bước đầu ứng dụng hệ thống tái sinh invitro trong nghiên cứu chuyển nạp gen phát sáng gfp ở cây hoa cát tường eustoma grandiflorum grise

Sự tạo thành mô bứu là kết quả của sự di chuyển, biến nạp integration và biểu hiện của một đọan chuyên biệt trong plasmid của vi khuẩn, gọi là T-DNA vào bộ gene của thực vật.. tumerfacie

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài:

BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG HỆ THỐNG

CỨU CHUYỂN NẠP GEN PHÁT

(EUTOMAGRANDIFLORUM GRISE)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NIÊN KHÓA: 2003 - 2007 Tp.Hồ Chí Minh, năm 2007

TP.Hồ Chí Minh,2008

Lời cám ơn

Điều đầu tiên tôi muốn viết trong cuốn luận văn này đó là lời cám ơn đến gia đình, thầy cô và bạn bè, những người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong những năm qua

Trước hết, em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Hổ, cùng tất cả thầy cô và các anh chị đang làm việc tại viện Sinh Học Nhiệt Đới Dù bận rất nhiều việc nhưng thầy cô và anh chị vẫn hướng dẫn, chỉ bảo em với tất cả sự tận tình trong suốt thời gian em thực tập

Để có thể làm luận văn hôm nay, không thể không nhắc đến công ơn dạy dỗ trong suốt những năm qua của tất cả thầy cô ở khoa Công Nghệ Sinh Học Những kiến thức đó sẽ là hành trang để em vững bước vào đời

Tôi xin gởi đến tất cả các bạn đã giúp tôi lời cám ơn chân thành bởi những gì mà các bạn đã cho tôi trong suốt thời gian qua Các bạn luôn là người ở bên cạnh tôi những lúc vui buồn, luôn cho tôi niềm tin để vượt qua những khó khăn

Cuối cùng, con xin gởi đến ba mẹ lòng biết ơn sâu sắc bởi tất cả những gì ba mẹ đã dành cho con Xin cám ơn cô chú đã luôn thương yêu, quan tâm, động viên cháu Gia đình luôn là chỗ dựa để con vững tin trước những khó khăn trong cuộc sống!

Xin chân thành cám ơn

Lê Văn Quỳnh

MỤC LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT IVMỤC LỤC HÌNH VTÓM TẮT VIILỜI MỞ ĐẦU X

I GIỚI THIỆU VỀ CÂY CÁT TƯỜNG 2

I.1 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 2

I.2 MÔI TRƯỜNG SỐNG VÀ ĐẶC ĐIỂN SINH LÝ CỦA CÂY CÁT TƯỜNG: 3

II CƠ SỞ XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH 5

1 Một số khái niệm 5

2 Nguyên liệu để tái sinh 6

3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tái sinh 6

III PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE THỰC VẬT 7

1 Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật 7

2 Giới thiệu về vi khuẩn E.Colivà vi khuẩn Agrobacterium: 8

a Giới thiệu về vi khuẩn E.Coli: 8

b Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium: 10

c Cấu trúc và chức năng của T-DNA 12

IV GIỚI THIỆU VỀ gfp 14

1 SƠ LƯỢC VỀ GEN gfp VÀ PROTEIN gfp 14

2 CẤU TRÚC ĐẶC TRƯNG VÀ BIỂU HIỆN CỦA gfp: 15

a Một số biến đổi của Protein gfp 17

V NGUYÊN TẮC CHUYỂN DNA NGOẠI LAI VÀO TẾ BÀO MÔ THỰC VẬT NHỜ A.Tumefaciens 19

1 Vector: 20

2 Kĩ thuật tạo vector tái tổ hợp được sử dụng để tạo ra vector dựa trên nguyên tắc hoạt động của Ti-plasmid Những vector này thường có các thành phần sau: 21

3 Những phương pháp khảo sát sự hiện diện của gen gfp: 22

a Kỹ thuật điện di: 22

2 GIỐNG VI KHUẨN VÀ VECTOR 34

3 HOÁ CHẤT, MÔI TRƯỜNG, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM: 36

a HOÁ CHẤT : 36

b MÔI TRƯỜNG 38

c DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM: 39

II PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM: 43

1 Quy trình làm thí nghiệm 43

2 Nhân giống Cát tường từ cây ngoài thị trường 44

3 Khảo sát sự tái sinh của mẫu lá trên môi trường khác nhau 44

4 Khảo sát nồng độ chất chọn lọc Hygromycin 44

5 Tạo dòng A.tumefaciens chứa Plasmid mang gen gfp 45

6 Khảo sát sự hiện diện và biểu hiện của gen gfp trên thực vật: 45

I Cát tường tái sinh từ cây ngoài thị trường 51

II Tái sinh của cát tường trong các môi trường 51

3 Kết quả khảo sát nồng độ chọn lọc kháng sinh Hygromycin 54

4 Vi khuẩn mang vector gfp: E.coli và A.tumefacciens 56

5 Chuyển gene gfp vào cây cát tường sử dụng vi khuẩn A.tumefaciens 57

6 Quá trình chuyển gene và chọn lọc kháng sinh 60

a Tiền xử lý mô lá (pre-conditioning) 60

b Quy trình chuyển gene 61

c Quá trình chọn lọc kháng sinh 61

7 Kiểm tra sự hiên diện của gen gfp 62

a Kêt quả nhuộm Gus 62

b Kết quả PCR DNA Cát tường chuyển gen: 63

I Kết luận 66

II Đề nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC 70

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BA : benzyl adenyl

BAP : 6-benzylaminopurine

DNA : desoxyribonucleic acid

GA3 : gibebrellic acid

EG : Ethylene glycol

GFP : Green Flourescent Protein

IAA : 3-indonylacetic cid

IBA : 3-dolebutyric acid

NAA : 1-naphtaleneacetic acid

NAD : nicotin amid adenyl dinucleotic acid

PEG : polyethylene glycol

RNA : ribonucleic aci

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1-1: hoa cát tường 2

Hình 1-2: Vi khuẩn E.Coli 9

Hình 1-3: A tumefacien chụp dưới kính hiển vi(1) 11

Hình 1-4: A tumefacien chụp dưới kính hiển vi(2) 12

Hình 1-5: Cây bị bệnh do vi khuẩn A.tumefaciens 13

Hình 1-6: cấu trúc của Plasmid TI 13

Hình 1-7: Quá trình cắt, chuyển, sâm nhập và biểu hiện của T-DNA 15

Hình 1-8: Súa Aequorea victoria 16

Hình 1-9: Green Fluorescent Protein 16

Hình 1-10: Cấu trúc gfp và liên kết đặc trưng Ser-Tyr-Gly 17

Hình 1-11: Sơ đồ chuyển đổi xanh biển sang xanh lục nhờ thay đổi mức năng lượng 18 Hình 1-12: Cơ chế nhiễm Ti plasmid từ A tumefaciens vào tế bào thực vật 20

Hình 1-13: Sơ đồ mô tả sự chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium 23

