đề tài nghiên cứu phát triển phương pháp phát hiện nhanh virus rota gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em

Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển phươngpháp phát hiện nhanh virus rota gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em” với mục tiêu:Xác lập một số điều kiện thích hợp tạo que thử p

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn của tôi Các kết quảnghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính toán là hoàn toànchính xác và chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào, mộtphần kết quả đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành.

Mọi dữ liệu, hình ảnh và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thuthập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Hà Nội, ngày 29 tháng 9 năm 2015

Học viên

Lương Trịnh Thùy Linh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi

đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, giađình và bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trương Quốc Phong Trưởng phòng thí nghiệm Proteomic (Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Côngnghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đạihọc Bách Khoa Hà Nội) đã tận tình định hướng, hướng dẫn và truyền cho tôi niềmđam mê nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện đề tài

-Tôi xin chân thành cảm ơn trung tâm Nghiên cứu sản xuất vắc-xin và sinhphẩm y tế, Bộ Y tế đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn họcviên, sinh viên công tác tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã góp những ý kiếnquý báu cho tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè, đồngnghiệp và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăntrong suốt quá trình nghiên cứu

Do điều kiện, khả năng và thời gian thực hiện có giới hạn nên đề tài khôngthể tránh những sai sót Tôi rất mong nhận được sự đóng góp của các thầy cô và cácbạn để đề tài được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 29 tháng 9 năm 2015

Học viên

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AuNPs : Nanoshells (hạt nano vàng)

BSA : Bovine Albumine Serum (huyết thanh bê)

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

(thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme)

NSP : Non-Structural Protein (protein không cấu trúc)

PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(điện di trên gel polyacrylamide)PBS : Phosphate Buffered Saline (dung dịch đệm muối phốt phát)PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)

WHO : World Health Organization (tổ chức Y tế Thế giới)

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm của virus rota 3

1.1.1 Sơ lược lịch sử phát hiện virus rota 3

1.1.2 Hình thái và cấu trúc 3

1.1.3 Các thành phần hóa học của virus rota và chức năng 5

1.1.4 Phân nhóm và týp huyết thanh 6

1.1.5 Tính chất hóa lý 7

1.1.6 Sự nhân lên của virus rota trong tế bào 8

1.1.7 Khả năng gây bệnh cho người 10

1.1.8 Cơ chế gây bệnh 11

1.2 Tình hình nhiễm virus rota trên thế giới và Việt Nam 11

1.2.1 Tình hình nhiễm virus rota trên thế giới 11

1.2.2 Tình hình nhiễm virus rota tại Việt Nam 12

1.3 Các phương pháp phát hiện virus rota 15

1.3.1 Quan sát bằng kính hiển vi điện tử 15

1.3.2 Phương pháp ELISA 15

1.3.3 Phương pháp ngưng kết hạt nhựa 16

1.3.4 Phương pháp điện di 17

1.3.5 Phương pháp RT-PCR hoặc realtime PCR 18

1.3.6 Phương pháp giải trình tự gen 18

1.3.7 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 18

1.4 Nguyên lý của que thử 19

1.4.1 Nguyên lý 19

1.4.2 Đặc tính các thành phần que thử 20

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Vật liệu 29

2.1.1 Hóa chất, kháng thể 29

2.1.2 Các vật liệu chế tạo que thử 29

2.1.3 Thiết bị 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Phương pháp gắn kháng thể kháng virus rota lên bề mặt hạt nano vàng 30

2.2.2 Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 31

2.2.3 Phương pháp phát hiện virus rota sử dụng phức hợp kháng thể/nano vàng 33

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Thiết lập điều kiện tạo que thử 35

3.2 Nghiên cứu điều kiện tối ưu tạo cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng 36

3.2.1 Xác định giá trị pH thích hợp tạo cộng hợp 36

3.2.2 Tối ưu nồng độ kháng thể thỏ tạo cộng hợp với hạt nano vàng 37

3.2.3 Nhiệt độ tạo cộng hợp 39

3.2.4 Thời gian tạo cộng hợp 39

3.2.5 Tối ưu đệm cộng hợp (CB) 40

3.2.6 Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ BSA che phủ 42

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước hạt nano vàng đến khả năng hấp phụ của kháng thể lên bề mặt 43

3.4 Nghiên cứu điều kiện tối ưu tạo miếng cộng hợp chứa phức kháng thể và hạt nano vàng (conjugate pad) 44

3.4.1 Vật liệu sử dụng làm miếng cộng hợp 44

3.4.2 Tối ưu nhiệt độ xử lý miếng cộng hợp 46

3.5 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 47

3.5.1 Lựa chọn màng nitrocellulose 47

3.5.2 Tối ưu hàm lượng kháng thể chuột cố định lên màng nitrocellulose 48

3.5.3 Tối ưu nhiệt độ xử lý màng nitrocellulose 49

3.6 Tối ưu dung dịch ly giải mẫu (SPS) 51

3.7 Đánh giá que thử 52

3.7.1 Ngưỡng phát hiện 53

3.7.2 Phản ứng chéo 53

3.7.3 Độ nhạy và độ đặc hiệu 54

3.7.4 Điều kiện bảo quản que thử 54

3.7.5 Khả năng ứng dụng que thử tại Việt Nam 55

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

KẾT LUẬN 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1: Chủng virus rota lưu hành gây bệnh tại việt nam từ 1998-2004 13 BẢNG 1.2: CHỦNG VIRUS ROTA LƯU HÀNH GÂY BỆNH TẠI VIỆT NAM TỪ1998-2004 14 BẢNG 3.1: CÁC LOẠI VẬT LIỆU ĐƯỢC SỬ DỤNG LÀM MIẾNG CỘNG HỢP 45 BẢNG 3.2: CÁC LOẠI MÀNG NITROCELLULOSE SỬ DỤNG LÀM VẬT LIỆU CHẾ TẠO QUE THỬ 47

DANH MỤC HÌNH

HÌNH 1.1: HÌNH ẢNH VIRUS ROTA CHỤP DƯỚI KÍNH HIỂN VI ĐIỆN

TỬ 4

HÌNH 1.2: HÌNH MINH HỌA CẤU TRÚC CỦA VIRUS ROTA 5

HÌNH 1.3: SỰ PHÂN BỐ CÁC ĐOẠN ARN CỦA VIRUS ROTA NHÓM A TRÊN GEL POLYACRYLAMIT 6

HÌNH 1.4: SỰ NHÂN LÊN CỦA VIRUS ROTA TRONG TẾ BÀO 10

Hình 1.5: Sự phân bố chủng virus rota (G týp) lưu hành tại việt nam từ 1998 – 2004 14 Hình 1.7: Nguyên lý của phương pháp ELISA 15

Hình 1.8: Kỹ thuật ngưng kết hạt nhựa 16

Hình 1.9: Sự phân bố khác nhau của dsRNA của các chủng rotavirus nhóm A, B, C 17 Hình1.10: Cấu tạo que thử phát hiện nhanh virus rota theo nguyên lý sắc ký miễn dịch 19 Hình 2.1: Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 31

Hình 3.1: Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu Vạch tín hiệu được đánh dấu bởi mũi tên 35

Hình 3.2: Xác định giá trị pH thích hợp cho phản ứng tạo cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng theo nguyên tắc hấp phụ thụ động 36

Hình 3.3: Tối ưu hóa lượng kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng 38

Hình 3.4: Tối ưu nhiệt độ tạo cộng hợp 39

Hình 3.5: Tối ưu thời gian tạo cộng hợp 40

Hình 3.6: Ảnh hưởng của các công thức đệm cộng hợp đến tín hiệu que thử 41

Hình 3.7: Tối ưu hóa nồng độ BSA che phủ 42

Hình 3.9: Thử nghiệm ảnh hưởng của kích thước hạt nano vàng đến khả năng phát hiện virus ở nồng độ thấp 44

Hình 3.10: Kết quả thử nghiệm các loại vật liệu khác nhau làm miếng cộng hợp 46

Hình 3.11: Tối ưu nhiệt độ xử lý miếng cộng hợp 46

Hình 3.12: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu màng nitrocellulose 48

Hình 3.14: Tối ưu nhiệt độ xử lý màng nitrocellulose 49

Hình 3.15: Kết quả thử nghiệm các loại đệm khác nhau cố định kháng thể lên màng 51

