nghiên cứu sơ bộ qui trình thiết lập kỹ thuật real time pcr để phát hiện và định lượng bệnh đốm trắng wssv trên tôm

“Thiết lập kỹ thuật Realtime PCR phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng WSSV ở tôm” GVHD:TS.BS.. “Thiết lập kỹ thuật Realtime PCR phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm t

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ – BÁN CÔNG TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***

Đề tài:

NGHIÊN CỨU SƠ BỘ QUI TRÌNH THIẾT LẬP KỸ THUẬT REAL TIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV)TRÊN TÔM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

CHUYÊN NGHÀNH: SINH HỌC PHÂN TỬ

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN :TS.BS PHẠM HÙNG VÂN

BS NGUYỄN PHẠM THANH NHÂN SINH VIÊN THỰC HIỆN :VÕ THỊ THANH THẢO

Tp.Hồ Chí Minh 11/2004

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

°°°

Em xin chân thành cảm ơn trường Đại Học Mở Bán Công Tp.HCM và các thầy cô trong khoa CNSH đã tạo môi trường học tập tốt và đào tạo chúng em trưởng thành về mọi mặt

Em xin chân thành cảm ơn TS.BS Phạm Hùng Vân đã tận tình giảng dạy, định hướng em thực hiện đề tài này Đồng thời em cũng cảm ơn sự giúp đỡ của

BS Nguyễn Phạm Thanh Nhân, CN Phạm Thanh Thùy Trang và các anh chị trong phòng SHPT nói riêng, các anh chị trong công ty Nam Khoa nói chung đã giúp đỡ em về mặt tài liệu, cơ sở vật chất cũng như tinh thần để thực hiện đề tài thuận lợi

Cám ơn tất cả bạn bè đã cho tôi nhiều lời khuyên bổ ích cũng như động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua

Trang 3

CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

dATP : 2’ – deoxyadenosine – 5’ – triphosphate

dCTP : 2’ – deoxycitydine – 5’ – triphosphate

dTTP : 2’ – deoxyithymine – 5’ – triphosphate

dGTP : 2’ – deoxyguanosine – 5’ – triphosphate

dNTP : 2’ – deoxynucleoside – 5’ – triphosphate

EDTA : Ethylen diamine tetraacetic acid

FAO : Food and Agriculture Organization

HHNBV : Hypodermal and henatopoietic necrosis baculovirus

PL : Postlarvae – Hậu ấu trùng tôm

Realtime – PCR : Real time Polymerase chain reaction

Tm : Nhiệt độ nóng chảy của DNA sợi đôi

Trang 4

TE : Tris - EDTA

SEMBV : Systemic hec toderma and mesodemal baculovirus

VASEP : VietNam Association of Seafood Exporters and

Producers WSSV : White Spot Syndrome Virus

Trang 5

M ỤC L ỤC

***

LỜI CẢM ƠN

CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

LỜI MỞ ĐẦU 1

Phần I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TÔM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 5

1 SƠ LƯỢC VỀ TÔM SÚ 7

2.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái của tôm sú 7

2.2.1 Vị trí phân loại học của tôm sú trong tự nhiên 7

2.2 Sự tăng trưởng và phát triển của tôm sú 8

2.2.1 Các giai đoạn phát triển của tôm sú từ tăng trưởng đến trưởng thành 8

2.2.2 Tập tính ăn và loại thức ăn 9

2 VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WHITE SPOT SYNDROME VIRUS) 9

3.1 White spot syndrome virus (wssv) 9

3.2 Dấu hiệu bệnh lý 10

3.3 Cơ chế xâm nhập và con đường truyền lây 11

3.3.1 Qúa trình truyền lây 11

Trang 6

3.3.1.1 Lây theo chiều ngang (Horizontal transmission) 11

3.3.2.1 Lây theo chiều dọc (Varitical transmission) 12

3.3.2 Cơ chế xâm nhập 12

3.3.3 Ký chủ 13

3.3.4 Sức đề kháng 13

3.3.5 Phương pháp chẩn đoán 14

3 PHƯƠNG PHÁP PCR 14

4.1 Khái niệm 14

4.2 Nguyên tắc 15

4.3 Qui trình phản ứng PCR 15

4.4 DNA đích(target DNA) 16

4.5 Mồi và nhiệt độ lai 16

4.6 Enzyme 17

4.7 Đệm và MgCl2 18

4.8 Deoxytriphosphat(dNTPs) 18

4 CÁC KỸ THUẬT CẢI TIẾN CỦA PCR 18

5.1 Cải tiến thứ nhất: Kỹ thuật Non Stop Nested PCR 18

5.2 Cải tiến thứ hai: Kỹ thuật Real time PCR 19

5.2.1 Khái niệm 19

5.2.2 Nguyên tắc 19

5.2.3 Phương pháp 20

5.2.3.1 Dùng probes tóm bắt huỳnh quang 20

5.2.3.2 Dùng những tác nhân để ràng buộc DNA 22

Trang 7

5.2.4 Qui trình 23

5.2.4.1 Threshold cycle (ct) chu kỳ ngưỡng 23

5.2.4.2 Standar curve 24

5.2.4.3 Melt curve 24

5.2.4.4 End point ` 25

5.2.5 Ưùng dụng 25

Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 ĐỊA ĐIỂM LẤY MẪU 28

2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 28

3 VẬT LIỆU 28

3.1 Mẫu thử 28

3.2 Thuốc thử 28

3.2.1 Tách chiết DNA 28

3.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng Real time PCR 28

3.2.3 Bộ kit PCR non Stop Nested PCR 29

3.2.4 Mồi dùng cho phản ứng Real time PCR 29

3.2.5 Hóa chất dùng cho điện di 29

3.2.6 Thang DNA 29

4 THIẾT BỊ 30

5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

5.1 Chuẩn bị mẫu 30

5.2.1 Số lượng mẫu 30

5.2.2 Yêu cầu đối với mẫu phân tích 31

Trang 8

5.2 Phương pháp tiến hành 31

5.2.1 Xử lý mẫu 31

5.2.2 Ly trích thô 31

5.2.3 Ly trích bằng Intagene matrix 32

5.3 Phản ứng khuếch đại PCR 32

5.4.1 Real time PCR 32

5.4.2 Non Stop Nested PCR 34

5.4 Tiến hành điện di 35

5.4.1 Chuẩn bị gel Agarose 1,5% 36

5.4.2 Điện di 36

5.5 Đọc kết quả 36

Phần 3: KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN 1 QUI TRÌNH LY TRÍCH DNA CỦA WSSV- SO SÁNH HAI QUI TRÌNH LY TRÍCH THÔ VÀ INTAGENE MATRIX 39 2 THỬ NGHIỆM REAL TIME PCR VỚI TAQMAN PROBE VÀ SYBR GREEN I 44

