nghiên cứu chế tạo que giấy dùng thực hiện thử nghiệm phát hiện niacin

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE GIẤY DÙNG THỰC HIỆN THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN NIACIN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH Y HỌC GVHD : TS–BS PHẠM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài:

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE GIẤY DÙNG THỰC HIỆN THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN NIACIN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH Y HỌC

GVHD : TS–BS PHẠM HÙNG VÂN CN PHẠM THÁI BÌNH

SVTH : ĐOÀN ĐỨC TRƯỜNG THANH PHONG MSSV : 30100340

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên xin cho phép em được gởi lời tri ân sâu sắc đến TS–BS Phạm Hùng Vân – Giáo viên bộ môn Vi sinh Khoa Y trường Đại học Y dược TPHCM, anh CN Phạm Thái Bình là những người trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Cho em gởi lời cảm ơn đến Ban giám đốc Công ty Nam Khoa cùng tập thể nhân viên Công ty, đặc biệt là các anh chị Phòng Vi sinh – Miễn dịch đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập của em

Bên cạnh đó em cũng được sự hướng dẫn, giúp đỡ của TS–BS Nguyễn Thị Ngọc Lan – Trưởng khoa Vi sinh Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, cùng các nhân viên Phòng xét nghiệm tại Bệnh viện trong quá trình thử mẫu nghiên cứu

Để đạt được thành công như hôm nay, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trường Đại học Mở Bán công TPHCM, các thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học đã trang bị cho em nền tảng kiến thức vững chắc Đây chính là những hành trang quý báu để em có thể tự tin vững bước trong sự nghiệp của mình

Cuối cùng con xin cám ơn gia đình luôn ở bên cạnh động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập của con

MỤC LỤC

Lời cảm ơn 1

Mục lục 2

Danh mục các chữ viết tắt 4

Đặt vấn đề 5

Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1 Sơ lược về bệnh lao 8

1.1 Tình hình bệnh lao 8

1.2 Tình hình bệnh lao kháng thuốc 9

2 Khái quát về vi khuẩn lao M tuberculosis 10

2.1 Đặc điểm vi thể 10

2.2 Đặc điểm nuôi cấy 11

2.3 Phương pháp phát hiện các M tuberculosis 12

2.3.1 Phương pháp khảo sát trực tiếp 12

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy 13

2.3.3 Kỹ thuật PCR 14

2.4 Thử nghiệm Niacin trong định danh M tuberculosis 15

2.4.1 Các thử nghiệm định danh M tuberculosis 15

2.4.2 Thử nghiệm Niacin 15

Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

1 Vật liệu 19

1.1 Hóa chất 19

2 Phương pháp 20

2.1 Phương pháp thử nghiệm Niacin kinh điển 20

2.2 Phương pháp chế tạo que giấy Niacin 22

2.3 Phương pháp kiểm tra chất lượng que giấy Niacin 22

2.4 Phương pháp xác định các thông số của que giấy Niacin 22

Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 23

1 Que giấy Niacin 24

1.1 Que giấy Niacin 24

1.2 Kết quả kiểm tra chất lượng que giấy 27

1.3 Kết quả xác định thông số của que giấy 27

2 Đề xuất quy trình sản xuất 29

2.1 Yêu cầu nguyên liệu 29

2.2 Chỉ tiêu ngoại quan 29

2.3 Chỉ tiêu phát hiện Niacin 30

2.4 Quy trình sản xuất que giấy 31

Phần 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

1 Kết luận 33

2 Đề nghị 33

Tài liệu tham khảo 34

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(+) : Dương tính (-) : Âm tính

AFB : Acid – fast bacille: trực khuẩn kháng acid

AFB (+) : Acid – fast bacille: trực khuẩn kháng acid dương tính AFB (-) : Acid – fast bacille: trực khuẩn kháng acid âm tính BK : Bacille de Kock (trực khuẩn Kock)

BK (+) : Vi khuẩn lao qua xét nghiệm trực tiếp dương tính DNA : Deoxyribo Nucleic Acid

M tuberculosis : Mycobacterium tuberculosis

MOTT : Mycobacteria other than M tuberculosis: những chủng Mycobacterium sp nhưng không phải là M tuberculosis

PCR : Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi Polyme

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mycobacterium tuberculosis là tác nhân gây bệnh lao ở người Để phát hiện

tác nhân này có thể sử dụng các phương pháp như: khảo sát trực tiếp, nuôi cấy, PCR Đối với khảo sát trực tiếp bằng phết nhuộm, độ đặc hiệu cao 100%[8,12] nhưng độ nhạy rất thấp 5%[8,12] và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác Đối với kỹ thuật PCR, độ nhạy 73,3 – 90%[11,12,14] và độ đặc hiệu cao 99 – 100%[11,12,14] nhưng chỉ có thể

phát hiện M tuberculosis, mà không thể phát hiện được vi khuẩn kháng thuốc

Phương pháp nuôi cấy được xem là chuẩn vàng trong chẩn đoán Phương pháp này có độ đặc hiệu cao 100%[8,12] nhưng độ nhạy cảm thấp 16,7%[12] vì chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khách quan Hơn nữa, phương pháp này có thể xác định được các chủng vi khuẩn kháng thuốc từ đó đưa ra phác đồ điều trị cụ thể đối với từng bệnh nhân

