Sự tạo thành mô bứu là kết quả của sự di chuyển, biến nạp integration và biểu hiện của một đọan chuyên biệt trong plasmid của vi khuẩn, gọi là T-DNA vào bộ gene của thực vật.. tumerfacie
GIỚI THIỆU VỀ CÂY CÁT TƯỜNG
NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI
Có nguồn gốc từ vùng Tây Nam nước Mỹ, hoa cát tường (Eustoma grandiflorum (Raf) Shiners hay Eustoma russllianum (Hook) G.Don) đã được du nhập vào Việt Nam hơn 8 năm qua Với khả năng chịu lạnh tốt, hoa cát tường được ưa chuộng với nhiều màu sắc đa dạng như kem, tím, vàng, hồng, hồng phai, tím đậm, trắng viền tím Mặc dù không rực rỡ như hoa cúc hay lộng lẫy như hoa hồng, loài hoa này lại thu hút người nhìn bởi vẻ đẹp giản dị và mang ý nghĩa may mắn, cát tường.
Hiện tại cát tường là giống hoa được người tiêu dùng rất ưa chuộng và đang được sản xuất làm hoa thương phẩmh(hoa cắt cành) Hoa cát tường được sản xuất nhiều ở Đà Lạt vì điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng nơi đây rất phù hợp với đặc điểm sinh trưởng của nó Ngoài ra, cát tường còn được coi là hoa chủ lực và làm lên thương hiệu nhiều vườn hoa như vườn hoa Lang Biang Farm Hiện nay, do nhu cầu chơi hoa cát tường ngày càng tăng, hoa sản xuất ra không đủ cầu Vì vậy, Hiệp hội hoa Đà Lạt đã tổ chức hội thảo chuyên đề về qui trình kỹ thuật canh tác, thu họach hoa cát tường với sự có mặt của 10 nhà khoa học và hơn 40 người trồng hoa trên địa bàn Đà Lạt để trồng hoa cát tường có hiệu quả và cung cấp tốt nhất nhu cầu của người tiêu dùng
Phân loại cây cát tường:
⮚ Giới phụ cây thân thảo
♦ Lớp cây hai lá mầm
♦ Giống Eustoma salisb.ex G.Don
❖ Loài Eustoma exaltatum (L.) Salisb.ex G.Don
❖ Phân loài Eustoma exaltatum (L.) Salisb.ex G.Don ssp.russellianum (Hook.) Kartes
Giống hoa cát tường gồm có hai loại: Giống hoa kép và hoa đơn
− Giống hoa kép: Gồm Nhóm Avilia, Nhóm Balboa, Nhóm Catalina, Nhóm Candy, Nhóm Echo, Nhóm Mariachi…
− Giống hoa đơn: Gồm nhóm Flamenco, Nhóm Heidi, Nhóm Laguna, Nhóm Malibu, Nhóm Yodel.
MÔI TRƯỜNG SỐNG VÀ ĐẶC ĐIỂN SINH LÝ CỦA CÂY CÁT TƯỜNG
Hoa cát tường sinh trưởng tốt trong điều kiện ánh sáng tự nhiên ở mức 70 - 80 Klux Do vậy, vào mùa xuân và mùa hè khi cường độ ánh sáng cao, nên che lưới cho hoa Ngoài ra, loài hoa này phù hợp với vụ dài ngày, yêu cầu số giờ chiếu sáng tối ưu là 16 giờ mỗi ngày để đảm bảo chất lượng hoa tốt nhất.
Nhiệt độ tối thích cho hoa cát tường sinh trưởng và phát triển là từ 18 – 20 0 C vào ban ngày và 15 – 18 0 C vào ban đêm Nhiệt độ vào ban đêm thấp hơn 15 0 Csẽ làm trì trệ quá trình sinh trưởng của cây Vào ban ngày, khi nhiệt độ cao hơn 28 0 C sẽ làm cho hoa nở sớm, rút ngắn quá trình sinh trưởng của hoa và cho hoa kém chất lượng Tùy theo từng chủng loại giống mà có yêu cầu về nhiệt độ và quang chu kỳ khác nhau Tính cả thời gian từ lúc gieo hạt cho đến khi cây ra hoa là từ 20 – 23 tuần
Nước là nhu yếu thiết yếu để cây cát tường phát triển và ra hoa Ngược lại, khi đất quá khô hạn, cây sẽ chậm lớn và hoa ra kém phẩm chất Song, nếu tình trạng ngập úng kéo dài, vi sinh vật gây thối gốc sẽ tấn công khiến cây chết Vì vậy, việc duy trì độ ẩm đất hợp lý là điều kiện tiên quyết khi trồng hoa cát tường Giai đoạn đầu, phun nước là biện pháp thích hợp trong 2-3 tuần đầu mới trồng Sau đó, sử dụng hệ thống phân phối nước tưới vào gốc cho đến lúc thu hoạch.
⮚ Độ pH Độ pH là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của cây Cát tường Có nhiều những nghiên cứu đã đưa ra mức pH phù hợp cho sự phát triển của cây con lẫn cây đã lớn là trong khoảng 5.8– 7
B.K Harbaugh và S.S.Woltz sau khi tiến hành khảo sát tác động của pH trong môi trường rễ lên quá trình sinh trưởng và phát triển của Cát tường đã đưa ra một số kết quả (bảng 1.1)
Bảng 1.1 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của cây Độ pH
Cây con Cây ra hoa tán cây (cm) trọng lượng (g) chiều cao (cm) trọng lượng(g) số hoa và chồi hoa
Qua bảng trên ta thấy cây con cũng như cây đã ra hoa đều phát triển tốt nhất ở pH từ 5.8 - 7 Số hoa và chồi cũng nhiều nhất khi pH trong khoảng này Ta có thể điều
Cây Cát tường trải qua hai giai đoạn phát triển rõ rệt Giai đoạn đầu, khi cây con phát triển kéo dài cho đến khi ra hoa, cần cung cấp nồng độ Nitơ trong khoảng 100-
150 ppm, dưới dạng muối nitrate, nồng độ Kali cũng được cung cấp ở mức độ cân bằng với Nitơ
Pha thứ hai bắt đầu khi những nụ hoa nhỏ được hình thành Trong giai đoạn này, ta cần phải giảm nồng độ Nitơ, đồng thời tăng nồng độ Kali.Tỷ lệ giữa Nitơ và Kali thích hợp nhất trong giai đoạn này là 1N:1.5K Để tạo môi trường cho sự phát triển của cát tường, ta cũng phải giữ hàm lượng Canxi trong đất ở mức độ cao, khoảng 1500ppm
Có một điều cần lưu ý là lượng phân bón cho cây trong từng giai đoạn quan trọng nhưng khả năng hấp thụ phân bón mới quyết định Khả năng này phụ thuộc nhiều vào pH của môi trường có thích hợp hay không.
CƠ SỞ XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH
Một số khái niệm
Sự tái sinh cơ quan là quá trình phân hóa hình thành các cơ quan từ tế bào chưa phân hóa hoặc từ tế bào chưa phân hóa nhưng đã trải qua giai đoạn phản phân hóa Ở thực vật có sự tái sinh là do nó có tính mềm dẻo và tính toàn năng
Tính mềm dẻo là khả năng thay đổi để thích nghi với sự thay đổi của điều kiện môi trường và sự tổn thương do thực vật sống cố định trong xuốt thời gian sống
Tính toàn năng là khả năng tái sinh và biểu hiện tất cả các đặc điểm di truyền ẩn chứa trong gen của một loại cây nào đó từ một mô thuộc cây đó khi được kích thích thích hợp Quá trình nuôi cấy mô và tái sinh cây đã cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất về tính toàn năng này.
Sự tái sinh là kết quả của quá trình biệt hoá lần hai được cho bởi sự tái biệt hoá của tế bào Nó không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình phức tạp gồm các giai đoạn sau :
✔ Sự phân hoá của những tế bào đã phân hoá ( có thể dẫn đến sự tái xác định và
✔ Sự phân chia tế bào, đôi khi tạo thành mô sẹo; khi tế bào phân chia thì bắt đầu xảy ra sự hình thành cơ quan
✔ Sự hình thành cơ quan
✔ Sự phát triển của cơ quan
Xây dựng hệ thống tái sinh là quá trình nguyên cứu thực nghiệm để tìm ra những điều kiện tối ưu cho sự tái sinh của một đối tượng xác định Qua thực nghiệm cho thấy điều khiện nuôi cấy và kích thích để cây tái sinh có thể rất khó khăn và nó vẫn phụ thuộc nhiều và kinh nghiệm.
