giang thị minh anh tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 2 methoxy n phenylbenzamid mới mang khung benzimidazol

Novobiocin và deguelin là hai hoạt chất tự nhiên cho thấy tác dụng ức chế miền đầu C và thể hiện những ưu điểm so với các chất ức chế miền đầu N của HSP90 như không gây ra phản ứ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

GIANG THỊ MINH ANH

TỔNG HỢP VÀ

THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ

CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

2-METHOXY-N-PHENYLBENZAMID MỚI

MANG KHUNG BENZIMIDAZOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

GIANG THỊ MINH ANH

TỔNG HỢP VÀ

THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ

CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

2-METHOXY-N-PHENYLBENZAMID MỚI

MANG KHUNG BENZIMIDAZOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ

BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 8720202

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Công Trường

PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải

HÀ NỘI 2024

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các đồng nghiệp, các em tại phòng thí nghiệm, gia đình và bạn

bé

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc với PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải và TS Nguyễn Công Trường đã tận tâm chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại Bộ môn Hóa hữu cơ - trường Đại học Dược Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Đức Vịnh, khoa Dược lý – Dược Lâm sàng

đã hỗ trợ trong quá trình đo tác dụng sinh học của các chất và xin được cảm ơn ThS Nguyễn Nữ Huyền My, ThS Đoàn Minh Sang cùng các thầy cô giáo, và các em sinh viên tại phòng nghiên cứu đã hỗ trợ nhiệt tình trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Học viên

Giang Thị Minh Anh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về HSP90 3

1.1.1 Cấu trúc và chức năng 3

1.1.2 Cơ chế hoạt động 4

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động của HSP90 4

1.1.4 Vị trí liên kết của miền đầu C với các chất ức chế 6

1.1.5 Phân loại 7

1.2 Các chất ức chế HSP90 8

1.2.1 Các chất ức chế miền đầu N và nhược điểm 8

1.2.2 Các chất ức chế chọn lọc isoform 10

1.2.3 Các chất ức chế miền đầu C 10

1.3 Tổng quan về khung benzimidazol 17

1.3.1 Giới thiệu 17

1.3.2 Khung benzimidazol trong các chất ứng chế ung thư 18

1.4 Các phương pháp tổng hợp khung benzimidazol 19

1.4.1 Phản ứng ngưng tụ đóng vòng của o-phenyldiamin với các dẫn xuất acid carboxylic 19

1.4.2 Phản ứng ngưng tụ từ o-phenylendiamin hoặc dẫn chất o-phenylendiamin với bromo cyanid 20

1.4.3 Phản ứng ngưng tụ từ o-phenylendiamin hoặc các dẫn chất với aldehyd

21

1.5 Các phương pháp tổng hợp liên kết amid giữa acid carboxylic và amin 22

1.5.1 Tổng hợp gián tiếp từ acid carboxylic thông qua hoạt hóa tạo thành acyl halogenid 22

1.5.2 Tổng hợp từ aldehyd 23

1.5.3 Tổng hợp amid thông qua este 23

1.5.4 Tổng hợp trực tiếp bằng tác nhân ghép đôi EDC 24

1.6 Định hướng thiết kế cấu trúc 25

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nguyên liệu 27

2.2 Thiết bị, dụng cụ và phần mềm 27

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 28

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 34

3.1 Dự đoán tương tác của các chất với trung tâm hoạt động đầu C của HSP90 34 3.2 Hóa học 35

3.2.1 Tổng hợp hóa học 35

3.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết 47

3.2.3 Khẳng định cấu trúc 48

3.3 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 53

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 54

4.1 Dự đoán tương tác của các chất với trung tâm hoạt động đầu C của HSP90 54 4.2 Tổng hợp hóa học 56

4.2.1 Các phản ứng tổng hợp các acid trung gian 56

4.2.2 Các phản ứng tổng hợp các amin trung gian 58

4.2.3 Phản ứng tổng hợp các chất mục tiêu (VIII.1-6) 61

4.3 Khẳng định cấu trúc 63

4.3.1 Phổ hồng ngoại 63

4.3.2 Phổ khối lượng 65

4.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 66

4.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR 69

4.4 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư 71

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75

5.1 Kết luận 75

5.1.1 Về tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc 75

5.1.2 Thử hoạt tính sinh học 75

5.2 Kiến nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

PHỤ LỤC 85

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

4T1 Tế bào ung thư vú

ACN acetonitril

ATP adenosine triphosphate

dương tính)

Cancer)

CDI 1'-carbonyldiimidazole

CTD Miền đầu C của phân tử HSP90

h hextet

cancer)

HSP Protein sốc nhiệt

HSR Phản ứng sốc nhiệt

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectrometry)

J Hằng số tương tác (Hz)

MD Miền giữa của phân tử HSP90

MDA-MB-231 Dòng tế bào ung thư vú bộ ba âm tính (Triple-negative Breast

NTD Miền đầu N của phân tử HSP90

PPA acid polyphosphoric

SAR Mối liên quan cấu trúc – tác dụng

SKLM Sắc ký lớp mỏng

t o nc Nhiệt độ nóng chảy

TLC Sắc ký lớp mỏng

TPR tetratricopeptid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chất ức chế miền đầu N của HSP90 được đưa vào thử nghiệm lâm

sàng (N/A: không có thông tin) 9

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu 27

Bảng 3.1 Kết quả năng lượng liên kết giữa các dẫn chất được thiết kế và protein HSP90 thông qua docking 34

Bảng 3.2 Các thông số về cảm quan, khối lượng và hiệu suất của 6 dẫn chất tổng hợp được 47

Bảng 3.3 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (To nc) của 6 dẫn chất tổng hợp được 48

Bảng 3.4 Dữ liệu phân tích phổ hồng ngoại của 6 dẫn chất tổng hợp được 48

Bảng 3.5 Dữ liệu phân tích phổ khối lượng của 6 dẫn chất tổng hợp được 49

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của 6 dẫn chất tổng hợp được 50

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của 6 dẫn chất tổng hợp được 52

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư trên dòng tế bào MDA-MB-231 và A459 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc homodimer của HSP90 (NTD: miền đầu N; CTD: miền đầu C;

MD: miền giữa) [8] 3

Hình 1.2 Tác dụng của các chất ức chế HSP90 6

Hình 1.3 Kết quả blind docking của (A) Novobiocin, (B) A4 và (C) DHN2 6

Hình 1.4 Geldanamycin (1), 17-AAG (2) và 17-DMAG (3) 8

Hình 1.5 Radicicol và dẫn chất của nó 9

Hình 1.6 Một số chất ức chế isoform của HSP90 10

Hình 1.7 Cấu trúc của novobiocin 11

Hình 1.8 Novobiocin và các dẫn chất của nó 12

Hình 1.9 Deguelin và một số dẫn chất 13

Hình 1.10 Một số hợp chất kết hợp giữa novobiocin và deguelin 14

Hình 1.11 Mô hình liên kết phân tử của NCT-50 với HSP90 ở trạng thái mở 15

Hình 1.12 Model docking của NCT-80 trong túi liên kết ATP của HSP90 16

Hình 1.13 Model docking phân tử NCT-58 17

Hình 1.14 Một số sản phẩm dẫn chất benzimidazol được bán trên thị trường 18

Hình 1.15 Dẫn chất benzimidazol có hoạt tính ức chế ADN Gyrase 19

Hình 1.16 Công thức của EDC và HOBt 25

Hình 2.1 Công thức chung của các dẫn chất N-phenylbenzamid có chứa khung benzimidazol mới 29