2.1 Thử nghiệm Realtime PCR với SYBR GREEN I 45

2.2 Thử nghiệm Realtime PCR với TaqMan Probe 50

3 SO SÁNH ĐÔ NHẠY GIỮA REAL TIME PCR VỚI KỸ THUẬT NON STOP NESTED PCR PHÁT HIỆN WSSV TRÊN TÔM 54

Phần 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Trang 9

1 KẾT LUẬN 61

2 ĐỀ NGHỊ 61

Trang 10

“Thiết lập kỹ thuật Realtime PCR phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm

trắng (WSSV ) ở tôm”

GVHD:TS.BS Phạm Hùng Vân, BS.Nguyễn Phạm Thanh Nhân

SVTH: Võ Thị Thanh Thảo - 30000676 Trang 1

LỜI MỞ ĐẦU

Theo hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP) năm

2003, nước ta sản xuất khoảng 300.000 tấn tôm, trong đó tôm nuôi đạt 244.000 tấn Đây cũng là năm mà kim nghạch xuất khẩu tôm vượt mức 1 tỷ USD, chiếm 49% tổng kim nghạch xuất khẩu thủy sản Điều đó cho thấy vị trí quan trọng của tôm trong cơ cấu xuất khẩu Bên cạnh lợi nhuận lớn, rủi ro còn lớn hơn, ngoài vụ kiện tôm vừa qua, người nuôi tôm còn bị rủi ro khi tôm bị dịch bệnh làm tôm chết hàng loạt vẫn thường xuyên xảy ra.[ 21]

Dịch bệnh do nhiều nguyên nhân khác nhau, có thể do virus, vi khuẩn, nấm,

ký sinh trùng,… Cóù nhiều loại virus gây bệnh trên tôm sú Penaeus monodon:

WSSV, MBV, HPV, YHV, GAV… đây là các tác nhân gây bệnh nguy hiểm, hàng năm, những virus này gây thiệt hại nghiêm trọng cho các khu vực nuôi tôm[ 15 ] Đặc biệt, bệnh do virus WSSV gây hội chứng đốm trắng có mức thiệt hại cao gấp nhiều lần các bệnh khác và đang lan tràn khắp nơi, thời gian từ lúc nhiễm bệnh đến khi tôm chết rất ngắn và tỉ lệ lây nhiễm giữa các ao nuôi trong cùng khu vực rất cao, nhất là khi nông dân chưa có kinh nghiệm nhiều về phòng chống lây nhiễm các loại bệnh này Ngoài ra, tác nhân gây bệnh là virus, không có thuốc đặc trị nên phòng bệnh vẫn là chủ yếu Vì vậy cần phải có biện pháp chẩn đoán nhanh, phát hiện kịp thời các triệu chứng lâm sàng của bệnh cũng như chẩn đoán sớm trong phòng thí nghiệm trong tất cả các giai đoạn từ giai đoạn thả tôm đến khi thu hoạch để nhanh chóng phát hiện mầm bệnh, từ đó hạn chế được thiệt hại cho người nuôi tôm và cho môi trường

Chính vì những lý do trên, các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhiều phương pháp phát hiện sự có mặt của WSSV trong các mẫu tôm bệnh cũng như mẫu môi trường để nhằm chẩn đoán sớm sự có mặt của WSSV trên những mẫu thử này

Trang 11

Từ phương pháp kinh điển như tìm các triệu chứng lâm sàng của bệnh đốm trắng trên tôm, đến phương pháp mô học phát hiện một số triệu chứng trên mẫu mô cắt, phương pháp miễn dịch cũng đã được nghiên cứu triển khai và gần đây, việc ứng dụng phương pháp hiện đại hơn đó là dùng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction ) để chẩn đoán bệnh

Để chẩn đoán được tác nhân virus WSSV, phương pháp PCR có thể được coi như là một phương tiện thích hợp và hữu hiệu vì trước hết đây là tác nhân virus nên không thể hay khó nuôi cấy trong các điều kiện của nông dân Việt Nam hay của các cơ quan kiểm tra dịch bệnh trên tôm PCR xác định WSSV không chỉ có thể thực hiện trên các mẫu thử là tôm mà còn có thể thực hiện trên các mẫu thử là môi trường nuôi tôm cũng như các động vật giáp xác hoang dã có trong môi trường, vì vậy nên còn được dùng như là một xét nghiệm hữu hiệu trong phòng dịch

Như vậy, phương pháp PCR cho kết quả chẩn đoán nhiễm WSSV nhanh, nhạy, chính xác Sau khi có được kỹ thuật PCR phát hiện bệnh đốm trắng WSSV trên tôm, người ta đã đi thêm một bước nữa là nghiên cứu kỹ thuật Realtime PCR cho phép phát hiện và có thể định lượng được mức độ nhiễm WSSV trên các mẫu thử

Được sự chấp thuận của khoa Công nghệ Sinh học trường Đại Học Mở Bán Công Tp.HCM và được sự đồng ý của công ty Nam Khoa với sự hướng dẫn của TS.BS Phạm Hùng Vân và BS Nguyễn Phạm Thanh Nhân, tôi tiến hành đề tài:

“Thiết lập kỹ thuật REALTIME PCR phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) ở tôm” với những mục tiêu:

Trang 12

1 Thiết kế qui trình ly trích DNA của virus WSSV cho kỹ thuật REALTIME PCR So sánh hiệu quả giữa hai qui trình ly trích: ly trích thô DNA và ly trích tinh bằng bộ InstageneTM Matrix trong Realtime PCR

2 Thiết kế kỹ thuật Realtime PCR hoàn chỉnh để phát hiện và định lượng mức độ nhiễm bệnh trên tôm

3 So sánh độ nhạy giữa Realtime PCR với kỹ thuật Nonstop Nested PCR phát hiện WSSV trên tôm

Sau khi giải quyết được các mục tiêu trên, xây dựng được một bộ thử nghiệm hoàn chỉnh phát hiện và định lượng WSSV Có nghĩa là bộ thử nghiệm phải giúp được các phòng thí nghiệm PCR thực hiện được đầy đủ các khâu trong thử nghiệm, từ tách chiết nucleic acid đích, đến khuếch đại sản phẩm đặc hiệu trên hệ thống Realtime PCR để cuối cùng là phát hiện và định lượng nồng độ virus WSSV có trong các mẫu thử