Nguyên liệu để tái sinh
Nguyên liệu để tái sinh có thể đi từ những tế bào.
• Chưa phân hoá: mô sẹo, đỉnh sinh trưởng , tế bào tiền phôi (hợp tử)
• Đã phân hoá: lá , thân , rễ , phôi … Đối với những tế bào chưa phân hoá, sự tái sinh sẽ diễn ra khi gặp điều kiện thuận lợi Còn những tế bào đã phân hoá chỉ có thể tái sinh được sau khi trải qua quá trình phản phân hoá để trở thành tế bào chưa phân hoá Quá trình này kéo dài hay ngắn phụ thuộc nguồn gốc của tế bào đã phân hoá Tế bào càng già thì thời gian phản phân hoá càng lâu, khả năng phân hoá càng khó.
Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tái sinh
Những đặc tính chính của mẫu cấy ảnh hưởng đến sự phản ứng của mẫu cấy trong môi trường nuôi cấy là:
✔ đặc điểm sinh lý và tuổi của mẫu cấy
✔ mùa mà mẫu cấy được thu nhận
✔ kích thước của mẫu cấy
✔ chất lượng chung của cây lấy mẫu
Nói chung, tất cả các mẫu cấy (lá, thân, rễ, hoa, phôi…) đều có khả năng tái sinh mẫu cấy đều có thể phân chia, tái sinh trực tiếp hay gián tiếp thông qua mô sẹo Những mẫu cấy còn non, trong đó có nhiều tế bào phân chia mạnh sẽ dễ phân chia tiếp trong nuôi cấy và dễ tái sinh hơn
⮚ Dinh dưỡng và thành phần của môi trường
Mỗi loại cây khác nhau thì sẽ có một môi trường dinh dưỡng với những thành phần và nồng độ khác nhau Trong đó có những yếu tố chính sau:
✔ môi trường giàu dinh dưỡng và nghèo dinh dưỡng thường dùng là MS và
✔ nguồn cacbon (dùng làm năng lượng) thường dùng là 2-4 % suerose
✔ nguồn nito thường được hạ thấp
✔ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: auxins (2,4-D, IAA, NAA và IBA); cytokinins (kinetin và BA), gibberellin, abscisic acid…
✔ các vitamine: inositol, nicotinic acid, pyridoxine và thiamine
✔ một số hợp chất khác như: acid amin, polyamine, dyosacharide…
⮚ tính chất môi trường nuôi cấy
✔ dạng môi trường: đặc hay lỏng (có hay không có agar)
✔ cường độ và thời gian chiếu sáng
✔ sự thông khí của thiết bị nuôi cấy
PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE THỰC VẬT
Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật
Hàng loạt các phương pháp chuyển gen đã được khám phá như phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterrium tumefacien (Klee và Roger,1989), chuyển gen trực tiếp bằng kỹ thuật bắn gen (Klein và CS, 1989), vi tiêm (Neuhaus và CS, 1987), xử lý laser (Weber và CS, 1988),… Trong đó, cho đến nay, kỹ thuật chuyển gen bằng A.tumefaciens vẫn được coi là phương pháp đơn giản và đạt hiệu quả cao
Chuyển gen được thực hiện qua các bước cơ bản sau:
- Xác định gen liên quan đến tính trạng quan tâm
- Gắn gen vào vector biến nạp
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật
- Chọn các thể biến nạp
- Tái sinh cây biến nạp
- Chứng minh sự có mặt của gen trong cây tái sinh.
Giới thiệu về vi khuẩn E.Coli và vi khuẩn Agrobacterium
a Giới thiệu về vi khuẩn E.Coli :
• Tên khoa học: Escherichia coli
Escherichia coli (thường được viết tắt là E coli) là vi khuẩn gram âm, có hình que dài khoảng 1 micromet) một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú) Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột E coli thuộc họ vi khuẩn
Enterobacteriaceae E.Coli có 1 nhiễm sắc thể (phân tử DNA) dạng vòng nằm trong vùng nhân Kích thước của các phân tử DNA này khoảng 4 ×10 6 cặp base Các quá trình biểu hiện của gen như phiên mã, dịch mã, được xảy ra đồng thời Sau khi RNA được tổng hợp sẽ được sử dụng ngay để dịch mã mà không qua các bước sửa đổi sau phiên mã vì gen của chúng không có các đoạn intron (đoạn không mã hoá) Do vậy,
E.Coli được coi là tế bào chủ đơn giản nhất Rất nhiều các thí nghiệm tách dòng gen ở các phòng thí nghiệm đang sử dụng E.Coli là tế bào chủ
Người ta thường dùng E Coli là vật chủ thu nhận các vector chuyển gen do đặc tính dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống lại chấp nhận được nhiều vector Tế bào E Coli sau 30 phút đã tự nhân đôi Từ 1 tế bào E Coli sau 12 giờ tiến hành được 24 đợt nhân đôi cho 224 tế bào (trên 16 triệu tế bào) Trong các tế bào đó DNA tái tổ hợp cũng được nhân lên nhanh chóng, sản xuất ra 1 lượng lớn các chất tương ứng với gen đã ghép vào plasmit Vì thế vi khuẩn E.coli đáp ứng được các yêu cầu của tế bào chủ lí tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dòng gen Do tính chất đặc biệt của tế bào chủ lí tưởng nên E.Coli được nghiên cứu tỷ mỉ về cơ chế di truyền, phân lập và tạo nên nhiều chủng khác nhau Các nghiên cứu đó làm cơ sở cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp và Công nghệ di truyền
Trong công tác chuyển gen vào thực vật, người ta thường sử dụng vi khuẩn E Coli để tạo ra 1 lượng lớn DNA cần thiết dùng làm nguyên liệu cho việc chuyển gen vào thực vật bằng phương pháp bắn gen b Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium :
• Loài: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes
− Agrobacterium là nhóm vi sinh vật đất gram âm gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương
− Chi Agrobacterium gồm 1 số loài chính sau:
• A.tumefaciens gây bệnh u thân cây
• A.shizogenes gây bệnh tóc rễ cây
• A.rubi gây bệnh u cho cây dâu đất, mâm xôi…
− Hiện nay, người ta đã nghiên cứu và khai thác khả năng sử dụng chúng như một vector tự nhiên để mang gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật
Hình 1-3: A tumerfacien chụp dưới kính hiển vi(1)
− Ở A.tumefaciens có chứa một plasmid lớn có kích thước cỡ 200kb gọi là Ti plasmid (Tumor inducing plasmid) plasmid này có khả năng sao chép độc lập, đây chính là thủ phạm truyền bệnh cho cây
Agrobacterium tumefaciens nhóm vi khuẩn Gram âm sống tự do trong đất Dòng vi khuẩn này có khả năng nhiễm vào cây hai lá mầm và cảm ứng tạo bứu ở cổ rễ thực vật (crown gall) Sự tạo thành mô bứu là kết quả của sự di chuyển, biến nạp (integration) và biểu hiện của một đọan chuyên biệt trong plasmid của vi khuẩn, gọi là T-DNA vào bộ gene của thực vật T-DNA là một phần của Ti-plasmid (tumor inducing- plasmid cảm ứng tạo bướu)- hầu hết các dòng Agrobacterium đều có mang plasmid này Tùy vào các dòng vi khuẩn khác nhau mà chiều dài vùng T-DNA có thể thay đổi từ 12-24 kb Những dòng Agrobacterium không chứa Ti-plasmid không có khả năng tạo mô bứu [4, tr514]
Hình 1-4: A tumerfacien chụp dưới kính hiển vi.