Hình 4.1 Kết quả docking của NCT-58 55

Hình 4.2 Kết quả docking của VIII.4 56

Hình 4.3 Cơ chế chuyển liên kết C=O thành liên kết C-O trong quá trình đo phổ IR 64

Hình 4.4 Phổ hồng ngoại của dẫn chất VIII.1 65

Hình 4.5 Phổ khối lượng của dẫn chất VIII.1 65

Hình 4.6 Cách đánh số của khung cấu trúc chung có R = propyl 66

Hình 4.7 Cách đánh số của khung cấu trúc chung có R = benzyl 66

Hình 4.8 Phổ 1H-NMR của dẫn chất VIII.1 69

Hình 4.9 Phổ 13C-NMR của chất VIII.1 70

Hình 4.10 Vị trí đỉnh doublet của C35 (d, 114,82, J = 22,7 Hz) và C37 (d, 115,23, J

= 20,2 Hz) trong phổ 13C-NMR của dẫn chất VIII.1 71 Hình 4.11 Kết quả docking của dẫn chất VIII.6 74

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Cơ chế hoạt động của HSP90 [13] 4

Sơ đồ 1.2 Cơ chế sinh HSR khi ức chế HSP90 ở người [13] 8

Sơ đồ 1.3 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất benzimidazol của Hoebrecker 19

Sơ đồ 1.4 Phản ứng ngưng tụ đóng vòng của o-phenylendiamin với các dẫn xuất acid carboxylic [64] 19

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp 2-arylbenzimidazol bằng công nghệ vi sóng [65] 20

Sơ đồ 1.6 Phản ứng o-phenylendiamin với các bromo cyanid 20

Sơ đồ 1.7 Phản ứng ngưng tụ từ o-phenylendiamin hoặc dẫn chất o-phenylendiamin với aldehyd 21

Sơ đồ 1.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất benzimidazol từ aldehyd và o-phenylendiamin 21

Sơ đồ 1.9 Cơ chế phản ứng ngưng tụ đóng vòng 2-aryl benzimidazol với tác nhân natri metabisulfit 21

Sơ đồ 1.10 Phản ứng ngưng tụ của o-phenylendiamin với aldehyd và xúc tác FeCl3/Al2O3 22

Sơ đồ 1.11 Tổng hợp 2-phenylbenzimidazol từ o-phenylendiamin bằng tác nhân natri bisulfit 22

Sơ đồ 1.12 Phản ứng tỏng hợp amid từ acid carboxylic và amin với tác nhân SOCl2 23

Sơ đồ 1.13 Quy trình chung của quá trình tổng hợp amid từ aldehyd 23

Sơ đồ 1.14 Quá trình tổng hợp amid từ aldehyd 23

Sơ đồ 1.15 Một số phản ứng tổng hợp amid từ este và amin 24

Sơ đồ 1.16 Phản ứng tạo liên kết amid sử dụng DCC [74] 24

Sơ đồ 1.17 Một phản ứng tạo liên kết amid sử dụng EDC [76] 25

Sơ đồ 1.18 Định hướng thiết kế cấu trúc các chất chống ung thư mới mang khung benzimidazol 26

Sơ đồ 2.1 Quy trình chung tổng hợp các chất mục tiêu 31

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng hợp các acid trung gian 35

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tổng hợp các amin trung gian 35

Sơ đồ 3.3 Tổng hợp các chất mục tiêu 36

Sơ đồ 3.4 Sơ đồ tổng hợp 4-((3-fluorobenzyl)oxy)-2-methoxybenzaldehyd (I.1) 36

Sơ đồ 3.5 Sơ đồ tổng hợp 4-((3-clorobenzyl)oxy)-2-methoxybenzaldehyd (I.2) 36

Sơ đồ 3.6 Tổng hợp 4-((3-bromobenzyl)oxy)-2-methoxybenzaldehyd (I.3) 37

Sơ đồ 3.7 Tổng hợp acid 4-((3-fluorobenzyl)oxy)-2-methoxybenzoic (II.1) 37

Sơ đồ 3.8 Sơ đồ tổng hợp acid 4-((3-clorobenzyl)oxy)-2-methoxybenzoic (II.2) 38

Sơ đồ 3.9 Sơ đồ tổng hợp acid 4-((3-bromobenzyl)oxy)-2-methoxybenzoic (II.3) 38 Sơ đồ 3.10 Tổng hợp 4-cloro-3-nitrobenzamid (III) 39

Sơ đồ 3.11 Tổng hợp 3-nitro-4-(propylamino)benzamid (IV.1) 39

Sơ đồ 3.12 Sơ đồ tổng hợp 3-nitro-4-(benzylamino)benzamid (IV.2) 40

Sơ đồ 3.13 Sơ đồ tổng hợp 3-amino-4-(propylamino)benzamid (V.1) 40

Sơ đồ 3.14 Sơ đồ tổng hợp 3-amino-4-(benzylamino)benzamid (V.2) 41

Sơ đồ 3.15 Sơ đồ tổng hợp 2-(4-nitrophenyl)-1-propyl-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VI.1) 41

Sơ đồ 3.16 Sơ đồ tổng hợp 1-benzyl-2-(4-nitrophenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VI.2) 42

Sơ đồ 3.17 Sơ đồ tổng hợp 2-(4-aminophenyl)-1-propyl-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VII.1) 42

Sơ đồ 3.18 Sơ đồ tổng hợp 2-(4-aminophenyl)-1-benzyl-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VII.2) 43

Sơ đồ 3.19 Sơ đồ tổng hợp chất mục tiêu 2-(4-(4-((3-fluorobenzyl)oxy)-3-methoxybenzamido)phenyl)-1-propyl-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VIII.1) 44

Sơ đồ 3.20 Sơ đồ tổng hợp chất mục tiêu 2-(4-(4-((3-clorobenzyl)oxy)-3-methoxybenzamido)phenyl)-1-propyl-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VIII.2) 44

Sơ đồ 3.21 Sơ đồ tổng hợp chất mục tiêu 2-(4-(4-((3-bromobenzyl)oxy)-3-methoxybenzamido)phenyl)-1-propyl-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VIII.3) 45

Sơ đồ 3.22 Sơ đồ tổng hợp chất mục tiêu

1-benzyl-2-(4-(4-((3-fluorobenzyl)oxy)-3-methoxybenzamido)phenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VIII.4) 45

Sơ đồ 3.23 Sơ đồ tổng hợp chất mục tiêu 1-benzyl-2-(4-(4-((3-clorobenzyl)oxy)-3-methoxybenzamido)phenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VIII.5) 46

Sơ đồ 3.24 Sơ đồ tổng hợp chất mục tiêu 1-benzyl-2-(4-(4-((3-bromobenzyl)oxy)-3-methoxybenzamido)phenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VIII.6) 46

Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất trung gian số I 57

Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng oxy hóa Pinnick [80] 57

Sơ đồ 4.3 Cơ chế hình thành acyl clorid với tác nhân SOCl2 [81] 58

Sơ đồ 4.4 Cơ chế tổng hợp khung benzimidazol sử dụng tác nhân NaHSO3 [70] 61

Sơ đồ 4.5 Sơ đồ phản ứng tạo amid với xúc tác DCC hoặc EDC 62

Sơ đồ 4.6 Sơ đồ cơ chế phản ứng EDC Coupling 63

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đã và đang trở thành một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới cũng như tại Việt Nam Theo dữ liệu GLOBOCAN năm 2020, tại Việt Nam, ước tính có 182.563 ca mắc mới và 122.690 ca tử vong do ung thư, hiện

có 354.000 người 'sống chung' với ung thư [1] Trước tình hình đó, việc nghiên cứu

và phát triển các loại thuốc mới chống ung thư đang là chủ đề nghiên cứu hàng đầu ở Việt Nam và trên thế giới

