PHOÂI VOÂ TÍNH
Sơ lược lịch sử nghiên cứu
Hạt là cơ quan thiết yếu bảo vệ phôi và đóng vai trò sinh sản ở thực vật hạt kín Quá trình hoán vị gen trong hình thành giao tử cùng với sự kết hợp giữa giao tử tạo ra sự tiến hóa ở thực vật hạt kín Để thích nghi với môi trường, nhiều loài thực vật đã phát triển các cấu trúc như thân củ, thân rễ, củ hay thân bò để trì hoãn quá trình ra hoa và hạn chế tạo hạt Ngoài ra, một số loài có khả năng sinh sản vô tính thông qua hình thành phôi từ giao tử không thụ tinh hoặc tế bào sinh dưỡng.
Ngoài tự nhiên, sự tạo phôi vô tính bất định (apomitic adventive embryogeney) xuất hiện ở một số loài thực vật hạt kín Hiện tượng này được mô tả bằng thuật ngữ “somatic embryogeneesis” trong các nghiên cứu về nuôi cấy mô và tế bào (Sankaran và Indra, 1995)
Năm 1958, Street và Reinert là hai tác giả đầu tiên mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt Nhưng mãi đến năm 1977, trong một cuộc hội thảo tại Bỉ, Murashige mới đưa ra ý kiến cho rằng phôi vô tính có thể được ứng dụng trong vi nhân giống Đến nay, công nghệ phôi vô tính được xem là công nghệ rất có triển vọng cho ngành nông nghiệp của thế kỷ 21 (Nguyễn Vaờn Uyeồn, 1992)
Quá trình hình thành phôi vô tính đã được tiến hành thành công trên nhiều đối tượng thực vật Trong đó có khoảng 11 họ thuộc lớp một lá mầm như:
Alliaceae, Zingiberaceae, Gramineae, Iridaceae, Henerocallidaeae, Liliaceae, Araceae, Dioscoreaceae, Asparagaceae, Musaceae và Orchidaeae.
Khái niệm về phôi vô tính
Đa số các nghiên cứu về sự phát sinh phôi vô tính đều mô tả quá trình tiến triển thành cấu trúc lưỡng cực không xác định tương tự như các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi hợp tử Trong điều kiện thích hợp, cấu trúc này có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh có chồi và rễ Sự hình thành phôi vô tính được coi là một con đường phát triển độc lập, khác biệt so với quá trình sinh chồi và rễ, trong đó một tế bào phát triển thành một cấu trúc chứa mô phân sinh chồi và rễ đầy đủ mà không liên kết hệ thống mạch với mô ban đầu Theo quan điểm này, sự tạo phôi có thể được coi như kết quả của một loạt sự kiện sinh cơ quan cạnh tranh nhau.
Williams và Maheswaran (1986) cho rằng phôi vô tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào Thông qua một quá trình phân chia có thứ tự, phôi sẽ diễn ra sự biệt hóa, trưởng thành và phát triển thành cây con Cây có thể phát triển từ một hay từ một cụm tế bào phôi Tiến trình này khác với những quá trình tự nhiên khác và được gọi là quá trình hình thành phôi voâ tính
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền do không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái Vì vậy các phôi vô tính có vật chất di truyền giống hệt với các tế bào sinh dưỡng đã sinh ra chúng (Nguyễn Văn Uyển, 1992) Tuỳ vào loài thực vật, quá trình phát triển của phôi hữu tính qua các giai đoạn sau:
⮚ Đối với cây hai lá mầm: dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng hai lá mầm
⮚ Đối với cây một lá mầm: dạng cầu → dạng khiên → dạng diệp tiêu
⮚ Đối với họ lan: dạng cầu → dạng chuyển tiếp → dạng protocorm
Theo một số nghiên cứu, các tế bào mô sẹo có khả năng đổi hướng phát triển để tạo phôi vô tính và các bước phát sinh hình thái ở phôi vô tính tương tự ở phôi hữu tính Điểm khác biệt cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn đi kèm với nội nhũ còn phôi vô tính thì không Sự khác nhau này không chỉ đáng chú ý về mặt khoa học mà còn là một yếu tố rất quan trọng trong coõng ngheọ phoõi voõ tớnh (Nguyeón Vaờn Uyeồn, 1992)