Hình 1-14: Chuột phát sang 30

Hình 1-15(trên): Cúc không chuyển gen(trên) 31

Hình 1-16(dưới): Cúc chuyển gen(dưới) 31

Hình 1-17: Một con lợn chuyển gen(xanh) bên cạnh con lợn thường 32

Hình 1-18: Tim phôi chuột phát sang 33

Hình 1-19: Bướm phát sang 34

Hình 2-1: Cây cát tường invitro 36

Hình 2-2: Cát tường dung chuyển gen 37

Hình 2-3: Bản đồ giới hạn vector Pcambia 1303 38

Hình 2-4:Máy điện di biorad@ và khay đổ gel Biorad@ 43

Hình 2-5: Máy ổn nhiệt Heto và máy ổn nhiệt Techne@ 43

Hình 2-6: Phòng tối và máy chụp ảnh gel điện di Biorad@ 44

Hình 2-8: Máy li tâm Eppendarf và máy siêu li tâm Eppendarf Centrifuge 5417R 44

Hình 2-9: Máy lắc ổn nhiệt Innova 4230 – máy khuấy từ - máy đo pH 45

Hình 3-1: Cát tường tái sinh từ cây trồng vườn 54

Hình 3-2: Cát tường tái sinh trong các môi trường khác nhau 56

Hình 3-3: Mô sẹo và cây nhỏ trong môi trường bổ sung Hygromycin 20 mg/l 57

Hình 3-4: Mô sẹo và chồi con trong môi trường bổ sung Hygromycin 30 mg/l 58

Hình 3-5: Mô sẹo và chồi nhỏ trong môi trường bổ sung Hygromycin 40 mg/l 58

Hình 3-6: Mô sẹo và chồi nhỏ trong môi trường không bổ sung Hygromycin 59

Hình 3-7: E.coli mang gen gfp 60

Hình 3-8: Vi khuẩn A.tumefaciens dùng đẻ chuyển gen 60

Hình 3-9: Mô lá đã rửa vi khuẩn nuôi trong môi trường có Hygromycin 20 mg/l 61

Hình 3-10: Mô sẹo cấy chuyền qua môi trường có Hygromycin 30 mg/l 62

Hình 3-11: Mô sẹo phát triển trong môi trường có Hygromycin từ 30-40 mg/l 62

Hình 3-12: Mô sẹo tiêp tục phát triển trong môi trường có Hygromycin 30-40 mg/l 62

Hình 3-13: Mô sẹo nhuộm Gus 65

Hình 3-14: kết quả chạy PCR 66

TÓM TẮT 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cát tường là loại cây ôn đới có hoa đẹp, màu sắc dung dị; hoa cắt cành có giá trị cao đối với nhiều nước trên thế giới như nhật bản, Đức, New Zealand Mỹ… thời gian gần đây, cây hoa này được trồng ở Đà Lạt và đươc xem là một trong những cây hoa bổ sung vào thị trương sãn xuất và kinh doanh hoa cắt cành ở nước ta Hiện nay, hoa cát tường được bán và tiêu thụ tại nhiều tỉnh thành trong cả nước trên thế giới, ngoài nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô, việc tạo giống mới như giống kháng nấm bệnh, giống có dạng thấp cây, nhiều phát hoa, hoa có màu sắc mới lạ đang đượ quan tâm nghiên cứu thông qua phương pháp lai tạo truyền thống và phương pháp công nghệ sinh học

Bằng phương pháp công nghệ sinh học cụ thể là công nghệ chuyển nạp gen, các nhà khoa học có thể tạo ra nhiều dạng màu hoa mới lạ (novel patterns) trên cơ sở hiểu biết nguyên lý sự hình thành và hoạt động trao đổi chất của sắc tố (pigment) ở hoa cây trồng này Thời gian gần đây, gen gfp đã được chuyển nạp thành công vào một số giống hoa thương mại như hồng, phong lan Dendrobium, cúc Osteospermum, lily…mở ra khả năng sử dụng gen này vào trong công tác tạo giống hoa mang đặc tính phát sang (green fluorescent flower) trong đó có giống hoa cát tường theo tài liệu công bố của Mercuri và ctv (2002), cây cát tường chuyển gen có biểu hiện gen gfp rất mạnh so với các cây hoa chuyển gen khác, mở ra khả năng thương mại hóa sản phẩm như trường hợp cây hoa phong lan mang gen phát sang lục có nguồn gốc động vật đom đóm

Đề cương khóa luận này, ngoài nội dung nuôi cấy mô, còn nêu nội dung nuôi cấy bước đầu về chuyển gen gfp nhằm tạo ra cây hoa cát tường chứa protein GFP- như là chất nhuộm màu huỳnh quang cho hoa (green fluorescent dye) và cây hoa chuyển gen này có thể tạo ra sự hấp dẫn nhất định trong lĩnh vực trồng và kinh doanh hoa cũng như trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản

2 Mục tiêu

− Bước đầu nhận được mô sẹo, trồi con mang gen gfp

1 Phương pháp nghiên cứu chính:

− Phương pháp nuôi cấy mô tế bào invitro (sử dụng các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng tạo tái sinh tốt cho mô nuôi cấy)

− Biến nạp vector plasmid mang gen gfp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

− Phương pháp nuôi chung mô tế bào với vi khuẩn − Phương pháp chọn lọc triệt để nhiều chu kì

− Phương pháp kiểm tra invitro tính kháng Hygromycin của chồi chuyển gen

− Phương pháp hóa mô tế bào (thử Gus)

− Phương pháp PCR để xác định sự hiện diện của gen đích gfp ở mô chuyển gen

2 Nội dung nghiên cứu:

2.1 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng (NAA, BA) trên sự tái sinh chồi từ mảnh lá phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen

2.2 Ảnh hưởng của các tác nhân chọn lọc hygromycin đến mô lá nuôi cấy in

vitro (nhằm tìm ra nồng độ tối thiểu gây chết mô)

2.3 Tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pCAMBIA 1303 mang gen gfp và ghi nhận sự phát sáng của dòng vi khuẩn này qua

chiếu tia UV sóng dài (365 nm)

2.4 Xây dựng quy trình chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

2.5 Phân tích mô sẹo/chồi chuyển gen bằng một số phương pháp sinh học định

tính (thử GUS, kiểm tra in vitro tính kháng hygromycin)

3 Kế hoạch nghiên cứu:

Thời gian Nội dung thực hiện Dự kiến kết quả Tháng 2/2008

Tháng 3-6/2008

Xây dựng hệ thống tái sinh cây từ vật liệu mảnh lá Chuyển gen bằng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

Tái sinh được cây in vitro

Nhận được mô sẹo/chồi

con mang gen gfp

LỜI MỞ ĐẦU

Thế kỉ 21 là thế kỉ của cơng nghê sinh học.Chính sự bùng nổ của cơng nghê sinh học mà đặc biệt là cơng nghệ về di truyền đã làm thay đổi nhiều điều trên thế giới ngày nay, thay đổi cả suy nghĩ của con người về khả năng biến những cái khơng thể thành cĩ thể Tuy khơng phải là một ngành quá mới mẻ nhưng cơng nghệ sinh học vẫn cịn chứa đựng rất nhiều điều bí ẩn Để cĩ thể bắt kịp sự phát triển của thế giới thì quan tâm phát triển cơng nghệ gen nĩi riêng và cơng nghệ sinh học nĩi chung là một hướng đi tất yếu