Những thành tựu đột phá trong lĩnh vực sinh học, di truyền đã giúp con người phát hiện được các cơ chế bệnh sinh của ung thư cũng như những phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành và phát triển của khối u Do vậy, bên cạnh các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như phẫu thuật, xạ trị, hóa trị… các nhóm thuốc điều trị tại đích đang ngày càng được quan tâm và ưu tiên phát triển do những lợi ích rõ rệt trong việc cải thiện tiên lượng sống và giảm tác dụng không mong muốn Trong những năm gần đây, HSP90 được đánh giá là một trong những đích tác dụng tiềm năng trong điều trị ung thư [2], [3] HSP90 cần thiết trong cả việc tạo ra, duy trì

và phá hủy protein Các nghiên cứu cho thấy việc ức chế HSP90 là một phương pháp tiềm năng để ức chế sự sống sót, tăng sinh, xâm lấn và di chuyển của khối u [2] Nhiều chất ức chế HSP90 đã được báo cáo và cho thấy hiệu quả Các chất ức chế miền đầu N của HSP90 được phát hiện ra đầu tiên Một số dẫn chất đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng nhưng chưa hợp chất nào thành công ra thị trường do độc tính

và tác dụng phụ của chúng [4] Không dừng lại ở đó, các nghiên cứu cấu trúc protein HSP90 đã khám phá ra vị trí liên kết ATP mới tại miền đầu C [5] và mở ra con đường nghiên cứu các dẫn chất ức chế HSP90 mới Novobiocin và deguelin là hai hoạt chất

tự nhiên cho thấy tác dụng ức chế miền đầu C và thể hiện những ưu điểm so với các chất ức chế miền đầu N của HSP90 như không gây ra phản ứng sốc nhiệt Điều đó cho thấy tiềm năng trong việc tổng hợp các hợp chất mới dựa trên hai hợp chất này Bên cạnh đó, khung benzimidazol cũng cho thấy tiềm năng ức chế tế bào ung thư Do đó, nhóm nghiên cứu thực hiện nghiên cứu và tổng hợp một số hợp chất chống ung thư theo hướng hướng ức chế miền đầu C của HSP90 với đề tài “TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN

2

CHẤT 2-METHOXY-N-PHENYLBENZAMID MỚI MANG KHUNG BENZIMIDAZOL” với mục tiêu:

- Tổng hợp được 6 dẫn chất N-phenylbenzamid có chứa khung

benzimidazol mới theo hướng ức chế miền đầu C của HSP90

- Thử hoạt tính gây độc tế bào của 6 dẫn chất tổng hợp được trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và ung thư phổi A549

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về HSP90

1.1.1 Cấu trúc và chức năng

HSP90 là một protein chaperon quan trọng có chức năng duy trì độ cuộn, gấp chính xác của một nhóm các protein được gọi là các protein client [6], [7] Thông qua tương tác với các chất hỗ trợ hoạt động (protein co-chaperon) và các protein client, HSP90 điều chỉnh quá trình gấp, thoái hóa protein liên quan đến một số con đường truyền tín hiệu tế bào cũng như sự tăng sinh, sống sót và quá trình tự hủy của tế bào

Về mặt cấu trúc, HSP90 là một homodimer với mỗi monomer gồm 3 phần: đầu N (NTD) chứa vị trí liên kết ATP, phần giữa (MD) là nơi xảy ra liên kết tương tác

protein-protein và đầu C (CTD) chịu trách nhiệm cho quá trình dimer hóa [6] (hình

1.1) Đầu C chứa một vị trí liên kết nucleotit làm điều biến hoàn toàn hoạt động

ATPase trong NTD CTD sở hữu trình tự Met-Glu-Glu-Val-Asp (MEEVD) được bảo tồn tại điểm cuối để cung cấp các tương tác với các protein co-chaperon chứa tetratricopeptid lặp lại (TPR) [7] Những tương tác với các co-chaperon này rất quan trọng đối với việc điều chỉnh và tiến triển của chu trình gấp protein mới sinh của HSP90

Hình 1.1 Cấu trúc homodimer của HSP90 (NTD: miền đầu N; CTD: miền đầu C;

MD: miền giữa) [8]

4

1.1.2 Cơ chế hoạt động

Cơ chế của HSP90 đến nay vẫn chưa được xác định chính xác Các nghiên cứu cho rằng chu trình bắt đầu khi phức hợp HOP (protein tổ chức HSP90-HSP70) chuyển một polypeptid mới sinh từ HSP70 sang HSP90 thông qua liên kết với miền đầu C [9][10] như được hiển thị trong sơ đồ 1.1 Các protein client mới sinh được chuyển đến HSP90 thông qua việc hình thành một phức hợp với HSP70 và HSP40 Sau khi vận chuyển, immunophilin và các protein co-chaperon có thể tương tác với HSP90, hình thành một phức hợp protein phức tạp và tập hợp lại để gấp các protein client mới sinh thành các cấu trúc 3 chiều của chúng [9], [11] Sự liên kết và thủy phân ATP tại đầu N với sự tham gia của các co-chaperon (p23) và chất hoạt hóa Aha1 của ATPase thúc đẩy các protein client trưởng thành [12] Sau khi giải phóng các protein client

đã được gấp đúng cách, phức hợp protein HSP90 phân tách và HSP90 tiếp tục lặp lại chu trình gấp protein

Sơ đồ 1.1 Cơ chế hoạt động của HSP90 [13]

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động của HSP90

HSP90 là protein chaperon của trên 400 protein client [14] HSP90 tạo điều kiện cho các tương tác protein-protein và tham gia vào quá trình truyền tín hiệu tế bào cũng như phản ứng với stress [15][16] Các tế bào ung thư sử dụng cơ chế này để bảo

vệ các protein ung thư bị đột biến và biểu hiện quá mức khỏi bị sai lệch và bị thoái

số chất co-chaperon, bao gồm p50/Cdc37 [20][26], protein tổ chức HSP90 (HOP/Sti1, p23, Aha1 và HSP70), và nhiều loại immunophilin cần HSP90 để hoạt động [11][13][27]

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng sự biểu hiện của HSP90 ở tế bào ung thư cao gấp 2 đến 10 lần so với tế bào bình thường và sự biểu hiện quá mức của HSP90 đã được tìm thấy ở nhiều tế bào khối u bao gồm vú, phổi, đại trực tràng, buồng trứng, nội mạc tử cung, thực quản, xương, ung thư tiết niệu và tuyến tiền liệt [15][22] Người ta cũng tiết lộ rằng biểu hiện cao của HSP90 có liên quan đến tiên lượng xấu trong điều trị lâm sàng Biểu hiện HSP90 là yếu tố quyết định tỷ lệ sống sót của bệnh ung thư vú phụ thuộc hormone và protein kinase [23] [24]

Nghiên cứu của Kamal và cộng sự chỉ ra rằng HSP90 trong tế bào ung thư tồn tại dưới dạng phức hợp, thúc đẩy hoạt động ATPase của HSP90 và làm tăng ái lực của HSP90 với chất ức chế của nó gấp 100 lần [22] Moulick và cộng sự [25] cũng tuyên

bố rằng các phức hợp HSP90 trong khối u có khác biệt về mặt sinh học Các HSP90

đó tồn tại dưới dạng một phức hợp protein phức tạp liên kết với các protein client và các co-chaperon thay vì phức hợp homodimer không hoạt động nằm trong mô bình thường Phức hợp heteroprotein này thể hiện ái lực cao hơn đáng kể đối với ATP và các phối tử liên kết cạnh tranh với ATP Do đó, HSP90 trong tế bào ung thư đã được chứng minh là thể hiện ái lực cao hơn đối với các chất ức chế so với các HSP90 trong

tế bào bình thường [21] Khi chất ức chế HSP90 liên kết với đầu N hoặc C, protein client không trưởng thành mà bị thoái hóa thông qua con đường ubiquitin-proteosome [26][27]

