thiện với mơi trường để giảm chi phí xử lý chất thải mơi trường Theo khảo sát tổng hàm lượng PLT HPL ethanol 30% cao nhất, dung môi cần lựa chọn chiết cao khô DHCĐ quy mô sản xuất công nghiệp Dung môi sẽ hiệu kinh tế an tồn lao động sản xuất 4.3.3 Tiêu chuẩn hóa cao khơ Diệp hạ châu đắng DĐVN V có chuyên luận dược liệu DHCĐ cao đặc DHCĐ Trong đó, tiêu định tính dùng dược liệu đối chiếu xác định chất điểm PLT SKLM, tiêu định lượng xác định hàm lượng PLT dựa vào CĐC PLT HPLC Việc xây dựng tiêu định tính định lượng dựa vào chất chất có hoạt tính sinh học DHCĐ không PLT HPL, mà cịn có NRT NTT NRT NTT có tác dụng dược lý tốt bệnh lý về gan Điều có ý nghĩa thiết thực góp phần ổn định hàm lượng hoạt chất nguồn nguyên liệu đưa vào sản xuất thành phẩm, tránh trường hợp thành phẩm thuốc không đạt hàm lượng hoạt chất mong muốn Cho nên, xây dựng tiêu định tính phải có hoạt chất cần thiết Xây dựng tiêu định lượng dựa hoạt chất PLT HPL phù hợp với điều kiện thực tế nước ta, tất sở sản xuất hoặc đơn vị kiểm nghiệm có thiết bị HPLC đều làm tiêu Mức chất lượng cao khô dược liệu đưa dựa kết kiểm nghiệm lô nguồn dược liệu nên mức chất lượng chưa thể tính đại diện cho nhiều nguồn dược liệu khác tùy thuộc vào vùng thổ nhưỡng, thời gian thu hái, cách chế biến dược liệu, Tuy nhiên, mức chất lượng cao dược liệu nêu đề tài sẽ nguồn 20 tham khảo để nhà sản xuất qui định tiêu chuẩn chấp nhận riêng cho tiêu chất lượng tùy thuộc vào nguồn dược liệu cung cấp 4.3.4 Điều chế cao giàu lignan dùng làm cao đối chiếu Diệp hạ châu đắng Hiện nay, chuyên luận dược liệu USP hay EP người ta dùng cao chuẩn (Herbal reference standard extract) để đánh giá dược liệu Sau tiến hành SKLM HPLC cao chuẩn USP, thành phần cao chủ yếu lignan, hợp chất nhóm khác khơng có Do đó, từ mẫu cao ethanol 96% chọn quy mô PTN, khảo sát dung mơi chiết theo hướng làm giàu nhóm lignan, loại tạp nhiều Từ kết SKLM HPLC, n-hexan cho hàm lượng lignan cao loại nhiều tạp phân cực Chọn n-hexan để chiết phân đoạn lignan từ cao ethanol 96 % Sau chiết với n-hexan, phân đoạn thu chứa nhiều tạp: chất béo, chất màu… Do đó, tiến hành tinh chế phân đoạn sắc ký cột chân không để loại tạp, thu phân đoạn giàu lignan Phân đoạn giàu lignan thu có hàm lượng PLT HPL cao nhiều so với cao chuẩn USP Vì vậy, tiến hành điều chỉnh hàm lượng hoạt chất (theo HPL) tương đương với cao chuẩn USP Tá dược thêm vào để điều chỉnh hàm lượng Tá dược chọn phải đạt yêu cầu trơ với lignan, khơng làm vi kh̉n nấm mốc phát triển, có khả hút ẩm, có tính trơ Do đó, silica dioxyd chọn thêm vào lượng để làm tá dược Cao sau điều chế đánh giá chất lượng đạt độ lặp lại ổn định Tuy nghiên cứu dừng lại việc đóng lọ, dán nhãn tạm, chưa đánh giá so sánh liên phịng thí nghiệm để dùng làm cao đối chiếu theo qui định WHO ASEAN 4.4 Đánh giá số thông số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng 4.4.1 Xây dựng thẩm định qui trình định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin niranthin huyết tương thỏ 21 Đề tài xây dựng quy trình định lượng đồng thời PLT, HPL NRT huyết tương thỏ phương pháp LC-MS/MS dựa theo tài liệu công bố thẩm định phương pháp theo hướng dẫn US-FDA, EMA DĐVN V Hiện nay, công trình nghiên cứu cơng