Các quá trình xảy ra trong quá trình chuyển gene từ Agrobacteriums vào tế bào thực vật
✔ Khởi sự từ vết thương, tế bào thực vật tạo ra các hợp chất phenol như acetosyringon và hydroxyacetosyringone [3, tr256] Các hợp chất này là sản phẩm của con đường tổng hợp một số sản phẩm thứ cấp như lignin và flavonoid Acetosyringon và hydroxyacetosyringone có vai trò cảm ứng gene gây độc (virulence- vir gene) trong Ti plasmid [4, tr514]
✔ Acetosyringon di chuyển vào tế bào vi khuẩn, cảm ứng sự cắt đứt sợi đơn T- DNA, tạo bản sao sợi đơn này để có DNA sợi kép
✔ T-DNA sợi kép được chuyển và xen vào bộ gene của tế bào thực vật
✔ T-DNA biểu hiện trong tế bào thực vật: tạo các hợp chất opin và các chất đìều hòa sinh trưởng như auxin và cytokinin liên quan đến sự tạo bướu [3, tr256]
− Khi cây bị nhiễm A tumefaceins qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn Khả năng này có được là do vi khuẩn đã chuyển một đoạn DNA của Ti plasmid (T-DNA) nhập vào bộ gen của cây bị bệnh Phân tích các khối u ở cây cho thấy sự hình thành các chất mới như nopalin và octopin được gọi chung là opin Các chất opin này không tồn tại ở cây bình thường
Hình 1-5: Cây bị bệnh do vi khuẩn A tumefaceins c.Cấu trúc và chức năng của T-DNA
• T-DNA đã được nghiên cứu rất kỹ Đó là một đoạn DNA có kích thước
25000 bp trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) có các đoạn nucleotid tương tự nhau Ngoài T-DNA, trên Ti plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm (vir region) và chuyển nạp (conjugative transfer), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism)
Hình 1-6 : Cấu trúc của plasmid Ti
• Trong các vùng DNA của Ti plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng Vir Sản phẩm hoạt động của gen nằm trong vùng này dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt protein đặc hiệu vir E2, vir B, vir D, vir
• Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với bộ gen của cây chủ một cách an toàn
• Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn”, nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti plasmid
GIỚI THIỆU VỀ gfp
SƠ LƯỢC VỀ GEN gfp VÀ PROTEIN gfp
Hệ thống gen GFP (gen tạo nên protein phát sáng sinh học) là một công cụ hứa hẹn trong nghiên cứu khoa học nhờ tính dễ dàng kiểm tra hơn so với gen chỉ thị GUS A GFP không chỉ giúp đánh giá biểu hiện in vivo để xác định protein dung hợp, mà còn hỗ trợ nghiên cứu vận chuyển protein nội bào và định vị tế bào đặc biệt trong hệ thống đa bào.
Protein phát quang lục (green fluorescent protein) hay gfp là một protein được khám phá bởi Shimomura (1962) từ con sứa biển Aequorea Victoria gfp với choromophore phát ra đã đem lại ma lực, sự quyến rũ vốn có bên trong và cả một giá trị to lớn do tính dễ phát hiện trong cơ thể sống Chỉ mới ba năm sau đó, protein gfp từ chỗ ít được biết đến đã trở thành một trong những protein được nghiên cứu và khai thác rộng lớn trong y sinh học và trong tế bào học
CẤU TRÚC ĐẶC TRƯNG VÀ BIỂU HIỆN CỦA gfp
gfp có cấu trúc nguyên thuỷ gồm 238 amono axit được dẫn xuất từ loài sứa
Aequorea Victoria Cấu trúc gfp hiện diện dưới dạng “β - can” (trụ tròn rỗng β), “can” bao gồm 11 lọn β và 1 trung tâm xoắn ốc α Thể huỳnh quang được biểu hiện do thể nhiễm sắc ở trung tâm cấu trúc protein
Hình 1-10: Cấu trúc gfp và liên kết đặc trưng Ser – Tyr – Gly
Sự phát sáng ở sứa A Victoria là do photoprotein (Aequorin) được kích hoạt bởi ion Ca 2+ Trong cơ chế còn có sự hiện diện của protein phát huỳnh quang gfp
Aequorin là một phân tử phức hợp apoprotein 2,4 kDa, oxygen phân tử và coelenterazine Khi Aequorin được kích hoạt bởi ion Ca 2+ , nó oxy hoá coelenterazine thành coelenteramide, nó ở trạng thái hoạt hóa Coelenteramide quay lại trạng thái ban đầu và phát ra ánh sáng ở bước sóng 470nm Năng lượng này được chuyển cho protein huỳnh quang gfp và nó phát ra huỳnh quang màu xanh Nếu không có mặt protein gfp sứa sẽ phát quang màu xanh biển với bước sóng 466nm
Protein gfp chứa một thể màu mà nó hấp thu ánh sáng xanh biển và chỉ cho phép phát ra ánh sáng xanh lục Thể màu này được tổng hợp do cấu trúc đặc biệt của các amino axit ở vị trí 65 – 67 (Ser – Tyr – Gly) của protein gfp Cấu trúc vòng giữa Ser 65 và Gly 67 được nối với chuỗi Tyr 66 cho phép thực hiện phản ứng oxi hoá ở mức năng lượng thấp Sử dụng bước sóng kích thích tối đa 395 nm (UV) với một đỉnh sáng nhỏ tại bước sóng 475 nm (blue), ánh sáng xanh lục sẽ được biểu hiện ở bước sóng 508nm (green) làm phát ra ánh sáng màu xanh lá cây a Một số biến đổi của Protein gfp
Trong những năm qua, các dạng khác của protein gfpđã được tạo ra dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử để thay đổi cấu trúc chuỗi DNA, thay đổi các amino acid chính yếu tạo nên thể màu trong phân tử gfp Bằng cách sử dụng các vector thích hợp, các nhà nghiên cứu đã có thể thêm chuỗi DNA tạo ra các protein đang được nghiên cứu để tạo ra chuỗi DNA – gfp Khi cấu trúc khảm này được chuyển vào trong tế bào, tế bào chủ sẽ tổng hợp một protein đơn chứa gfp và các protein đang nghiên cứu Khi chụp ảnh tế bào chủ, gfp và các protein đang được nghiên cứu sẽ phát quang xanh lục Duy nhất điều này đã giúp cho các tế bào chủ có thể nghiên cứu invivo mà không cần phải gắn cố định hay sử dụng bất kỳ loại thuốc nhuộm nào
Nhiều dạng phụ của loại protein này đã được tạo ra và sử dụng như 1 công cụ thăm dò để nghiên cứu các tế bào sống Các dạng khác nhau của loại protein này có thể phát các ánh sáng như xanh dương, lục lam, vàng, đỏ a Tách dòng và biểu hiện của gen gfp
Theo Mandel và Higa, phơi tế bào vi khuẩn E coli trong dung dịch CaCl2 sau khi sốc nhiệt ở 42 độ C làm tăng đáng kể tính dễ bị biến nạp DNA ngoại lai của chúng.
Hình 1-11: Sơ đồ chuyển đổi xanh biển sang xanh lục nhờ thay đổi mức năng lượng
− Tạo dạng vi khuẩn mang gen gfp bằng cách biến nạp plasmid theo phương pháp Calcium-lạnh Tế bào được xử lý nhiệt độ thấp 0-4 0 C trong dung dịch CaCl2, bổ sung DNA plasmid tái tổ hợp rồi sốc nhiệt tới 42 0 C Sốc nhiệt giúp tính thấm của màng vi khuẩn bị thay đổi cho phép DNA xâm nhập vào Sử dụng môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc Kanamycin nồng độ 50mg/l Các hợp chất hoá sinh IPTG (Isopropyl β-D-thiogalatoseside) 50mg/l và X-gal (5-Bromo 4-chloro 3- indolul β-D-galactopyranoside) 40mg/l được bổ sung vào môi trường nuôi cấy các thể biến nạp nhằm hoạt hoá enzyme β-galactosidase, cho phép chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng
− Hiệu suất của phương pháp này vào khoảng 10 5 đến 10 6 tế bào biến nạp trên 1mg DNA tái tổ hợp Qua các kết quả thực nghiệm, người ta thấy rằng, các tế bào phát triển ở pha sớm đến pha giữa dễ được biến nạp hơn Những nghiên cứu sau này cho thấy việc xử lí tế bào bằng các ion kim loại hoá trị hai như Mg 2+ , Mn 2+ và Ba 2+ cũng cho khả năng biến nạp lớn Ngoài ra, hiệu suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước các plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biến nạp càng cao
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium:
Việc sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium để chuyển gen ở thực vật là phương pháp phổ biến nhất hiện nay do khả năng đưa gen ngoại lai vào hệ gen thực vật chính xác và ổn định Agrobacterium gây bệnh bằng cách xâm nhập vào tế bào thực vật và gắn một đoạn DNA (T-DNA) vào bộ máy di truyền của tế bào, dẫn đến rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh Tùy vào từng loại Agrobacterium, quá trình này có thể tạo ra khối u (trường hợp A tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A rhizogenes).
Các nhà khoa học đã tận dụng khả năng chuyển gen của plasmid Ti trong Agrobacterium để tạo ra các vectơ chuyên chở gen Vectơ liên hợp và vectơ nhị thể được phát triển với mục đích đưa gen mong muốn vào cây trồng, mở ra cánh cửa cho quá trình chuyển gen được cải tiến và hiệu quả hơn.