Hình 3.16: Kết quả thử nghiệm các dung dịch ly giải mẫu khác nhau 52 Hình 3.17: Kết quả kiểm tra ngưỡng phát hiện của que thử 53 Hình 3.18: Thử nghiệm que thử với 10 tác nhân vi sinh vật gây bệnh 54 ERROR! HYPERLINK REFERENCE NOT VALID.Hình 3.19: Điều kiện bảo

quản que thử 55

MỞ ĐẦU

Virus rota là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy thể nặng ở trẻ sơ sinh

và trẻ nhỏ, chiếm tới 45% trong tổng số các trường hợp tiêu chảy thể nặng tại cácnước phát triển và đang phát triển Hầu như toàn bộ trẻ em trên thế giới bị nhiễmvirus rota trong giai đoạn 3-5 tuổi Hàng năm, virus rota gây ra khoảng 111 triệu đợtbệnh viêm dạ dày ruột chỉ cần chăm sóc tại nhà và 25 triệu ca phải đến thăm khámtại các cơ sở y tế, 2 triệu ca phải nhập viện và có từ 352.000 đến 592.000 ca tử vong

ở trẻ em dưới 5 tuổi Trong số đó, khoảng 90% các ca nhập viện và 99% các ca tửvong xảy ra tại các nước đang phát triển, ước tính có khoảng 145.000 ca tử vongxảy ra do virus rota xảy ra tại khu vực cận Sahan – châu Phi và xấp xỉ 200.000 ca tửvong xảy ra tại châu Á Tại châu mỹ La tinh, có khoảng 75.000 ca vào nằm việntrong đó có 15.000 ca chết Bệnh được phòng ngừa bằng vắc xin [5, 6]

Từ năm 1999, tại châu Á, hệ thống giám sát bệnh tiêu chảy do virus rota đãđược thiết lập, trong đó Việt Nam là một thành viên Theo thống kê trong 2 nămđầu tiên thực hiện ở 36 bệnh viện đã xác định được bệnh tiêu chảy do virus rotachiếm 45% trong tổng số các ca tiêu chảy Thông báo này dựa trên kết quả báo cáocủa Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Hồng Kông, Đài Loan, Hàn Quốc, Malaysia

thống kê về tỉ lệ chết nhưng theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới 20% trẻ emdưới 5 tuổi tử vong là do virus rota [9, 16]

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phát hiện sự có mặt virus rotatrong mẫu phân bệnh nhân đã được WHO khuyến cáo Tuy nhiên đa số các phươngpháp này chỉ phù hợp thực hiện trong các phòng thí nghiệm và cơ sở giám sát dịch

tễ Do việc xét nghiệm đòi hỏi phải được thực hiện nhanh, đơn giản với số lượngmẫu lớn nên thực tế hiện nay các cơ sở xét nghiệm đều dùng dạng que thử nhanh.Tuy nhiên, hiện nay chúng ta hoàn toàn phải nhập ngoại sinh phẩm này Việc nhậpkhẩu dẫn đến một số vấn đề: không chủ động nguồn sinh phẩm, giá thành cao, vàđặc biệt có thể không phù hợp với chủng virus rota hiện đang lưu hành tại ViệtNam Do đó, việc tạo được que thử nhanh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợptyp virus rota đang lưu hành phổ biến ở nước ta là việc làm cần thiết và thực sự có ý

nghĩa thực tiễn Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển phương pháp phát hiện nhanh virus rota gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em” với mục tiêu:

Xác lập một số điều kiện thích hợp tạo que thử phát hiện nhanh virus rota từ mẫu phân

Nội dung nghiên cứu đề tài:

- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu chế tạo một số thành phần que thử: cộnghợp Ab – AuNPs; miếng cộng hợp chứa Ab – AuNPs; màng cố địnhkháng thể

- Tạo và nghiên cứu một số đặc tính que thử

- Khảo sát ứng dụng thử nghiệm que thử

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm của virus rota

1.1.1 Sơ lược lịch sử phát hiện virus rota

Năm 1973, Bishop và cộng sự quan sát dưới kính hiển vi điện tử mảnh sinhthiết niêm mạc ruột của một em bé chết vì tiêu chảy cấp đã phát hiện ra một loại

virus giống Reovirus, có đường kính 70 nm Sau đó, virus này đã được đặt tên là

virus rota vì hình thể của nó rất giống các bánh xe với các nan hoa (hình 1) Trướckhám phá này thì căn nguyên gây tiêu chảy ở trẻ em chỉ được phát hiện từ 10 – 30%[4, 5]

Trong vòng 5 năm (1973 – 1978), virus rota đã được công nhận là nguyênnhân phổ biến nhất thường gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ trên khắp thế giới,đặc biệt trẻ em dưới 5 tuổi Có khoảng 1/3 trường hợp tiêu chảy nặng do virus Rota

ở trẻ em phải nằm viện

Ở Việt Nam, mãi đến năm 1980 mới nghiên cứu và xác định virus này lànguyên nhân chính gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em Tỷ lệ trung bình số trẻ mắcbệnh tiêu chảy cấp do virus rota trong năm 1998 và 1999 ở Việt Nam là 56% vàhàng năm số trẻ chết do virus rota chiếm từ 4% - 8% trong tổng số trẻ dưới 5 tuổi bịchết vì mọi nguyên nhân [6, 8]

Việc phát hiện ra virus rota là một trong những căn nguyên chính gây nêntiêu chảy ở trẻ em đã dẫn tới việc mở rộng các nghiên cứu nhằm tìm ra các biệnpháp năn chặn, giảm tỉ lệ mắc và tử vong do căn bệnh này gây ra

1.1.2 Hình thái và cấu trúc

1.1.2.1 Hình thái

Những virus hoàn chỉnh có đường kính khoảng 75nm, giống hệt như một cáibánh xe có các gai ngắn và một cái vành rất nhẵn Tên virus rota từ tiếng LatinhRota có nghĩa là bánh xe bắt đầu bởi hình thái của nó.

Hình 1.1: Hình ảnh virus rota chụp dưới kính hiển vi điện tử

(nguồn:http://vi.wikipedia.org/wiki/Virus_rota#/media/

File:Multiple_rotavirus_particles.jpg) 1.1.2.2 Cấu trúc

Dưới kính hiển vi điện tử, virus rota có dạng khối cầu 20 mặt, đường kínhkhoảng 75 nm Chuỗi nucleocapsit của virus được tạo thành bởi 3 vòng xoắn đồngtâm gồm 11 đoạn ARN kép [5, 6]

Capsit của virus rota có dạng đối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp đốixứng xoắn Cấu trúc capsit của virus rota gồm 3 lớp:

 Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4 và VP7

 Lớp trong chứa protein cấu trúc VP6 là loại kháng nguyên đặc hiệu nhóm,chiếm 50% hạt virus và có thể được phát hiện trong kỹ thuật ELISA

 Lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3

Các nghiên cứu bằng kỹ thuật điện di miễn dịch và kính hiển vi điện tử đãkhẳng định: Capsit trong mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm, capsit ngoài mangkháng nguyên đặc hiệu týp, nhân của virus không mang tính kháng nguyên

Hình1.2: Hình minh họa cấu trúc của virus rota

Đối với virus rota nhóm A, có 4 gen có kích thước lớn, 2 gen trung bình, 3gen nhỏ và 2 gen nhỏ nhất như hình 3

Hình1.3: Sự phân bố các đoạn ARN của virus rota nhóm A trên gel

Polyacrylamit[14]

1.1.3.2 Protein

Hạt virus chứa ít nhất 6 protein cấu trúc: Các gen 1, 2, 3 và 6 mã hóa cho cácprotein VP1, VP2, VP3 và VP6 Đoạn gen 4, 9 mã hóa cho các protein capsit lớpngoài VP4 và VP7 Các gen còn lại (5, 7, 8, 10 và 11) mã hóa cho các protein khôngcấu trúc ( NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 )

Ba protein mang tính đặc hiệu kháng nguyên của virus là VP4, VP6 và VP7.VP7 là một glycoprotein (G serotype) là kháng nguyên trung hòa đặc hiệu cho týphuyết thanh VP4 là một protein nhạy cảm với proteaza (P serotype) là khángnguyên có đặc tính ngưng kết hồng cầu Nhờ enzyme phân hủy protein, VP4 đượctách ra một cách đặc hiệu giúp cho sự xâm nhập của virus vào tế bào VP6 là khángnguyên chung cho các dưới nhóm của virus rota