Để làm phong phú thêm cho cuộc sống hằng ngày, con người khơng ngừng tìm kiếm và tác động bằng chính tri thức của mình vào cuộc sống “Hoa” luơn ẩn chứa sự quyến rũ lạ kì làm say đắm lịng người “Hoa” là thứ ngơn ngữ khơng biên giới chứa đựng trong đĩ những thơng điệp đầy ý nghĩa mà người ta cĩ thể trao cho nhau và là thứ khơng thể thiếu trong cuộc sống hằng ngày đĩ

Và cơng nghệ sinh học tác động nên cây cĩ hoa chính là nhằm tạo ra và đáp ứng nhũng nhu cầu hang ngày đĩ Việc tạo ra giống hoa đáp ứng thị hiếu con người ngày

nay: đĩ là lý do mà tơi chọn đề tài: “Bước đầu ứng dụng hệ thống tái sinh in vitro trong nghiên cứu chuyển nạp gen phát sáng gfp ở cây hoa Cát tường (Eustoma

grandiflorum Grise.)” Nghiên cứu này nếu thành cơng cĩ thể mở ra một hướng đi mới

đầy triển vọng trong việc ứng dụng tái sinh cây chuyển gen khơng chỉ với hoa cát tường mà cịn với nhiều lồi hoa cĩ giá trị khác

Nội dung nghiên cứu gồm cĩ:

2.1 Ảnh hưởng của chất điều hồ sinh trưởng (NAA, BA) trên sự tái sinh chồi từ mảnh lá phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen

2.2 Ảnh hưởng của các tác nhân chọn lọc hygromycin đến mơ lá nuơi cấy in

vitro (nhằm tìm ra nồng độ tối thiểu gây chết mơ)

2.3 Tạo dịng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid

pCAMBIA 1303 mang gen gfp và ghi nhận sự phát sáng của dịng vi khuẩn này qua chiếu tia UV sĩng dài (365 nm)

2.4 Xây dựng quy trình chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

2.5 Phân tích mô sẹo/chồi chuyển gen bằng một số phương pháp sinh học định

tính (thử GUS, kiểm tra in vitro tính kháng hygromycin)

CHƯƠNG I:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I GIỚI THIỆU VỀ CÂY CÁT TƯỜNG

Hình 1-1 : hoa cát tường

Cây cát tường có tên khoa học là Eustoma grandiflorum (Raf) shiners hay Eustoma

russllianum (Hook) G.Doncó nguồn gốc từ miền tây nước Mỹ, có khả năng chịu lạnh tốt, du nhập vào Đà Lạt nước ta lần đầu tiên khoảng hơn 8 năm về trước với nhiều chủng loại và màu sắc đa dạng như: kem, tím, vàng, hồng, hồng phai, tím đậm, trắng viền tím… Cát tường không rực rỡ như hoa cúc và không lộng lẫy như hoa hồng nhưng lại thu hút khách bởi vẻ đẹp đơn sơ và bởi quan niệm cát tường là loài hoa mang lại nhiều may mắn

Hiện tại cát tường là giống hoa được người tiêu dùng rất ưa chuộng và đang được sản xuất làm hoa thương phẩmh(hoa cắt cành) Hoa cát tường được sản xuất nhiều ở Đà Lạt vì điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng nơi đây rất phù hợp với đặc điểm sinh trưởng của nó Ngoài ra, cát tường còn được coi là hoa chủ lực và làm lên thương hiệu nhiều vườn hoa như vườn hoa Lang Biang Farm Hiện nay, do nhu cầu chơi hoa cát tường ngày càng tăng, hoa sản xuất ra không đủ cầu Vì vậy, Hiệp hội hoa Đà Lạt đã tổ chức hội thảo chuyên đề về qui trình kỹ thuật canh tác, thu họach hoa cát tường với sự có mặt của 10 nhà khoa học và hơn 40 người trồng hoa trên địa bàn Đà Lạt để trồng hoa cát tường có hiệu quả và cung cấp tốt nhất nhu cầu của người tiêu dùng

Phân loại cây cát tường:

• Phân nhom cây hoa

⮚ phân lớp asteridae

• Họ Gentianaceae

♦ Giống Eustoma salisb.ex G.Don

❖ Loài Eustoma exaltatum (L.) Salisb.ex G.Don

❖ Phân loài Eustoma exaltatum (L.) Salisb.ex G.Don

ssp.russellianum (Hook.) Kartes

− Giống hoa kép: Gồm Nhóm Avilia, Nhóm Balboa, Nhóm Catalina, Nhóm Candy, Nhóm Echo, Nhóm Mariachi…

− Giống hoa đơn: Gồm nhóm Flamenco, Nhóm Heidi, Nhóm Laguna, Nhóm Malibu, Nhóm Yodel.

I.2 MÔI TRƯỜNG SỐNG VÀ ĐẶC ĐIỂN SINH LÝ CỦA CÂY CÁT TƯỜNG:

Hoa cát tường phát triển tốt ở điều kiện 70 - 80 Klux ánh sáng tự nhiên Do vậy vào mùa xuân hay mùa hè có cường độ ánh sáng cao nên thường phải che lưới cho hoa Hoa cát tường thích hợp với vụ dài ngày, có số giờ chiếu sáng trong ngày tối ưu là 16 giờ trong ngày thì sẽ cho chất lượng bông cao nhất

Nhiệt độ tối thích cho hoa cát tường sinh trưởng và phát triển là từ 18 – 200 C vào ban ngày và 15 – 180 C vào ban đêm Nhiệt độ vào ban đêm thấp hơn 150 Csẽ làm trì trệ quá trình sinh trưởng của cây Vào ban ngày, khi nhiệt độ cao hơn 280 C sẽ làm cho hoa nở sớm, rút ngắn quá trình sinh trưởng của hoa và cho hoa kém chất lượng Tùy theo từng chủng loại giống mà có yêu cầu về nhiệt độ và quang chu kỳ khác nhau Tính cả thời gian từ lúc gieo hạt cho đến khi cây ra hoa là từ 20 – 23 tuần

⮚ Nước

Nước rất cần thiết cho sự phát triển và ra hoa của cây cát tường Ở những vùng khô hạn kéo dài, cây rất chậm phát triển và chất lượng hoa sẽ kém Tuy nhiên, nếu để xảy ra hiện tượng ngập úng nước thì trong đất sẽ xuất hiện vi sinh vật gây thối gốc, cây sẽ bị chết Luôn duy trì độ ẩm thích hợp là yêu cầu bắt buộc khi trồng hoa cát tường Trong quá trình trồng, ta nên tưới phun trong khoảng 2-3 tuần đầu tiên kể từ khi hình thành cây Sau đó, ta chuyển qua dùng hệ thống phân phối nước vào gốc cây cho đến khi thu hoạch hoa [21]

⮚ Độ pH

Độ pH là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của cây Cát tường Có nhiều những nghiên cứu đã đưa ra mức pH phù hợp cho sự phát triển của cây con lẫn cây đã lớn là trong khoảng 5.8– 7

B.K Harbaugh và S.S.Woltz sau khi tiến hành khảo sát tác động của pH trong môi trường rễ lên quá trình sinh trưởng và phát triển của Cát tường đã đưa ra một số kết quả (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của cây