Kết quả phương pháp nuôi cấy bao gồm kết quả định danh và kháng sinh đồ

(nếu có) Để có thể định danh M tuberculosis, phải thực hiện một số thử nghiệm

sinh hóa Trong đó, Niacin là một trong những thử nghiệm quan trọng nhất và đặc

trưng cho M tuberculosis

Thử nghiệm Niacin được thực hiện theo phương pháp kinh điển bằng cách dùng dung dịch Cyanogen bromide Việc thao tác với dung dịch này cần phải thận trọng vì có thể ảnh hưởng sức khỏe của kỹ thuật viên Chính vì thế, một số hãng nước ngoài như: BD, Bacto… đã cho ra đời que giấy dùng thực hiện thử nghiệm Niacin Chính điều này đã khắc phục được nhược điểm của phương pháp kinh điển

cao so với nguồn chi phí hạn hẹp của các phòng thí nghiệm lao ở nước ta, đặc biệt là các bệnh viện thuộc tuyến tỉnh, huyện

Do đó, chúng tôi nghiên cứu chế tạo que giấy phát hiện Niacin dùng thực

hiện định danh M tuberculosis với chất lượng cao nhưng giá thành phù hợp với tình

hình thực tiễn tại Việt Nam Đây cũng chính là mục tiêu tổng quát của đề tài Đề tài thực hiện với các mục tiêu chuyên biệt như sau:

1 Nghiên cứu chế tạo que giấy phát hiện Niacin

2 Xác định các thông số của que giấy như độ đặc hiệu, độ nhạy cảm, ngưỡng thời gian pháp hiện

3 Đề xuất quy trình sản xuất và tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng que giấy

PHẦN 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH LAO 1.1 Tình hình bệnh lao

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới) Ước tính mỗi năm có thêm khoảng 8 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người chết do lao[18]

Tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng và mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [2,5]

Bệnh lao là bệnh của người nghèo lây lan nhanh chóng trong cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh và dinh dưỡng kém Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển con người của các quốc gia[2,5]

Tại Việt Nam, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao Trong giai đoạn 1997 – 2002, chương trình chống lao quốc gia đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính, đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ lệ khỏi là 92% Hiện nay, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%)[3,5,13]

Ước tính với dân số 70 – 80 triệu, hàng năm nước ta có: Số mới mắc lao (mọi thể): 130.000; Số lao phổi BK dương tính mới: 60.000; Tổng số trường hợp lao: 260.000; Tổng số lao phổi BK dương tính:120.000[3,5]

1.2 Tình hình bệnh lao kháng thuốc

Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí không điều trị được ở một số trường hợp[2,5]

Trên thế giới, tỷ lệ kháng thuốc ở mỗi nước khác nhau, theo kết quả của dự án nghiên cứu bệnh lao kháng thuốc trên toàn cầu của Tổ chức Y tế thế giới công bố năm 1998 như sau: Tình hình kháng thuốc tiên phát trung bình (1994 – 1997)[13]: Isoniazid: 3,2%, Rifampicin: 0,2%, Ethambuton: 0,3%, Streptomicin: 2,5% Tình hình kháng thuốc mắc phải trung bình (1994 - 1997) [13]: Isoniazid: 63%, Rifampicin: 0,7%, Ethambuton: 0,0%, Streptomicin: 2,6%

Tại Việt Nam, tình hình kháng thuốc lao thực hiện trên toàn quốc năm 1996 – 1997[13,14,15], tỷ lệ kháng thuốc lao là 32,5% (kháng 1 đến 4 thứ thuốc) Trong đó, tỷ lệ kháng Streptompicine là 24%, kháng Isoniazide là 20%, kháng Rifampicine là 36%, kháng Ethamlentol là 1,1% và đa kháng thuốc là 2,3%

2 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN LAO M TUBERCULOSIS

2.1 Đặc điểm vi thể

M tuberculosis thuộc giống Mycobacteria là giống duy nhất thuộc họ vi

khuẩn Mycobacteriaceae Vi khuẩn M tuberculosis có những đặc điểm:

Hình que dài mảnh dẻ có khi hơi cong kích thước 0,2 – 0,6µm x 1,4µm Các vi khuẩn này thường đứng riêng lẻ một mình hoặc dính kết thành từng đám lớn, trong đó cá thể từng tế bào rất khó phân biệt được Dạng que thường thấy trong các mô Trong môi trường nuôi cấy, dạng sợi dài đôi khi thấy cùng với những loại que

ngắn, phồng trông giống vi khuẩn bạch hầu Mycobacterium tuberculosis không di

động, không sinh bào tử[9]

Mycobacterium tuberculosis được quan tâm tới nhiều nhất là thành phần lipid

rất lớn trong tế bào, chiếm tới 40% trọng lượng khô Các chất lipid có mối liên hệ chặt chẽ với sinh lý tế bào và độc tính của vi khuẩn Nhiều lipid liên kết chặt chẽ với cấu trúc vách tế bào làm cho vi khuẩn lao có tính kháng acid, kỵ nước và tăng trưởng dồn cục với tốc độ chậm Các lipid gồm những loại chính sau: phospholipid, mycolic acid, glycolypid, phức hợp peptidoglycolipid[9,14] Do đặc tính này,

Mycobacterium tuberculosis không nhuộm được bằng các phương pháp nhuộm

thông thường (nhuộm Gram) như đối với các vi khuẩn khác Chúng chỉ có thể nhuộm bằng phương pháp nhuộm Ziehl – Neelson hoặc nhuộm với phẩm nhuộm huỳnh quang (auramine O-rhodamine Flourochrome)[9]

2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn lao sinh trưởng chậm, thời gian nhân đôi khoảng 20 giờ Đây là loại vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối, nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất là 370C, pH môi trường thích hợp là 6,7 – 7,2 Vi khuẩn không sống được trên các môi trường nuôi cấy thông thường mà chỉ có thể phát triển trên các loại môi trường giàu chất khoáng, chất đạm, vitamin Môi trường thông dụng nhất là Lowenstein – Jensen[10,17]

Trên môi trường Lowenstein – Jensen, M tuberculosis có khuẩn lạc hình hoa

bắp cải, sần sùi, khô, hình hạt cơm, màu kem Các khuẩn lạc này dễ lấy khỏi môi trường nhưng khó tan trong nước[8,10,13,17]

Hình 1: Khuẩn lạc vi khuẩn lao trên môi trường Lowenstein – Jensen

2.3 Phương pháp phát hiện các M tuberculosis 2.3.1 Phương pháp khảo sát trực tiếp

Khảo sát trực tiếp là giai đoạn đầu tiên của chẩn đoán bệnh lao Phương pháp phổ biến là phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen (ngoài ra còn có thể sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang)[8,9,14]

Khảo sát trực tiếp có tầm quan trọng chính vì có thể phát hiện trực khuẩn lao một cách đơn giản, nhanh chóng, ít tốn kém, nhất là trong những trường hợp lao có nhiều BK, truyền nhiễm mạnh, phát hiện được nguồn lây nhiễm chính giúp theo dõi điều trị Độ nhạy của khảo sát trực tiếp thấp khoảng 5%[8,12] nhưng độ đặc hiệu gần 100%[8,12]; ngưỡng phát hiện là 103 – 5.103/ml đàm[13,17], nếu đàm chứa 104 – 105

trực khuẩn kháng cồn kháng acid trong 1ml thì khảo sát trực tiếp dương tính trên 95%[13] Độ nhạy có thể tăng lên khi dùng phương pháp huỳnh quang và khảo sát nhiều bệnh phẩm liên tiếp

Mức độ BK (+) quy định như sau[8,14]:

Không có BK trong 300 vi trường (–) Không có BK trong 100 vi trường (–) Có từ 1 – 9 BK trong 100 vi trường ghi rõ số lượng Có từ 10 – 100 BK trong 100 vi trường (+) Có từ 1 – 9 BK trong 1 vi trường (++) Có từ 10 BK trở lên trong 1 vi trường (+++)

Hình 2: Vi khuẩn lao khi nhuộm Ziehl – Neelsen

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy

Môi trường được sử dụng rộng rãi để nuôi cấy vi khuẩn lao là môi trường Lowenstein – Jensen và Ogawa[10,17]

Khi lao phổi có từ 102 BK trong 1 ml đàm thì có thể phát hiện được BK bằng nuôi cấy[13] Khi nuôi cấy (+) nghĩa là trong môi trường đã có trực khuẩn kháng cồn kháng acid[8,14]

Với phương pháp nuôi cấy có thể chẩn đoán các tổn thương lao tiết ra ít BK do đó làm tăng số lượng ca phát hiện, phát hiện được một số trường hợp nhuộm Ziehl – Neelsen (-), khả năng phát triển của vi khuẩn cao, có khả năng phân biệt

sinh đồ để đưa ra một công thức điều trị phù hợp[8,14]