1.1.4 Phân nhóm và týp huyết thanh

1.1.4.1 Phân nhóm

Theo Lambert J.P ( 1992 ) virus rota được chia thành 5 nhóm A, B, C, D và

E Nhóm A có 2 phân nhóm là 1 và 2, phân nhóm 1 có týp huyết thanh 2, phânnhóm 2 có týp huyết thanh 1, 3 và 4

Baoming ( 1995 ) chia virus rota thành 7 nhóm A, B, C, D, E, F và G trong

đó chỉ có nhóm A, B, C gây bệnh cho cả người và động vật Nhóm D, E, F, G chỉ

thấy ở động vật Nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các dịch tiêu chảy nặng ở trẻ

em Nhóm B, C thường gây những vụ dịch lẻ tẻ, hay gặp ở trẻ em lớn và ngườitrưởng thành [10, 12]

1.1.4.2 Týp huyết thanh

Trong mỗi nhóm, virus rota được phân loại theo các týp huyết thanh: VP4 làmột loại protein chống phân tách proteaza – protein P và VP7 một loại glycoprotein– protein G Hai protein này là 2 protein cấu trúc lớp ngoài cùng quyết định týphuyết thanh của virus và được coi như một nhân tố hàng đầu trong nghiên cứu sảnxuất vắc xin vì chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trung hòa kháng thể.Hai thành phần gen mã hóa cho những protein này theo lý thuyết có thể phân chiađộc lập với nhau 14 týp VP7 đã được phát hiện bằng phản ứng trung hòa giảm đámhoại tử, 10 trong 14 týp trên xuất hiện ở người và đã được xác định bởi phản ứngtrung hòa chéo với các mẫu huyết thanh động vật đa dòng Các týp huyết thanh nàytương quan với các đặc điểm kháng nguyên của glycoprotein VP7 Hiện nay, chúng

ta vẫn chưa sản xuất được kháng thể đa dòng và đơn dòng kháng đặc hiệu khángnguyên VP4, do đó đã cản trở sự phân loại các týp huyết thanh VP4 Tuy nhiên, dựavào phân tích gen người ta đã phát hiện ra ít nhất 19 týp huyết thanh VP4 Về mặt lýthuyết sẽ có rất nhiều chủng virus rota của người khác nhau bởi sự kết hợp của cáctýp huyết thanh G và P Tuy nhiên, trên thế giới hiện nay chỉ có 4 chủng virus rotachủ yếu phân bố G1P8, G3P8, G4P8, G2P4, nhưng sự lưu hành của các chủng virusrota có khác nhau đáng kể ở các vùng khí hậu khác nhau, một số chủng không thôngthường lại phân bố ở một vài quốc gia đang phát triển, chẳng hạn P6 kết hợp với týphuyết thanh G9 chiếm 9,5% tổng số các chủng virus rota ở Ấn Độ [15]

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu năm 2000 – 2001 chủng G1P8 chiếm đa số,ngoài ra còn có một tỷ lệ nhỏ các chủng G2P4, G1P4, G4P8, G4P6…

1.1.5 Tính chất hóa lý

1.1.5.1 Sức đề kháng với nhiệt độ

Trong phân, ở nhiệt độ thường virus tồn tại nhiều ngày Ở 4oC thậm chí ở

20oC, với sự có mặt của 1,5 mM CaCl2 virus rota vẫn giữ được tính gây nhiễm trùng

trong nhiều tháng Ở - 20oC, virus có thể tồn tại nhiều năm Virus dễ bị bất hoạt ởnhiệt độ cao trên 45oC Nếu đông tan băng nhiều lần thì virus mất khả năng gâynhiễm trùng Virus có khả năng tồn tại lâu trong buồng bệnh nhân nên tỷ lệ nhiễmtrùng bệnh viện khá cao.

1.1.5.4 Tính đề kháng

Virus rota nói chung đề kháng với fluorocacbon, ete, chloroform, deoxycholate

và dung dịch không ion Virus rota cũng không chịu tác dụng của kháng sinh, chỉ dùngkháng sinh trong trường hợp bội nhiễm hay nhiễm khuẩn phối hợp

1.1.6 Sự nhân lên của virus rota trong tế bào

Các đặc trưng chung của quá trình nhân lên của virus rota trong tế bào như sau:

 Quá trình sao chép xảy ra hoàn toàn trong tế bào chất

 Tế bào không chứa các enzyme dùng cho sao chép sợi kép ARN, vì thế virusphải tự cung cấp các enzyme cần thiết

 ARN sợi (-) được dùng làm khuôn để sao chép sợi (+) nhờ enzyme ARNpolymeraza phụ thuộc ARN Sợi dương này dùng để tổng hợp các protein,đồng thời phiên mã tạo ARN sợi âm Khi sợi âm được tổng hợp hoàn toàn,

nó duy trì việc liên kết với sợi (+)

 Các đoạn ARN sợi kép được hình thành trong các hạt virus mới và các ARN sợikép hay các ARN đơn sợi âm không bao giờ tồn tại tự do trong các tế bào nhiễm.

 Các hạt virus chưa hoàn chỉnh hình thành trong quá trình liên kết với nguyênsinh chất của virus sẽ được hoàn chỉnh nhờ sự nảy chồi qua màng lưới nộichất của tế bào Trong quá trình này, các hạt virus cần các protein capsit lớpngoài của chúng

 Sự phân giải tế bào sẽ giải phóng các hạt virus khỏi các tế bào nhiễm

Các giai đoạn chi tiết của quá trình sao chép virus rota được mô tả dưới đây:

1.1.6.1 Giai đoạn hấp phụ, xâm nhập và cởi vỏ

Các điểm tiếp nhận đặc hiệu (receptor) trên bề mặt tế bào chưa hoàn toànđược biết rõ Những nghiên cứu về sự gắn của chủng SA11 lên các tế bào MA104cho thấy có khoảng 13 nghìn đơn vị tiếp nhận trên một tế bào Sự gắn khởi đầu phụthuộc vào natri và axit sialic trên màng tế bào Sau khi gắn vào tế bào khoảng 60 –

90 phút, virus xâm nhập vào tế bào nhờ enzyme phân giải protein Enzym lysosomecủa tế bào có tác dụng phá vỡ capsit lớp ngoài của virus[Arias et al., 2004]

Sự xâm nhập của virus rota người phụ thuộc vào việc tách lớp vỏ ngoài củavirus bằng trypsin Virus đã được xử lí trước bằng trypsin sẽ trực tiếp xâm nhập quamàng tế bào vào trong bào tương của tế bào[Cuadras et al., 1997]

Giả thuyết khác cho rằng, những hạt virus đã được hoạt hóa bằng trypsindính vào màng tế bào sẽ bơm trực tiếp axit nucleic qua khe hở hình thành giữacapsomer và lỗ trên màng tế bào

Những hạt virus chưa được xử lí bằng trypsin sẽ vào tế bào bằng con đườngthực bào, những virion này sau khi gắn vào màng tế bào khoảng 20 phút sẽ vàotrong lysosome

1.1.6.2 Giai đoạn tổng hợp và sao chép

Khi ARN của virus đã vào trong bào tương tế bào cảm thụ thì quá trình saochép sẽ được tiến hành Quá trình dịch mã không đồng đều, các bản sao là nhữngARN dương sao chép từ sợi ARN âm Sợi ARN dương và ARN âm xuất hiện ở 3giờ đầu sau nhiễm trùng Sau 3 giờ, mức độ phiên mã tăng dần lên và kéo dài từ 9 –

12 giờ [Stacy-Phipps et al., 1987] Tại thời điểm này, lượng ARN sợi dương là tối

đa Tỷ lệ tổng hợp ARN sợi dương và sợi âm thay đổi trong suốt quá trình nhiễmtrùng và mức độ tổng hợp tối đa sợi âm xuất hiện vài giờ trước khi lượng ARN sợidương được tổng hợp tối đa

Các protein của virus được tổng hợp đồng thời với sự sao chép ARN củavirus Các protein cấu trúc bao gồm VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7 có tác dụngtạo capsit của virus Các protein không cấu trúc bao gồm NSP1, NSP2, NSP3,NSP4, NSP5 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ARN [11]

1.1.6.3 Giai đoạn lắp ráp và giải phóng

ARN sợi kép tạo thành sẽ được lắp ráp với các protein cấu trúc tạo thành hạtvirus hoàn chỉnh trong bào tương tế bào và được giải phóng ra ngoài tế bào bằngcách ly giải tế bào chủ hoặc nảy chồi