bố đề cập định lượng lignan huyết tương chuột, nay, chưa có nghiên cứu xác định nồng độ lignan huyết tương thỏ 4.4.2 Đánh giá số thơng số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng Một số công trình nghiên cứu về sinh khả dụng hợp chất lignan loài chuột Tuy nhiên, nghiên cứu về sinh khả dụng hợp chất động vật thử nghiệm khác chưa Do vậy, đề tài thực thỏ, loài động vật bậc cao chuột, để từ có nhìn tổng quan về sinh khả dụng hợp chất lignan DHCĐ Kết thực nghiệm cho thấy, thông số dược động học sau cho thỏ uống, lignan phyllanthin, hypophyllanthin niranthin nhanh chóng hấp thu nồng độ đỉnh (Cmax) đạt tương ứng 14,62  1,88; 5,91  0,82 4,41  0,45 ng/mL Tmax tương ứng 0,24; 0,26 0,24 giờ; Tuy nhiên, lignan nhanh chóng thải trừ khỏi thể, thời gian bán thải (T1/2) tương ứng 1,78; 1,17; 1,41 Từ thông số dược động học cho thấy hoạt chất cao DHCĐ thấp thu kém, điều hoàn toàn phù hợp với tài liệu công bố Đề tài dừng lại bước đầu việc xác định thông số dược động học PLT, HPL NRT sau thỏ uống cao khơ DHCĐ ch̉n hóa dùng làm nguyên liệu sản xuất thành phẩm dạng rắn Việc nghiên cứu sinh khả dụng lignan đề nghị sẽ tiếp tục nghiên cứu chuyên sâu với mục đích cải thiện hấp thu đường uống góp phần tham khảo hỗ trợ giúp xác định liều uống cho chế phẩm dạng viên lưu hành thị trường Việt Nam nhằm tăng hiệu điều trị 22 chế phẩm từ dược liệu Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum et Thonn KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, luận án hoàn thành nội dung nghiên cứu đạt tất mục tiêu đề ban đầu Các kết nghiên cứu đạt sau: Chiết xuất, phân lập, tinh chế xác định cấu trúc, độ tinh khiết chất phân lập (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) Từ 60 g cao dicloromethan chiết xuất từ kg bột dược liệu Diệp hạ châu đắng phân lập hợp chất lignan có độ tinh khiết lớn 95% gồm: 1730 mg phyllanthin, 400 mg hypophyllanthin, 190 mg niranthin, 250 mg nirtetralin 60 mg phyltetralin Xây dựng liệu phổ nghiệm gồm phổ UV, IR, MS, NMR hợp chất lignan phân lập gồm: phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin phyltetralin Thiết lập chất đối chiếu hợp chất chiết từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) Trong hợp chất phân lập có hợp chất đủ khối lượng đạt độ tinh khiết để thiết lập chất đối chiếu gồm: phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin nirtetralin Do hợp chất phyllanthin thiết lập chất đối chiếu [3] nên luận án thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin niranthin Đối với nirtetralin xác định độ tinh khiết để ứng dụng định lượng lignan Diệp hạ châu đắng đề tài Thiết lập hợp chất chiết từ dược liệu Diệp hạ châu đắng gồm: hợp chất hypophyllanthin niranthin đạt yêu cầu dùng làm chất đối chiếu tiêu chuẩn sở để đánh giá chất lượng; hợp chất nirtetralin xác định độ tinh khiết sắc ký dùng làm chất đối chiếu phịng thí nghiệm Quy trình thiết lập chất đối chiếu tuân theo hướng dẫn WHO 23 ASEAN Điều chế xây dựng tiêu chuẩn cao khô Diệp hạ châu đắng Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời lignan: phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin nirtetralin phương pháp HPLC với cột C18, đầu dò PDA, đẳng dòng Quy trình định lượng