Trang 13

Phần 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 14

1 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TÔM TRÊN THẾ GIỚI VÀVIỆT NAM

Hiện nay nghề nuôi tôm đang phát triển mạnh, phổ biến là tôm sú, tập trung chủ yếu ở hai khu vực Nam Mỹ và Châu Á Đặc biệt, năm 2003 ở Châu Á, chiếm 86% sản lượng tôm trên thế giới, trong đó các nước sản xuất lớn là Thái Lan, Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan …[ 21 ]

Theo số liệu của FAO (2002) thì năm 2003, sản lượng tôm nuôi của Châu Á ước tính đạt 1,35 triệu tấn, tăng 11% so với sản lượng ước tính năm 2002 và 15% sản lượng thực tế của năm 2001 Riêng Trung Quốc, sản lượng ước tính đạt 390.000 tấn, tăng 15% so với sản lượng ước tính năm 2002 và 8% sản lượng thực tế của năm 2001 là 304.000 tấn. [ 21 ]

Trong những năm gần đây, do mật độ nuôi tôm quá dày gây tồn đọng, tích tụ chất thải hữu cơ và khí độc Thêm vào đó là do cho ăn quá nhiều cộng với vệ sinh kém, cộng với môi trường nước nuôi tôm xấu dẫn đến việc càng ngày càng có nhiều địa phương tôm nhiễm bệnh và chết hàng loạt Trong các bệnh làm cho tôm chết, bệnh do virus chiếm tỉ lệ cao nhất và làm cho tôm chết nhanh nhất Sự xuất hiện của virus gây hội chứng đốm trắng White Spot Syndrome Virus (WSSV) bắt đầu được xác định ở tôm sú tại Trung Quốc và Đài Loan và đã có ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành công nghiệp nuôi tôm Châu Á, bệnh đã gây thiệt hại nhiều ở những vùng nuôi tôm của Thái Lan, Trung Quốc…, làm giảm sản lượng xuất khẩu ở các nước này Đại dịch đã làm cho các nước nuôi tôm lớn như Thái Lan phải chịu tổn thất ước lượng xấp xỉ 1 tỷ USD ; ở Trung Quốc, tổng sản lượng thu hoạch trong năm 1999 đã giảm xuống chỉ còn 70.000 tấn [ 16 ] , đặc biệt năm 1999 làm tổn thất 0.5 tỷ USD mỗi năm ở Châu Mĩ La Tinh

Ở Việt Nam, nghề nuôi trồng thủy sản trong những năm gần đây phát triển rất mạnh Chỉ trong một thời gian ngắn, diện tích nuôi tôm đã tăng thêm 110.000

Trang 15

ha ở 3 tỉnh: Cà Mau, Bạc Liêu và Kiên Giang Phong trào nuôi tôm bùng phát dữ dội thành một cao trào không gì ngăn cản nổi ở các tỉnh ven biển, hình thức nuôi tôm chủ yếu là quảng canh cải tiến (chiếm 80%) Sáu tháng đầu năm, sản lượng khai thác và nuôi thủy sản toàn tỉnh Cà Mau đạt 140.000 tấn, bằng 56% kế hoạch, tăng 3,3% với cùng kỳ, trong đó, sản lượng tôm đạt 45.000 tấn, tăng 9,76 so cùng ky.ø [ 21 ]

Chính phủ vừa phê duyệt chương trình giống thủy sản Việt Nam đến năm

2010, nhằm mục đích hình thành tập đoàn giống thủy sản đa dạng, có giá trị kinh tế xuất khẩu, Việt Nam phấn đấu đạt 35 tỉ con. [ 22 ]

Tuy nhiên trong quá trình sản xuất giống và nuôi tôm thịt, nhiều cơ sở sản xuất đã bị thiệt hại nhiều do bệnh ở tôm Sự phát triển của bệnh ở tôm có chiều hướng gia tăng khi số trại nuôi và diện tích nuôi tôm được mở rộng; khi chuyển hình thức nuôi từ quảng canh truyền thống sang quảng canh cải tiến và bán thâm canh; khi số người nuôi tôm chưa được đào tạo kỹ thuật và hiểu biết về con tôm ngày càng đông…

Từ năm 1990-1995, số lượng tôm nuôi có xu hướng giảm sút do các nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và dịch bệnh (FAO, 1997) Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam diễn ra trên qui mô khá rộng Nhiều đợt dịch bệnh xảy ra trên qui mô toàn quốc gây thiệt hại nặng nề, nhất là

ở các tỉnh nuôi tập trung như: Bà Rịa-Vũng Tàu, Bến Tre, Bạc Liêu, Tiền Giang…

Khảo sát kiểm tra của đoàn công tác bộ thủy sản cho thấy tình trạng tôm chết

ở những vùng mới chuyển đổi đã đến mức báo động Từ tháng 01/1994 đến nay, tôm ở những vùng nuôi tập trung bị chết hàng loạt, chủ yếu là tôm sú Tính đến 30/09/1994, diện tích nuôi tôm bị chết lên đến gần 85.000 ha, ước tính thiệt hại lên đến 5.520 tấn, trị giá 294 tỉ đồng. [ 7 ]

Trang 16

Dịch bệnh trên tôm ở Việt Nam tập trung ở một số bệnh do virus như: đốm

trắng, đầu vàng, còi, và nhóm vi khuẩn Vibrio… Trong đó bệnh đốm trắng đã gây

ra những thiệt hại lớn Qua ghi nhận và nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước, hiện nay có trên 30 bệnh và hội chứng của bệnh tôm nuôi với hai nguyên nhân nhiễm trùng và không nhiễm trùng Tác nhân gây bệnh quan trọng nhất phải kể đến trước tiên là virus, đã gây nhiều thiệt hại đến năng suất người nuôi tôm. [ 6 ]

2 SƠ LƯỢC VỀ TÔM SÚ

2.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái của tôm sú

Đây là loài tôm có kích thước lớn, giá trị kinh tế cao Khi còn tươi, ở vỏ đầu ngực tôm có vằn ngang (tôm ở biển vằn trắng - nâu hoặc trắng xanh xen kẽ, ở đầm đìa nước lợ, tôm có vằn màu xanh đen) Tôm sú là loài tôm sống ở đáy, nơi có chất bùn hoặc bùn cát Ban ngày thường vùi mình trong đáy, không di động; ban đêm hoạt động mạnh đi tìm mồi Giai đoạn tôm giống thường tập hợp thành quần thể, nơi có nhiều rong cỏ, hoặc bám trên cỏ, vì vậy có vùng ngư dân gọi là tôm cỏ Khả năng thích nghi với nồng độ muối tương đối rộng 10- 30% và nhiệt độ nước 17-29º C Sức sống của tôm sú lớn, rời khỏi nước một thời gian mới chết