• Vector liên hợp là kết quả của sự liên hợp của 2 loại plasmid: Plasmid Ti đã cắt bỏ gen gây khối u, các gen tổng hợp opine nhưng vẫn giữ vùng vir, bờ phải và bờ trái Thay vào những phần gen bị cắt bỏ là đoạn tương đồng của plasmid trung cho hai loại plasmid này tiếp xúc với nhau chúng sẽ trao đổi chéo giữa 2 đoạn tương đồngvới nhau Kết quả là tạo ra vector mới nằm trong vi khuẩn A tumefaciens , có thể chuyển gen cần thiết vào cây theo cơ chế thông thường
• Vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có cả hai loại vector (plasmid) cùng tồn tại và hoạt động trong vi khuẩn A tumefaciens Loại vector thứ nhất tách dòng từ E.Coli trong đó có thiết kế vùng bờ phải, bờ trái và ở giữa hai bờ này là các gen chỉ thị và các gen cần chuyển vào cây Vector (plasmid) thứ hai chính là plasmid Ti đã bị cắt bỏ T – DNA, bờ phải, bờ trái và chỉ giữ lại vùng vir Nhờ hệ thống vector nhị thể này có thể chuyển gen một cách hữu hiệu
Agrobacterium đã mang gen cần chuyển sẽ xâm nhập vào tế bào của mẫu cấy từ các vết thương ở mép, chuyển plasmid có mang gen cần chuyển Sau đó, những tế bào này sẽ đuợc cho tái sinh tạo thành cây đã chuyển gen mong muốn.
Tumefaciens
Vector
Mặc dù Ti-plasmid là vector tự nhiên nhưng chúng có nhược điểm so với vector nhân dòng:
- Sự sản xuất hormone thực vật của tế bào thực vật chuyển gene sống trong môi trường ngăn cản chúng tái sinh thành cây trưởng thành Do đó, gene mã hóa enzyme tham gia tổng hợp auxin và cytokinin cần phải được lọai bỏ khỏi Ti- plasmid
Diệp lục nhân Nhiễm sắc thể vi khuẩn
Ti thể Kênh vận chuyển
Các gen mã hóa enzyme tổng hợp opine không có lợi cho cây chuyển gen và thậm chí có thể làm giảm năng suất cây do tiêu tốn năng lượng để tổng hợp opine Do đó, nên loại bỏ các gen này.
- Ti plasmid thường có kích thước lớn (200-800 kb) Trong quá trình thao tác với DNA tái tổ hợp, plasmid có kích thước nhỏ được ưu tiên Các đọan DNA không cần thiết cho quá trình tạo dòng và biểu hiện gene cần phải lọai bỏ
Do nguồn gốc sao chép của Ti-plasmid không hoạt động trong E coli, nên để nhân dòng plasmid chứa gen quan tâm trong E coli, cần bổ sung thêm nguồn gốc sao chép của E coli vào cấu trúc vector plasmid [4, tr517].
Kĩ thuật tạo vector tái tổ hợp được sử dụng để tạo ra vector dựa trên nguyên tắc hoạt động của Ti - plasmid Những vector này thường có các thành phần sau
thường có các thành phần sau:
- Các gene chọn lọc (a selectable marker gene) như neomycin phosphotransferase, gene tạo khả năng kháng kanamycin của tế bào thực vật chuyển gene Vì một số gene kháng kháng sinh có nguồn gốc prokaryote, do đó, cần phải đặt chúng dưới sự điều hòa của trình tự phiên mã (promoter và trình tự kết thúc polyadenyl) của thực vật (prokaryote) để đảm bảo sự biểu hiện của gene chuyển trong tế bào thực vật
- Trình tự ori cần thiết cho sự sao chép và nhân đôi của plasmid trong E coli
Trình tự của vùng T-DNA trên vai phải là yêu cầu cần thiết trong quá trình chuyển gen Điều này là do vùng T-DNA chứa mã di truyền chỉ đạo cho quá trình tích hợp DNA lạ vào hệ gen của tế bào vật chủ Một số vectơ có thể mang trình tự của cả hai vai phải và trái, giúp tăng khả năng tích hợp thành công của DNA lạ.
- Vùng polylinker (multiple cloning site) để thuận tiện cho việc cắt và chèn gene vào plasmid [4, tr519]
Khả năng chuyển gen tự nhiên này được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn bằng cách nuôi mẫu cấy trong môi trường thích hợp có chứa Agrobacterium mang vector cần chuyển Agrobacterium sẽ xâm nhập vào tế bào của mẫu cấy từ các vết thương ở mép, chuyển plasmid có mang gen cần chuyển Sau đó, những tế bào này sẽ đuợc cho tái sinh tạo thành cây đã chuyển gen mong muốn [3, tr259].
Những phương pháp khảo sát sự hiện diện của gen gfp
a Kỹ thuật điện di: Điện di là một kỹ thuật được sử dụng trong phòng thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, người ta thường sử dụng điện di để tách các phân tử DNA nguyên vẹn, các phân đoạn DNA nguyên vẹn, các phân đoạn DNA do enzyme cắt hạn chế hay sản phẩm PCR DNA là một phân tử mang điện tích âm và di chuyển dòng điện chạy qua bản gel agarose từ cực âm catot sang cực dương anot
Trên cùng một gel, có cùng một dòng điện, các phân tử DNA khác nhau về khối lượng và do đó khác nhau về điện tích sẽ chạy được các quãng đường khác nhau sau
Hình 1-13: Sơ đồ mô tả sự chuyển gen vào thực vật bằng vi khuẩn
Agrobacterium được các phân tử DNA trên cùng một bản gel Qua đó có thể so sánh DNA đang cần phân tích với các mẫu DNA chuẩn được biết trước khối lượng phân tử hoặc tách ly được các phân tử DNA có khối lượng khác nhau
Nguyên lí của phương pháp điện di gel Agarose:
• Trước khi đổ gel, hoà agarose khô vào đệm, đun nóng hỗn hợp cho nóng chảy đều Đổ dung dịch gel ấm vào khuôn đổ gel và cắm lược Nồng độ phần trăm agarose trong gel phụ thuộc vào kích thước phân đoạn DNA Thông thường người ta hay sử dụng gel agrose 0,7% Trong trường hợp kích thước phân đoạn DNA nhỏ hơm 1kb thì người ta đổ gel 1; 1,5; hoặc 2%, tuỳ theo kích thước của nó nhỏ đến mức nào Bổ sung EtBr vào gel để các phân tử DNA phát ra huỳnh quang dưới tia
• Nhúng ngập gel vào đệm điện di trong bồn điện di ngang Hoà trộn DNA với đệm nạp chứa thuốc nhuộm và nạp vào các giếng Chạy điện di thường với 150 – 200 mA trong 0,5 – 1 giờ ở nhiệt độ phòng tuỳ theo nhiệt mục đích phân tách mong muốn Khi sử dụng gel agarose nóng chảy thấp, chạy điện di với 100 – 120mA trong 0,5 đến 1 giờ cũng tuỳ theo mục đích mong muốn Có thể đặt vào buồng lạnh hoặc quạt để giải phóng nhiệt sinh ra khi điện di
• Để tiện việc xác định kích thước sơ bộ phân đoạn DNA, nạp DNA kích thước chuẩn và chạy điện di cùng Có rất nhiều thang DNA chuẩn Nhưng người ta hay sử dụng hai loại thang phổ biến là Φ – X 174 được cắt với endonuclease hạn chế
Trong quá trình điện di gel, enzyme HaeIII được sử dụng để xác định các phân đoạn DNA có kích thước từ 0,3 - 2 kb và enzyme HindIII được dùng để xác định các phân đoạn có kích thước từ 2 - 23 kb Sau khi điện di xong, gel được đặt trong buồng ánh sáng UV và chụp ảnh huỳnh quang DNA nhuộm EtBr để quan sát và ghi lại kết quả.
Ngoài ra người ta còn tiến hành điện di bằng gel polyacrylamide và điện di trong điện trường xung
• Gel polyacrylamide: Được dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ thường là dưới 1000 cặp base Thao tác với gel acrylamide thường phức tạp hơn so với gel agarose, do đó gel này chỉ được dùng với những mục đích mang tính đặc hiệu Gel được đổ giữa hai tấm thủy tinh và phương điện di là phương thẳng đứng Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là:
∗ Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp
∗ Xác định trình tự DNA
∗ Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base
• Điện di trong trường xung: Được dùng để phân tách các đoạn DNA khá lớn (>50kb), không thể phân tách được bằng gel agarose dù ở nồng độ tối thiểu là 0.4% (dưới 0.4% bản gel sẽ quá mềm không thể thao tác được) Nguyên tắc của loại điện di này là sự thay đổi hướng của diện trường trong quá trình điện di Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải định hướng trở lại Thời gian định hướng sẽ tùy thuộc kích thước của phân tử, phân tử càng dài thì thời gian tự định hướng sẽ càng lớn khiến nó di chuyển chậm hơn các phân tử kích thước nhỏ b Kỹ thuật PCR:
Đoạn mồi là yêu cầu bắt buộc trong tổng hợp mạch DNA mới của tất cả các DNA polymerase hoạt động từ mạch khuôn DNA, giúp DNA polymerase nối dài mồi để hình thành đoạn DNA mới Để khuếch đại trình tự DNA cụ thể, cần có thông tin tối thiểu về trình tự đó để thiết kế cặp mồi chuyên biệt: một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen.