Theo Kohlenbach (1978), các thể phôi vô tính trong nuôi cấy in vitro xuất hiện từ ba nguồn tế bào nhị bội: tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành; tế bào sinh sản không phải là hợp tử và trục hạ diệp, tử diệp của phôi hợp tử; cây con không thông qua sự phát triển của mô sẹo Theo Sharp và cộng sự (1980), phôi vô tính có thể phát sinh theo hai con đường: phôi phát sinh trực tiếp từ mẫu mô ban đầu và phôi phát sinh gián tiếp thông qua mô sẹo
Sự phát sinh phôi vô tính in vitro có ba kiểu:
⮚ Sự phát sinh phôi vô tính bất định: các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay mô sẹo có liên quan đến bộ máy sinh sản Phương pháp này được sử dụng trong di truyền cải tạo giống, chẳng hạn cứu các phôi bị chết do lai tạo
⮚ Sự phát sinh đa phôi vô tính: hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy noãn non của thực vật hạt trần Các khối mô có khả năng tạo phôi cao khi được cấy chuyền sẽ phát triển và tăng nhanh chóng thành các phôi
⮚ Sự phát sinh phôi vô tính do cảm ứng: hiện tượng xảy ra khi nuôi cấy lỏng hay nuôi cấy đặc các tế bào và mô sẹo vô tính sau khi các mô này chịu các xử lý đặc biệt gây cảm ứng khả năng tạo phôi Người ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu với nhiều loài thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau như cà rốt, cà phê, đậu nành, cọ dầu…
Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật phụ thuộc vào các điều kiện của môi trường và tùy thuộc vào loài hoặc các chủng cùng loài Khả năng này đã được chứng minh là do một hoặc vài genee điều khiển Vì vậy, bằng biện pháp lai tạo, có thể chuyển khả năng tạo phôi vô tính cao từ cây này sang cây khác (Nguyển Văn Uyển, 1992)
Bên cạnh đó, một số vấn đề nảy sinh trên phôi vô tính cũng được ghi nhận:
⮚ Thứ nhất, sự phát sinh phôi trong nuôi cấy tế bào có tính lập lại cao và phôi vô tính có thể tạo ra những phôi phụ nhỏ hơn nằm dọc theo trục phôi Những phôi phụ này thỉnh thoảng mới có vị trí xác định, ví dụ như tại chỗ nối giữa rễ với trục hạ diệp hoặc tại phần gốc của rễ Trong một số trường hợp, phôi phụ và phôi thứ cấp có thể xuất hiện dọc theo trục phôi Đây là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự không đồng bộ trong quaàn theồ phoõi voõ tớnh
Bên cạnh dạng đơn phôi, các dạng song phôi, tam phôi hoặc các cụm đa phôi cũng được ghi nhận Các cụm phôi này tạo ra nhiều chồi khi cây con hình thành.
⮚ Thứ ba, sự phát triển của lá mầm có thể bị ảnh hưởng cả về số lượng lẫn hình thái Có thể có một, hai, ba hay nhiều lá mầm trên một trục đơn
Chúng có thể phát triển rất kém hoặc có thể bị dính lại với nhau từng phần hay toàn bộ
⮚ Thứ tư, các chồi ngọn có thể bị ảnh hưởng Mặc dù phôi có thể có hình thái bên ngoài bình thường nhưng nó lại không sản xuất được chồi có đủ lá và thân giống như các chồi được tạo ra từ phôi hữu tính khi hạt nảy maàm
⮚ Vấn đề cuối cùng, khi phôi vô tính trưởng thành, nó có thể biến đổi trực tiếp thành cây con mà vẫn không ngừng tăng trưởng và cũng không cần sự trưởng thành của hạt Trong nhiều trường hợp, điều này xảy ra rất sớm (được gọi là nảy mầm sớm) với các kết quả tương tự được tìm thấy khi nuôi cấy phôi hợp tử còn non, và kết quả thường là tạo ra các cây dị dạng hay không phát triển (Ammirato, 1987)
Phát triển kỹ thuật gây phôi vô tính mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn, đặc biệt trong lĩnh vực vi nhân giống (Bornman, 1993; Vasil, 1994) Nó còn được dùng để tạo hạt nhân tạo (Redenbaugh, 1993) và sản xuất hàng loạt bằng lò phản ứng sinh học (Onishi và cộng sự, 1994) Ngoài ra, phôi vô tính ứng dụng trong chọn lọc tế bào, chuyển gen, nhân giống lai vô tính, tạo cây đa bội, bảo quản chất mầm, loại bỏ virus và sản xuất hợp chất hoạt tính sinh học (Vicient và Martinez, 1998).
CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN TẠO
Khái niệm hạt nhân tạo
Redenbaugh và cộng sự (1991) và Saiprasad (2001) đã đưa ra một số yêu cầu cho công nghệ hạt nhân tạo Yêu cầu đầu tiên là cần phải có một chương trình sản xuất phôi vô tính cung cấp hàng loạt phôi chất lượng cao (Saiprasad, 2001) Các yêu cầu tiếp theo nhằm vào vật liệu dùng tạo vỏ bao cho hạt nhân tạo Vỏ bao không những phải đủ mềm để bảo vệ phôi và cho phép hạt nảy mầm mà còn phải bền trong suốt quá trình sản xuất, dự trự, vận chuyển và gieo trồng Ngoài ra, vỏ bao phải chứa chất dinh dưỡng, các nhân tố kiểm soát sinh trưởng như các chất điều hòa sinh trưởng và một số thành phần khác cần thiết cho hạt nảy mầm và sinh trưởng Và cuối cùng, mục tiêu cao nhất là hạt nhân tạo có thể được gieo trồng bằng các thiết bị cơ giới hiện đại (Redenbaugh và cộng sự, 1991)
Vậy hạt nhân tạo là gì ?
Công nghệ hạt nhân tạo là phương pháp tạo một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên Hạt nhân tạo chứa phôi vô tính được bọc trong một lớp alginate có chứa chất dinh dưỡng, sau đó các phôi vô tính có thể nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh (Redenbaugh và cộng sự, 1987; Saiprasad, 2001)
Tuy nhiên, việc gieo hạt nhân tạo trực tiếp ra ngoài đồng ruộng phục vụ những mục đích thực tế còn bị giới hạn do hạt nhân tạo có tỷ lệ sống sót thấp khi trồng ra ngoài vườn ươm(Redenbagh và cộng sự, 1986; Kamada, 1985)
Hạt nhân tạo đem lại nguồn lợi lớn dựa trên khả năng nhân giống cây trồng thông qua sự phát sinh phôi vô tính (Ipekci và Gozukirmizi, 2003) Theo Aitken-Christie và cộng sự (1995), hạt nhân tạo có thể được gieo trồng trong điều kiện in vitro hay ex vitro và tạo ra các cây con đồng nhất về hình thái Theo Bornman (1993), hạt nhân tạo là kỹ thuật duy nhất có thể phục vụ thiết thực cho việc sản xuất giống thương mại ở một số dòng thực vật vô tính, thực vật chuyển gene, thực vật không hạt và thực vật đa bội Hạt nhân tạo mang nhiều ưu điểm có thể ứng dụng hiệu quả trong nhân giống như dễ vận chuyển, thời gian bảo quản hạt dài, hệ số nhân cao và giá thành thấp (Ghosh và Sen, 1994) Ngoài ra tiềm năng tự động hóa toàn bộ quy trình sản xuất cũng là một thuận lợi của công nghệ hạt nhân tạo vì phôi vô tính được sản xuất với qui mô lớn trong thương mại (Ziv, 1995) Theo Janeiro và cộng sự (1997), việc trữ lạnh hạt nhân tạo sẽ giúp tăng khả năng nảy mầm và sống sót của hạt, đồng thời duy trì đặc tính di truyền
Tóm lại, phương pháp tạo hạt nhân tạo có những ưu điểm sau:
⮚ Giúp sản xuất số lượng lớn cây giống với giá thành hạ
⮚ Duy trì đặc tính di truyền của giống (do không có sự phân li tính trạng hoặc tái tổ hợp như phôi hữu tính)
Thời gian nhân giống ngắn và không cần yêu cầu về điều kiện vật lý giữa nuôi cấy mô và chuyển cây con ra vườn ươm Điều này giúp giữ phôi được lâu hơn, đảm bảo cung cấp giống kịp thời theo yêu cầu.
⮚ Cung cấp những nguồn giống thực vật mới như cây chuyển genee, cây không hạt, cây đa bội (Saiprasad, 2001)
⮚ Ứng dụng nhân giống cho các loài thực vật không tạo được hạt, số lượng hạt tạo thành thấp, khả năng sống sót thấp, khó nhân giống và chất mầm không thể bảo quản.