Tuy nhiên phương pháp này lại phụ thuộc vào chất lượng môi trường nuôi cấy và tốn nhiều thời gian[8,14]

Cách đọc kết quả của phương pháp nuôi cấy như sau:[8,10,14]

Mọc từ 20 đến 50 khuẩn lạc (+)

Mọc nhiều nhưng không mọc thành đám (+++)

2.3.3 Kỹ thuật PCR[1,8,10,11,12,14,17]

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi Polyme): dùng chẩn đoán lao phổi ở giai đoạn sớm và lao ngoài phổi Bằng cách sản xuất hàng trăm nghìn bản sao từ một chuỗi đích của DNA Phương pháp này sử dụng một DNA polymerase đặc hiệu (đoạn IS6110) và các chất cơ sở cần thiết cho tổng hợp DNA, ta có thể nhân lên tới hàng triệu lần mảng DNA mà ta muốn phát hiện với trực khuẩn lao, sau khi chuỗi đích được khuếch đại, vào lúc này có thể phát hiện bằng cách lai tạo với mẫu dò gene

Kỹ thuật PCR còn được sử dụng để tìm ra các gene đột biến kháng thuốc Tuy nhiên, cũng có những trường hợp không phát hiện được gen đột biến ở chủng

kháng thuốc Vì vậy, đòi hỏi kỹ thuật này phải hoàn thiện hơn nữa trước khi đưa vào ứng dụng rộng rãi[10]

Phương pháp PCR có độ nhạy 73,3–90%[11,12,14], độ đặc hiệu 99–100%[11,12,14]

và nhanh chóng để phát hiện phức hợp M tuberculosis ở bệnh phẩm lâm sàng so

với các phương pháp truyền thống

2.4 Thử nghiệm Niacin trong định danh M tuberculosis 2.4.1 Các thử nghiệm định danh M tuberculosis[10,17]

− Khả năng tổng hợp Niacin (Nicotinic acid) − Thử nghiệm Catalase (+) ở 22 oC, (-) ở 68oC − Khả năng khử Nitrite thành Nitrate

− Kháng với TCH 2% (thiophen cacboxylic hydrazid acid)

2.4.2 Thử nghiệm Niacin

Đây là phản ứng điển hình nhằm xác định M tuberculosis, vi khuẩn tiết ra

Niacin và sản phẩm này được tích lũy trong môi trường nuôi cấy[10,17]

Thử nghiệm Niacin (-) của M tuberculosis là rất hiếm, trong khi đó chỉ có một số ít Mycobacteria khác cho thử nghiệm Niacin (+): M simiae, M chelonae[19]

Để thực hiện thử nghiệm này vi khuẩn thường được nuôi cấy trên môi trường Lowenstein – Jensen Môi trường phải được cấy ít nhất 3 – 4 tuần và phải có trên 50 khuẩn lạc Nếu số lượng khuẩn lạc ít hơn dễ cho kết quả âm tính giả[10,17,19]

nghiệm Niacin kinh điển (phương pháp sử dụng dung dịch) và phương pháp thử nghiệm bằng giấy Niacin (phương pháp que giấy)

Nguyên tắc của phương pháp kinh điển[20]

Konno đã chế tạo ra đầu tiên chuẩn thử nghiệm Niacin, sau đó được cải tiến bởi Runyon và các cộng sự Niacin được sản xuất bởi tế bào của vi khuẩn lao tác dụng với Cyanogen bromide tạo ra γ-carboxy-glutaconic aldehyde, chất này tiếp tục tác dụng với amin vòng thơm để tạo ra phức chất có màu

(1) Cyanogen bromide + Niacin γ-carboxy-glutaconic aldehyde

(2) γ-carboxy-glutaconic aldehyde + amin vòng thơm(*) Phức chất có màu(**)

Amin vòng thơm(*)Phức chất có màu(**)

p-aminosalycilate vàng p-aminobenzoate vàng

Nguyên tắc của phương pháp que giấy[20]

Kilburn và Kubica đã cải tiến thử nghiệm Niacin bằng cách sử dụng một que giấy tẩm các hóa chất Acid Potassium thiocyanate tác dụng với Chloramine T tạo ra Cyanogene chloride, chất này kết hợp với amin vòng thơm tạo ra phức chất có màu nếu có Niacin trong môi trường, khi không có Niacin thì không màu

Cơ chế của phương pháp này như sau:

(1) Chloramine T + Potasium thiocyanate Cyanogen chloride

(2) Cyanogen chloride + Niacin γ-carboxy-glutaconic aldehyde

(3) γ-carboxy-glutaconic aldehyde + amin vòng thơm(i) Phức chất có màu

(i): Các amin vòng thơm tùy theo mỗi hãng có những công thức công nghệ khác nhau