Độ pH

tán cây (cm) trọng lượng (g) chiều cao (cm) trọng lượng(g) số hoa và chồi hoa

⮚ Nguồn dinh dưỡng

Cây Cát tường có hai pha phát triển rõ rệt Pha đầu là lúc cây con phát triển kéo dài đến khi ra hoa Trong pha này, nồng độ Nitơ cần được cung cấp trong khoảng 100-150 ppm, dưới dạng muối nitrate, nồng độ Kali cũng được cung cấp ở mức độ cân bằng với Nitơ

Pha thứ hai bắt đầu khi những nụ hoa nhỏ được hình thành Trong giai đoạn này, ta cần phải giảm nồng độ Nitơ, đồng thời tăng nồng độ Kali.Tỷ lệ giữa Nitơ và Kali thích hợp nhất trong giai đoạn này là 1N:1.5K Để tạo môi trường cho sự phát triển của cát tường, ta cũng phải giữ hàm lượng Canxi trong đất ở mức độ cao, khoảng 1500ppm

Có một điều cần lưu ý là lượng phân bón cho cây trong từng giai đoạn quan trọng nhưng khả năng hấp thụ phân bón mới quyết định Khả năng này phụ thuộc nhiều vào pH của môi trường có thích hợp hay không

II CƠ SỞ XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH 1 Một số khái niệm

Sự tái sinh cơ quan là quá trình phân hóa hình thành các cơ quan từ tế bào chưa phân hóa hoặc từ tế bào chưa phân hóa nhưng đã trải qua giai đoạn phản phân hóa Ở thực vật có sự tái sinh là do nó có tính mềm dẻo và tính toàn năng

Tính mềm dẻo là khả năng thay đổi để thích nghi với sự thay đổi của điều kiện môi trường và sự tổn thương do thực vật sống cố định trong xuốt thời gian sống

Tính toàn năng là khả năng tái sinh và biểu hiện tất cả tính trạng có chứa trong gen của một cây nào đó của một mô thuộc cây đó nếu được kích thích phù hợp Nuôi cấy mô và làm tái sinh cung cấp chứng cứ rõ ràng nhất cho tính toàn năng này

Sự tái sinh là kết quả của quá trình biệt hoá lần hai được cho bởi sự tái biệt hoá của tế bào Nó không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình phức tạp gồm các giai đoạn sau :

✔ Sự phân hoá của những tế bào đã phân hoá ( có thể dẫn đến sự tái xác định và trẻ hoá của tế bào)

✔ Sự phân chia tế bào, đôi khi tạo thành mô sẹo; khi tế bào phân chia thì bắt đầu xảy ra sự hình thành cơ quan

✔ Sự hình thành cơ quan ✔ Sự phát triển của cơ quan

Xây dựng hệ thống tái sinh là quá trình nguyên cứu thực nghiệm để tìm ra những điều kiện tối ưu cho sự tái sinh của một đối tượng xác định Qua thực nghiệm cho thấy điều khiện nuôi cấy và kích thích để cây tái sinh có thể rất khó khăn và nó vẫn phụ thuộc nhiều và kinh nghiệm

2 Nguyên liệu để tái sinh

Nguyên liệu để tái sinh có thể đi từ những tế bào.

• Chưa phân hoá: mô sẹo, đỉnh sinh trưởng , tế bào tiền phôi (hợp tử) • Đã phân hoá: lá , thân , rễ , phôi …

Đối với những tế bào chưa phân hoá, sự tái sinh sẽ diễn ra khi gặp điều kiện thuận lợi Còn những tế bào đã phân hoá chỉ có thể tái sinh được sau khi trải qua quá trình phản phân hoá để trở thành tế bào chưa phân hoá Quá trình này kéo dài hay ngắn phụ thuộc nguồn gốc của tế bào đã phân hoá Tế bào càng già thì thời gian phản phân hoá càng lâu, khả năng phân hoá càng khó

3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tái sinh

⮚ mẫu cấy:

Những đặc tính chính của mẫu cấy ảnh hưởng đến sự phản ứng của mẫu cấy trong môi trường nuôi cấy là:

✔ nguồn gốc của mô

✔ đặc điểm sinh lý và tuổi của mẫu cấy ✔ mùa mà mẫu cấy được thu nhận ✔ kích thước của mẫu cấy

✔ chất lượng chung của cây lấy mẫu

Nói chung, tất cả các mẫu cấy (lá, thân, rễ, hoa, phôi…) đều có khả năng tái sinh

mẫu cấy đều có thể phân chia, tái sinh trực tiếp hay gián tiếp thông qua mô sẹo Những mẫu cấy còn non, trong đó có nhiều tế bào phân chia mạnh sẽ dễ phân chia tiếp trong nuôi cấy và dễ tái sinh hơn

⮚ Dinh dưỡng và thành phần của môi trường

Mỗi loại cây khác nhau thì sẽ có một môi trường dinh dưỡng với những thành phần và nồng độ khác nhau Trong đó có những yếu tố chính sau:

✔ môi trường giàu dinh dưỡng và nghèo dinh dưỡng thường dùng là MS và BS

✔ nguồn cacbon (dùng làm năng lượng) thường dùng là 2-4 % suerose ✔ nguồn nito thường được hạ thấp

✔ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: auxins (2,4-D, IAA, NAA và IBA); cytokinins (kinetin và BA), gibberellin, abscisic acid…

✔ các vitamine: inositol, nicotinic acid, pyridoxine và thiamine ✔ một số hợp chất khác như: acid amin, polyamine, dyosacharide… ⮚ tính chất môi trường nuôi cấy

✔ dạng môi trường: đặc hay lỏng (có hay không có agar) ✔ pH môi trường

✔ cường độ và thời gian chiếu sáng ✔ nhiệt độ

✔ độ ẩm

✔ sự thông khí của thiết bị nuôi cấy

III PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE THỰC VẬT 1 Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật

Hàng loạt các phương pháp chuyển gen đã được khám phá như phương pháp

chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterrium tumefacien (Klee và Roger,1989), chuyển

gen trực tiếp bằng kỹ thuật bắn gen (Klein và CS, 1989), vi tiêm (Neuhaus và CS, 1987), xử lý laser (Weber và CS, 1988),… Trong đó, cho đến nay, kỹ thuật chuyển gen

bằng A.tumefaciens vẫn được coi là phương pháp đơn giản và đạt hiệu quả cao

Chuyển gen được thực hiện qua các bước cơ bản sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng quan tâm - Phân lập gen

- Gắn gen vào vector biến nạp - Nhân dòng vector

- Tách DNA plasmid

- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật - Chọn các thể biến nạp

- Tái sinh cây biến nạp

- Chứng minh sự có mặt của gen trong cây tái sinh

2 Giới thiệu về vi khuẩn E.Colivà vi khuẩn Agrobacterium:

a Giới thiệu về vi khuẩn E.Coli:

• Họ: Enterobacteriaceae • Chi: Escherichia

• Loài: E Coli

• Tên khoa học: Escherichia coli

Escherichia coli (thường được viết tắt là E coli) là vi khuẩn gram âm, có hình que

dài khoảng 1 micromet) một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú) Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột E coli thuộc họ vi khuẩn

Enterobacteriaceae E.Coli có 1 nhiễm sắc thể (phân tử DNA) dạng vòng nằm trong vùng nhân Kích thước của các phân tử DNA này khoảng 4 ×106 cặp base Các quá trình biểu hiện của gen như phiên mã, dịch mã, được xảy ra đồng thời Sau khi RNA được tổng hợp sẽ được sử dụng ngay để dịch mã mà không qua các bước sửa đổi sau phiên mã vì gen của chúng không có các đoạn intron (đoạn không mã hoá) Do vậy,