Các nhân tố cần thiết trong tổng hợp hạt nhân tạo
Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực hiện với nhiều bước nhưng ít tốn kém Yêu cầu cơ bản cho quá trình tổng hợp hạt nhân tạo là phôi vô tính phải có chất lượng cao và đồng bộ
Vỏ bọc cho phôi có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite (Kelko Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum… Những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường chứa chất điện phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc amonium chloride nhờ liên kết ion Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Redenbaugh và cộng sự, 1993) Alginate được sử dụng nhiều do những đặc tính thuận lợi như: tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi vô tính, có đặc tính tương hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để lâu được, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi những tổn thương bên ngoài
1.2.3 Nguyên tắc và điều kiện tạo vỏ bọc bằng chất nền là sodium aginate
Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi được nhỏ vào trong hỗn hợp CaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na + có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca 2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lượng ion natri trao đổi với ion Ca 2+ Do đó, nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhaát
Do phôi vô tính không có nội nhũ nên vỏ bọc của hạt nhân tạo thường được bổ sung các chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng và carbohydrate để nuôi phôi (Gray, 1990) Ngoài ra để giữ nước, tăng sức đề kháng và tránh các tổn thương cơ học cho phôi, người ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật (chẳng hạn như rhizobia)
Tạo hạt nhân tạo bằng cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate đã đạt được một số thành công Tuy nhiên, lớp phủ alginate vẫn còn nhiều vấn đề, như mất chất dinh dưỡng (Redenbaugh et al., 1987) và trao đổi khí kém (Redenbaugh et al., 1993) Để khắc phục những hạn chế này, việc bổ sung than hoạt tính đã được đề xuất Than hoạt tính giúp tăng cường hô hấp và giữ lại chất dinh dưỡng tốt hơn, tạo môi trường thuận lợi cho sự phát triển của phôi.
1.2.4 Sơ lược một số các nghiên cứu trên thế giới
Năm 1958, các nhà nghiên cứu bắt đầu nỗ lực phát triển hạt nhân tạo, với những nghiên cứu ban đầu được thực hiện trên cây cỏ linh lăng và cần tây Trong đầu thập niên 70, Murashige đề cập đến khái niệm hạt nhân tạo, sau đó nhiều phương pháp khác nhau đã được thử để tạo hạt nhân tạo, chẳng hạn như công nghệ gieo lỏng cà rốt và sử dụng polyoxyethylene làm vỏ hạt Tuy nhiên, không có phương pháp nào mang lại kết quả khả quan.
Từ khi việc sử dụng vỏ bao hydrogel tạo hạt nhân tạo xuất hiện, nhiều phòng thí nghiệm đã tiến hành các nghiên cứu trên cây cỏ linh lăng, cà rốt, cần tây, măng tây, thông trầm hương, vân sam (Redenbaugh và cộng sự, 1991) Tuy nhiên, cho đến thời điểm năm 1991, ngoại trừ các kết quả nghiên cứu của Redenbaugh cùng cộng sự (1991) và của Kamada và cộng sự (1988) thì không có một báo cáo nào công bố về sự biến đổi hoàn chỉnh phôi thành cây (Redenbaugh và cộng sự, 1991)
Redenbaugh và cộng sự (1987, 1991) đã khảo sát việc sử dụng các vỏ calcium alginate để bao bọc phôi sinh dưỡng của cỏ linh lăng và cần tây bằng cách trộn lẫn phôi sinh dưỡng với dung dịch sodium alginate rồi nhỏ giọt vào dung dịch muối calcium Các dữ liệu công bố cho thấy tần số biến đổi in vitro của hạt nhân tạo thay đổi từ 40 - 50% đối với cỏ linh lăng và 60 - 90% đối với cần tây Kết quả chỉ ra rằng phôi vô tính biến đổi sẽ không xảy ra khi không có các muối chính (potassium nitrate, magnesium sulfate và calcium chloride) và nếu thiếu muối ammonium phosphate thì sự biến đổi giảm từ 30% xuống còn 5%
Trong thập niên 80, khởi đầu từ những báo cáo của Kitto và Janick (1982, 1985) trên cà rốt, sự làm khô phôi sinh dưỡng đã tạo sự quan tâm đáng kể Các kết quả nghiên cứu tiến hành trên một số cây trồng khác nhau được trình bày trong bảng 1.1
Bảng 1.1: Sự làm khô phôi sinh dưỡng Đối tượng Kết quả Tác giả
33% hạt biến đổi sau bước làm khô;
21% hạt biến đổi khi không có bước làm khô
Fujii và Redenbaugh (không biết thời gian)
65% hạt biến đổi sau bước làm khô;
65% hạt biến đổi khi không có bước làm khô
Cà rốt Tỉ lệ sống sót của phôi có lớp phủ polyoxyethylene đạt 3%; phôi không có lớp phủ không sống sót
Cần tây Cây con được sản xuất sau bước làm khô phôi với lớp phủ polyoxyethylene
20% hạt biến đổi sau khi làm khô và dự trữ 21 ngày, 34% hạt biến đổi sau khi làm khô và dự trữ 7 ngày, 5% hạt biến đổi sau bước làm khô
Nghiên cứu cho thấy:- Sau khi sấy khô và bảo quản 21 ngày, 4% hạt đã bị biến đổi.- Sau khi sấy khô và bảo quản 7 ngày, 8% hạt đã bị biến đổi.- Nếu không tiến hành sấy khô, 32% hạt đã bị biến đổi.