6

Hình 1.2 Tác dụng của các chất ức chế HSP90

1.1.4 Vị trí liên kết của miền đầu C với các chất ức chế

Sgobba và các cộng sự đã chỉ ra rằng: tồn tại 1 vị trí liên kết với phân tử ATP ở vùng đầu C là đích đến của các chất ức chế miền đầu C của HSP90 [5] Do chưa có các cấu trúc tinh thể giữa các chất ức chế và vị trí liên kết này nên hầu hết các nghiên cứu đều đưa ra các vị trí giả định ở vùng đầu C có thể liên kết với chất ức chế

Hình 1.3 Kết quả blind docking của (A) Novobiocin, (B) A4 và (C) DHN2 Các túi liên kết được tìm ra bao gồm: pck1a (màu hồng nhạt), pck1b (màu tím), pck2 (màu

xanh lá), pck3 (màu xanh dương) [28]

7

Nghiên cứu docking của Sgobba và các cộng sự sử dụng chương trình AutoLigand

và SiteMap [28] Nghiên cứu này đã chỉ ra 4 túi liên kết giả định trong miền đầu C của HSP90 gồm có pck1a, pck1b, pck2 và pck3 [28] Đối với túi liên kết pck1b, phần đường và vòng coumarin liên kết với Lys631, Lys632, Lys576 và Glu584, Ala629 và Tyr627 tạo tương tác kỵ nước với vòng coumarin, benzamid, và isopentenyl [28] Trong túi liên kết pck2, vòng coumarin tạo tương tác kỵ nước với Phe507, phần cấu trúc đường tạo tương tác với Thr495, Thr607 và Ala608.[28]

Ở túi liên kết pck3, vòng coumarin tương tác với các phần kỵ nước (Tyr604 và Trp606), chuỗi benzamid và isopentenyl neo vào túi phía trên thông qua tương tác với Val544 [28]

Dựa vào đó, các nhà nghiên cứu cho rằng vùng liên kết có khả năng cao nằm ở vùng pck2 và hoặc có thể là vùng pck1 [28]

1.1.5 Phân loại

Họ HSP90 bao gồm bốn dạng đồng phân xuất hiện ở các vị trí khác nhau trong tế bào HSP90α và HSP90β nằm trong tế bào chất và nhân [29][30], GRP94 xuất hiện trong mạng lưới nội chất [31], và TRAP-1 chủ yếu nằm trong ty thể, cũng hiện diện trong mạng lưới nội chất [32]

- HSP90α và HSP90β là các dạng đồng phân được biểu hiện rộng rãi nhất và chủ yếu nằm trong tế bào chất Chúng tham gia vào quá trình truyền tín hiệu tế bào, chuyển hóa năng lượng và duy trì khả năng sống của tế bào [29][33] Ngoài ra, HSP90α được tiết ra ngoại bào đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong

sự xâm lấn và di chuyển của một số loại ung thư được thử nghiệm in vitro và in vivo

[29], cho thấy rằng việc chặn HSP90α là một phương pháp hợp lý để kiểm soát ung thư

- GRP94 hoạt động như “người giám sát chất lượng” của các protein được tiết

ra và protein màng GRP94 nhận biết và liên kết với các protein bị sai lệch, cố gắng sửa chữa chúng, ngăn chặn sự thoái hóa của chúng trong tế bào chất [31]

- TRAP-1 cần thiết cho cân bằng nội môi của ty thể và đã được chứng minh là

có liên quan đến việc điều chỉnh trạng thái oxy hóa khử của ty thể và hạn chế chuyển hóa năng lượng [32]

8

Tất cả bốn dạng đồng phân đều có mức độ tương tự cao về trình tự ở đầu N, do đó các vị trí liên kết ATP trên đầu N là những điểm nhắm mục tiêu đầu tiên mà các nhà nghiên cứu đã tập trung vào [6]

1.2 Các chất ức chế HSP90

Các chất ức chế HSP90 được chia làm ba loại bao gồm: các chất ức chế miền đầu

N, các chất ức chế miền đầu C và các chất ức chế chọn lọc isoform

1.2.1 Các chất ức chế miền đầu N và nhược điểm

Geldanamycin (GDA) (hình 1.4) được phát hiện là chất ức chế HSP90 vào đầu

những năm 1990 [34], liên kết với đầu N tại vị trí liên kết ATP, cạnh tranh với ATP, làm gián đoạn hoạt động ATPase và ngăn chặn sự liên kết của đầu N với các protein client, dẫn đến sự suy giảm các protein sinh ung thư và do đó, ngăn chặn một số quá trình của tế bào [35] Tuy nhiên, GDA tạo ra tác dụng phụ nghiêm trọng [36] Nhưng, người ta đã phát hiện vị trí C-17 có vai trò quan trọng trong tác dụng của GDA cũng như độc tính của nó Và từ đó 17-AAG [36], 17-DMAG [37] và một số dẫn chất khác

đã được phát triển

Hình 1.4 Geldanamycin (1), 17-AAG (2) và 17-DMAG (3)

Tuy nhiên, các dẫn chất này đã không được đưa vào thử nghiệm lâm sàng do độc tính ở gan, mắt, tim… gây ra bởi phản ứng sốc nhiệt (HSR) (Sơ đồ 1.2) [38]

Sơ đồ 1.2 Cơ chế sinh HSR khi ức chế HSP90 ở người [13]

9

Phản ứng này làm tăng số lượng các protein chaperon, từ đó, ngăn ngừa hoặc đảo ngược lại quá trình gấp cuộn sai của protein, làm giảm tác dụng của các chất ức chế

Một chất tự nhiên khác được xác định có tác dụng ức chế miền đầu N của HSP90

là Radicicol (RD) (hình 1.5) [40] RD có chứa phần resorcinol hoạt động theo cách

tương tự như vòng adenin của ATP, là cấu trúc cần thiết để ức chế HSP90 Từ cấu

trúc vòng này, một số dẫn chất ức chế khác đã ra đời như STA-9090 (hình 1.5) có ái

lực cao với HSP90, làm bất hoạt HSP90 ở nồng độ thấp 10nM, giảm độc tính [41] Tuy nhiên, chất này cũng một số dẫn chất khác cũng đã thất bại trong thử nghiệm lâm sàng do không thể hiện lợi ích trong điều trị

3 (Radicicol) 4 (STA-9090)

Hình 1.5 Radicicol và dẫn chất của nó

Do các chất ức chế đầu N của HSP90 gây nhiều tác dụng phụ nên việc ức chế đầu

N cho đến nay đã không còn là mục tiêu cho việc tổng hợp các chất ức chế HSP90 [42]

Bảng 1.1 Một số chất ức chế miền đầu N của HSP90 được đưa vào thử nghiệm lâm

sàng (N/A: không có thông tin)