E.Coli được coi là tế bào chủ đơn giản nhất Rất nhiều các thí nghiệm tách dòng gen ở

các phòng thí nghiệm đang sử dụng E.Coli là tế bào chủ

Người ta thường dùng E Coli là vật chủ thu nhận các vector chuyển gen do đặc tính dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống lại chấp nhận được nhiều vector Tế bào E Coli sau 30 phút đã tự nhân đôi Từ 1 tế bào E Coli sau 12 giờ tiến hành được 24 đợt nhân

đôi cho 224 tế bào (trên 16 triệu tế bào) Trong các tế bào đó DNA tái tổ hợp cũng được nhân lên nhanh chóng, sản xuất ra 1 lượng lớn các chất tương ứng với gen đã

ghép vào plasmit Vì thế vi khuẩn E.coli đáp ứng được các yêu cầu của tế bào chủ lí

tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dòng gen Do tính chất đặc biệt

của tế bào chủ lí tưởng nên E.Coli được nghiên cứu tỷ mỉ về cơ chế di truyền, phân lập

và tạo nên nhiều chủng khác nhau Các nghiên cứu đó làm cơ sở cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp và Công nghệ di truyền

Trong công tác chuyển gen vào thực vật, người ta thường sử dụng vi khuẩn E

Coli để tạo ra 1 lượng lớn DNA cần thiết dùng làm nguyên liệu cho việc chuyển gen vào thực vật bằng phương pháp bắn gen

b Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium:

− Phân loại:

• Giới: Bacteria

• Ngành: Proteobacteria • Lớp: Alpha Proteobacteria • Bộ: Rhizobiales

• Họ: Rhizobiaceae • Chi: Agrobacterium

• Loài: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes

− Agrobacterium là nhóm vi sinh vật đất gram âm gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương

− Chi Agrobacterium gồm 1 số loài chính sau: • A.tumefaciens gây bệnh u thân cây • A.shizogenes gây bệnh tóc rễ cây

• A.rubi gây bệnh u cho cây dâu đất, mâm xôi…

− Hiện nay, người ta đã nghiên cứu và khai thác khả năng sử dụng chúng như một vector tự nhiên để mang gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật

Hình 1-3: A tumerfacienchụp dưới kính hiển vi(1)

− Ở A.tumefaciens có chứa một plasmid lớn có kích thước cỡ 200kb gọi là Ti

plasmid (Tumor inducing plasmid) plasmid này có khả năng sao chép độc lập, đây chính là thủ phạm truyền bệnh cho cây

⮚ Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens nhóm vi khuẩn Gram âm sống tự do trong đất

Dòng vi khuẩn này có khả năng nhiễm vào cây hai lá mầm và cảm ứng tạo bứu ở cổ rễ thực vật (crown gall) Sự tạo thành mô bứu là kết quả của sự di chuyển, biến nạp (integration) và biểu hiện của một đọan chuyên biệt trong plasmid của vi khuẩn, gọi là T-DNA vào bộ gene của thực vật T-DNA là một phần của Ti-plasmid (tumor

inducing- plasmid cảm ứng tạo bướu)- hầu hết các dòng Agrobacterium đều có mang

plasmid này Tùy vào các dòng vi khuẩn khác nhau mà chiều dài vùng T-DNA có thể

thay đổi từ 12-24 kb Những dòng Agrobacterium không chứa Ti-plasmid không có

khả năng tạo mô bứu [4, tr514]

Hình 1-4: A tumerfacienchụp dưới kính hiển vi.

Các quá trình xảy ra trong quá trình chuyển gene từ Agrobacteriums vào tế bào

thực vật

✔ Khởi sự từ vết thương, tế bào thực vật tạo ra các hợp chất phenol như

acetosyringon và hydroxyacetosyringone [3, tr256] Các hợp chất này là sản

phẩm của con đường tổng hợp một số sản phẩm thứ cấp như lignin và flavonoid Acetosyringon và hydroxyacetosyringone có vai trò cảm ứng gene

gây độc (virulence- vir gene) trong Ti plasmid [4, tr514]

✔ Acetosyringon di chuyển vào tế bào vi khuẩn, cảm ứng sự cắt đứt sợi đơn

T-DNA, tạo bản sao sợi đơn này để có DNA sợi kép

✔ T-DNA sợi kép được chuyển và xen vào bộ gene của tế bào thực vật

✔ T-DNA biểu hiện trong tế bào thực vật: tạo các hợp chất opin và các chất đìều hòa sinh trưởng như auxin và cytokinin liên quan đến sự tạo bướu [3, tr256]

❖ Cây bị nhiễm A.tumefaciens

− Khi cây bị nhiễm A tumefaceins qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các

khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn Khả năng này có được là do vi khuẩn đã chuyển một đoạn DNA của Ti plasmid (T-DNA) nhập vào bộ gen của cây bị bệnh Phân tích các khối u ở cây cho thấy sự hình thành các chất mới như nopalin và octopin được gọi chung là opin Các chất opin này không tồn tại ở cây bình thường

Hình 1-5: Cây bị bệnh do vi khuẩn A tumefaceins

c.Cấu trúc và chức năng của T-DNA

• T-DNA đã được nghiên cứu rất kỹ Đó là một đoạn DNA có kích thước 25000 bp trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) có các đoạn nucleotid tương tự nhau Ngoài T-DNA, trên Ti plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm (vir region) và chuyển nạp (conjugative transfer), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism)

Hình 1-6 : Cấu trúc của plasmid Ti

• Trong các vùng DNA của Ti plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng Vir Sản phẩm hoạt động của gen nằm trong vùng này dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt protein đặc hiệu vir E2, vir B, vir D, vir D2, vir C1,…

• Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với bộ gen của cây chủ một cách an toàn

• Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn”, nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti plasmid

− Cơ chế lây nhiễm của A rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng tương tự,

nhưng trong vùng T-DNA của vi khuẩn này chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh

− Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy

người ta cho rằng chúng chỉ có thể nạp T-DNA vào bộ gen của cây hai lá mầm Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có

thể sản xuất opine và có thể khai thác chuyển gen của Agrobacterium ở cây một lá

mầm

− Cơ chế chuyển đoạn T – DNA vào tế bào thực vật được minh học bởi hình sơ đồ sau đây:

Hình 1-7: Quá trình cắt, chuyển, xâm nhập và biểu hiện của T – DNA

IV GIỚI THIỆU VỀ gfp

1 SƠ LƯỢC VỀ GEN gfp VÀ PROTEIN gfp

Gfp là hệ thống gen tinh vi gồm 2 hệ thống gen tạo nên protein phát sáng sinh học protein gfp Gen này hứa hẹn sẽ được sử dụng nhiều hơn trong các nghiên cứu khoa

học do việc kiểm tra đơn giản hơn so với gen chỉ thị gus A vì không cần huỷ mẫu và

không đòi hỏi cơ chất tác dụng Hơn nữa, nó còn có thể sử dụng để đánh giá biểu hiện

invivo xác định các protein dung hợp, sự vận chuyển các protein nội bào và sự định vị

các tế bào đặc biệt trong hệ thống đa bào (Prasher, 1995)