Hình 1.4: Sự nhân lên của virus rota trong tế bào [http://en.wikipedia.org/wiki/User:Colin/Rotavirus ]

1.1.7 Khả năng gây bệnh cho người

1.1.7.1 Khả năng gây bệnh cho trẻ em

Virus rota nhóm A là nguyên nhân hàng đầu gây viêm dạ dày ruột cấp dẫnđến tiêu chảy ở trẻ em, đặc biệt là trẻ từ 6 đến 24 tháng tuổi Trẻ sơ sinh hiếm khi bịbệnh, chủ yếu là nhiễm trùng không triệu chứng hoặc biểu hiện bệnh rất nhẹ Một

nghiên cứu cho thấy chỉ có 10-20% trẻ sơ sinh bị nhiễm virus rota có biểu hiện lâmsang Nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể liên quan tới kháng thể từ

mẹ truyền qua nhau thai cho con hoặc kháng thể và các yếu tố ức chế trypsin trongsữa mẹ, enzyme pancreatic chưa hoàn chỉnh… Như vậy, mặc dù sữa mẹ không phải

là phòng được nhiễm virus rota nhưng có thể phòng được bệnh tiêu chảy nặng

Ngoài gây viêm dạ dày ruột cấp, virus rota còn có thể gây viêm ruột hoại tử,lồng ruột, tắc mật ngoài gan, xuất huyết đường niệu, nhiễm trùng huyết… Tuynhiên, hiện nay chưa có bằng chứng điển hình có tính thuyết phục về vấn đề này

1.1.7.2 Khả năng gây bệnh cho người lớn

Nhiễm trùng do virus rota cũng khá phổ biến ở người lớn Theo một nghiêncứu khoảng 55% người lớn khi tiếp xúc với trẻ em nằm viện vì viêm dạ dày ruột dovirus rota có bằng chứng lượng kháng thể tăng trong thời gian con cái họ nằm viện.Một nghiên cứu khác cho thấy 11 – 70% người lớn bị nhiễm trùng đã biểu hiệnthành bệnh tiêu chảy Bệnh thường do virus nhóm B Người mắc có thể không cótriệu chứng hoặc bị tiêu chảy mãn tính

1.1.8 Cơ chế gây bệnh

Virus rota vào cơ thể người theo đường phân – miệng và virus nhân lên chủyếu ở niêm mạc tá tràng Ở đây, virus nhân lên trong bào tương và phá hủy tế bào,

tế bào bị tổn thương có các vi nhung mao teo ngắn, các bể lưới nội sinh căng phồng,

ty lạp thể phồng, vi nhung mao thưa thớt, không đều Tổn thương tế bào dẫn đến rốiloạn hấp thu các chất dinh dưỡng, nước và điện giải Các chất carbonhydrat ứ đọngbên trong ruột làm tăng áp suất thẩm thấu, kéo nước vào long ruột, hậu quả dẫn đếnrối loạn tiêu hóa, gây tiêu chảy làm mất nhiều nước và mất nhiều chất điện giải

1.2 Tình hình nhiễm virus rota trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình nhiễm virus rota trên thế giới

Tiêu chảy cấp là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh và gây tửvong ở trẻ em trên toàn thế giới Tỷ lệ tiêu chảy trung bình là 3.3 lượt trên một trẻ

em mỗi năm Một phần ba số tử vong của trẻ em dưới 5 tuổi có liên quan tới tiêuchảy cấp, trong đó virus rota là căn nguyên hàng đầu Virus rota có phạm vi lưuhành trên khắp các châu lục [18, 19]

Ở các nước đang phát triển, hàng năm có khoảng trên 125 triệu ca tiêu chảy

do virus rota ở trẻ em dưới 5 tuổi Trong đó, mười tám triệu trẻ em bị tiêu chảy nặng

và vừa, gây ra khoảng 8 trăm nghìn ca tử vong mỗi năm

Tỷ lệ mắc bệnh do virus rota phụ thuộc vào từng khu vực và kỹ thuật chẩnđoán Virus rota chiếm tỷ lệ khoảng 20 – 40% trong số các căn nguyên tiêu chảy ởtrẻ em dưới 5 tuổi vào điều trị tại bệnh viện các nước nhiệt đới Con số này ở bệnhviện các nước là 40 – 60% Tỷ lệ tiêu chảy cấp do virus rota thay đổi theo điều kiệnsống, tiêu chảy cấp do virus này ở các nước giàu có lại cao hơn các nước nghèo,điều này cho thấy việc cung cấp nước sạch và vệ sinh tốt cũng không làm giảm cáctrường hợp tiêu chảy do virus rota gây nên Có một vài sự khác biệt về dịch tễ họccủa virus rota ở các nước có khí hậu nhiệt đới đang phát triển và các nước phát triển

có khí hậu ôn đới, đây là yếu tố chủ yếu liên quan đến chiến lược phát triển vắc xinvirus rota trong tương lai

Tỷ lệ phát hiện virus rota tuy khác nhau giữa các nước nhưng bệnh vẫn tậptrung chủ yếu ở trẻ em dưới 5 tuổi và thường vào mùa khô lạnh Theo Mei – ShangHoo, ở Mỹ, từ 1979 – 1984, tiêu chảy cấp do virus rota xuất hiện chủ yếu vào cáctháng mùa đông và trẻ bị tiêu chảy chủ yếu từ 2 – 35 tháng tuổi Theo Charles W.Lebaron, trong thời gian từ 1998 đến 1999, ở 88 trung tâm y tế thuộc Canada,Mexico và Mỹ có 34644 trường hợp trẻ chủ yếu ở 3 tháng tuổi đến 3 tuổi phát hiệnđược virus rota và đỉnh cao của bệnh xuất hiện vào mùa thu kéo dài đến mùa xuân,liên quan đến thời tiết lạnh và độ ẩm thấp Theo Thomas J.T, ở Mỹ từ 1991 đến

1996, virus rota hoạt động mạnh vào tháng mười đến tháng tư Ở Ấn Độ, trong 2năm 1988 và 1989, 17.7% trẻ được phát hiện có virus rota, nhóm chiếm tỷ lệ caonhất là trẻ em từ 0 – 2 tuổi, trong đó nhóm trẻ từ 7 đến 24 tháng có tỷ lệ mắc (22%)cao hơn nhóm trẻ dưới 6 tháng (18.2%) [20, 21]

1.2.1 Tình hình nhiễm virus rota tại Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam đã có một vài nghiên cứu về bệnh tiêu chảy cấp dovirus rota Tỷ lệ phát hiện virus rota bằng kỹ thuật ELISA đối với bệnh nhân tiêuchảy cấp là tương đối cao Virus rota lưu hành quanh năm nhưng giảm vào các

tháng nóng ẩm Lứa tuổi mắc bệnh nhiều nhất là dưới 2 tuổi Miền Bắc Việt Namnằm trong vùng khí hậu cận nhiệt đới chia làm bốn mùa rõ rệt nên tỷ lệ mắc bệnhtiêu chảy do virus rota cũng thay đổi theo mùa Đỉnh điểm của mùa bệnh là từ tháng

11 đến tháng 5 (mùa đông – xuân) còn các mùa khác tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy dovirus rota ở trẻ em giảm đi rõ rệt Theo tài liệu giám sát bệnh tiêu chảy do virus rota

ở trẻ em dưới 5 tuổi tại một số bệnh viện lớn của Việt Nam từ năm 1998 đến năm

2003, tỷ lệ phát hiện ra virus rota ở bệnh viện nhi tiêu chảy cấp tại Viện Nhi ThụyĐiển chiếm 55.64%; tại Bệnh viện Xanh Pôn chiếm 49.84%; Viện Nhi Hải Phòng là59.28%; Bệnh viện Đa khoa Khánh Hòa là 58.32%, Viện Nhi Đồng 1 là 58.82%;Viện Nhi Đồng 2 là 58.65% Trung bình tỷ lệ trẻ mắc tiêu chảy cấp do virus rotatrên cả nước là 57.39%, rõ ràng là một tỷ lệ rất cao [2]

Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy do virus rota tại các bệnh viện chínhcủa Việt Nam từ 1998 đến 2004 cho thấy rằng: Chủng virus rota lưu hành tại nước

Hình 1.5: Sự phân bốchủng virus rota (G týp) lưu hành tại Việt Nam từ 1998 – 2004