10

1.2.2 Các chất ức chế chọn lọc isoform

Như đã đề cập, họ HSP90 của động vật có vú gồm 4 dạng đồng phân là HSP90α, HSP90β, GRP94 và TRAP1 Trong số này, HSP90α và HSP90β là các dạng đồng phân được biểu hiện nhiều nhất và chủ yếu nằm trong tế bào chất [29], [33] Dạng HSP90α ngoại bào là chìa khóa cho sự xâm lấn và di chuyển của tế bào ung thư [29] GRP94 hiện diện trong mạng lưới nội chất và “kiểm soát chất lượng” của một tập hợp nhỏ protein Nó nhận biết và liên kết với các protein bị gấp sai, sửa chữa và tái gấp các protein nói trên Các chất ức chế GRP94 ngăn chặn các quá trình kể trên, dẫn đến sự chuyển vị trí của các protein bị gấp sai này sang tế bào chất và khiến chúng bị thoái hóa sau đó [31] Bên cạnh đó, các vị trí gắn Ca2+ trên GRP94 ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của khối u [44] TRAP1, nằm trong ty thể, đóng một vai trò quan trọng trong cân bằng nội môi của ty thể Nó liên quan đến việc điều chỉnh trạng thái oxy hóa khử của cơ quan và làm gián đoạn quá trình chuyển hóa năng lượng của

tế bào ung thư

Một số hợp chất ức chế isoform của HSP90 như AT13387 hay PU-H71 [43]

Hình 1.6 Một số chất ức chế isoform của HSP90

1.2.3 Các chất ức chế miền đầu C

a Novobiocin và các dẫn chất

Chất ức chế miền đầu C của HSP90 đầu tiên được phát hiện là novobiocin [45], một kháng sinh coumarin, liên kết với vị trí liên kết nucleotid dị lập thể trong CTD,

vị trí này chỉ khả dụng sau khi ATP liên kết với NTD [46] Novobiocin có khả năng ức chế tế bào ung thư yếu (IC50 là 700µM trên dòng tế bào SkBr3) nhưng vẫn ức chế một số quá trình phát triển của tế bào ung thư mà không gây ra phản ứng sốc nhiệt

11

(HSR) [47] Novobiocin bao gồm 3 phần riêng biệt có thể thực hiện các sửa đổi: chuỗi bên benzamid, lõi coumarin và đường noviose [48]

Hình 1.7 Cấu trúc của novobiocin

Theo nghiên cứu của Xiao Ming và các cộng sự, khi cắt ngắn chuỗi bên N-acyl,

loại nhóm thế 4-hydroxy và nhóm carbamoyl trên phần phụ của noviose, gây ra sự thoái hóa của các protein client phụ thuộc HSP90 ở nồng độ thấp hơn ~70 lần so với novobiocin [49] Nghiên cứu này đã chứng minh rằng việc gắn phần phụ noviose vào

vị trí 7 và một liên kết amid ở vị trí 3 của vòng coumarin là cần thiết để ức chế HSP90 Các chất tương tự novobiocin đã được nghiên cứu và tổng hợp, từ đó, phát hiện thêm một số mối quan hệ cấu trúc – tác dụng (SAR), đồng thời cải thiện khả năng ức chế

miền đầu C của các hợp chất mới (hình 1.8) [19]

Khi nghiên cứu thay thế chuỗi bên amid, người ta thấy rằng khi các phân tử có

chuỗi amid bên lớn hơn thì tác động chống tăng sinh tế bào tăng lên [13] Chất KU174 (12) mang chuỗi bên amid cồng kềnh, có tác dụng chống tăng sinh tế bào ung thư

nhưng không gây ra HSR, đồng thời làm ức chế tương tác HSP90 – Aha1 và ức chế

hoạt động gấp nếp của các protein phụ thuộc HSP90 [50] KU174 (12) thể hiện hoạt động rộng rãi trên nhiều dòng tế bào ung thư Các tế bào được tiêm 0.1 µM KU174

trong 24 giờ cho thấy khả năng sống sót giảm phụ thuộc vào liều lượng, dao động từ 70-25%, trong khi đó, chất mẹ là novobiocin cho thấy khả năng tồn tại của tế bào ung

thư ~75% ở mức liều 500 µM, cho thấy KU174 biểu hiện hiệu lực tăng gấp 10-50 lần

so với phân tử gốc [50]

12

Hình 1.8 Novobiocin và các dẫn chất của nó

b Deguelin và các dẫn chất

Một chất ức chế miền đầu C khác là deguelin (13) Chất này là một rotenoid sinh

tổng hợp liên kết với vùng liên kết nucleotid trong miền đầu C của HSP90 và hình thành các tương tác chính với Ser677 và Lys615, được nghi ngờ là vị trí liên kết với

HSP90 [51] Liên kết của deguelin (13) với CTD dẫn đến sự thoái hóa của protein

client của HSP90 và yếu tố gây thiếu oxy (HIF-1α) [51] Deguelin làm mất ổn định các tương tác HIF-1α, ức chế sự tăng sinh và di căn của tế bào ở một số dòng tế bào

ung thư cả in vitro và in vivo Nó đã được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn chu

kỳ tế bào và gây chết tế bào trong các tế bào biểu mô phế quản ác tính ở người và ung thư phổi không tế bào nhỏ [52] Tuy nhiên, ở liều cao hơn, deguelin là chất gây độc thần kinh [51]

Sau các nghiên cứu SAR mở rộng của nhóm giáo sư Lee và các cộng sự, vào năm

2015, một dẫn xuất deguelin mới, L80 (14a) đã được phát triển nhằm chống lại ung thư phổi không tế bào nhỏ [53] (Hình 1.9) 14a không gây độc thần kinh, nhưng thể

hiện hoạt tính chống tăng sinh và chết theo chương trình mạnh mẽ, chống lại nhiều

dòng tế bào ung thư Ở in vivo, 14a thể hiện các hoạt tính chống khối u và chống tạo

mạch chống lại xenograft H1299 với IC50 nằm trong khoảng 1 – 10 µM [53] 14a ức

chế sự tăng sinh, hình thành mạch, di căn và giảm độc tính đối với các tế bào khỏe

mạnh so với deguelin 14a được cho là có tác dụng ức chế di căn trong bệnh ung thư

vú bộ 3 âm tính Khi thử nghiệm tác dụng gây độc tế bào trên các dòng tế bào

MDA-13

MB-231, 4T1, BT549 và Hs578T in vivo, 14a với nồng độ 0.2 - 20 µM, sau 48 - 72

giờ, ức chế đáng kể khả năng sống sót của các dòng tế bào kể trên (p < 0.05) [53]

Hình 1.9 Deguelin và một số dẫn chất

Các nghiên cứu tiếp theo đã tạo ra 14b (hình 1.9), gây ra sự suy giảm HIF-1α theo cách phụ thuộc vào liều lượng và cải thiện hoạt động chống tăng sinh so với 14a 14b

ức chế quá trình tạo mạch qua trung gian thiếu oxy trong tế bào nội mô vi mạch võng

mạc ở người (HRMEC) in vitro [25] Thử nghiệm gây độc tế bào trên dòng tế bào

H1299 cho thấy IC50 của 14b trong khoảng 1 – 10 µM [39]

So với 13, 14a và 14b đã mở dị vòng, gắn thêm nhóm chức este và dị vòng nitơ Từ 14a, các nhà nghiên cứu đã tổng hợp được 15 với mạch nhánh chứa dị vòng piperazin đồng thời loại bỏ nhóm este Điều này làm tăng độ tan của 15 so với 14a,

tạo ra cấu hình chữ T khi liên kết với túi liên kết nucleotid của đầu C thông qua liên

kết hydro và tương tác p – π [13] 15 cho thấy khả năng ức chế sự tăng sinh ác tính

của tế bào ung thư vú bộ 3 âm tính Khi đánh giá khả năng gây độc tế bào trên dòng

tế bào MDA-MB-231 cho thấy IC50 tương đối tốt, trong khoảng 2 – 5 µM [13]