Protein phát quang lục (green fluorescent protein) hay gfp là một protein được khám phá bởi Shimomura (1962) từ con sứa biển Aequorea Victoria gfp với

choromophore phát ra đã đem lại ma lực, sự quyến rũ vốn có bên trong và cả một giá

trị to lớn do tính dễ phát hiện trong cơ thể sống Chỉ mới ba năm sau đó, protein gfp từ

chỗ ít được biết đến đã trở thành một trong những protein được nghiên cứu và khai thác rộng lớn trong y sinh học và trong tế bào học

gfp có cấu trúc nguyên thuỷ gồm 238 amono axit được dẫn xuất từ loài sứa

Aequorea Victoria Cấu trúc gfp hiện diện dưới dạng “β - can” (trụ tròn rỗng β), “can”

bao gồm 11 lọn β và 1 trung tâm xoắn ốc α Thể huỳnh quang được biểu hiện do thể nhiễm sắc ở trung tâm cấu trúc protein

Hình 1-10: Cấu trúc gfpvà liên kết đặc trưng Ser – Tyr – Gly

Sự phát sáng ở sứa A Victoria là do photoprotein (Aequorin) được kích hoạt bởi

ion Ca2+ Trong cơ chế còn có sự hiện diện của protein phát huỳnh quang gfp

Aequorin là một phân tử phức hợp apoprotein 2,4 kDa, oxygen phân tử và coelenterazine Khi Aequorin được kích hoạt bởi ion Ca2+, nó oxy hoá coelenterazine thành coelenteramide, nó ở trạng thái hoạt hóa Coelenteramide quay lại trạng thái ban đầu và phát ra ánh sáng ở bước sóng 470nm Năng lượng này được chuyển cho protein

huỳnh quang gfp và nó phát ra huỳnh quang màu xanh Nếu không có mặt protein gfp

sứa sẽ phát quang màu xanh biển với bước sóng 466nm

Protein gfp chứa một thể màu mà nó hấp thu ánh sáng xanh biển và chỉ cho phép

phát ra ánh sáng xanh lục Thể màu này được tổng hợp do cấu trúc đặc biệt của các

amino axit ở vị trí 65 – 67 (Ser – Tyr – Gly) của protein gfp Cấu trúc vòng giữa Ser 65

và Gly 67 được nối với chuỗi Tyr 66 cho phép thực hiện phản ứng oxi hoá ở mức năng lượng thấp Sử dụng bước sóng kích thích tối đa 395 nm (UV) với một đỉnh sáng nhỏ tại bước sóng 475 nm (blue), ánh sáng xanh lục sẽ được biểu hiện ở bước sóng 508nm (green) làm phát ra ánh sáng màu xanh lá cây

a Một số biến đổi của Protein gfp

Trong những năm qua, các dạng khác của protein gfpđã được tạo ra dựa vào kỹ

thuật sinh học phân tử để thay đổi cấu trúc chuỗi DNA, thay đổi các amino acid chính

yếu tạo nên thể màu trong phân tử gfp Bằng cách sử dụng các vector thích hợp, các

nhà nghiên cứu đã có thể thêm chuỗi DNA tạo ra các protein đang được nghiên cứu để

tạo ra chuỗi DNA – gfp Khi cấu trúc khảm này được chuyển vào trong tế bào, tế bào chủ sẽ tổng hợp một protein đơn chứa gfp và các protein đang nghiên cứu Khi chụp ảnh tế bào chủ, gfp và các protein đang được nghiên cứu sẽ phát quang xanh lục Duy nhất điều này đã giúp cho các tế bào chủ có thể nghiên cứu invivo mà không cần phải

gắn cố định hay sử dụng bất kỳ loại thuốc nhuộm nào

Nhiều dạng phụ của loại protein này đã được tạo ra và sử dụng như 1 công cụ thăm dò để nghiên cứu các tế bào sống Các dạng khác nhau của loại protein này có thể phát các ánh sáng như xanh dương, lục lam, vàng, đỏ

a Tách dòng và biểu hiện của gen gfp

Hoá biến nạp:

− Theo Mandel và Higa cho thấy rằng E Coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi DNA

ngoại lai khi các tế bào vi khuẩn này được xử lí trong môi trường có CaCl2 và trước đó được sốc nhiệt ở 420C

Hình 1-11: Sơ đồ chuyển đổi xanh biển sang xanhlục nhờ thay đổi mức năng lượng

− Tạo dạng vi khuẩn mang gen gfp bằng cách biến nạp plasmid theo phương pháp

Calcium-lạnh Tế bào được xử lý nhiệt độ thấp 0-40C trong dung dịch CaCl2, bổ sung DNA plasmid tái tổ hợp rồi sốc nhiệt tới 420C Sốc nhiệt giúp tính thấm của màng vi khuẩn bị thay đổi cho phép DNA xâm nhập vào Sử dụng môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc Kanamycin nồng độ 50mg/l Các hợp chất hoá sinh IPTG (Isopropyl β-D-thiogalatoseside) 50mg/l và X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolul β-D-galactopyranoside) 40mg/l được bổ sung vào môi trường nuôi cấy các thể biến nạp nhằm hoạt hoá enzyme β-galactosidase, cho phép chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng

− Hiệu suất của phương pháp này vào khoảng 105 đến 106 tế bào biến nạp trên 1mg DNA tái tổ hợp Qua các kết quả thực nghiệm, người ta thấy rằng, các tế bào phát triển ở pha sớm đến pha giữa dễ được biến nạp hơn Những nghiên cứu sau này cho thấy việc xử lí tế bào bằng các ion kim loại hoá trị hai như Mg2+, Mn2+ và Ba2+cũng cho khả năng biến nạp lớn Ngoài ra, hiệu suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước các plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biến nạp càng cao

Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium:

Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium để chuyển gen ở thực vật là phương pháp

hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực

vật một cách chính xác và ổn định Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi

xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn một đoạn DNA (T-DNA) vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường

hợp A tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A rhizogenes)

Dựa vào đặc tính của plasmid Ti trong tế bào vi khuẩn Agrobacterium là có khả

năng chuyển đoạn T – DNA vào hệ gen thực vật, các nhà khoa học đã tạo ra vector liên hợp và vector nhị thể để chuyển gen cần thiết vào cây trồng

• Vector liên hợp là kết quả của sự liên hợp của 2 loại plasmid: Plasmid Ti đã cắt bỏ gen gây khối u, các gen tổng hợp opine nhưng vẫn giữ vùng vir, bờ phải và bờ trái Thay vào những phần gen bị cắt bỏ là đoạn tương đồng của plasmid trung

cho hai loại plasmid này tiếp xúc với nhau chúng sẽ trao đổi chéo giữa 2 đoạn tương

đồngvới nhau Kết quả là tạo ra vector mới nằm trong vi khuẩn A tumefaciens , có

thể chuyển gen cần thiết vào cây theo cơ chế thông thường

• Vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có cả hai loại vector

(plasmid) cùng tồn tại và hoạt động trong vi khuẩn A tumefaciens Loại vector thứ nhất tách dòng từ E.Coli trong đó có thiết kế vùng bờ phải, bờ trái và ở giữa hai bờ

này là các gen chỉ thị và các gen cần chuyển vào cây Vector (plasmid) thứ hai chính là plasmid Ti đã bị cắt bỏ T – DNA, bờ phải, bờ trái và chỉ giữ lại vùng vir Nhờ hệ thống vector nhị thể này có thể chuyển gen một cách hữu hiệu

Agrobacterium đã mang gen cần chuyển sẽ xâm nhập vào tế bào của mẫu cấy từ các vết thương ở mép, chuyển plasmid có mang gen cần chuyển Sau đó, những tế bào này sẽ đuợc cho tái sinh tạo thành cây đã chuyển gen mong muốn

BÀO MÔ THỰC VẬT NHỜ A.Tumefaciens

Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng

gắn một đoạn DNA (T-DNA) vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối

loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A rhizogenes)

Hình 1-12 Cơ chế nhiễm Ti plasmidtừ A tumefaciensvào tế bào thực vật.

