KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE GIẤY DÙNG THỰC HIỆN THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN NIACIN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH Y HỌC GVHD : TS–BS PHẠM
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Các hóa chất được nhập từ hãng Merck và còn trong hạn sử dụng theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất
Que giấy được chế tạo từ giấy lọc Whatman hoặc Satorius có kích thước 12x7x1mm và 12x8x1mm
Vi khuẩn kiểm tra chất lượng que giấy Niacin là những vi khuẩn
Mycobacteria chuẩn được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm lao chuẩn quốc gia Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, TPHCM Bao gồm:
- M tuberculosis H37Rv được dùng làm chứng (+)
- Chủng MOTT (Mycobacteria other than M tuberculosis) là những chủng Mycobacterium sp nhưng không phải là M tuberculosis dùng làm chứng (-)
Vi khuẩn thử nghiệm bao gồm những chủng vi khuẩn được phân lập từ các bệnh phẩm tại bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, TPHCM Các chủng vi khuẩn này đã được cấy trên môi trường Lowenstein – Jensen và ủ ở nhiệt độ 37 o C/4 tuần.
Phương pháp
Cách thực hiện của thử nghiệm Niacin kinh điển được tiến hành theo quy trình xét nghiệm thường quy tại Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, TPHCM
Thêm 1ml nước muối vô trùng vào môi trường Nếu sự phát triển của khuẩn lạc dồn cục thành đám thì ta đâm thủng môi trường bằng pipet
Pasteur để nước tiếp xúc với môi trường Đặt ống nghiệm nằm ngang để chất lỏng dàn đều toàn bề mặt môi trường Để yên trong 30 phút để chiết Niacin, thời gian chiết này có thể lâu hơn nếu số lượng khuẩn lạc ít Đặt ống nghiệm thẳng đứng trong 5 phút để dung dịch chảy xuống đáy ống nghieọm
Bỏ 0,5 ml dịch nước chiết vào 1 ống tube sạch (tube 13x75 mm)
Tiếp tục bỏ 0,5ml Benzidine 4% và 0,5ml Cyanogen bromide 10% Đóng ống nghiệm và để yên trong vòng 10 phút sau đó tiến hành đọc kết quả Phản ứng (+): dung dịch chuyển sang hồng Đọc kết quả
Phản ứng (-) : không có phản ứng màu (màu trắng) Phản ứng (+) : dung dịch chuyển sang hồng trong vòng 10 phút
Hình 3: Cách đọc kết quả thử nghiệm Niacin kinh điển
Tube 1: chuỷng (+) chuaồn Tube 2: chuỷng (-) chuaồn Tube 3 – 10: chuỷng vi khuaồn beọnh phaồm
2.2 Phương pháp chế tạo que giấy Niacin
Que giấy Niacin được chế tạo dựa theo nguyên tắc tẩm bão hòa dung dịch và ủoõng khoõ
Dung dịch dùng để tẩm que giấy Niacin được pha chế theo một công thức riêng biệt mà chúng tôi không thể nêu ra vì lý do bí mật công nghệ
Các que giấy sau khi tẩm bão hòa sẽ được đông khô cho đến khi khô hoàn toàn
2.2 Phương pháp kiểm tra chất lượng que giấy Niacin
Que giấy được kiểm tra chất lượng trên các chủng vi khuẩn lao chuẩn được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm lao chuẩn quốc gia Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, TPHCM
Que giấy đạt chất lượng khi cho kết quả (+) với chủng M tuberculosis H37Rv và (-) với chủng MOTT
2.3 Phương pháp xác định các thông số của que giấy Niacin
Thực hiện thử nghiệm Niacin bằng phương pháp kinh điển và que giấy trên các chủng vi khuẩn được phân lập từ các bệnh phẩm So sánh kết quả và thời gian phát hiện giữa 2 phương pháp Trên cơ sở đó, xác định ngưỡng thời gian phát hiện, độ đặc hiệu và độ nhạy cảm của que giấy được chế tạo so với phương pháp kinh
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Que giaáy Niacin
Chúng tôi đã chế tạo thành công que giấy phát hiện Niacin bằng kỹ thuật tẩm bão hòa và đông khô
Cách phát hiện Niacin được đề xuất theo quy trình thử nghiệm Niacin bằng que giấy Quan sát sự đổi màu của que giấy từ trắng sang hồng (+)
Que giấy sau khi chế tạo được bảo quản ở 2-8 o C
Hình 4: Que giấy (đóng gói, mặt trước, mặt sau)
1.2 Quy trình thử nghiệm Niacin bằng que giấy