[ 12 ]

2.1.1 Vị trí phân loại học của tôm sú trong tự nhiên [ 4 ]

− Ngành động vật chân đốt Arthropoda

− Phụ bộ chân bơi Natantia

Trang 17

Tên la tinh (Tên khoa học): Penaeus (Penaeus) monodon Fabricius

Tên tiếng Anh:Giant Tiger Prawn,Tiger Prawn,Black Tiger Prawn

(Hệ thống phân loại của Hoihtus,1989)

2.2 Sự tăng trưởng và phát triển của tôm sú

Trong giống tôm he, tôm sú là loài có thể trọng lớn nhất Thể trọng có thể đạt 0,5 kg, chiều dày 350 mm Tôm sú lớn rất nhanh, từ post 1 sau một tháng có thể dài 45 mm, thể trọng 0,8 g, hai tháng dài 80 mm và nặng 4,5 g, sáu tháng có thể đạt 160 mm và nặng 80 g, một năm có thể dài 240 mm và nặng trên 100 g Theo kết quả của nhiều tác giả cho rằng vòng đời của tôm sú từ 1-2 năm, nhưng cá biệt cũng có thể sống dài hơn

Trong thiên nhiên, ấu trùng tôm sú trải qua ba thời kỳ biến thái (Nauplius – Zoea – Mysis) Aáu trùng sẽ theo sóng biển dạt vào cửa sông, đó là vùng nước lợ

có độ mặn 15-30%o Tại môi trường nước lợ, ấu trùng larvae phát triển sang thời

kỳ hậu ấu trùng Postlarvae Sau đó Postlarvae chuyển sang thời kỳ ấu niên Juvenile đồng thời bơi ra biển, tiếp tục tăng trưởng và phát triển.[ 11 ]

2.2.1 Các giai đoạn phát triển của tôm sú từ trứng đến giai đoạn

trưởng thành [ 5 ]

Giai đoạn trứng : 13-14 giờ

Giai đoạn Nauplius : Kéo dài 48 –56 giờ, chia thành sáu giai

đoạn từ N1 đến N6, tỷ lệ sống 90%

Giai đoạn Zoea : kéo dài 3-4 ngày, gồm ba giai đoạn Z1

đến Z3

Giai đoạn Mysis : kéo dài 3-4 ngày, gồm ba giai đoạn, tỷ

lệ sống 70%

Giai đoạn Postlarvae : kéo dài 20 ngày, có 20 giai đoạn từ PL1

-Pl20, tỷ lệ sống 40-50%

Trang 18

 Giai đoạn juvenile : Giai đoạn chuyển qua ao nuôi thịt sau

4-7 tháng có thể thu hoạch

Hình 1.1: Vòng đời tôm sú Penaeus monodon (TheoV.A.De Graindorge và T.W.Flegel,1999)

2.2.2 Tập tính ăn và loại thức ăn

Tôm sú là loài ăn tạp, ăn cả thực vật lẫn động vật, ở giai đoạn ấu trùng Zoea,

ăn thực vật phù du với hai giống tảo Silic thích hợp là Chaetoceros và Skeletonema Ở giai đoạn chuyển sang ăn một số loài sinh vật phù du như luân

trùng và ấu trùng (Nauplius của Artemia) Giai đoạn Postlavae ăn giun nhiều tơ, ấu trùng tôm, cua, nhuyễn thể, mùn bã hữu cơ Nguồn thực phẩm của tôm trưởng thành là giáp xác, sản phẩm thực vật, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, cá, côn trùng [ 5 ]

3 VIRUS GÂY HỘI CHỨNG BỆNH ĐỐM TRẮNG (WHITE SPOT SYNDROME VIRUS)

3.1 White Spot Syndrome Virus (WSSV)

Định danh :

Trang 19

“ Thiết lập kỹ thuật Realtime PCR phát hiện va định lượng virus gây bệnh đốm

- DNA kep, kích thước phan tử 150 kb, 163 kb hoạc 168 kb

Vị trí sao chep : nhan

Vị trí thanh thục : nhan

Tac nhan virus gay benh đom trang đước goi bới nhieu ten do nhieu nhom nghien cứu khac nhau

- SEMBV : Systemic hec toderma and mesodermal baculovirus

- HHNBV : Hypodermal and henatopoietic necrosis baculovirusHiện nay, virus gay bệnh đom trang tren tom su WSSV la ten thong dung

3.2 Dau hiệu bệnh ly [ 28 ]

Bênh đom trang la bênh truyen nhiem cấp tính tren nhom tom su do nhomvirus thuộc ho Baculovirus khong co the an gay nen

Trang 20

Hình 1.2: Bệnh đốm trắng trên tôm sú

-Dấu hiệu đặc trưng của bệnh là có những đốm trắng có đường kính lớn, nhỏ khác nhau (thường nhỏ hơn 3 mm), nằm ở mặt trong của lớp vỏ kitin ở phần đầu ngực và đốt bụng thứ sáu Ở những trường hợp nặng, đốm trắng xuất hiện trên toàn thân Một số tôm chết có màu hồng đỏ trên lớp biểu bì

-Những dấu hiệu khác: đầu tiên, thấy tôm ở tầng mặt dạt vào bờ, bỏ ăn , hoạt động kém, các phần phụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên, vỏ có nhiều sinh vật bám

-Các đốm trắng xuất hiện ngay khi có dấu hiệu đầu tiên, sức khỏe tôm yếu và có thể lên đến 70% tôm bị bệnh trong vòng không quá 7 ngày

Tuy nhiên cũng cần phân biệt những trường hợp bệnh lý giống như bệnh đốm trắng Trong trường hợp này, những đốm trắng xuất hiện loang lỗ trên thân tôm và tôm chỉ chết rải rác hoặc kéo dài, khi lột xác song, các đốm trắng bong ra khỏi vỏ và tôm hoạt động trở lại bình thường dấu hiệu này là do pH cao hoặc do tôm bị nhiễm vi khuẩn