Protein gây độc

Diệp lục

nhân Nhiễm sắc thể

vi khuẩn

Ti thể Kênh vận

chuyển

- Gene mã hóa các enzyme tham gia tổng hợp opine không có vai trò đối với thực vật chuyển gene và có thể làm giảm năng suất thực vật do tiêu hao năng lượng vào việc tổng hợp opine Vì vậy, các gene này nên bị lọai bỏ

- Ti plasmid thường có kích thước lớn (200-800 kb) Trong quá trình thao tác với DNA tái tổ hợp, plasmid có kích thước nhỏ được ưu tiên Các đọan DNA không cần thiết cho quá trình tạo dòng và biểu hiện gene cần phải lọai bỏ

- Vì Ti-plasmid không sao chép trong E coli nên việc nhân dòng plasmid đã chèn đọan gene cần quan tâm trong E.coli không thực hiện được Do đó, khi xây dựng vector plasmid, đọan ori để sao chép trong E coli phải được thêm vào [4, tr517]

2 Kĩ thuật tạo vector tái tổ hợp được sử dụng để tạo ra vector dựa

trên nguyên tắc hoạt động của Ti-plasmid Những vector này

thường có các thành phần sau:

- Các gene chọn lọc (a selectable marker gene) như neomycin phosphotransferase, gene tạo khả năng kháng kanamycin của tế bào thực vật chuyển gene Vì một số gene kháng kháng sinh có nguồn gốc prokaryote, do đó, cần phải đặt chúng dưới sự điều hòa của trình tự phiên mã (promoter và trình tự kết thúc polyadenyl) của thực vật (prokaryote) để đảm bảo sự biểu hiện của gene chuyển trong tế bào thực vật

- Trình tự ori cần thiết cho sự sao chép và nhân đôi của plasmid trong E coli

- Trình tự vai phải của vùng T-DNA Vùng này tuyệt đối cần thiết cho quá trình

chuyển gene diễn ra Một số vector có thể có trình tự của cả hai vai

- Vùng polylinker (multiple cloning site) để thuận tiện cho việc cắt và chèn gene

vào plasmid [4, tr519]

Khả năng chuyển gen tự nhiên này được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn bằng cách nuôi mẫu cấy trong môi

trường thích hợp có chứa Agrobacterium mang vector cần chuyển Agrobacterium sẽ

xâm nhập vào tế bào của mẫu cấy từ các vết thương ở mép, chuyển plasmid có mang gen cần chuyển Sau đó, những tế bào này sẽ đuợc cho tái sinh tạo thành cây đã chuyển gen mong muốn [3, tr259]

3 Những phương pháp khảo sát sự hiện diện của gen gfp:

Điện di là một kỹ thuật được sử dụng trong phòng thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, người ta thường sử dụng điện di để tách các phân tử DNA nguyên vẹn, các phân đoạn DNA nguyên vẹn, các phân đoạn DNA do enzyme cắt hạn chế hay sản phẩm PCR DNA là một phân tử mang điện tích âm và di chuyển dòng điện chạy qua bản gel agarose từ cực âm catot sang cực dương anot

Trên cùng một gel, có cùng một dòng điện, các phân tử DNA khác nhau về khối lượng và do đó khác nhau về điện tích sẽ chạy được các quãng đường khác nhau sau

Hình 1-13: Sơ đồ mô tả sự chuyển gen vào thực vật bằng vi khuẩn

Agrobacterium

được các phân tử DNA trên cùng một bản gel Qua đó có thể so sánh DNA đang cần phân tích với các mẫu DNA chuẩn được biết trước khối lượng phân tử hoặc tách ly được các phân tử DNA có khối lượng khác nhau

Nguyên lí của phương pháp điện di gel Agarose:

• Trước khi đổ gel, hoà agarose khô vào đệm, đun nóng hỗn hợp cho nóng chảy đều Đổ dung dịch gel ấm vào khuôn đổ gel và cắm lược Nồng độ phần trăm agarose trong gel phụ thuộc vào kích thước phân đoạn DNA Thông thường người ta hay sử dụng gel agrose 0,7% Trong trường hợp kích thước phân đoạn DNA nhỏ hơm 1kb thì người ta đổ gel 1; 1,5; hoặc 2%, tuỳ theo kích thước của nó nhỏ đến mức nào Bổ sung EtBr vào gel để các phân tử DNA phát ra huỳnh quang dưới tia UV

• Nhúng ngập gel vào đệm điện di trong bồn điện di ngang Hoà trộn DNA với đệm nạp chứa thuốc nhuộm và nạp vào các giếng Chạy điện di thường với 150 – 200 mA trong 0,5 – 1 giờ ở nhiệt độ phòng tuỳ theo nhiệt mục đích phân tách mong muốn Khi sử dụng gel agarose nóng chảy thấp, chạy điện di với 100 – 120mA trong 0,5 đến 1 giờ cũng tuỳ theo mục đích mong muốn Có thể đặt vào buồng lạnh hoặc quạt để giải phóng nhiệt sinh ra khi điện di

• Để tiện việc xác định kích thước sơ bộ phân đoạn DNA, nạp DNA kích thước chuẩn và chạy điện di cùng Có rất nhiều thang DNA chuẩn Nhưng người ta hay sử dụng hai loại thang phổ biến là Φ – X 174 được cắt với endonuclease hạn chế

HaeIII để xác định các phân đoạn trong khoảng 0, 3 – 2 kb và λ phage được cắt với

endonuclease hạn chế HindIII để xác định các phân đoạn giữa 2 – 23 kb Sau khi

điện di, đặt gel vào buồng ánh sáng UV và chụp ảnh huỳnh quang DNA nhuộm EtBr

Ngoài ra người ta còn tiến hành điện di bằng gel polyacrylamide và điện di trong điện trường xung

• Gel polyacrylamide: Được dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ thường là dưới 1000 cặp base Thao tác với gel acrylamide thường phức tạp hơn so với gel agarose, do đó gel này chỉ được dùng với những mục đích mang tính đặc hiệu Gel

được đổ giữa hai tấm thủy tinh và phương điện di là phương thẳng đứng Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là:

∗ Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp ∗ Xác định trình tự DNA

∗ Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base

• Điện di trong trường xung: Được dùng để phân tách các đoạn DNA khá lớn (>50kb), không thể phân tách được bằng gel agarose dù ở nồng độ tối thiểu là 0.4% (dưới 0.4% bản gel sẽ quá mềm không thể thao tác được) Nguyên tắc của loại điện di này là sự thay đổi hướng của diện trường trong quá trình điện di Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải định hướng trở lại Thời gian định hướng sẽ tùy thuộc kích thước của phân tử, phân tử càng dài thì thời gian tự định hướng sẽ càng lớn khiến nó di chuyển chậm hơn các phân tử kích thước nhỏ

b Kỹ thuật PCR:

− Nguyên tắc: Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần đến sự hiện diện của những đoạn mồi chuyên biệt Mồi là một đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp chuyên biệt với một đầu của đoạn DNA mẹ, DNA polymerase sẽ nối dài mồi để tạo thành đoạn DNA mới Thật vậy, nếu ta cung cấp 2 mồi chuyên biệt bắt cặp với 2 đầu của hai mạch DNA của DNA mẹ ta sẽ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa 2 đoạn mồi Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA ta phải có các thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi chuyên biệt gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen

− Các thành phần tham gia phản ứng PCR:

• DNA khuôn (DNA template): Có thể là DNA kép đơn, hoặc RNA được tách chiết từ đối tượng nghiên cứu DNA khuôn phải có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp và có lượng ban đầu từ 1 đến hàng chục ng

• Mồi (primer): Lựa chọn các mồi rất quan trọng cho phản ứng PCR Đoạn mồi là các oligonucleotid có độ dài từ 6 – 30 nucleotid,có trình tự bắt cặp bổ sung với

• DNA polymerase: là enzym xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotid A, T, G, C vào các mạch DNA mới đang tổng hợp ngày nay người ta dùng nhiều loại

DNA polymerase: Tag DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, T4 DNA

polymerase… Nhưng phổ biến nhất là Tag DNA polymerase Tag DNA polymerase được tách chiết từ chủng vi khuẩn suối nước nóng Thermophilus

aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA ( 920C) Tag DNA

polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra nhanh , chính xác và đặc hiệu

• Các deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP) gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tham gia tạo nên mạch DNA mới Nồng độ tối ưu của

dNTP thường dùng là 100 – 200 μM Tuy nhiên ở nồng độ thấp hơn thì Tag

DNA polymerase hoạt động chính xác hơn

• Dung dịch đệm (buffer): Thành phần dung dịch đệm của phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại enzym DNA polymerase sử dụng trong PCR Ví dụ, thành

phần dung dịch đệm 10X cho phản ứnh PCR khi sử dụng Tag DNA polymerase

bao gồm:

✔ Tris – HCl 100μM với pH = 8 ở 250C ✔ KCl 500 μM

✔ Gelatin 0,01%

✔ MgCl2 2mM Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0,5 đến 5nM Chính ion Mg2+ có tác dụng gắn liên kết dNTP với DNA polymerase tăng khả năng bám nối của mồi

− Thực nghiệm:

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: • Bước 1 Trong thành phần hỗn hợp phản ứng phải bao gồm các thành phần phản ứng của sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 940 – 95 0C trong vòng 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn biến tính

• Bước 2 Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 400-700C tùy thuộc Tm của mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây-1 phút Đây là giai đoạn lai

• Bước 3 Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp là tốt nhất Thời gian tùy thuộc vào độ dài của phân tử DNA cần khuếch đại khoảng từ 30 giây cho đến nhiều phút Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài

• Một chu kỳ PCR gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng đôi số lượng mẫu của lần trước đó Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu

− Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR:

• DNA mẫu: phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA tinh sạch tuy nhiên nhiều kĩ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt được kết quả cao với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm với việc sử dụng polymerase hiệu quả cao Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban đầu còn giảm được sự khuếch đại ký sinh tạo những sản phẩm phụ không mong muốn Một ưu điểm có thể kể đến của phương pháp PCR là khuếch đại được cả các mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết,…

• Enzyme: Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I nhưng vì đây là enzyme không chịu được nhiệt độ cao nên thao tác phức tạp và không hiệu quả (phải thêm enzyme mới vào sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị phân hủy do nhiệt độ), nhiệt độ lai thấp dẫn đến khuếch đại ký sinh rất cao Phương pháp PCR được cải tiến và đạt được hiệu quả cao với sự xuất hiện của polymerase chịu nhiệt Taq polymerase không bị phân hủy ở nhiệt độ biến

• Mồi và nhiệt độ lai: Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR và phải tuân thủ một số nguyên tắc như: chọn mồi không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược, không có cấu trúc kẹp tóc Tm của mồi xuôi và mồi ngược không được cách nhau quá xa, thành phần các baze phải cân bằng tránh sự lập lại nhiều lần các cặp GC Mồi phải đặc trưng cho đoạn gen cần khuếch đại và không được trùng với các trình tự lặp trên gen trình tự nằm giữa hai mồi không được quá lớn

• Các thành phần khác: Nồng độ 4 loại base thường sử dụng ở nồng độ 20 – 200 microgam/lít/base Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến khuếch đại ký sinh, sự mất cân bằng trong thành phần các Nucleotid cũng có thể làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

• Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR: Thường không thực hiện vượt quá 40 chu kỳ/phản ứng PCR Do trong giai đoạn đầu của mỗi phản ứng PCR số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu Nhưng sau đó hiệu quả khuếch đại sẽ giảm hẳn do nhiều nguyên nhân : sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng,

các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau… − Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR:

Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của cùng một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị Ống nghiệm cho mỗi nghiên cứu cụ thể cũng phải cùng loại vì đặc tính truyền nhiệt của mỗi loại ống cũng khác nhau do khác nhau về vật liệu, hình dạng ống… ảnh hưởng lớn đến quá trình

thực hiện phản ứng

− Một số nhược điểm của phương pháp PCR:

• Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên Phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb

Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5kb cho kết quả tốt

• Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này Trong đó nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là những sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ… rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành

sau đó

• Các sai sót do Tag polymerase: Sự sao chép bởi Tag polymerase cho tỷ lệ sai sót khá cao Đặc tính này đặc biệt có ảnh hưởng nghiêm trong khi ta cần xác định chính xác trình tự DNA

NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN PHÁT SÁNG gfp

TRONG NHỮNG NĂM GẦN ĐÂY:

Ứng dụng quan trọng nhất của protein gfp là làm chất dò sinh học để minh hoạ cụ

thể chi tiết các quá trình sinh học như quá trình tạo khối u trong cơ thể động vật, quá trình phân chia tế bào, quá trình cộng sinh tương tác với thực vật (như sự cộng sinh) hay phát hiện các virus xâm nhập Đặc biệt đối với tế bào thực vật, không thể sử dụng

thuốc nhuộm và chúng không thấm được vào tế bào thực vật, gfp được sử dụng như

một công cụ thăm dò quan trọng để kiểm tra những quá trình nội bào

1 Chuột phát sáng:

Gần đây nhà sinh học từng đoạt giải Nobel ở Viện công nghệ California đã sử

dụng phương pháp Lentivirus, vốn là họ hàng xa của virus HIV đã bị bất hoạt để đưa

gen sứa vào phôi chuột Kết quả thí nghiệm cho thấy hơn 80% chuột sinh ra từ các phôi trên đều chứa protein đặc biệt của sứa Chúng phân tán khắp cơ thể và làm cho những

chú chuột bị phát sáng dưới tia UV