− Các thành phần tham gia phản ứng PCR:
• DNA khuôn (DNA template): Có thể là DNA kép đơn, hoặc RNA được tách chiết từ đối tượng nghiên cứu DNA khuôn phải có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp và có lượng ban đầu từ 1 đến hàng chục ng
• Mồi (primer): Lựa chọn các mồi rất quan trọng cho phản ứng PCR Đoạn mồi là
• DNA polymerase: là enzym xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotid A, T, G,
C vào các mạch DNA mới đang tổng hợp ngày nay người ta dùng nhiều loại DNA polymerase: Tag DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, T4 DNA polymerase… Nhưng phổ biến nhất là Tag DNA polymerase Tag DNA polymerase được tách chiết từ chủng vi khuẩn suối nước nóng Thermophilus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA ( 92 0 C) Tag DNA polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra nhanh , chính xác và đặc hiệu
• Các deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP) gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tham gia tạo nên mạch DNA mới Nồng độ tối ưu của dNTP thường dùng là 100 – 200 μM Tuy nhiên ở nồng độ thấp hơn thì Tag
DNA polymerase hoạt động chính xác hơn
Thành phần của dung dịch đệm trong phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase được sử dụng Ví dụ, đối với phản ứng PCR sử dụng enzyme Taq DNA polymerase, thành phần của dung dịch đệm 10X bao gồm:
✔ MgCl2 2mM Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0,5 đến 5nM Chính ion
Mg 2+ có tác dụng gắn liên kết dNTP với DNA polymerase tăng khả năng bám nối của mồi
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
• Bước 1 Trong thành phần hỗn hợp phản ứng phải bao gồm các thành phần phản ứng của sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94 0 – 95 0 C trong vòng 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn biến tính
MỘT SỐ THÀNH TỰU TRONG CÔNG TÁC NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN PHÁT SÁNG gfp TRONG NHỮNG NĂM GẦN ĐÂY
TRONG NHỮNG NĂM GẦN ĐÂY: Ứng dụng quan trọng nhất của protein gfp là làm chất dò sinh học để minh hoạ cụ thể chi tiết các quá trình sinh học như quá trình tạo khối u trong cơ thể động vật, quá trình phân chia tế bào, quá trình cộng sinh tương tác với thực vật (như sự cộng sinh) hay phát hiện các virus xâm nhập Đặc biệt đối với tế bào thực vật, không thể sử dụng thuốc nhuộm và chúng không thấm được vào tế bào thực vật, gfp được sử dụng như một công cụ thăm dò quan trọng để kiểm tra những quá trình nội bào
Gần đây nhà sinh học từng đoạt giải Nobel ở Viện công nghệ California đã sử dụng phương pháp Lentivirus, vốn là họ hàng xa của virus HIV đã bị bất hoạt để đưa gen sứa vào phôi chuột Kết quả thí nghiệm cho thấy hơn 80% chuột sinh ra từ các phôi trên đều chứa protein đặc biệt của sứa Chúng phân tán khắp cơ thể và làm cho những chú chuột bị phát sáng dưới tia UV
Trong dự án 1 triệu USD, các nhà khoa học Ý đã chuyển gen phát sáng của sứa biển vào hoa cúc Gen này khi chuyển vào tế bào giúp cây tạo ra một loại protein phát sáng Kết quả là cho ra những bông hoa toả ánh sáng rực rỡ khi chiếu dưới đèn cực tím Tuy nhiên kỹ thuật này chỉ áp dụng với những loài hoa cánh trắng, do màu sắc nguyên thuỷ của hoa có thể lấn át ánh sáng do gen gfp tạo ra Nhiều công trình nghiên cứu cho protein phát sáng trong thực vật cũng được thực hiện như cam phát sáng, cây thuốc lá phát sáng, nốt sần cây họ đậu phát sáng
Hình 1-15: Hoa cúc ngoài trời có màu trắng(trên)Hình 1-16: Hoa cúc toả ánh sáng rực rỡ dưới tia UV(dưới)
Các nhà khoa học Đài Loan đã nuôi cấy chuyển gen thành công 3 chú lợn phát ra ánh sáng huỳnh quang lục trong bóng tối, đánh dấu bước ngoặt tiềm năng trong việc nghiên cứu tế bào gốc Nhóm nghiên cứu đã chèn một protein (chiết tách từ một loài sứa) vào trong nhân của các tế bào phôi lợn, từ đó tạo ra 3 con lợn đực chuyển gene Những con lợn này phát sáng cả từ bên trong, bao gồm các nội tạng Nhóm hy vọng những con lợn này có thể giúp giới khoa học lần theo sự phát triển của các mô - nơi tế bào gốc được sử dụng để sửa chữa những nội tạng hỏng Công trình này sẽ có ích trong việc thúc đẩy nghiên cứu lâm sàng về tế bào gốc của người, vì về mặt di truyền người ta tin rằng lợn thuộc nhóm động vật gần gũi với người nhất
4 Chuột có tim phát sang
Theo thông tin từ trường Đại học Corney -Welsh, các nhà khoa học của Mỹ và Nhật Bản đã nuôi được chuột thí nghiệm có tim phát sáng, phân tử huỳnh quang có canxi được cấy vào cơ tim của chuột thí nghiệm, và bị kích hoạt khi cơ tim co bóp Trong cơ thể của chuột thí nghiệm có gien chuyển đổi có thể tự tổng hợp Abumin phát quang, trong điều kiện tự nhiên bình thường, hiện tượng này chỉ xuất hiện ở loài sứa Nhưng các nhà khoa học Nhật Bản đã phải thực hiện thay đổi rất nhỏ đối với các phân tử, vì để quan sát được các cơ quan nội tạng, huỳnh quang cần phải sáng lên, mà tim của chuột thí nghiệm mỗi giây đập tới 10 lần, vì vậy nếu không có sự thay đổi phân tử phát sáng thì sẽ không thể quan sát được Sử dụng phương pháp này, các kỹ sư sinh học có thể quan sát được sự phát triển của tim trong bào thai chuột thí nghiệm mà
Hình 1-17: Một con lợn chuyển gen màu xanh bên cạnh con lợn thường. thể quan sát được trong tim lần lượt phát triển hai tâm thất, rồi đến bốn tâm thất (đây là hai giai đoạn phát triển ở ngày thứ 10 và ngày thứ 14 sau khi phôi thai được hình thành) Ngoài ra, các nghiên cứu viên còn cho biết trong khi thí nghiệm trên chuột, họ còn phát hiện ra "tế bào giảm tốc" ngăn chặn sự truyền mạch giữa tim và tâm thất ở giai đoạn mới phát triển, nhưng sau đó những tế bào này sẽ mất đi Các nghiên cứu viên dự định giới thiệu phương pháp mới này ứng dụng với các tổ chức khác, trong đó bao gồm cả tổ chức thần kinh Họ hy vọng rằng, trong tương lai phương pháp này có thể ứng dụng trong lâm sàng thông thường, cấy những tế bào huỳnh quang vào các tổ chức cần phải chẩn đoán
Các tiến bộ trong công nghệ protein gfp cung cấp 1 phương tiện hữu hiệu đầy hứa hẹn để dò tìm, phát hiện các phân tử sinh học trong cơ thể sống Tuy còn quá sớm để mong chờ vào việc khai thác các ứng dụng của ngành khoa học còn non trẻ này nhưng rõ ràng hình ảnh sinh học là một kỹ thuật mới đầy hứa hẹn, có thể trợ giúp các ngành sinh học trong tương lai và protein gfp chính là công cụ đắc lực để phát triển ngành hình ảnh sinh học trong thời gian tới
Hình 1-18: Tim phôi chuột phát sáng
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU
Thí nghiệm với mẫu cây cát tường trắng
- Trong thí nghiệm nhân giống in vitro: sử dụng đốt thân có chồi ngọn hoặc chồi bên và lá cây cát tường ngoài thị trường hoặc trong phong thi nghiệm để nhân giống tạo cây trong bình tam giác
- Trong thí nghiệm khảo sát sự tái sinh: sử dụng mẫu lá từ cây cát tường vô trùng trong bình tam giác để khảo sát khả năng tái sinh với các môi trường khác nhau
- Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ kháng sinh: sử dụng mẫu lá và chồi nhỏ của cây cát tường vô trùng trong bình tam giác
- Chuyển gen: sử dụng mẫu lá từ cây cát tường trong bình tam giác để chuyển gen gfp và tái sinh thành cây trong môi trường tái sinh đã chọn với chất chọn lọc là kháng sinh hygromycin
Hình 2-1: Cây Cát tường invitro
2 GIỐNG VI KHUẨN VÀ VECTOR
Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plamid pCAMBIA 1303
− Plasmid PCAMBIA 1303 (12361bp): được điều khiển bởi promoter CaMV 35s, có các gen kháng kháng sinh Hygromycin và Kanamycin giúp cho quá trình chọn lọc dòng, ngoài ra còn có gen gusA và gen mGFP5 là hai gen chỉ thị giúp cho việc xác định dòng mang plasmid dễ dàng và đơn giản qua thao tác nhuộm GUS hoặc soi
UV Trên plasmid còn có nhiều điểm cắt của nhiều enzyme giới hạn, plasmid này được cung cấp bởi phòng thí nghiệm CN gen, Viện Sinh Học Nhiệt Đới
− Một số đặc điểm của pCAMBIA 1303:
• Có các vị trí cắt giới hạn duy nhất của nhiều enzym trên MCS (multiple cloning sites – nằm giữa trình tự gusA và gen kháng Hygromycin) thuận lợi cho việc tạo dòng
• Sự có mặt của các vùng rep và sta của pVS1 giúp các vector này ổn định trong A.tumefaciens ngay cả trong điều kiện không có chất chọn lọc [Deblaere và ctv, (1987) Methods in Enzymeology 153:277 – 292, Plant Molecular Biology 25 (1994) 989 – 994]
• Có mang gen gusA và gen mGFP5* là 2 gen chỉ thị giúp cho việc xác định dòng plasmid dễ dàng và đơn giản qua thao tác nhuộm GUS và soi UV
Cát tường dùng để chuyển gen (cát tường trắng) kháng được Kanamycin và Hygromycin Điểm yếu của pCAMBIA 1303 là không có đoạn intron chèn vào trình tự mã hóa gen gusA, dẫn đến gen này biểu hiện trong vi khuẩn.