3.3 Cơ chế xâm nhập và con đường truyền lây

3.3.1 Qúa trình truyền lây [ 21 ]

3.3.1.1 Lây theo chiều ngang (Horizontal transmission)

Nhiễm bệnh từ tôm bệnh truyền sang, từ vật chủ trung gian mang mầm bệnh hoặc các mầm bệnh có sẵn trong nước do:

-Nuôi với mật độ cao

Trang 21

-Không có lưới ngăn -Không dùng ao lắng, bơm nước trực tiếp từ ngoài vào -Vật chủ trung gian: các loại cua biển, tôm đất…

3.3.1.2 Lây theo chiều dọc (Vertical transmission)

Nhiễm bệnh từ tôm bố mẹ

-Tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh -Thức ăn của tôm bố mẹ (cua biển, hà biển) bị nhiễm bệnh -Nước dùng cho trại giống bị nhiễm bệnh

3.3.2 Cơ chế xâm nhập [ 14 ]

WSSV ký sinh trong tế bào trùng của các cơ quan: cuống mắt, dạ dày, mang… chúng nhân lên rất nhanh trong tế bào vật chủ và dần dần phá vỡ nhân tế bào Chúng tiếp tục tấn công vào tế bào bên cạnh hoặc theo phân thải ra môi trường ngoài Tôm ăn phải virus tự do có trong bùn ao và trong nước sẽ bị nhiễm mầm bệnh WSSV

Trong thí nghiệm lây bệnh virus WSSV trên hai loài tôm Penaeus monodon và Penaeus indicus bằng cách tiêm hoặc cho ăn tôm bị bệnh WSSV Kết quả cho

thấy tỉ lệ tôm chết là 100% trong vòng 5-7 ngày sau khi tôm xuất hiện dấu hiệu bệnh đốm trắng

Tỷ lệ chết của hai loài khác nhau Đối với P.monodon, tỷ lệ chết 100% chỉ trong vòng 5 ngày còn ở P.indicus trong 7 ngày Tỷ lệ chết 100% sau 72 giờ sau khi tiêm và 108 giờ qua đường tiêu hóa ở tôm P.indicus, đối với tôm P.monodon

là 48 giờ sau khi tiêm và 120 giờ qua tiêu hóa

Ngoài ra, WSSV còn có khả năng lây truyền từ tôm bố mẹ sang tôm ở giai đoạn ấu trùng, duy trì qua giai đoạn giống và phát bệnh ở giai đoạn 1-2 tháng sau khi thả nuôi

3.3.3 Ký chủ

Trang 22

Vùng ký chủ của WSSV rất rộng lớn Trong điều kiện môi trường mới, virus thích nghi rất nhanh

Các loài tôm he: Penaeus monodon (Black Tiger Shrimp), P.japonicus (Kuruma Shrimp), P.penicillatus (Red tai Shrimp), Metapenaeus ensis (Sand shrimp), Litopenaeus vanamei, P.indicus

Các loài tôm khác: Palaemon Seaticyliferus, Macrobrachium rosenbergii, Expalaemon orientalis

Cácloài cua hoang dã: Charybdis feriatus, Potumus pelagicus, Portunus sanguineolentus, Scylla serraata

- Cua ký cư : Helice indens

- Giáp xác chân chèo : Copepodas (day – Sanz,Flegel,1997)

3.3.4 Sức đề kháng

Virus gây bệnh có sức chống chịu yếu với các tác nhân vật lý và hóa học

-Aùnh sáng: virus sẽ chết trong vòng 72 giờ

-Nhiệt độ: ở nhiệt độ 55oC trong 90 phút và 75oC trong 5 phút virus không có khả năng gây bệnh

-Tia cực tím: virus bất hoạt sau 60 phút (tia UV 9 x 105 ws/cm2)

-Độ pH:

pH=1 bất hoạt sau 10 phút

pH=3 bất hoạt sau 1 giờ

pH=12 bất hoạt sau 10 phút

-Ozon(O3): virus bất hoạt ở nồng độ 0.5µg/ml

-Sodiumhypochloride (100ppm), Povidineiodine (100ppm), Benzalkanium chloride (75 ppm): virus không còn tác dụng sau 10 phút

3.3.5 Phương pháp chẩn đoán [ 6 ]

Trang 23

Kết hợp với dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đã được mô tả ở trên, mầm bệnh đốm trắng có thể phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau: -Phương pháp mô học : dấu hiệu định bệnh là sự xuất hiện của những thể vùi trong nhân tế bào của các mô có nguồn gốc trung bì

-Phương pháp PCR : dấu hiệu định bệnh là phát hiện sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen đặc hiệu của tác nhân gây bệnh

-Phương pháp lai tại chỗ DNA ( In situ DNA hybridization ) : dấu hiệu định bệnh là kết quả lai giữa đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh trong điều kiện nghiêm ngặt

-Phương pháp Dot blot và Southern blot : được thực hiện với sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen đặc trưng của tác nhân

-Phương pháp miễn dịch huỳnh quang

4 PHƯƠNG PHÁP PCR

4.1 Khái niệm. [ 32 ]

PCR là chữ viết tắt của Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi nhờ men Polymerase) PCR là nhân bản trình tự DNA trong ống nghiệm nhờ các chu kỳ nhiệt

Phản ứng chuỗi Polymerase đầu tiên được mô tả năm 1985 do K.B Mullis và cộng sự PCR cho phép khuếch đại một lượng rất nhỏ DNA lên đến một số lượng đến mức mà ở đó người ta dễ dàng phát hiện bằng những phương pháp thông thường như điện di trên gel

Trang 24

4.2 Nguyên tắc

Một phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA khi trong dung dịch phản ứng khuếch đại có đủ các thành phần cần thiết cho phản ứng Các thành phần đó là:

− Mồi( Primer): Quyết định tính đạc hiệu của phản ứng PCR

− PCR mix: có các thành phần dNTP, Taq Polymerase, MgCl2, Buffer, và

1 số ion khoáng chất khác

− Dịch tách chiết DNA

4.3 Quy trình phản ứng PCR. [ 1 , 2 ,18 ]

Trong phản ứng PCR, nhiệt độ và thời gian là 2 yếu tố quan trọng Phản ứng PCR là một quy trình gồm nhiều chu kỳ nhiệt, mỗi chu kỳ thường qua 3 bước: Bước 1: Biến tính DNA mạch khuôn mẫu Khi nâng nhiệt độ trong ống nghiệm lên 94oC thì 2 mạch đơn của đoạn DNA bị biến tính và duỗi thẳng tách rời nhau ra Thời gian thực hiện biến tính thường trong vòng 30 giây đến 1 phút Bước 2: Bắt cặp mồi vào mạch khuôn mẫu Khi hạ nhiệt độ trong ống nghiệm xuống khoảng từ 50o- 65 oC thì các mồi bắt cặp vào 2 mạch đơn theo qui luật bắt cặp bổ sung Thời gian thực hiện thường trong vòng 30 giây đến 2 phút tùy theo mỗi loại phản ứng PCR