Chất 18 được tổng hợp dựa trên 14a [54] Sự liên kết của 18 vào HSP90 làm gián

đoạn tương tác giữa HSP90 và co-chaperon, phức hợp protein HSP90-HSP70 (HOP)

14

và thể hiện hoạt tính kháng ung thư tốt đối với 3 loại ung thư phổi khác nhau (khối u

không tế bào nhỏ, khối u do KRAS và khối u PDX) trong in vivo [54]

c Các hợp chất kết hợp khung novobiocin và deguelin

Với sự thành công của các chất ức chế miền đầu C có nguồn gốc từ deguelin và novobiocin, tiềm năng của việc kết hợp các khung tạo ra một phân tử kết hợp duy nhất đang được tiếp tục nghiên cứu Chuỗi dẫn xuất deguelin và novobiocin ức chế miền đầu C của HSP90 đã được thiết kế và tổng hợp thông qua phép lai giữa cấu trúc của novobiocin và deguelin

Hình 1.10 Một số hợp chất kết hợp giữa novobiocin và deguelin

NCT-50 (19) (hình 1.10) thể hiện hoạt tính ức chế cao hơn và độc tính thấp hơn cả

novobiocin và deguelin, IC50 của NCT-50 trên dòng tế bào H1299 là 0.23 µM, thấp hơn rất nhiều so với các chất trước đó [55] NCT-50 thể hiện hoạt tính ức chế cả tế

bào ung thư phổi không tế bào nhỏ kháng hóa chất và chưa hóa trị, đồng thời ức chế chức năng của HSP90 bằng cách ổn định cấu trúc mở của homodimer Khi nghiên

cứu docking của phân tử này bằng chương trình Surflex-Dock, NCT-50 khớp với

khoang liên kết của HSP90, nằm ở khu vực trung tâm của vùng liên kết dimer hóa

(hình 1.11) [55] Nguyên tử oxy của nhóm acylamino tạo thành liên kết hydro với

chuỗi bên của Lys615 trong chuỗi A và oxy trong nhóm methoxy tạo thành liên kết hydro bổ sung với chuỗi bên của Ser677 (A) [55] Ngoài ra, vòng benzopyran của

NCT-50 tham gia vào liên kết π-cation với amin chuỗi bên của Lys615 Hai vị trí acid

amin này (Lys615 và Ser677) đã được xác nhận là các vị trí chính để liên kết ATP trong miền đầu cuối C của HSP90 bằng xét nghiệm liên kết ATP-agarose [28] trong các nghiên cứu trước đây Phần cấu trúc pyridine và benzen nằm trong vùng phân cực

15

và oxy trong nhóm methoxy trong vòng benzene tạo thành liên kết hydro với chuỗi bên Asn622 [55]

Hình 1.11 Mô hình liên kết phân tử của NCT-50 với HSP90 ở trạng thái mở Chuỗi

A được hiển thị bằng dải băng màu cam và chuỗi B là dải băng màu xanh lam Vùng hoạt động được hiển thị dưới dạng bản đồ hoạt tính tĩnh điện Các vùng màu

đỏ, xanh lam và trắng tương ứng với các vùng tích điện âm, tích điện dương và

trung tính NCT-50 được biểu hiện bằng cầu trúc màu vàng Các phần cấu trúc liên

liên kết của các acid amin được thể hiện bằng màu xám Các tương tác liên kết hydro được mô tả dưới dạng các đường đứt nét màu vàng và tương tác p -π được

mô tả dưới dạng các đường đứt nét màu xanh lá cây [55]

Chất tương tự có liên quan, NCT-80 (20) (hình 1.10), đã ức chế sự hoạt hóa của

STAT3 và làm gián đoạn tương tác giữa HSP90 và STAT3 được xác định bằng xét

nghiệm kích thích miễn dịch và pull-down [56] (một phương pháp in vitro nhằm xác

định tương tác vật lý giữa 2 hoặc nhiều protein)

Nghiên cứu docking sử dụng mô hình tương đồng về cấu trúc mở của homodimer

HSP90 ở người cho thấy NCT-80 rất phù hợp với miền đầu C của HSP90 (hình 1.12)

Hydro alpha trên vòng pyridine của NCT-80 hình thành liên kết hydro yếu với cả

nhóm carboxyl chuỗi bên của Glu611 và nhóm hydroxyl của Ser677 trong túi liên kết

ATP đầu C [56] Ngoài ra, NCT-80 tham gia vào hai tương tác với nhóm amino chuỗi

bên được proton hóa của Lys615 trong chuỗi A của HSP90: tương tác π-cation bởi

vòng benzen trung tâm và liên kết hydro bởi oxy carbonyl của liên kết amid của

NCT-80 [56] Những kết quả này cho thấy NCT-NCT-80 liên kết với túi liên kết ATP đầu C của

HSP90 và ổn định cấu trúc mở của homodimer HSP90, ức chế chức năng HSP90 [56]

16

Hình 1.12 Model docking của NCT-80 trong túi liên kết ATP của HSP90 Hai chuỗi

HSP90 lần lượt được minh họa bằng màu cam (Chuỗi A) và xanh lam (Chuỗi B) Phân tử thuốc được thể hiện dưới dạng bóng và có màu tím, loại bỏ các nguyên tử hydro để tạo độ rõ ràng Tương tác giữa các phân tử giữa thuốc và protein được thể

hiện dưới dạng các đường nét đứt [56]

Trong chuỗi các dẫn chất được tổng hợp từ sự lai hóa của novobiocin và deguelin,

NCT-58 thể hiện sự ức chế rõ ràng trong ung thư vú nhạy cảm với trastuzumab và

kháng trastuzumab [57], và không thể hiện bất kỳ độc tính nào với tế bào thường Đối

với tế bào ung thư vú dương tính với HER2, điều trị NCT-58 (0,1–20 μM trong 72

giờ) làm giảm khả năng sống sót của tế bào phụ thuộc vào liều trong các tế bào BT474

và SkBr3 dương tính với HER2 NCT-58 không ảnh hưởng đến các tế bào MCF10A

biểu mô tuyến vú bình thường của con người Bên cạnh đó, khi đánh giá khả năng

tiêu diệt các tế bào kháng trastuzumab, điều trị NCT-58 (0,1–20 M, 72 giờ) đã ức chế

đáng kể khả năng tồn tại của tế bào JIMT-1 và MDA-MB-453 theo cách phụ thuộc vào liều [57] Giá trị IC50 của NCT-58 đối với 2 dòng tế bào kể trên lần lượt là 8.53

μM (95% CI: 6.429–11.33 μM)] và 4.45 μM (95% CI: 2.959–6.691 μM) [58]

Nghiên cứu docking của phân tử NCT-58 trong mô hình homodimer HSP90 ở người cho thấy NCT-58 khớp với vùng đầu C, nhóm chức 2- piperidin chiếm giữ túi

17

liên kết ATP, vị trí của nhóm chức deoxyribose (hình 1.13) [57] Nhóm amin proton

hóa tạo thành một liên kết hydro mạnh mẽ với chuỗi bên carboxy của Glu611 [57] Hai nhóm vòng thơm từ vùng benzen trung tâm và vòng chromen tạo một liên kết cho nhận π – cation với Lys615 của mỗi chuỗi HSP90 Oxy ở nhóm methoxy và nhóm amid tạo liên kết hydro với Asn622 and Lys615 ở chuỗi A Các tương tác đa đạng cho

phép NCT-58 liên kết với cả hai chuỗi của HSP90 và làm ổn định cấu trúc mở của

HSP90 homodimer [57]