Bảng 1.2: Chủng virus rota lưu hành gây bệnh tại Việt Nam từ1998-2004 (P týp)

1.3 Các phương pháp phát hiện virus rota

Với mục đích nhằm tạo ra một vacxin hiệu quả thì việc chẩn đoán nhữngbệnh nhân tiêu chảy do virus rota gây ra là vô cùng cần thiết để bác sỹ có thể ápdụng phương pháp điều trị thích hợp và hiệu quả nhất Hiện nay, trên thế giới cónhiều phương pháp phát hiện sự có mặt virus rota: kính hiển vi điện tử, phát hiệnkháng nguyên (miễn dịch enzyme, ngưng kết latex và sắc ký miễn dịch) phát hiệnaxit nucleic (điện di polyacrylamide – PAGE), khuếch đại axit nucleic RT-PCR,giải trình tự gen… Phần lớn các phương pháp này tương đối hiệu quả cho xác địnhvirus rota, mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng của nó Cácphương pháp này đều được WHO khuyến cáo sử dụng trong những trường hợp nhấtđịnh, trong đó hai phương pháp được khuyến cáo sử dụng trong các xét nghiệm tạicác cơ sở y tế đó là ELISA và sắc ký miễn dịch (que thử) WHO, 2009

1.3.1 Quan sát bằng kính hiển vi điện tử

Kính hiển vi điện tử có khả năng phát hiện chính xác virus rota Phươngpháp này xác định được hình dạng của virus rota nhưng phải cần số hạt virus đủ lớn.Mặt khác phương pháp này cũng không phù hợp trong việc phát hiện virus rota chomột lượng lớn mẫu phân Kính hiển vi điện tử là thiết bị đắt tiền và nhân viên phảiđược đào tạo chuyên sâu, đặc biệt sử dụng phương pháp này không thể phân biệtđược giữa các nhóm virus rota khác nhau [5, 10]

1.3.2 Phương pháp ELISA

Hình 1.7: Nguyên lý của phương pháp ELISA (http://www.epitomics.com/products/product_info/6111-1)

ELISA là phương pháp phát hiện kháng nguyên thích hợp nhất cho cácnghiên cứu giám sát quy mô lớn Phương pháp này sử dụng các kháng thể đặc hiệuvirus rota để bắt giữ các kháng nguyên (VP6) Kháng nguyên sau đó được phát hiệnnhờ phản ứng màu bằng cách sử dụng 1 kháng thể đặc hiệu virus rota bậc 2 đượcgắn với enzyme Giới hạn phát hiện của phương pháp > 8 x 105 hạt/ml Phươngpháp ELISA có độ nhạy, tính đặc hiệu cao và có thể phân tích một lượng lớn mẫu.Thời gian phân tích 2-3 giờ (Kelkar et al…2004) Kỹ thuật này có thể sử dụng cáckháng thể đơn dòng để xác định các phân nhóm dựa vào VP6 và các typ dựa vàoVP4, VP7 ( Greenberg et al, 1983; Couldson et al, 1987; Taniguchi et al, 1987;Coulson et al 1991, Coulson 1992 ) Phương pháp này cho phép xác định các thôngtin typ G và có thể đưa ra thông tin sự khác nhau về mặt kháng nguyên giữa cácchủng virus của cùng một typ Tuy nhiên, một bất lợi của định typ sử dụng cáckháng thể đơn dòng đó là đòi hỏi các hạt virus nguyên vẹn Mặt khác sự biến đổitính kháng nguyên ở các typ phổ biến làm cho chúng không có hoạt tính với cáckháng thể đơn dòng và các chất ức chế có mặt trong mẫu phân làm thay đổi liên kếtcủa virus với kháng thể [2].

1.3.3 Phương pháp ngưng kết hạt nhựa

Hình 1.8: Kỹ thuật ngưng kết hạt nhựa (nguồn http://www.dieutri.vn/bgmiendich/31-10-2012)

Phương pháp này sử dụng các hạt nhựa được phủ bởi các kháng thể khángvirus rota có thể được dùng như một phương pháp thay thế ELISA Phương phápnày có giới hạn phát hiện tương tự như ELISA, đơn giản nhanh chỉ mất khoảng 30phút tuy nhiên không thích hợp với số lượng lớn [10].

1.3.4 Phương pháp điện di

Các dsRNA virus rota có thể được phát hiện trong các mẫu lâm sàng bằngcách tách chiết ARN và phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide sau đónhuộm bạc Các dsRNA virus rota có 11 đoạn Khi điện di qua gel các đại phân tửtích điện âm này phân tách theo kích thước Các nhóm virus rota ở người A, B, C có

sự phân bố các đoạn gen khác nhau Kết quả điện di tương ứng với sự có mặt của 1nhóm đặc hiệu virus rota nào đó Điện di bộ gen của virus rota cho phép phát hiện

và phân loại virus thành 2 nhóm electrophorotypes dài (L) hay ngắn (S) dựa vàokiểu hình di truyền của các mảnh 10 và 11trên gel polyacryamide Đối với virus rotanhóm A hầu hết các mẫu là dương tính với ELISA sẽ dương tính sau khi điện di vànhuộm bạc các đoạn ARN (Herring et al 1982; Boom et al 1990) Phương pháp nàytương đối khó, mất nhiều thời gian, đòi hỏi nhân viên phải được đào tạo nhưng lợithế chính của PAGE là cho kết quả rõ ràng [2]

Hình 1.9: Sự phân bố khác nhau của dsRNA của các chủng Rotavirus nhóm A, B, C

[Rahman et al., 2005]

1.3.5 Phương pháp RT-PCR hoặc realtime PCR

Phương pháp này được phát triển dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho các genvirus rota khác nhau (Gouvea et al 1991, Wilde et al 1991; Leite et al 1996; Logan

et al 2006) Phương pháp này có độ nhạy rất cao có thể phát hiện ở nồng độ thấp vàiphân tử, tương đối nhanh và có độ tin cậy cao Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏicác thiết bị chuyên dụng và các nhân viên phải được đào tạo chuyên sâu, nguyên vậtliệu đắt đối với Realtime PCR định lượng

1.3.6 Phương pháp giải trình tự gen

Phương pháp giải trình tự gen được sử dụng khi gặp các chủng không thểđịnh typ bằng các phương pháp trên do biến đổi di truyền từ các chủng phổ biếnhoặc là các chủng mới Các nhà nghiên cứu đã đọc trình tự nucleotide để xác địnhcác chủng này và thiết kế lại các mồi định týp Đọc trình tự cũng có thể được sửdụng để khẳng định các kết quả định týp

1.3.7 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch cũng được sử dụng để phát hiện kháng nguyênvirus rota Hiện nay dạng que nhúng đã được thiết kế dựa trên nguyên tắc sắc kýmiễn dịch để phát hiện kháng nguyên virus rota trong mẫu phân Que nhúng này cóchứa 1 kháng thể kháng virus rota được gắn cộng hợp với các hạt vàng dạng keo tụ(phức cộng hợp vàng) Kháng thể kháng virus rota có nguồn gốc từ thỏ được cốđịnh tại vị trí kiểm tra của que nhúng (vạch kiểm tra) Một kháng thể khác khángkháng thể trong phức cộng hợp vàng cố định tại vị trí đối chứng (vạch đối chứng).Nếu dịch chiết mẫu phân có chứa kháng nguyên virus rota thì khi đưa que nhúngvào sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể - hạt vàng Khi phức hợp này

di chuyển dọc theo que nhúng tới vị trí kiểm tra hình thành một vạch màu hồng tía

và thể hiện trạng thái dương tính Phần cộng hợp còn lại không gắn với khángnguyên di chuyển tới vị trí đối chứng cho vạch màu hồng tía chứng tỏ que nhúnghoạt động bình thường, kết quả có giá trị Như vậy khi xuất hiện cả hai vạch hồngtía ở vạch kiểm tra và vạch đối chứng, chứng tỏ mẫu dương tính với virus rota; khi

chỉ có một vạch hồng tía ở vị trí đối chứng kết luận mẫu âm tính Phương pháp nàynhanh, đơn giản nhưng khó thực hiện với lượng mẫu lớn Kỹ thuật này được đánhgiá là độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian phân tích rất nhanh 2-3 phút.