Bước 3: Sau đó nhiệt độ được đưa lên 70- 72oC, ở nhiệt độ này thì men DNA polymerase đã được hoạt hóa trong giai đoạn bắt cặp sẽ hoạt động kéo dài mạch DNA bổ sung Thời gian thực hiện bước này là trong vòng 30 giây đến nhiều phút

Sau đó mạch khuôn mẫu đích và bản sao của nó được dùng làm khuôn mẫu cho các chu kỳ sau Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 bước biến tính – bắt cặp –kéo dài được lặp lại nhiều lần (30-40 lần) Sau mỗi chu kỳ, số lượng bản copies của vi sinh vật đích tăng gấp hai lần

Trang 25

Sau n chu kỳ, sẽ có 2n đoạn DNA “đích” được nhân lên

Hình 1.3: Các giai đoạn của phản ứng PCR

4.4 DNA đích (target DNA)

DNA đích là DNA của vi sinh vật đích được ly trích từ các mẫu thử DNA đích được cho vào phản ứng PCR dùng làm mạch khuôn mẫu DNA đích sau khi

ly trích phải tinh sạch, không lẫn tạp chất khác vì những tạp chất này có thể gây ức chế phản ứng PCR

Phản ứng PCR thường khuếch đại tối ưu các DNA tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA được tách chiết trực tiếp từ dịch chiết tế bào hay mẫu mô Lượng DNA đích cho vào phản ứng nên được ước lượng sao

cho phù hợp vì cho nhiều quá đôi khi sẽ dẫn đến ức chế phản ứng PCR

4.5 Mồi và nhiệt độ lai

DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn mẫu cần sự hiện diện của những đoạn mồi chuyên biệt Mồi chuyên biệt là những sợi đơn DNA ngắn, kích thước từ 19- 25 nucleoid nên thường được gọi là đoạn Oligonucleotid Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer) Do đó, khi tổng hợp DNA, mồi sẽ bắt cặp bổ

5’

Bắt cặp ở 55oC

Kéo dài ở 72oC

3’

5’Biến tính ở 94oC

Trang 26

sung vào đầu 3’ của mạch khuôn và enzyme Taq polymerase sẽ kéo dài để hình thành mạch mới Mồi là yếu tố quan trọng nhất để quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR Thiết kế mồi cho phản ứng PCR thường tuân theo nguyên tắc đặc hiệu và có hiệu quả cao Trình tự các nucleotid của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược(Dimer primer ) và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” (hairpin) do sự bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một mồi Để tránh sự bắt cặp không đặc hiệu, người

ta thường thêm vào đầu 3’của mồi khoảng hơn ba nucleotide loại G/C Tm (nhiệt độ bắt cặp) của mồi xuôi và mồi ngược không quá cách biệt nhau, thường không quá 5oC Thành phần các nucleotide của các mồi phải cân bằng, trong đó các nucleotide loại G,C chiếm 50-60 % Chiều dài đoạn DNA sau khi khuếch đại không quá lớn Phản ứng PCR sẽ tối ưu đối với những trình tự nhỏ hơn 1 kb

hợp từ đầu đến cuối quá trình trong phản ứng Taq polymerase được tổng hợp và

thể hiện trong tế bào E.coli, có độ tinh khiết và hiệu suất cao, bền ở nhiệt độ

94oC lặp lại nhiều lần Taq polymerase này bắt đầu tổng hợp DNA từ mồi (ở đầu 3’), sử dụng sợi DNA đích làm mẫu Các nucleotide tự do được kết hợp để kéo dài thành sợi DNA mới Nếu sử dụng trong Realtime PCR thì ta phải yêu cầu nhà cung cấp đảm bảo rằng Taq phải có hoạt tính 5’- 3’ exonuclease (Newton C.R and Graham A,1994)

Trang 27

4.7 Đệm và MgCl2

MgCl2 cũnglà một trong những yếu tố quan trọng khi làm PCRø Ion Mg2+

làm co-enzyme cho Taq polymerase hoạt động, ngoài ra còn ảnh hưởng đến nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi Nhìn chung, nồng độ Mg++ thừa hay thiếu đều sẽ làm giảm hiệu quả phản ứng Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào từng phản ứng PCR, thường thì nằm trong khoảng từ 1-5 mM

Đệm cho phản ứng PCR thường gồm có Tris, KCl hay NaCl và một số khoáng chất khác cần thiết cho phản ứng PCR

4.8 Deoxy triphosphat (dNTPs)

Nồng độ dNTPs được sử dụng cho phản ứng PCR khoảng 10 - 100mM cho mỗi nucleotide : dATP, dCTP, dGTP, dTTP Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của Taq polymerase

5 CÁC KỸ THUẬT CẢI TIẾN CỦA PCR

Gần đây, đã có nhiều cải tiến về kỹ thuật cơ bản của phản ứng PCR, cho phép mở rộng phạm vi ứng dụng của PCR

5.1 Cải tiến thứ nhấtù: Kỹ thuật Non - Stop Nested PCR (PCR tổ không dừng). [ 22]

Phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR tổ, trước tiên khuếch đại một đoạn DNA trên bộ gen của vi sinh vật đích, sau dó khuếch đại một đoạn DNA bên trong sản phẩm khuếch đại đầu tiên này để có sản phẩm khuếch đại cuối cùng phát hiện được nhỏ hơn sản phẩm khuếch đại ban đầu Ba ưu điểm của phương pháp này là: (1) Nhờ dùng kỹ thuật PCR tổ nên độ nhạy phát hiện vi sinh vật đích rất cao (2) Đây là phương pháp PCR tổ không dừng giũa chừng (non-stop nested-PCR), nghĩa là sản phẩm PCR1 đã được tính toán có một lượng vừa đủ để

Trang 28

tham gia ngay trực tiếp vào PCR2 mà không cần phải mở tube lấy sản phẩm PCR1 cho vào PCR mix mới để chạy PCR2, chính nhờ vậy mà tránh được nguy

cơ ngoại nhiễm và có thể trang bị được hệ thống chống ngoại nhiễm bên trong PCR mix (3) Đây là phương pháp PCR mà các phòng thí nghiệm PCR chẩn đoán hoàn toàn có thể tránh được một thảm hoạ rất dễ gặp là ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại nhờ bản thân các PCR mix đã có chứa sẵn hệ thống phá huỷ các sản phẩm ngoại nhiễm không cho tham gia vào chu kỳ khuếch đại