• Bên cạnh đó, đuôi hexahistidine ở đầu carboxyl cho phép protein được tinh sạch bằng phương pháp sắc kí ái lực với ion kim loại được cố định (IMAC – immobilized metal ion affinity chromatography)
− Bản đồ giới hạn của plasmid pCAMBIA 1303 như sau:
Hình 2-3: Bản đồ giới hạn vector plasmid pCAMBIA 1303 (Trung tâm nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp, Úc)
3 HOÁ CHẤT, MÔI TRƯỜNG, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM: a HOÁ CHẤT :
− Hoá chất sử dụng trong quy trình tách chiết và tinh sạch plasmid:
• Bộ kit tách chiết plasmid từ vi khuẩn Wizard® Plus SV Minipreps DNA purification on System (Promega coporation, USA) Thành phần:
∗ Cell Resuspension Solution (50mM Tris; 10mM EDTA; 100àg/ml
∗ Cell lysis Solution (0,2% NaOH và 1% SDS)
∗ Wizard® Plus SV Minipreps DNA purification Resin
∗ Column Wash Solution (80mM Potassium acetate; 8,3 mM Tris – HCl , pH= 7,5, 40àM EDTA, 55% ethanol)
∗ Thêm 70ml ethanol 95% để pha 120ml dung dịch
- Hóa chất trong phản ứng thử Gus và trong phản ứng PCR
Hoá chất trong phản ứng thử Gus: Hoá chất trong phản ứng PCR:
∗ Dung dịch đệm NaPO4 (pH=7) 10ml
✔ dNTPs(ATP, CTP, GTP, TTP)
- Hóa chất trong tách chiết DNA thực vật và trong điện di
Hoá chất trong tách chiết DNA thực vật: Hoá chất trong điện di:
• Ladder λ phage 23kb và ladder 1kb
- Hóa chất dùng trong thí nghiệm chuyển gen
• Hygromycin pha trong nước cất, lọc vô trùng
• Acetosyringone tan trong cồn, pha trong nước cất, lọc vô trùng
• Cefotaxime pha trong nước cất, lọc vô trùng b MÔI TRƯỜNG
- Môi trường LB bổ sung Kanamycin 50mg/l được dùng chọn lọc và giữ dòng
Agrobacterium tumerfacien đã biến nạp
- Môi trường nuôi cấy cây con trong bình tam giác: MS (Murashige và Skoog, 1962) không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng
- Môi trường dùng trong nhân giống: MS, TH 1( MS bổ sung BA 1 mg/l và NAA 0.1 mg/l)
- Môi trường dùng trong khảo sát khả năng tái sinh:
1 mg/l (1mg/2ml) 0.1 mg/l (1mg/ml)
CT 2 1 mg/l (1mg/2ml) 0.2 mg/l (1mg/ml)
CT 3 1 mg/l (1mg/2ml) 0.3 mg/l (1mg/ml)
CT 4 2 mg/l (1mg/2ml) 0.1 mg/l (1mg/ml)
CT 5 2 mg/l (1mg/2ml) 0.2 mg/l (1mg/ml)
CT 6 2 mg/l (1mg/2ml) 0.3 mg/l (1mg/ml)
- Môi trường dùng để khảo sát nồng độ chất chọn lọc tối ưu: TH 1 bổ sung
- Môi trường dùng để chọn lọc cây đã chuyển gen: TH 1 có bổ sung cefotaxime
200 mg/l và hygromycin c DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM:
− Bình tam giác 250 ml, nút cao su, ống đong 50, 100 ml, đĩa petri, elern 1000ml
− Phễu, muỗng inox, giấy thấm, bình tia nước cất, bình tia đựng cồn 96 0 , bình phun đựng cồn 70 0 , giấy thấm, thun, đèn cồn, bật lửa, kéo, thun , kẹp gắp……
− Tủ cấy vô trùng (ADS Laminaier France)
− Máy lắc (Innova 2100 Flatform Shaker)
− Tủ ổn nhiệt (Incubator – SANYO)
− Máy khuấy từ (IKA ® RT basic)
− Nồi hấp (HICLAVE ™ HV – 85 hiệu HYRAYAMA)
− Cân độ chính xác 0,2g (TANITA model 1476)
− Tủ lạnh (Electrolux frost free)
− Máy chụp ảnh Lumix Panasonic
− High intensity – UV lamp Mineralight ® và Black Ray ® Lamps Model UVGI 58- San Gariel USA
− Máy ổn nhiệt Techne ® , Heto
− Máy ổn nhiệt và lắc Innova 4230
− Máy siêu li tâm Eppendorf ® Centrifuge 5417R
− Máy chụp ảnh gel điện di Biorad ®
3) Một số hình ảnh các thiết bị tại Phòng Công nghệ Gen – Viện Sinh học Nhiệt Đới:
Hình 2-4: Máy điện di Biorad® và khay đổ gel Biorad®
Hình 2-5: Máy ổn nhiệt Heto và Máy ổn nhiệt Techne ®
Hình 2-7: Máy PCR Esco ® và Máy PCR Techne ®
Hình 2-8: Máy li tâm Eppendorf- Máy siêu li tâm Eppendorf Centrifuge 5417R
Hình 2-6: Phòng tối và Máy chụp ảnh gel điện di Biorad ®
Hình 2-9: Máy lắc và ổn nhiệt Innova 4230
Và Máy khuấy từ-Máy đo pH
PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
1 Quy trình làm thí nghiệm
Khảo sát nồng độ chất kháng sinh chọn lọc
Mẫu lá Môi trường thích hợp Nhân giống
Chuyển gen Cây ngoài chợ
Cây chuyển gen Plasmid mang gen ipt
A.tumefacie ns tái tổ hợp
2 Nhân giống Cát tường từ cây ngoài thị trường Đốt thân có chứa chồi ngọn hoặc chồi bên được cắt từ cây ngoài chợ có chiều dài khoảng 1.5 cm được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bằng dung dịch NaOCl 60% trong 30 phút hoặc 50% trong 60 phút gắp ra thấm khô bằng giấy thấm vô trùng rồi tiến hành cấy vào môi trường MS, TH 1 Cấy chuyền 3 tần/l lần
Mẫu lá được cắt từ lá non của cây ngoài vườn với kích thước 5 x 5 mm rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bằng dung dịch NaOCl 50% trong 30 phút, để khô trên giấy thấm vô trùng rồi tiến hành cấy vào môi trường tái sinh đã chuẩn bị, cấy chuyền 3 tuần/1lần Sau vài tuần khi mẫu đã tái sinh tạo chồi nhỏ, tiến hành tách chồi cấy vào môi trường MS để chồi lớn nhanh, phát triển thành cây con Điều kiện nhân giống: nhiệt độ 20 0 C, thời gian chiếu sáng 16h/ngày
3 Khảo sát sự tái sinh của mẫu lá trên môi trường khác nhau
Cắt những mẫu lá từ các cây vô trùng trong bình tam giác có độ tuổi giống nhau với kích thước 5 x 5 mm lần lượt cấy vào các môi trường CT 1, CT 2, CT 3, CT 4, CT5,
Để nghiên cứu sự tái sinh chồi của lá trầm hương, các mẫu lá cắt đoạn được cấy truyền trên môi trường CT6 với mật độ 4 mẫu lá/bình và chuyển mẫu sau mỗi 2 tuần Sau một khoảng thời gian nhất định khi các lá tái sinh phát triển, số lượng lá tái sinh, chồi tái sinh trên mỗi lá được ghi nhận và tình trạng sinh lý của chồi được quan sát trong điều kiện môi trường kiểm soát với nhiệt độ 20°C và thời gian chiếu sáng 16 giờ mỗi ngày.