1.4 Nguyên lý của que thử

1.4.1 Nguyên lý

Que thử phát hiện nhanh virus rota được thiết kế dựa trên nguyên lý sắc kýmiễn dịch: một kháng thể thứ nhất có nguồn gốc từ thỏ kháng virus rota được gắncộng hợp với các hạt vàng dạng keo tụ (phức hợp cộng vàng) và cố định trên miếngcộng hợp Kháng thể thứ hai kháng virus rota nguồn gốc từ chuột lang được cố địnhtại vị trí kiểm tra của que nhúng (vạch kiểm tra) Một kháng thể khác có nguồn gốc

từ dê kháng kháng thể thỏ trong phức hợp cộng hợp vàng được cố định tại vị trí đốichứng (vạch đối chứng) Nếu dịch chiết mẫu phân có chứa kháng nguyên virus rotathì khi đưa que nhúng vào sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể 1 – hạtnano vàng Khi phức hợp này di chuyển dọc theo que thử tới vị trí kiểm tra sẽ tạothành phức hợp kháng thể 2 – kháng nguyên – kháng thể 1 – hạt nano vàng, hìnhthành một vạch màu hồng tía và thể hiện trạng thái dương tính (positive) Phần cộnghợp còn lại không gắn với kháng nguyên di chuyển tới vị trí đối chứng và bị bắt lạibởi kháng thể 3 sẽ cho vạch màu hồng tía chứng tỏ que thử hoạt động bình thường,kết quả có giá trị Như vậy, khi xuất hiện cả hai vạch hồng tía ở vạch kiểm tra vàvạch đối chứng chứng tỏ mẫu dương tính với virus rota, khi chỉ có một vạch hồngtía ở vị trí đối chứng kết luận mẫu âm tính với virus rota

Hình1.10: Cấu tạo que thử phát hiện nhanh virus rota theo nguyên lý sắc ký miễn dịch

[http://www.indicia.fr/pages/en/8/rapid - tests.html]

Đặc tính các thành phần que thử

1.4.1.1 Hạt nano vàng (AuNPs)

Có nhiều phương pháp chế tạo hạt nano vàng dạng keo Hạt nano vàng đượctạo ra ở dạng lỏng (các phương pháp hóa lỏng) bằng cách khử hydro tetracloruavàng (HAuCl4) Sau khi hoà tan HAuCl4 trong nước dung dịch được khuấy từ nhanhtrong khi thêm các tác nhân khử vào Do đó Au3+ bị khử thành ion vàng hóa trị 1 Au

+ và trở thành nguyên tử vàng, vàng bắt đầu dần dần kết tủa dưới dạng hạt nhỏ hơnnano mét và lớn dần cho tới khi dung dịch trở nên siêu bão hòa

Để ngăn các hạt kết đám vào nhau, một vài tác nhân ổn định và có tính chấthoạt động bề mặt được thêm vào Chúng có thể được chức năng hóa bề mặt với cácnhóm chức hữu cơ tạo liên kết vô cơ – hữu cơ với các hạt vàng làm chúng được baoquanh bởi 1 lớp phân tử hữu cơ tích điện nhằm tránh sự kết dính vào nhau gọi là hạtkeo vàng Dưới đây là một số phương pháp tạo hạt nano vàng dạng keo

Phương pháp Turkevich 1951, một vài tác nhân ổn định và có tính chất hoạtđộng bề mặt dùng citrate làm tác nhân Chúng có thể được chức năng hóa bề mặtvới các nhóm chức hữu cơ tạo liên kết vô cơ – hữu cơ với các hạt vàng làm chúngđược bao lượng ion âm citrate tương ứng làm chất ổn định cho các hạt vàng Sau đóion âm citrate bám xung quanh hạt nano vàng bằng lực hút tĩnh điện làm cho bề mặtcủa các hạt vàng có điện tích âm ngăn không cho chúng kết hợp lại với nhau Để tạocác hạt có kích thước lớn hơn, dung dịch natri citrate thêm vào phải ít hơn

Phương trình phản ứng: Tạo hạt keo vàng bằng sử dụng citrate để khử ionvàng (III) thành vàng kim loại

Phương trình oxy hóa khử:

Au3+ + 3e -> AuKích thước hạt vàng phụ thuộc vào nồng độ citrate Bằng cách giảm lượngnatri citrate ta có thể tăng đường kính của hạt vàng Phương pháp này tạo hạt vàngtan trong nước được bao quanh bởi các nhóm citrate với các nhóm chức COO- và

OH – nằm trên bề mặt

Phương pháp Brust và Schifrinn (1990) là phương pháp tổng hạt vàng theohai giai đoạn từ muối HAuCl4 với chất khử NaBH4 và thiol SH là tác nhân ổn định.Người ta cũng thường sử dụng phương pháp này để chế tạo các hạt vàng sử dụngtrong các ứng dụng sinh học và hạt vàng loại này có các nhóm chức thiol bao quanh

là liên kết sinh học tích cực sẵn sàng kết hợp trực tiếp với các nhóm chức khác nhau

để tạo lợp hợp sinh cho các ứng dụng sinh học

Như đã biết, các hạt vàng dạng keo với các nhóm chức năng gắn kết trên bề mặtnhư – SH, - NH2 hay – COOH rất thân thiện với môi trường sinh học Chúng sẵnsàng kết hợp với các phân tử sinh học thông qua các nhóm chức trên mà không cầnlàm thêm lớp hợp sinh đặc biệt nào như các chấm lượng tử Tuy nhiên, sự kết hợpcủa hạt vàng với các phân tử sinh học với vai trò là chất đánh dấu (labels) đòi hỏiphải đảm bảo các yêu cầu sau:

 Gắn kết bền với các phân tử sinh học được đánh dấu

 Hạt vàng không làm ảnh hưởng tới chức năng nhận biết của phân tử sinhhọc Các chức năng của phân tử sinh học không bị hạt vàng làm ảnh hưởng

 Kích thước của hạt vàng thường vài trăm nano mét, vì vậy quá trình gắn kết

có thể làm biến đổi phân bố không gian của phân tử sinh học Do đó, yêu cầuviệc gắn kết là không làm ảnh hưởng tới hình thái và cấu trúc phân tử sinhhọc

 Không làm ảnh hưởng tới khả năng gắn kết với phân tử thụ cảm của phân tửsinh học

 Liên kết cộng hóa trị: các hạt nano vàng được gắn sẵn lớp polyethyleneglycol (PEG) với đầu hướng ra ngoài là nhóm cacboxyl Nhóm này sau khi

được xúc tác bởi tác nhân EDC/NHS sẽ hình thành liên kết cộng hóa trị vớikháng thể.

1.4.2.3 Miếng thấm mẫu (Sample pad)

Miếng thấm mẫu được sử dụng để vận chuyển mẫu đến các thành phần kháccủa que thử: miếng cộng hợp, màng nitrocellulose Miếng thấm mẫu phải có khảnăng vận chuyển mẫu trong suốt, liên tục và đồng nhất Thông thường miếng thấmmẫu cũng tham gia vào quá trình xử lý mẫu như loại bỏ cặn hoặc các yếu tố gâynhiễu đồng thời ổn định pH của mẫu Khi được ủ với các thành phần như protein,chất tẩy rửa, các chất tăng cường độ nhớt, muối, miếng thấm mẫu cũng có thể được

sử dụng để:

- Tăng độ nhớt của mẫu (điều chỉnh đặc tính dòng chảy)

- Tăng khả năng hòa tan của mẫu vào thuốc thử

- Ngăn cản cộng hợp và chất phân tích liên kết không đặc hiệu với bất kỳvật liệu nào trên que thử

- Thay đổi tính chất hóa học tự nhiên của mẫu để nó tương thích với khángthể tại vạch kiểm tra

Sự có mặt của các protein (ví dụ như Albumin), chất tẩy rửa và chất hoạt động

bề mặt (như SDS hoặc Tween 20 với nồng độ thấp) có thể làm tăng khả năng hòatan, giảm liên kết không đặc hiệu và giảm thiểu sự hấp thụ các chất phân tích lênmàng

Thông thường các mẫu xét nghiệm có nhiều sự khác biệt về thành phần hóahọc (ví dụ nước tiểu người có pH thay đổi từ 5 đến 10) Sự khác biệt về pH vàcường độ ion có thể ảnh hưởng đến độ đặc hiệu và độ nhạy của que thử Thêm mộtnồng độ muối tương đối cao vào miếng thấm mẫu có thể giảm tối thiểu sự ảnhhưởng này bằng cách kiểm soát pH và cường độ ion của dung dịch (ví dụ tiền xử lývới 0,1M borate, pH 9.5)