Thêm 2ml nước muối vô trùng vào môi trường Nếu sự phát triển của khuẩn lạc dồn cục thành đám thì ta đâm thủng môi trường bằng pipet
Pasteur để nước tiếp xúc với môi trường Đặt ống nghiệm nằm ngang để chất lỏng dàn toàn bộ bề mặt môi trường Để yên trong 30 phút để chiết Niacin, thời gian chiết này có thể lâu hơn nếu số lượng khuẩn lạc ít Đặt ống nghiệm thẳng đứng trong 5 phút để dung dịch chảy xuống đáy ống nghiệm Bỏ 1,5 ml dịch nước chiết vào 1 ống tube sạch (tube 13x75 mm)
Cho que giấy thử vào (đầu có đường gạch vào trước) và ngay lập tức đậy ống tube lại Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút (không làm nghiêng ống nghiệm)
Quan sát màu sắc của que giấy trên một nền trắng Đọc kết quả (hồng là dương tính)
Trung hòa giấy thử bằng NaOH 10% hoặc loại bỏ trong chất tẩy kiềm Đọc kết quả
Phản ứng (-) : không có phản ứng màu (màu trắng) Phản ứng (+) : màu hồng xuất hiện trên que giấy thử trong 10 phút
Hình 5: Thử nghiệm que giấy Niacin
Tube 1,2 : chuỷng (+) chuaồn Tube 3,4: chuỷng (-) chuaồn Tube 5 – 10: chuỷng vi khuaồn beọnh phaồm
1.3 Kết quả kiểm tra chất lượng que giấy
Thực hiện kiểm tra chất lượng que giấy trên các chứng (+) và chứng (-) được cung cấp tại Phòng thí nghiệm lao chuẩn quốc gia Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, TPHCM
Kết quả thử nghiệm cho thấy:
Phương pháp kinh điển Phương pháp que giấy
Thời gian phát hiện (đối với các chủng dương):
- Phương pháp kinh điển: chuyển từ trắng sang hồng sau 5 phút
- Phương pháp que giấy: chuyển từ trắng sang hồng sau 6 phút
Như vậy, bước đầu chúng tôi đã chế tạo thành công que giấy Niacin đạt chất lượng tương đương với phương pháp kinh điển và được kiểm định bởi Phòng thí nghiệm lao chuẩn quốc gia Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, TPHCM
1.4 Kết quả xác định thông số của que giấy
1.4.1 Ngưỡng thời gian phát hiện
Tất cả các phản ứng dương tính đều cho kết quả tạo màu trong vòng 10 phút Màu sắc của que giấy sau khi tạo màu (phản ứng dương tính) vẫn giữ ổn định và không biến mất Do đó, thời gian phát hiện của que giấy được đề xuất là đọc kết quả sau 10 phút.
1.4.2 Kết quả xác định độ đặc hiệu và độ nhạy cảm
Kết quả thử nghiệm trên 29 chủng vi khuẩn được ghi nhận như sau: n Phương pháp kinh điển Phương pháp que giấy
Từ kết quả trên cho thấy 2 phương pháp phát hiện Niacin: kinh điển (được xem như phương pháp chuẩn) và que giấy nghiên cứu hoàn toàn phù hợp trên 29 chủng Như vậy, que giấy của chúng tôi chế tạo bước đầu có độ đặc hiệu và độ nhạy cảm tương đương phương pháp kinh điển.
Đề xuất quy trình sản xuất
Nguyên liệu được sử dụng trong sản xuất que giấy thí nghiệm là Niacin và các hóa chất khác bắt buộc phải nhập khẩu từ hãng Merck Tất cả các loại hóa chất này đều có thời hạn sử dụng theo quy định của nhà sản xuất, do đó cần lưu ý kiểm tra thời hạn sử dụng trước khi đưa vào sử dụng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của que giấy thí nghiệm.
2.2 Chỉ tiêu ngoại quan Đĩa Niacin được chia thành 2 thành phần chính là phần ngoài (bao nhựa) và phần trong (các que giấy được tẩm hóa chất)
⮚ Đối với phần ngoài: bao nhựa phải được hàn sao cho các que giấy không thể rớt ra ngoài và phải có khoảng trống để dịch chiết có thể vào bên trong
- Mặt trước: được chia thành 5 phần với quy định về màu sắc như sau:
+ Phần 3: có màu vàng nhạt
+ Phần 5: có màu vàng nhạt (đây chính là đầu que giấy được bỏ vào trước)
- Mặt sau: có đường kẻ ngang ở một đầu que giấy (nằm ở phía phần 5), đây
Hình 6: Các thành phần của que giấy 2.3 Chỉ tiêu phát hiện Niacin
Que giấy Niacin phải đạt chất lượng theo tiêu chuẩn trên các chủng vi khuẩn lao chuaồn nhử sau:
- Chủng (+): M tuberculosis H37Rv que giấy chuyển từ trắng sang hồng sau 10 phuùt
- Chủng (-): MOTT que giấy không đổi màu (màu trắng)
2.4 Quy trình sản xuất que giấy
Sấy thanh trùng 120 0 C/2giờ Để nhiệt độ phòng
Tẩm bão hòa Đông khô hoàn toàn Đóng gói
Que giaáy Niacin Nguyeõn lieọu