Hình 1.13 Model docking phân tử NCT-58 Phân tử NCT-58 được thể hiện dạng

bóng và que màu xanh lá (Surflex-Dock score: 8.3236, CScore: 5) 2 chuỗi HSP90 được chia thành màu cam (chuỗi A) và màu xanh da trời (chuỗi B) Liên kết hydro, liên kết π và cầu muối được thể hiện bằng màu vàng, xanh lá và tím [57]

1.3 Tổng quan về khung benzimidazol

1.3.1 Giới thiệu

Benzimidazol là một khung cấu trúc mang hoạt tính quan trọng để phát triến nhiều loại thuốc Một loạt các tính chất dược lý của các chất benzimidazol được cho là xuất phát từ sự kết hợp của vòng benzen và imidazol độc đáo, có thể tương tác không cộng hóa trị với một loạt các mục tiêu sinh học do sự có mặt của hệ thống thơm giàu điện

tử và dị vòng 2 nguyên tử nitơ [59], [60] Các nhóm thế khác nhau trên vòng benzimidazol làm đa dạng hóa hoạt tính của các dẫn chất mang khung này

18

Các dẫn xuất của benzimidazol đã được chấp thuận sử dụng lâm sàng trong điều trị chống ký sinh trùng, chống loét, hạ huyết áp, kháng histamin, điều trị ung thư…[61]

Hình 1.14 Một số sản phẩm dẫn chất Benzimidazol được bán trên thị trường

(22) nocodazol, (23) bendamustin, (24) veliparib, (25) glasdegib, (26) crenolanib,

(27) abemaciclib, (28) liarozol, (29) pracinostat

1.3.2 Khung benzimidazol trong các chất ứng chế ung thư

Benzimidazol có cấu trúc tương tự với nucleotid purin tự nhiên cho phép các dẫn chất này có khả năng tiếp cận với các mục tiêu sinh học trong cơ thể Các hợp chất mang khung benzimidazol có nhiều tác dụng sinh học trên các tế bào ung thư như ức chế topoisomerase, ức chế các tác nhân alkyl hóa, đối kháng thụ thể androgen…[62] Neckers và đồng nghiệp cho rằng, các chất ức chế ADN gyrase B cũng có khả năng ức chế HSP90 do cả hai đích tác dụng này đều chứa nếp gấp Bergerat có cấu trúc tương tự nhau [45] Giả thuyết này được được chứng minh thông qua một số chất ức chế ADN gyrase B có khả năng gây ra sự thoái hóa protein client phụ thuộc HSP90

mà không làm tăng HSR trong các tế bào ung thư vú SKBR3 [45] tương tự novobiocin Một số dẫn chất mang khung benzimidazol cũng cho thấy cho thấy hoạt tính ức chế ADN gyrase với nhóm nitơ trong khung cấu trúc có khả năng tạo liên kết hydro với

19

nhóm chức trong amino acid tại vùng liên kết Bên cạnh đó, vòng benzimidazol có cấu trúc tương tự với purin Do đó, với khả năng này của các hợp chất mang khung benzimidazol, nhóm nghiên cứu lựa chọn tổng hợp một số dẫn chất có khung benzimidazol với kỳ vọng tăng hoạt tính kháng ung thư và khả năng ức chế miền đầu

C của HSP90

Hình 1.15 Dẫn chất benzimidazol có hoạt tính ức chế ADN Gyrase

1.4 Các phương pháp tổng hợp khung benzimidazol

Benzimidazol lần đầu tiên được tổng hợp vào năm 1872 bởi Hoebrecker đi từ nitro-4-methylacetanilid [63] theo sơ đồ sau:

2-Sơ đồ 1.3 2-Sơ đồ tổng hợp dẫn chất benzimidazol của Hoebrecker

Hiện nay, có nhiều phương pháp cũng như xúc tác đã được phát hiện để tổng hợp dẫn chất benzimidazol Trong đó, có một số phản ứng như sau:

1.4.1 Phản ứng ngưng tụ đóng vòng của o-phenyldiamin với các dẫn xuất acid carboxylic

Phản ứng loại nước với các tác nhân như acid polyphosphoric (PPA) [64], acid hydrocloric hoặc acid boric Phản ứng sử dụng nhiệt độ cao Sản phẩm tạo thành là dẫn chất của benzimidazol với các nhóm thế khác nhau trên vòng benzen của benzimidazol Phản ứng xảy ra theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 1.4 Phản ứng ngưng tụ đóng vòng của o-phenylendiamin với các dẫn xuất

acid carboxylic [64]

20

Một sản phẩm phụ của phản ứng này khi nhóm thế R có thể thế vào hydro của 1 trong 2 nguyên tử nitơ Điều này có thể gây khó khăn trong việc tinh chế sản phẩm sau này

Từ năm 1995, nhiều dẫn chất benzimidazol đã được tổng hợp theo công nghệ vi sóng để giảm thời gian phản ứng và tăng hiệu suất phản ứng lên so với các phương pháp trước Gần đây, A.Saberi và các cộng sự đã tổng hợp các dẫn xuất thế tại vị trí

số 2 của benzimidazol bằng cách chiếu xạ vi sóng trong điều kiện khác nhau với nhôm, silica gel và zeolite HY không cần dung môi Theo đó, tiến hành phản ứng

bằng cách trộn đều hỗn hợp o-phenylendiamin, acid carboxylic thơm và nhôm/silica

gel/zeolite trong cối xay, sau đó chiếu xạ trong lò vi sóng khoảng 5 – 9 phút ở 160 – 560W [65]

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp 2-arylbenzimidazol bằng công nghệ vi sóng [65]

1.4.2 Phản ứng ngưng tụ từ phenylendiamin hoặc dẫn chất phenylendiamin với bromo cyanid

o-Sử dụng phương pháp của Leonard cùng cộng sự để tạo ra dẫn chất aminobenzimidazol với hiệu suất cao Phản ứng được thực hiện bằng cách trộn một

2-tỷ lệ thích hợp các chất phản ứng gồm các dẫn chất o-phenylendiamin và bromo

cyanid trong hỗn hợp dung môi ethanol-H2O, đun nóng ở nhiệt độ 70oC trong vòng 1h [66]

Sơ đồ 1.6 Phản ứng o-phenylendiamin với các bromo cyanid

Tuy nhiên, việc sử dụng bromo cyanid trong phản ứng có thể gây nguy hiểm cho người làm thí nghiệm bởi vì độc tính của nó

Sơ đồ 1.7 Phản ứng ngưng tụ từ phenylendiamin hoặc dẫn chất

o-phenylendiamin với aldehyd

Venkateswarlu và cộng sự đã báo cáo việc tổng hợp các dẫn xuất benzimidazol, với việc sử dụng lanthanum clorua làm chất xúc tác hiệu quả Quá trình tổng hợp các

dẫn xuất benzimidazol từ o-phenylenediamin và nhiều loại aldehyd được thực hiện

với sự có mặt của lanthanum clorua (10 mol%) trong acetonitril ở nhiệt độ phòng [67]