Kết quả tái sinhđược xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC Chọn môi trường có khả năng tái sinh cao, chồi phát triển khỏe nhất, tốt nhất
4 Khảo sát nồng độ chất chọn lọc Hygromycin
Tiến hành thí nghiệm đối với mẫu lá tái sinh và chồi nhỏ:
- Mẫu lá được cắt ra từ cây vô trùng có kích thước 5 x 5 mm và chồi nhỏ được cấy vào môi trường CT 1 có bổ sung Hygromycin với nồng độ thay đổi từ 10 đến 40 mg/l và cefotaxime 500 mg/l, theo dõi khả năng tái sinh và sinh lý của mẫu lá Xác định chứng được nuôi cấy trong môi trường CT tương ứng nhưng không có chất kháng sinh
- Chọn môi trường thích hợp có nồng độ chất kháng sinh tối thiểu làm mẫu tái sinh chết hoàn toàn làm cơ sở cho công tác chọn lọc cây chuyển gen sau này
5 Tạo dòng A.tumefaciens chứa Plasmid mang gen gfp
Sau khi chuyển gen vào vi khuẩn, kết quả biến nạp sẽ thể hiện qua màu các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường sau 2 ngày nuôi cấy So sánh với các đĩa đối chứng Chọn những khuẩn lạc màu trắng, to và mọc rời rạc trên các đĩa biến nạp Đó là những dòng vi khuẩn tăng trưởng mạnh và có mang plasmid mới
Sau khi sơ chọn dòng vi khuẩn mang plasmid mong muốn, cấy lại vào môi trường
Vi khuẩn được cấy vào môi trường LB lỏng chứa chất chọn lọc Kanamycin và được ủ qua đêm ở nhiệt độ 37 độ C với tốc độ lắc 200 vòng/phút Nhờ gene kháng kháng sinh trên plasmid pCAMBIA 1303, những tế bào vi khuẩn nhận được plasmid này sẽ có khả năng kháng kháng sinh, đặc tính mà các tế bào không chuyển gen không sở hữu.
Quan sát tế bào vi khuẩn dưới tia UV để khảo sát sự biểu hiện của gen gfp
- Dùng đèn UV với ánh sáng tử ngoại 395nm chiếu vào các mẫu trong phòng tối và quan sát dưới kính hiển vi soi nổi huỳnh quang Sự biểu hiện của gen gfp là phát ra ánh sáng màu xanh lục khi được chiếu dưới ánh sáng 395 nm
6 Khảo sát sự hiện diện và biểu hiện của gen gfp trên thực vật:
− Sau khi được chuyển vào tế bào thực vật, các gen trên plasmid CAMBIA 1303 sẽ hoạt động tổng hợp tạo nên protein từ đó tế bào thực vật bắt đầu xuất hiện những đặc tính mới mà những mẫu đối chứng không chuyển gen không thể nào có được Như vậy, sau khi được chuyển gen mẫu Cát tường sẽ có tính kháng kháng sinh Hygromycin, xuất hiện những điểm màu xanh khi nhuộm với dung dịch X – gluc và phát quang màu xanh lục khi chiếu dưới đèn UV có bước sóng 395 nm
− Sau khi chuyển gen vào tế bào thực vật, do trên plasmid pCAMBIA 1303 có chứa gen kháng kháng sinh như Hygromycin, nên những tế bào thực vật nào mang plasmid 1303 sẽ sống trên môi trường chứa kháng sinh Hygromycin, còn những tế bào nào không chứa plasmid 1303 sẽ chết Chọn những mẫu cấy còn sống và tiếp tục cấy chuyền trên môi trường chọn lọc để tái sinh tạo cây chuyển gen (vì nếu mẫu cấy nào vẫn tiếp tục sống và có thể tái sinh được thì ta có thể kết luận đó là cây chuyển gen, vì những mẫu không mang gen chuyển không thể tái sinh và sẽ chết trong môi trường chọn lọc) a Thử gen gus bằng X – Gluc để gián tiếp kiểm tra sự hiện diện của gen gfp trong tế bào thực vật:
Trên vector pCAMBIA 1303 có mang gen gusA ta có thể dựa vào đặc tính này để nhận biết sự tồn tại của plasmid trong mô bào theo phương pháp thử Gus của Jefferson và ctv,1987
- Tiến hành nhuộm mẫu mô sẹo chuyển gen đã xử lý bằng thuốc nhuộm Gus trong 24 giờ Sau đó, kiểm tra mẫu dưới kính lúp Nếu có những vị trí nhuộm màu xanh, đó là những nơi tế bào đã được chuyển gen Mẫu đối chứng sẽ không chuyển màu xanh.- Phương pháp PCR cũng được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của gen gfp trong thực vật.
Các mẫu DNA, mẫu đối chứng dương sau khi được PCR và điện di hiện lên đúng band, mẫu đối chứng âm không hiện band khi soi bằng tia cực tím
Trên môi trường chọn lọc, chọn những chồi xanh có khả năng tái sinh từ những tế bào đã được chuyển gen Các chồi này sẽ được tách riêng từng dòng một để theo dõi Khi chồi lớn, chuyển các chồi này vào môi trường MS bổ sung chất chọn lọc Hygromycin và kháng sinh diệt khuẩn Cefotaxime để chồi phát triển thành cây Chọn ra những dòng phát triển mạnh nhất vì có nhiều khả năng là những dòng được chuyển
Cát tường tái sinh từ cây ngoài thị trường
Các mô lá tái sinh tốt trong môi trường TH 1 Khả năng tái sinh của mảnh lá cát tường khá cao, mảnh lá cát tường có thể tạo chồi nhanh trực tiếp mà không tạo chồi qua giai đoạn tạo mô sẹo.
Tái sinh của cát tường trong các môi trường
Những mẫu lá 5×5 mm cây cát tường trắng từ cây con vô trùng trong bình tam giác 250ml được cấy vào môi trường, mỗi môi trường 2 bình, mỗi bình 4 mẫu lá, cấy
Sau 4 tuần nuôi cấy, tất cả các mẫu lá đều tạo mô sẹo và một số tái sinh chồi Tiếp tục nuôi cấy trong cùng môi trường và cấy chuyền 2 tuần/lần, sau 6 tuần, đếm số chồi tái sinh và tiến hành xử lý thống kê đối với 6 môi trường để có được kết quả thống kê khả năng tái sinh.
Bảng 1: Tổng hợp tái sinh sau 6 tuần nuôi cấy
CV (Coefficient of Variation): hệ số biến đổi
LSD0.05 (Least Significant Difference): sự khác biệt có ý nghĩa nhất
MT BA NAA Tổng số mẫu Số mẫu lá tái sinh
Số mẫu lá tái sinh (%)
Qua thống kê cho thấy môi trường CT 2 là có khả năng tái sinh cao nhất vì vậy chúng tôi sẽ dung CT 2 làm môi trường chuyển gen Nhưng trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi nhận thấy môi trường này tạo chồi và tái sinh chậm hơn môi trương
Do đặc điểm chậm nảy chồi của cây CT 1, tôi đã quyết định sử dụng môi trường CT 1 (TH 1) để làm chuyển gen thay thế cho môi trường CT 2 Tôi đã không sử dụng môi trường CT 2 trong quá trình này.