5.2 Cải tiến thứ hai: Kỹ thuật Real time – PCR

5.2.1 Khái niệm:

Realtime PCR là một kỹ thuật PCR trong đó ta có thể định lượng nồng độ sản phẩm khuếch đại sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát quang hoặc phát huỳnh quang nên thường được gọi là PCR định lượng thời gian thực. [ 9 ]

5.2.2 Nguyên tắc:

Phương pháp dựa trên sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu Sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất hiện màu hay probe tóm bắt gắn hùynh quang Trong khi chạy PCR, đầu đọc Realtime sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở mỗi bước nhiệt đo trong mỗi chu kỳ nhiệtä tùy vào mỗi cơ chế phát hiện màu và lọai màu được cho vào Mẫu thử chứa nhiều DNA đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát

DNA Vi sinh vật đích

Trang 29

hiện sớm hơn là mẫu thử có ít DNA đích Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên phần mềm và biết được nồng độ virus ban đầu của mẫu thử dựa vào các nồng độ DNA chuẩn và chúng ta sẽ đo được nồng độ DNA trong các mẫu thử bằng đường biểu diễn chuẩn(Standard curve ) hiển thị mối quan hệ giữa các chu kỳ ngưỡng với các nồng độ DNA trong các mẫu chuẩn

5.2.3 Phương pháp:

có hai phương pháp hiện nay thường được sử dụng trong Realtime PCR [ 9 ,23,24,25,26 ]

5.2.3.1 Dùng probe đánh dấu hùynh quang

TAQMAN PROBES: là probe (mẫu dò) được thiết kế gắn chất phát huỳnh quang (FAM) ở đầu 5’và chất hấp thu hùynh quang (TAMRA) ở đầu 3’

- Mẫu dò được thiết kế đặc hiệu và chuyên biệt với gen đích

- Phản ứng PCR được thực hiện có 2 bước nhiệt độ: 94o C làm biến tính DNA, rồi hạ nhiệt độ xuống 60o C, lúc này thì probe sẽ tóm bắt và gắn vào 1 mạch đơn của sợi DNA theo nguyên tắc bổ sung, sau đó 2 mồi của phản ứng PCR sẽ gắn vào 2 sợi đơn và kéo dài của phản ứng PCR sẽ làm tách đầu 5’ của probe ra khỏi khuôn và lúc đó FAM được tự do sẽ phát hùynh quang khi có tia đèn UV chiếu vào và đầu đọc sẽ nhận biết và xử lý thông tin thu nhận được

- Hoạt tính 5’- 3’ exonuclease của taq polymerase chịu trách nhiệm tách đầu 5’ của probe ra khỏi mạch khuôn

- Cường độ huỳnh quang tỷ lệ với số mol phân tử sản phẩm khuếch đại

Trang 30

MOLECULAR BEACON PROBES: là probe (mẫu dò) được thiết kế gắn chất phát huỳnh quang (FAM,TAMRA,TET,ROX ) ở đầu 5’và chất hấp thu hùynh quang quencher(DABCYL) ở đầu 3’ Chúng được thiết kế có cấu trúc giống như kẹp tóc khi tự do để chất (FAM,TAMRA,TET,ROX ) phát huỳng quang ra bao nhiêu sẽ bị hấp thụ bấy nhiêu vào trong quencher

- Sản phẩm PCR sẽ bắt cặp với mẫu dò, làm biến tính duỗi thẳng probe và khi đó chất phát hùynh quang được tách ra khỏi xa quencher và hùynh quang sẽ phát

ra khi có tia sáng đèn UV chiếu vào

- Cường độ huỳnh quang tỷ lệ với số mol phân tử sản phẩm PCR

5.2.3.2 Dùng những tác nhân phát hiện màu huỳnh quang

Hình 1.5: Nguyên tắc của TaqMan probes

Hình 1.6: Nguyên tắc của Molecular Beacon

Trang 31

SYBR GREEN I

- Nguyên tắc của Realtime PCR này là chất hiện màu SYBR GREEN I cho vào trong PCR mix sẽ chèn vào sợi đôi DNA (dsDNA) SYBR GREEN I được kích thích tối đa ở bước sóng 497 nm và phát ra cực đại ở bước sóng 520 nm Trước khi vào các chu kỳ nhiệt của PCR, SYBR GREEN I phát ít huỳnh quang Khi vào chu kỳ PCR, sau mỗi chu kỳ PCR, số lượng sản phẩm khuếch đại được tăng lên gấp đôi thì lượng tín hiệu hùynh quang mà máy tính thu nhận được cũng tăng lên gấp đôi Vì thế nếu chúng ta đo được nồng độ hùynh quang phát ra sau mỗi chu kỳ PCR thì cũng đồng nghĩa với đo được lượng sản phẩm khuếch đại và từ đó có thể suy ra lương DNA đích ban đầu có trong mẫu thử

- Tín hiệu hùynh quang trên màn hình thể hiện số lượng của sản phẩm khuếch đại sau mỗi chu kỳ PCR Trong real time, ở giai đoạn biến tính, tất cả DNA trở thành chuỗi đơn, SYBR GREEN được giải phóng khỏi các sợi DNA và tự do trong dung dịch và tín hiệu huỳnh quang rất ít Sau đó, trong các giai đọan sau, mồi sẽ gắn vào các sợi DNA rồi Taq polymerase họat động kéo dài chuỗi DNA mới, đồng thời SYBR GREEN cũng sẽ gắn vào các sợi đôi mới tạo thành Vì thế, trong Realtime PCR này thì tín hiệu hùynh quang được phát ra từ SYBR GREEN sẽ được camera chụp ở giai đọan nhiệt độ kéo dài 72o C.Tín hiệu huỳnh quang sẽ được phát hiện sớm hay trễ phụ thuộc vào lượng DNA ban đầu cho vào PCR mix Mẫu thử chứa nhiều DNA đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu thử có ít DNA đích Điều quan trọng cần chú ý là tín hiệu hùynh quang thu nhận được có thể phát ra từ các sợi đôi DNA không rõ ràng như primer dimer (sản phẩm khuếch đại do 2 mồi bắt cặp với nhau ) và sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu

5.2.4 Qui trình

- Ly trích acid nucleic của mẫu thử

Trang 32

- Cho dung dịch sau khi ly trích vào trong tube PCR đã chứa sẵn một hỗn hợp các nguyên liệu cần thiết chạy Realtime PCR

- Cài đạt chương trình thích hợp cho từng kỹ thuật Realtime PCR và lựa chọn lọai kính lọc phát hiện màu đúng với màu được cho vào hỗn hợp PCR mix

- Cài đạt vị trí của mẫu trong buồng mẫu

- Chạy Realtime PCR và quan sát các tín hiệu huỳnh quang phát ra được ghi nhận trong suốt quá trình chạy

- Sau khi kết thúc, phân tích mẫu thử để biết mẫu (+) hay (-), nồng độ DNA ban đầu có trong mẫu thử, hiệu quả của phản ứng Realtime PCR cũng như độ tương quan của mẫu và của Standard

- Định lượng nồng độ DNA mẫu ban đầu bằng cách so sánh Ct mẫu thử với

Ct của mẫu Standar đã biết trước nồng độ và dựa vào đường biểu diễn

Standard curve

5.2.4.1 Threshold cycle (Ct): Chu kỳ ngưỡng

Chu kỳ ngưỡng là chu kỳ mà phần mềm của máy Realtime nhận diện được tín hiệu hùynh quang phát ra từ các phân tử DNA có trong mẫu thử Mặc dù trong những chu kỳ đầu của chương trình PCR thì đã có tín hiệu hùynh quang nhưng tín hiệu hùynh quang đó không hòan tòan là của các phân tử DNA đích Vì thế chu kỳ ngưỡng chỉ có thể nhận biết khi kết thúc chương trình PCR Đường cắt các tín hiệu huỳnh quang để tạo ra chu kỳ ngưỡng của từng mẫu thử được phần mềm Realtime thiết lập bằng cách lấy trung bình các tín hiệu huỳnh quang của tất cả các mẫu thử đang chạy Realtime trong khoảng từ 10- 20 chu kỳ đầu

5.2.4.2 Standar curve:

Đường biểu diễn Standard curve được thiết lập hiển thị mối quan hệ giữa các chu kỳ ngưỡng với các nồng độ DNA trong các mẫu chuẩn Nồng độ DNA ban

Trang 33

đầu trong các mẫu chuẩn sau khi kết thúc chương trình PCR được qui đổi ra Log Starting Quantitive và các tín hiệu huỳnh quang phát ra từ các mẫu chuẩn này được ghi nhận trong suốt quá trình chạy PCR để khi kết thúc chương trình sẽ tạo

ra các chu kỳ ngưỡng của các mẫu này Phương trình hồi qui giữa nồng độ DNA ban đầu của các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng được tính toán và đưa ra đường biểu diễn Standard curve với phương trình Y= aX + b với Y là chu kỳ ngưỡng và

X là Log Starting Quantitive Ngoài ra trên hiển thị Standard curve còn cho biết: (1) hệ số tương quan(Correlation Coefficient ) giữa nồng độ DNA ban đầu của các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng của các mẫu này, hệ số tương quan càng tiến đến 1 thì sự tương quan càng lớn và đồng nghĩa với phản ứng PCR Realtime hoạt động tốt.(2) Hiệu quả PCR (PCR Efficiency) phản ánh hiệu quả của phản ứng khuếch đại xảy ra giữa nồng độ DNA ban đầu trong các mẫu chuẩn với chu kỳ ngưỡng phát hiện, Hiệu quả này càng tiến đến 100% thì hiệu quả càng cao

5.2.4.3 Melt curve:

- Trong kỹ thuật Realtime PCR dùng chất hiện màu SYBR GREEN I, do tín hiệu hùynh quang thu nhận được có thể phát ra từ các sợi đôi DNA không rõ ràng như primer dimer (sản phẩm khuếch đại do 2 mồi bắt cặp với nhau ) và sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu nên khi cài đặt chương trình PCR Realtime thì người ta sử dụng Melt curve để xác định đặc tính của sản phẩm khuếch đại

- Mỗi sản phẩm sợi đôi DNA có nhiệt độ nóng chảy riêng (Tm), tính chất của nhiệt độ này có trong 50% sợi đơn DNA, 50% có trong sợi đôi Nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau như chiều dài sợi đôi DNA và %GC trong phân tử DNA, vì thế khi so sánh các nhiệt độ nóng chảy khác nhau của các mẫu khác nhau có thể phân biệt được đặc tính của các sản phẩm khuếch đại là mẫu (+) hay (-), sản phẩm của primer dimer hay sản phẩm khuếch đại không

Trang 34

đặc hiệu Có thể kiểm tra Tm của sản phẩm PCR bằng cách so sánh với kết quả chạy điện di sản phẩm PCR bằng gel electrophoresis

Monodon Baculovirus gây bệnh còi, phát hiện GAV Và trong luận văn này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện và định lượng mức độ nhiễm virus White Spot Syndrome Virus trong các mẫu thử nhằm mục đích: Kiểm tra và sàng lọc nhanh chóng virus WSSV tiềm tàng trên tôm post hay bố mẹ vì virus này có tỉ lệ nhiễm cao trên tôm sú làm chết tôm; Phát hiện bệnh trên tôm thịt trước khi dịch bùng phát, hay chẩn đoán xác định bệnh trên tôm thịt khi dịch bùng phát Vì vậy, nên dùng Realtime PCR để tìm ra và ngăn chặn bệnh đốm trắng ở các trại nuôi thủy sản Kỹ thuật này chứng tỏ rất có hiệu qủa khi phát hiện và định lượng WSSV ở các vùng khác nhau trên Thế giới Từ năm

1998 hệ thống này đã được chấp nhận và tỷ lệ lớn trại nuôi tôm đã ngăn chặn bệnh đốm trắng thành công

Trang 35

Phần 2:

VẬT LIỆU

&

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trang 36

Tiêu đề	NGHIÊN CỨU SƠ BỘ QUI TRÌNH THIẾT LẬP KỸ THUẬT REAL TIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV)TRÊN TÔM
Tác giả	Võ Thị Thanh Thảo
Người hướng dẫn	TS.BS. Phạm Hùng Vân, BS. Nguyễn Phạm Thanh Nhân
Trường học	Trường Đại Học Mở – Bán Công Tp.HCM
Chuyên ngành	Sinh học phân tử
Thể loại	Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Khoa học
Năm xuất bản	2004
Thành phố	Tp.Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	73
Dung lượng	811,11 KB