Sơ đồ 1.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất benzimidazol từ aldehyd và

o-phenylendiamin

Trong thời gian gần đây, một số tác nhân rẻ tiền và an toàn hơn đã được nghiên cứu trong quá trình tổng hợp khung benzimidazol Trong đó tác nhân natri metabisulfit đã được sử dụng trong nghiên cứu O Suheyla và các cộng sự Phản ứng này dựa vào việc hình thành chất trung gian bisulfit của arylaldehyd trước, sau đó,

chất trung gian tiếp tục phản ứng với o-phenylendiamin [68] như sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 1.9 Cơ chế phản ứng ngưng tụ đóng vòng 2-aryl benzimidazol với tác nhân

natri metabisulfit

Năm 2012, O.Chen và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất ở vị trí C2 trên nhân benzimidazol sử dụng chất xúc tác FeCl3/Al2O3 [69] không độc và rẻ

Bên cạnh đó, NaHSO3 là một chất đặc biệt, có khả năng kết hợp với aldehyd Việc

sử dụng NaHSO3 trong quá tình tổng hợp này cũng đã cho thấy hiệu suất tốt, tiến hành đơn giản hơn và giảm thời gian phản ứng ở một vài nghiên cứu trước đây NaHSO3 cũng là một tác nhân tan trong nước, có thể dễ dàng loại bỏ trong quá trình tinh chế sản phẩm, giá thành thấp, có thể dễ dàng tìm thấy trong điều kiện phòng thí nghiệm

1.5 Các phương pháp tổng hợp liên kết amid giữa acid carboxylic và amin

1.5.1 Tổng hợp gián tiếp từ acid carboxylic thông qua hoạt hóa tạo thành acyl halogenid

Sự tạo thành các chất trung gian acyl halogenid sử sụng các tác nhân như thionyl clorua, oxalyl chlorid, phospho triclorid Những phản ứng này thường được thúc đẩy bằng cách thêm một giọt dimethylformamid (DMF)

Nhóm nghiên cứu của Leggio và các cộng sự đã tiến hành tổng hợp cấu trúc amid từ amin bậc 2 và acid carboxylic với tác nhân SOCl2 Quá trình này xảy ra với hiệu suất tốt

23

Sơ đồ 1.12 Phản ứng tỏng hợp amid từ acid carboxylic và amin với tác nhân SOCl 2

Nhược điểm của phương pháp này chính là sự tạo ra các acid mạnh HX như HCl, HBr, nên sẽ không phù hợp để tổng hợp các amid có chứa các nhóm khác nhạy cảm với môi trường acid

1.5.2 Tổng hợp từ aldehyd

Phản ứng oxy hóa amid hóa của aldehyd đã được biết đến từ những năm 1980 Cơ chế xảy ra dựa trên sự phản ứng giữa aldehyd và amin để tạo ra chất trung gian carbinoamin, sau đó dưới tác dụng của các tác nhân oxy hóa tạo thành amid Quá trình loại nước của carbinoamin sẽ tạo nên các dẫn chất imin, sau đó hydro hóa sẽ được sản phẩm amin là một phản ứng phụ có thể xảy ra trong quá trình này

Sơ đồ 1.13 Quy trình chung của quá trình tổng hợp amid từ aldehyd

Nhóm nghiên cứu của K Ekoue và các cộng sự đã đưa ra một quy trình tổng hợp amid từ các dẫn chất aldehyd với chất xúc tác từ đồng [71] Tác nhân oxy hóa là dung

dịch tert-butyl hydroperoxid trong nước Amin được dùng ở dạng muối hydroclorid

để giảm phản ứng cạnh tranh oxy hóa amin Hiệu suất của phản ứng giảm khi sử dụng arylaldehyd béo hoặc nghèo điện tử

Sơ đồ 1.14 Quá trình tổng hợp amide từ aldehyd

1.5.3 Tổng hợp amid thông qua este

Các chất este sau khi được trộn với amin và xử lý bằng nhiệt sẽ tạo ra amid

24

Sơ đồ 1.15 Một số phản ứng tổng hợp amid từ este và amin

Phản ứng này có thể tạo ra amid bậc 1, bậc 2 và bậc 3 Một vài ví dụ về quá trình này được thể hiện trong sơ đồ 1.15

1.5.4 Tổng hợp trực tiếp bằng tác nhân ghép đôi EDC

Các dẫn chất carbodiimid đã được áp dụng cho quá trình tổng hợp peptid bởi Sheehan và Hess (1955) [72] và Khorana (1955) [73] Dẫn chất của carbodiimid được thêm vào hỗn hợp của cả hai thành phần để kết hợp, và do đó được gọi là tác nhân ghép nối Một số tác nhân ghép nối được sử dụng như DCC/DMAP, EDC/HOBt, HATU/DIPEA, CDI/Et3N và BOPCl/Et3N…

Carbodiimid là một nhóm chức có công thức chung là RN=C=NR

Một đại diện phổ biến nhất của các dẫn chất nhóm này là N,N’ – dicyclohexylcarbodiimid (DCC) Nó được sử dụng rộng rãi để tổng hợp amid và este, đặc biệt là để tổng hợp pha rắn của peptid nhờ hiệu suất phản ứng cao và rẻ tiền Tuy nhiên, DCC tạo ra sản phẩm phụ không tan trong nước, khó loại bỏ Ngoài ra, DCC cũng gây kích ứng da mạnh, cần cẩn thận khi tiếp xúc

Sơ đồ 1.16 Phản ứng tạo liên kết amid sử dụng DCC [74]

Một tác nhân khác cũng được sử dụng khá phổ biến là EDC dimethylaminopropyl)carbodiimid), là một carbodiimid hòa tan trong nước

(1-ethyl-3-(3-EDC có lợi thế hơn DCC trong một vài trường hợp do bản thân (1-ethyl-3-(3-EDC và sản phẩm phụ mà nó tạo ra (ure) dễ tan trong nước, có thể được loại bỏ khi rửa tủa bằng nước

25

[72] Tuy nhiên, khi sử dụng các dẫn chất carbodiimid trong phản ứng ghép cặp acid carboxylic và amin, một phần amin có thể bị racemic hóa nên người ta bổ sung thêm HOBt (1-hydroxybenzotriazol) vào trong phản ứng để làm giảm điều này

Hình 1.16 Công thức của EDC và HOBt

Nhóm nghiên cứu của Ghosh và các cộng sự đã thực hiện sự ghép nối của valine

được bảo vệ bằng nhóm Boc và dẫn chất 4-amino-N-(4-methoxybenzyl)benzamid với

sự có mặt của EDC.HCl [75] DMAP hoạt hóa acid carboxylic với sự có mặt của HOBt trong acetonitril đã cho hiệu suất tốt

Sơ đồ 1.17 Một phản ứng tạo liên kết amid sử dụng EDC [76]

1.6 Định hướng thiết kế cấu trúc

Từ phần lý thuyết trên, ta có thể thấy, phần cấu trúc chromen có vòng benzen và nhóm methoxy tạo liên kết quan trọng với Ser677 và Lys615 trên phần mềm Sulflex-Dock, là hai vị trí quan trọng trong liên kết với ATP của miền C của HSP90 [56], [57]

Do đó, đề tài tiến hành phân cắt, loại bỏ phần cấu trúc ethylen trên khung chromen ban đầu, thu được phần cấu trúc mới, giữ lại phần vòng benzen và nhóm methoxy

Đồng thời, từ cấu trúc của chuỗi hợp chất NCT (NCT-50, NCT-58, NCT-80), cho

thấy vòng benzen trung tâm tạo liên kết π-cation với các acid amin khác nên phần cấu trúc này được giữ lại cho hợp chất đích

Thay thế phần cấu trúc piperidin bằng khung cấu trúc 5-carbamoylbenzimidazol với kỳ vọng tăng khả năng khả năng ức chế tế bào ung thư và tạo thêm các liên kết với đích điều trị như tạo liên kết π bởi vòng benzen và liên kết hydro từ nhóm amid