Có hai loại vật liệu được sử dụng phổ biến để làm miếng thấm mẫu là: sợi dệtdạng mắt lưới (woven meshes) và cellulose (cellulose filters) Sợi dệt có ưu điểm làphân bố đều mẫu qua miếng cộng hợp, bền cơ học và dễ sử dụng, khả năng xử lý tốt

ngay cả khi ướt Khả năng thấm hút của sợi dệt rất kém (1–2 μl/cml/cm2), không thíchhợp để xử lý chúng với đủ lượng chất hòa tan để thay đổi tính chất protein, pH,cường độ ion và độ nhớt của mẫu phân tích Hơn nữa nhược điểm của loại vật liệunày là giá thành cao Cellulose có tính chất ngược lại so với mắt lưới dệt Chúngdày (>250μl/cmm), yếu và tương đối rẻ tiền.Vật liệu này có khả năng thấm hút rất tốt(>25μl/cml/cm2) nhưng khó xử lý hơn, nhất là khi ướt Cellulose được sử dụng nhiềunhất để làm miếng thấm mẫu do chúng cho phép nạp một lượng lớn dung dịch, chất

ổn định pH và cường độ ion, chất tăng cường độ nhớt Khi sử dụng cellulose làmmiếng thấm mẫu, cần đảm bảo tiếp xúc với miếng cộng hợp đặt phía dưới để tránhviệc tiếp xúc không tốt dẫn đến việc vận chuyển mẫu có thể bị gián đoạn và chấtlỏng không tới được miếng cộng hợp

Đặc điểm kỹ thuật của miếng thấm mẫu phụ thuộc rất lớn vào mục đích sửdụng trong các thiết bị kiểm tra Nếu miếng thấm mẫu đang được sử dụng với mụcđích chính là thay đổi mẫu, cần quan tâm các thuộc tính sau:

- Độ dày: có thể cỡ micro (μl/cmm), milimet (mm) hoặc một phần nghìn củamột inch (mils) Phạm vi biến đổi rất quan trọng vì nó có thể ảnh hưởngtới lượng thể tích chống và sự nén ổn định trong vỏ bọc

- Trọng lượng cơ sở (mg/cm2): có thể được nhân với độ dày (cm) để xácđịnh thể tích chống (μl/cml/cm2) Thể tích chống được xác định trực tiếptương ứng tỷ lệ thuận với độ xốp, tỷ lệ nghịch với mật độ.Thể tích chốngảnh hưởng lớn đến hiệu suất nhưng nó hiếm khi được cung cấp

- Độ bền cơ học: độ bền cơ học của vật liệu làm miếng thấm mẫu rất quantrọng Một vài vật liệu yếu không được sử dụng

- Khả năng ly giải: Nhiều loại vật liệu được dùng để làm miếng thấm mẫuchứa các liên kết giữ các sợi lại với nhau Ngoài ra, một vài sợi có thể bịphá vỡ hoặc không liên kết với cấu trúc vi mô của miếng thấm dẫn đếnmột lượng đáng kể các thành phần của miếng thấm có thể bị bật ra trongthời gian xử lý Khi chạy que thử, nó có thể dẫn đến mẫu bị tràn ra khỏi

miếng thấm mẫu và chỉ một lượng mẫu nhỏ được phân tích dẫn tới kếtquả có thể không chính xác.

- Kích thước (chiều dài, chiều rộng): Kích thước và dung sai cần đượchoàn toàn xác định

1.4.2.4 Miếng cộng hợp

Miếng cộng hợp thực hiện nhiều nhiệm vụ, nó là nơi cố định cộng hợp khángthể - hạt nano vàng và khi có dòng mẫu từ miếng thấm mẫu chuyển tới, nó giảiphóng cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng theo mẫu vào màng Yêu cầu đối vớimiếng cộng hợp cần có là:

- Khả năng liên kết không đặc hiệu thấp: nếu cộng hợp hoặc chất phân tíchliên kết chặt chẽ với miếng cộng hợp, nó sẽ không tạo thành phức hợpmiễn dịch tại vạch kiểm tra, do đó giảm cường độ tín hiệu và độ nhạy

- Ổn định đặc điểm dòng chảy: nếu như vật liệu miếng cộng hợp khôngduy trì đều dòng mẫu vào màng thì cộng hợp có thể chuyển lên màngnhưng sẽ tạo thành các vệt tín hiệu không đồng đều tại vạch kiểm tra vàvạch kiểm chứng

- Thể tích chống thích hợp: khi nạp cộng hợp vào miếng cộng hợp thìlượng phức hợp trên mỗi que thử phụ thuộc vào thể tích chống của vậtliệu Nếu thể tích chống thay đổi đáng kể thì biến đổi cường độ tín hiệu

có thể được quan sát thấy khá rõ dù các thành phần khác giữ cố định

- Độ ly giải thấp: các hạt tự do trong vật liệu làm miếng cộng hợp nếu dễdàng ly giải khỏi vật liệu có khả năng gây tắc nghẽn tại vùng tiếp xúc củamiếng cộng hợp hợp và màng

Miếng cộng hợp có ảnh hưởng rất lớn đến độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử.Các vật liệu thường dùng để làm miếng cộng hợp bao gồm: sợi thủy tinh, sợicellulose, polyester và polypropylene

Bảng 1.3: Đặc tính của các vật liệu chế tạo miếng cộng hợp

Sợi thủy

tinh

Dày 100 – 500μl/cmm, có thểbao gồm các chất kết dính

để giữ các sợi lại với nhau

Thể tích hấp phụ lớn,liên kết đặc hiệu thấp

Liên kết không đặchiệu rất thấp, thườngrất đồng đều

Thể tích hấp phụ cao (

>50μl/cml/cm2), rất yếukhi bị ướt

Polyester Dày 100 – 300 μl/cmm, kỵ

nước

Liên kết không đặchiệu thấp, độ bền cao

- Kiểm soát tốc độ dòng chảy mao mạch

- Liên kết chặt chẽ với kháng thể

- Ít hấp phụ không đặc hiệu tại vùng vạch kiểm tra và vạch đối chứng

- Dễ sử dụng và xử lý, rẻ tiền và có ái lực cao với các phân tử protein hoặccác phân tử sinh học khác.

1.4.2.6 Miếng thấm hút (absorbent pad).

Miếng thấm hút có chức năng chính là làm tăng tổng thể tích mẫu vào que thử,đồng thời tham gia vào việc duy trì tốc độ dòng chảy của chất lỏng qua màng Dotổng thể thể tích mẫu tạo thành tín hiệu được điều khiển bởi thể tích hòa tan các hạtđánh dấu ở vạch kiểm tra và vạch đối chứng, chứ không phải thể tích mẫu đi vàoque thử nên các miếng thấm hút tác động rất ít đến độ nhạy của phép thử

Các thông số kỹ thuật cần biết là:

- Kích thước

- Độ bền cơ học

- Độ dày

1.5 Các kit thương mại được sử dụng cho chẩn đoán virus rota

Hiện nay trên thế giới cũng có rất nhiều nhà sản xuất kit phát hiện trực tiếpkháng nguyên virus rota hoặc phát hiện gián tiếp kháng thể virus rota Phần lớn cáckit hoạt động dựa trên nguyên tắc ELISA, một số dựa trên phương pháp sắc ký miễndịch

Kit của DAKO phát hiện kháng nguyên rota dựa vào phương pháp ELISA,

có độ nhạy và độ đặc hiệu so với kính hiển vi điện tử 98% Thời gian thực hiệnphản ứng 30 phút, chỉ 1 lần rửa và 1 lần ủ ( http://www.dako.com )

Kit phát hiện kháng thể IgM của EIAab (Human Rotavirus IgM ELISA Kit)cho phép xác định đực hiệu nồng độ IgM virus rota người trong dịch nuôi cấy tế bàotrong huyết thanh Kit này dựa trên nguyên lý của phương pháp ELISA kẹp Mộtkháng thể đơn dòng đặc hiệu với IgM virus rota được gắn bản Mẫu chuẩn và mẫucần xác định cho vào giếng, IgM virus rota liên kết với kháng thể đã được gắn bản.Một kháng thể đơn dòng liên kết enzyme đặc hiệu với IgM virus rota được bổ sungvào các giếng Phản ứng được phát hiện bằng phản ứng màu (http://www.eiaab.com:Human Rotavirrus IgM ELISA Kit )