đạt yêu cầu tiêu thẩm định về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ đúng theo hướng dẫn ICH Xác định điều kiện chiết cao thích hợp cho quy mơ phịng thí nghiệm với dung mơi ethanol 96% quy mô pilot với dung môi ethanol 30% cho hàm lượng chất lignan cao so với dung mơi chiết khác Điều có ý nghĩa thiết thực, mang lại hiệu kinh tế, an tồn cho người khơng gây độc hại mơi trường Xây dựng quy trình điều chế tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng Xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao khô Diệp hạ châu đắng đáp ứng chất lượng về: tiêu, mức chất lượng, phương pháp thử theo qui định Dược điển Việt Nam Dược điển Mỹ Ứng dụng phương pháp định lượng đồng thời lignan: phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin nirtetralin phương pháp HPLC mẫu dược liệu cao chiết Diệp hạ châu đắng Ứng dụng xây dựng quy trình điều chế đánh giá chất lượng cao Diệp hạ châu đắng giàu lignan dùng làm cao đối chiếu đạt yêu cầu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm Đánh giá số thông số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời lignan: phyllanthin, hypophyllanthin niranthin huyết tương thỏ phương pháp LC-MS/MS với chất chuẩn nội diazepam, cột C18, đẳng dòng, đầu dò khối phổ ESI (+) chế độ đo MRM, xử lý mẫu chiết 24 lỏng - lỏng đạt yêu cầu tiêu thẩm định về tính đặc hiệu, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính, độ xác, độ đúng, hiệu suất chiết, ảnh hưởng nền mẫu, lượng mẫu tồn dư độ ổn định theo hướng dẫn US-FDA, EMA DĐVN V Bước đầu nghiên cứu số thông số dược động học Cmax, AUC, Tmax, T1/2 cho thỏ uống cao chuẩn hóa Diệp hạ châu đắng (hàm lượng phyllanthin 18,3 mg/g cao) với liều uống mg phyllanthin/kg cân nặng ghi nhận kết thông số dược động học biểu thị tốc độ mức độ hấp thu chất phyllanthin, hypophyllanthin niranthin huyết tương thỏ KIẾN NGHỊ Các kết đạt nêu sở khoa học để thực hướng nghiên cứu Một số kiến nghị sau: - Tiếp tục tối ưu hóa điều kiện để chiết xuất, phân lập, tinh chế hợp chất lignan: nirtetralin phyltetralin đánh giá chất lượng so sánh liên phịng thí nghiệm dùng làm chất đối chiếu - Đề nghị tiến hành xây dựng “Chuyên luận cao khô Diệp hạ châu đắng” cho Dược điển Việt Nam lần xuất tới - Theo chuyên luận Phyllanthus amarus USP 40, cao chuẩn Phyllanthus amarus với sắc ký đồ đối chiếu lô cao chuẩn Phyllanthus amarus dùng để định tính nên đề nghị tiếp tục nghiên cứu đồng lô đánh giá chất lượng so sánh liên phịng thí nghiệm cao giàu lignan điều chế để dùng làm cao đối chiếu ứng dụng cho định tính hợp chất lignan có dược liệu chế phẩm chứa Diệp hạ châu đắng - Tiếp tục nghiên cứu để cải thiện sinh khả dụng chế phẩm từ Diệp hạ châu đắng ... hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn. ) - Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn. ) - Điều chế. .. tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn. ) - Đánh giá số thông số dược động học cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn. )... 50% Cao ethanol 60% Cao ethanol 70% Cao nước Cao giàu lignan điều chế PLT (%) 1,4 5 0,8 3 1,1 7 0,9 1 0,7 7 0,1 8 8,3 7 HPL (%) 0,5 2 0,3 0 0,4 3 0,3 2 0,2 8 0,0 4 0,9 1 NRT (%) 0,5 9 0,4 0 0,5 9 0,4 3 0,3 8 0,0 4