30% hạt biến đổi sau bước làm khô;
60% hạt biến đổi khi không có bước làm khô
Lúa mì 50% hạt biến đổi sau bước làm khô Carman và cộng sự
Các báo cáo này cho thấy phôi sinh dưỡng bị tổn thương mặc dù chúng có khả năng sống sót sau quá trình làm khô Nguyên nhân dẫn đến sự tổn thương này là do quá trình khử nước và tái hấp thu nước hoặc do phôi chưa đạt đến trạng thái trưởng thành cần thiết để có khả năng chống chịu cao nhất đối với sự làm khô (Redenbaugh và cộng sự, 1991)
Ứng dụng hạt nhân tạo trong bảo quản lạnh chất mầm thực vật đã đạt được những thành công đáng kể Phủ vỏ bao alginate giúp bảo vệ tế bào mầm trong quá trình đông lạnh bằng nitơ lỏng Các hạt nhân tạo được hình thành từ đốt thân không lá của cây nuôi cấy mô Chúng được nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và sấy khô để giảm hàm lượng nước trong hạt Khi lượng nước trong hạt chỉ còn 5-10% so với trọng lượng hạt, chúng có thể chịu được sự khô hạn và sống sót sau khi nhúng vào nitơ lỏng.
Cho đến nay, công nghệ hạt nhân tạo cũng chỉ mới gặt hái được một số ít thành công trên đối tượng hoa phong lan Việc sản xuất hạt nhân tạo sử dụng các protocorm-like body (PLB) được bọc vỏ bao đã được thực hiện trên một vài loài lan như Dendrobium wardianum (Sharma và cộng sự, 1992), Phaius tankervillae
(Malemngaba và cộng sự, 1996), Spathoglottis plicata (Singh, 1991) Tiếp nối các nghiên cứu này, năm 1999, Datta và cộng sự [Internet] đã phát triển một phương thức sản xuất hạt nhân tạo cho một loài phong lan thuộc vùng đồi Terai (phía đông bắc dãy Himalaya) đang có nguy cơ tuyệt chủng – cây Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr Việc sản xuất hạt nhân tạo được thực hiện bằng cách bọc vỏ bao sodium alginate cho các PLB Phần vỏ hạt bao gồm môi trường KnC (Knudson, 1946) và bột sodium alginate với nồng độ 4% Dung dịch CaCl2.2H2O có nồng độ 50 mM Sau khi được giữ 15 - 20 phút trong dung dịch CaCl2.2H2O trên máy lắc với tốc độ 80 vòng/phút, hạt nhân tạo được rửa bằng nước cất 2 lần vô trùng và làm khô bề mặt bằng giấy thẩm tách (blotting paper) vô trùng Các hạt nhân tạo này được cấy trực tiếp vào môi trường KnC với các thành phần dinh dưỡng, nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện nuôi cấy tương tự như khi nuôi cấy hạt hữu tính Kết quả cho thấy 88% hạt nhân tạo nảy mầm và các cây con phát triển đầy đủ được thu nhận sau 6 - 8 tuần