DRG International (Inc, USA và Diagnostic Automation) Inc sử dụng cácgiếng được phủ bởi kháng thể đa dòng bắt giữ kháng nguyên virus rota Khángnguyên này phản ứng với kháng thể đơn dòng kháng virus rota Phản ứng được pháthiện bằng cách bổ sung kháng thể chuột gắn enzyme HPR Phản ứng có độ nhạy100%, độ đặc hiệu 97% ( http://www drg – international.com)

Kit Prospect TTM của Anh sử dụng kháng thể đa dòng thỏ kháng virus rotagắn trên pha rắn để bắt giữ các kháng nguyên đặc hiệu của virus rota nhóm A Khimẫu phân được cho vào giếng và ủ đồng thời với kháng thể đa dòng đặc hiệu củavirus rota gắn HRP trong 60 phút Rửa phiến và bổ sung cơ chất hiện màu Sự cómặt của các kháng thể gắn enzyme liên kết một cách đặc hiệu trong giếng dẫn đến

sự thay đổi màu, phản ứng dừng bằng cách thêm axit Cường độ màu phản ánh mức

độ nhiễm virus rota Kit có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng 98.7% và 99.2%

Premier Rotaclone của Meridian sử dụng kháng thể đơn dòng trên pha rắnbắt giữ kháng nguyên VP6 – kháng nguyên đặc hiệu nhóm cho tất cả các virus rota

ở người đã biết và kháng thể phát hiện là kháng thể đơn dòng kháng virus rota gắnHRP Kit có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 97%

Quick TestTM Rotavirus Strip của ORGENICS được sử dụng để phát hiện sự

có mặt của kháng nguyên virus rota trong mẫu phân Hiện nay, dạng que nhúng đãđược thiết kế dựa trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch Que nhúng này có chứa mộtkháng thể đơn dòng kháng virus rota được gắn cộng hợp với các hạt vàng dạng keo

tụ (phức cộng hợp vàng ) Kháng thể đa dòng kháng virus rota nguồn gốc từ thỏđược cố định tại vị trí kiểm tra của que nhúng (vạch kiểm tra) Một kháng thể kháckháng kháng thể đơn dòng trong phức cộng hợp vàng cố định tại vị trí đối chứng(vạch đối chứng) Nếu dịch chiết mẫu phân có chứa kháng nguyên virus rota thì khiđưa que nhúng vào sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể - hạt vàng Khiphức hợp này di chuyển dọc theo que nhúng tới vị trí kiểm tra hình thành một vạchmàu hồng tía và thể hiện trạng thái dương tính Phần cộng hợp còn lại không gắnvới kháng nguyên di chuyển tới vị trí đối chứng cho vạch màu hồng tía chứng tỏque nhúng hoạt động bình thường, kết quả có giá trị Như vậy, khi xuất hiện cả 2

vạch hồng tía ở vạch kiểm tra và đối chứng chứng tỏ mẫu dương tính với virus rota,khi chỉ có một vạch hồng tía ở vị trí đối chứng kết luận mẫu âm tính với virus rota.Quick Test có đặc hiệu 97.3%, độ nhạy 97.4% ( http://www.orgenics.com )

Qiuck TestTM Rota virus Ag Casette của ORGENICS phát hiện virus rotanhóm A trong mẫu phân Kit sử dụng hai loại kháng thể trong sắc ký miễn dịch pharắn để phát hiện protein đặc hiệu nhóm kể cả protein capsid bên trong và sự có mặtcủa virus rota nhóm A Màng nitrocellulose được phủ bởi các kháng thể thỏ khángvirus rota đơn dòng và các kháng thể chuột kháng virus rota đơn dòng được sử dụngnhư các detector tương ứng, điều này cho phép Quick TestTM Rota virus Ag Casettephát hiện sự có mặt của các kháng nguyên virus rota nhóm A trực tiếp từ miếng gạclấy mẫu phân với độ chính xác cao.Trước tiên chất keo vàng – kháng thể chuộtkháng virus rota phản ứng với virus rota có mặt trong mẫu phân người Sau đó hỗnhợp này sẽ phản ứng với kháng thể thỏ kháng virus rota trên màng Cassette có chữcái T như Test line và C như Control line trên bề mặt cassette Cả hai đều khôngđược nhìn thấy trước khi nhúng vào mẫu Control line sử dụng như một chứng choquy trình Khi thực hiện quy trình chính xác thì control line phải xuất hiện điều đóchứng tỏ các chất tham gia phản ứng của kit hoạt động tốt Vạch đỏ tía ở dòng Txuất hiện khi có đủ virus rota trong mẫu Nếu virus rota không có mặt ở trong mẫuthì không xuất hiện vạch màu ở dòng T Quick TestTM Rota virus Ag Casette là kitđịnh tính phát hiện nhanh sự có mặt của virus rota nhóm A trong mẫu phân người.Quick TestTM Rota virus Ag Casette chỉ sử dụng cho sàng lọc ban đầu, các kết quảnên khẳng định bằng kit ELISA thương mại hoặc RT- PCR Kit có độ nhạy 94%, độđặc hiệu 98.3% Thời gian thực hiện 20 – 30 phút ( http:// www.orgenics.com )

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Hóa chất, kháng thể

- Dung dịch hydro tetraclorua vàng (HAuCl4): phòng Proteomic thuộcTrung tâm Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học thuộc trườngĐại học Bách Khoa điều chế hạt nano vàng

- Đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0.2g; Na2HPO4

- Kháng thể dê tinh sạch kháng kháng thể thỏ trong miếng cộng hợp

2.1.2 Các vật liệu chế tạo que thử

- Miếng cộng hợp (Hãng Biotech - Conjugate pad ZC J2, size 21x20 cm)

- Miếng thấm mẫu (Hãng Biotech - Sample pad FM Y2)

- Màng nitrocellulose (HãngBiotech)

- Vỏ nhựa (Xuất xứ Trung Quốc)

- Miếng thấm hút (Hãng Biotech –Absorbent pad H5076, size 20x30 cm)

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinhhọc, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học BáchKhoa Hà Nội:

- Máy AUTOKUN (Sản xuất tại Ấn Độ, phân phối bởi công ty BCE ViệtNam)

- Máy CAMAG (Sản xuất tại Thụy Sĩ, phân phối bởi công ty BCE ViệtNam)

- Lò lai phân tử (UVP Hybrid, Mỹ)

- Kim tiêm ( phụ kiện đi kèm theo máy CAMAG)

- Cân kỹ thuật TE 612 (Sartorius, CHLB Đức)

- Cân phân tích CPA 324S (Sartorius, CHLB Đức)

- Tủ cấy vô trùng Class II Type A2 (ESCO)

- Tủ lạnh sâu – 20oC (Sanyo, Nhật Bản)

- Tủ lạnh sâu -80oC (Sanyo, Nhật Bản)

- Micropipette các loại (Biohit)

- Máy đo pH (Mettler Toledo)

- Máy ly tâm eppendorf (Eppendorf 5415C, CHLB Đức)

- Máy khuấy từ

- Máy votex Delta Mixer (Taitex, Nhật Bản)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp gắn kháng thể kháng virus rota lên bề mặt hạt nano vàng

2.2.1.1 Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể và nano vàng

Nguyên tắc chung cho pH tối ưu có thể gắn với hiệu suất cao nhất dựa trênđiểm đẳng điện PI của loại kháng thể đó Các hạt nano vàng sẽ gắn một cách hiệuquả với protein khi pH của dung dịch gần với điểm đẳng điện PI của protein đó Khi

ở pH cao hơn, hiệu suất gắn sẽ cao hơn nhưng điều này sẽ làm biến tính protein vàlàm cho phản ứng đặc hiệu trở nên kém và có thể mất tính đặc hiệu của kháng thểlên hạt vàng

Một điều đáng lưu ý là khi có quá nhiều protein gắn lên bề mặt hạt nanovàng sẽ là một bất lợi: một số protein liên kết yếu có thể tách khỏi bề mặt hạt nano.Điều này sẽ làm các hạt có gắn protein trở nên kém hiệu quả vì các protein tự do sẽcạnh tranh với các miền gắn trên hạt nano

Các hạt keo vàng kích thước nano mét được tổng hợp tồn tại ở dạng huyềnphù bởi lực đẩy tĩnh điện lẫn nhau được sinh ra và duy trì bởi mạng lưới điện tích