5, CT 6 để thay thế vì tôi nhận thấy hai môi trường này mô sẹo phát triển có màu hơi vàng, không xanh, chồi phát triển trong môi trường thường bị úng lá(hiện tượng thủy tinh) Ngoài ra chồi cũng phát triển chậm hơn CT 1(TH 1)
Như vậy, qua thí nghiệm này có thể thấy môi trường CT 1(TH 1)là môi trường tái sinh tạo chồi tốt nhất Vì vậy chúng tôi sẽ chọn môi trường CT 1(TH 1) làm môi trường tái sinh trong thí nghiệm chuyển gen và chọn lọc kháng sinh
Hình 3-2: Cát tường tái sinh trong các môi trường
3 Kết quả khảo sát nồng độ chọn lọc kháng sinh Hygromycin
Mẫu lá kích thước 5 x 5 mm thử kháng sinh trên môi trường TH 1 với các nồng độ thay đổi từ 20 đến 40 mg/l Nuôi cấy ở nhiệt độ 20 0 C và tiến hành cấy chuyền 2 tuần/lần Sau 4-6 tuần nuôi cấy, so với mẫu đối chứng, các mẫu còn lại đều có sức sống kém hơn, lá vàng hơn và khả năng tái sinh kém dần theo nồng độ tăng của kháng sinh Chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 30-40 mg/l mẫu đa số đã chết, hoặc hoàn toàn không thể phát triển Như vậy tôi sử dụng kháng sinh Hygromycin 20-40 mg/l để dung chọn lọc trong quá trình làm chuyển gen
Hình 3-3: mô lá và cây con bị vàng chậm phát triển ở môi trường Hygromycin 20 mg/l
Hình 3-5: Mảnh lá bị úa vàng, mô và chồi bị vàng ngưng phát triển, cây con ngừng phát triển và chết trong môi trường bổ sung hygromycin 40 mg/l
Hinh 3-4: Mảnh lá và chồi ngưng phát triển, bị úa vàng trong môi trường bổ sung Hygromycin 30 mg/ml
Theo kết quả khảo sát kháng sinh trên mẫu cây cát tường trắng chúng tôi thấy khả năng kháng Hygromycin của mô lá không hoặc chưa chuyển gen là từ 20 mg/l đã bị vàng và chậm phát triển ở nồng độ cao hơn từ 30-40 mg/l chết sau 6 tuần cấy chuyền liên tục (2 tuần/lần)
4 Vi khuẩn mang vector gfp : E.coli và A.tumefacciens
Những dòng vi khuẩn được chọn lọc dùng chuyển gen vào cát tường được nuôi cấy trong môi trường thích hợp kiểm tra và giữ giống cho chuyển gen
Hình 3-6: mảnh mô lá với mô sẹo và chồi phát triển trong môi trường không có Hygromycin
5 Chuyển gene gfp vào cây cát tường sử dụng vi khuẩn
Mẫu lá 5×5 mm đựoc cấy trên môi trường tái sinh A nuôi trong 3 ngày trước khi được dùng để chuyển gen Chủng vi khuẩn A tumefaciens mang gen gfp được nuôi lắc qua đêm trong môi trường khóang AB (Chilton và cs., 1974) có bổ sung kháng sinh Kanamycin nồng độ 50 mg/l, ở 28 0 C, đạt mật độ OD khoảng 0.8 khi dùng lây nhiễm mẫu lá Sau đó chúng tôi tiến hành cho mẫu lá đã chuẩn bị vào đĩa petri có chứa dịch trờn, bổ sung thờm acetosyringone 200 àMol để kớch thớch khả năng chuyển gen của vi
Hình 3-8: vi khuẩn A.tumefaciens dung để chuyển gen.
Hình 3-7: dong E.coli mang gen gfp với dòng đối chứng soi dưới đèn UV
• Dòng E.coli mang gen gfp phát sáng xanh
Mẫu lá được ngâm trong dịch khuẩn để lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens Sau đó, mẫu lá được cấy vào môi trường tái sinh không bổ sung chất chọn lọc để vi khuẩn phát triển và có thời gian chuyển gen vào mẫu lá.
Chọn lọc dòng chuyển gen Sau thời gian nuôi chung, mẫu lá sẽ được rửa bằng nước cất vô trùng bổ sung Cefotaxime 500 mg/l, trong 30 - 45 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng và thấm khô mẫu lá Mẫu lá sau đó được cấy vào môi trường tái sinh chọn lọc tương ứng (môi trường TH 1 có bổ sung Cefotaxime 250 mg/l, Hygromycin
Theo dõi, cấy chuyền 2 tuần/lần trên cùng môi trường và nâng dần nồng độ kháng sinh cho tới nồng độ chất chọn lọc tối ưu (như tôi thấy là với nồng độ 30 – 40 mg/l là mẫu mô thường đã chết) Sau vài tuần, những chồi xanh xuất hiện trên mẫu lá chết, tách ra từng dòng riêng rẽ cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung Cefotaxime và Hygromycin để các chồi phát triển nhanh Những chồi này tiếp tục được nuôi cấy, chọn
Hình 3-9: Mô cát tường sau khi rửa vi khuẩn nuôi trong môi trường TH 1
Có bổ sung Hygromycin 20 mg/l
Hình 3-10: Mô sẹo nuôi cấy ở nồng độ Hygromycin 20 mg/l được chuyển qua môi trường bổ sung Hygromycin 30 mg/l
Hình 3-11: những mô sẹo tiếp tục phat triển trong môi trường có Hygromycin
30 -40 mg/l tạo cụm chồi và chồi
Trong quá trình chọn lọc bằng Hygromycin đối với mẫu lá chuyển gen ban đầu còn yếu, vì vậy chúng tôi sử dụng nồng độ Hygromycin thấp để chọn lọc ban đầu một thời gian khi mô sẹo phát triển chúng tôi mới tiếp tục chuyển qua chọn lọc với nồng độ cao
30 – 40 mg/l Ở nồng độ chọn lọc cao hơn 20 mg/l một số mô sẹo đã ngưng phát triển và chết, một số sống chúng tôi tiếp tục cấy chuyền liên tục với những nồng độ Hygromycin cao (30 -40 mg/l) Nếu mô sẹo vẫn tiếp tục phát triển khỏe mạnh đó có thể là mô đã được chuyển gen Khi mô lớn hoặc tạo được chồi lớn chúng tôi kiểm tra sự hiện diện của gen gfp
6 Quá trình chuyển gene và chọn lọc kháng sinh a Tiền xử lý mô lá (pre-conditioning)
Trong hầu hết các nghiên cứ chuyển gene trên thế giới, các mô vừa chuẩn bị xong thường được nuôi cấy trên môi trường thích hợp trong một khỏang thời gian nhất định để tăng độ khỏe cho mô và tăng tần số chuyển nạp gene Trong trường hợp thí nghiệm đối với cây cát tường, chúng tôi chọn thời gian này là 3-6 ngày Đây cũng là
Hình 3-12: mô sẹo phát triển trên môi trường chọn lọc
Kết luận
1 Chúng tôi đã khảo sát và chọn môi trường CT 1(TH 1) (MS bổ sung BA 1mg/l và NAA 0.1 mg/l) là môi trường tái sinh thích hợp nhất cho công tác chuyển gen bằng Agrobaterium tumefaciens
2 Nồng độ chất kháng sinh Hygromycin thích hợp cho công tác chọn lọc dòng cát tường chuyển gen là 40 mg/l đối với mẫu lá
3 Một số mẫu chuyển gene không cho kết quả dương tính với thuốc nhuộm X-gluc trong phương pháp nhuộm Gus Nhưng trong quá trình chọn lọc Hygromycin cao chúng tôi đã thu được những mô sẹo và chồi, như vậy tạm thời kết luận mô sẹo và chồi đó có thể là những mô và chồi mang gen gfp vì chúng sống được trong môi trường chọn lọc cao Mà qua đó chúng tôi đã khẳng định sự tồn tại của gen kháng hygromycin trong nhiễm sắc thể của mẫu chuyển gene qua chọn lọc Bằng cách tiến hành phản ứng PCR để định sự tồn tại của gen gfp
4 Chúng tôi đã nhận được 02 dòng cát tường chuyển gene băng phương pháp nuôi chung mô lá với vi khuẩn Agrobacterium tumefacciens kết hợp chọn lọc với môi trường có 20-40 mg/l Hygromycin trên môi trường TH 1, MS.