Stephen và Jayabalan (2000) đã tiến hành sản xuất hạt nhân tạo bằng alginate từ phôi sinh dưỡng trưởng thành của cây rau mùi (Coriandrum sativum L.) Kết quả cho thấy nồng độ alginate 4% được ghi nhận là tốt nhất cho việc tạo hạt và các đơn phôi có vỏ bao có khả năng nảy mầm thành cây con với đầy đủ chồi và rễ.Sau đó, vào năm 2003, Ipekci và Gozukirmizi cũng đưa ra nghiên cứu đầu tiên về hạt nhân tạo của cây hông (Paulownia elongata) Các phôi sinh dưỡng của cây này được bọc vỏ với các nồng độ alginate 1,0%, 2,5% và 3,0% và được nhỏ vào dung dịch CaCl2 với các nồng độ 5,5 g/l, 6,6 g/l và 8,8 g/l, các phôi sinh dưỡng không có vỏ bao được dùng làm đối chứng Hạt và phôi không có vỏ bao được cấy vào các lọ nhỏ chứa than bùn và đá đen (tỉ lệ 3 : 1) Sau 5 tuần, kết quả cho thấy những phôi không có vỏ bao biểu hiện khả năng sống sót và nảy mầm cao nhất (89,8% và 65,8%) Tiếp đến là những hạt có nồng độ alginate 3% với khả năng sống sót đạt 73,7% và tỉ lệ nảy mầm là 53,3% Các cây con có nguồn gốc từ những hạt nhân tạo này có hình thái giống hệt cây in vitro ban đầu và phát triển bình thường trong điều kiện nhà kính Đối với cây sâm Siberia (Eleutherococcus senticosus), phôi sinh dưỡng có lá mầm được bọc bằng dung dịch sodium alginate 3,0%; 96% phôi được bọc vỏ biến đổi thành cây con có trụ thượng diệp đủ dài phát triển trên perlite chứa nguồn carbon là sucrose (Jung và cộng sự, 2004) Tuy nhiên, dù chúng đã nảy mầm nhưng sự phát triển sau nảy mầm của phôi sinh dưỡng được bọc vỏ lại bị hạn chế trên perlite không bổ sung sucrose Thay vì bổ sung sucrose vào perlite, sự bổ sung các nguồn carbohydrate khác vào dung dịch tạo vỏ cũng có khả năng tăng cường sự phát triển sau nảy mầm của phôi sinh dưỡng bọc vỏ Đối với dung dịch tạo vỏ chứa 2,0% sucrose, sự phát triển sau nảy mầm của phôi sinh dưỡng được bọc vỏ tăng gấp đôi (23,5%) so với những phôi được bọc vỏ không chứa sucrose (10,0%) Những phôi được bọc với dung dịch chứa 2,0% sucrose và 1,0% tinh bột có tỷ lệ phát triển sau nảy mầm cao nhất (42,1%) Sự nhuộm màu bằng iodine và phân tích nồng độ tinh bột trong dung dịch tạo vỏ cho thấy tinh bột trong dung dịch tạo vỏ phân huỷ dần trong suốt quá trỉnh nảy mầm của phôi Kết quả này chứng tỏ việc bổ sung carbohydrate vào dung dịch tạo vỏ làm tăng sự phát triển sau nảy mầm của phôi sinh dưỡng cây sâm Siberia được bọc vỏ
Sơ lược một số các nghiên cứu trên thế giới
Mặc dù phôi sinh dưỡng đã được sản xuất lần đầu tiên vào năm 1958, nhưng mãi đến đầu thập niên 70 người ta mới có khái niệm về hạt nhân tạo do Murashige đề cập Năm 1958, những nổ lực ban đầu để phát triển hạt nhân tạo được Walker và Sato tiến hành trên cây cỏ linh lăng (Medicago sativa L.) và bởi Lawrence tiến hành trên cây cần tây và rau diếp (Redenbaugh và cộng sự, 1987, 1991) Nhiều phương pháp tạo hạt nhân tạo khác nhau đã được thử nghiệm như công nghệ gieo lỏng cà rốt (Drew, 1979), dùng polyoxyethylene làm vỏ hạt (Kitto và Janick) nhưng kết quả không khả quan
Từ khi việc sử dụng vỏ bao hydrogel tạo hạt nhân tạo xuất hiện, nhiều phòng thí nghiệm đã tiến hành các nghiên cứu trên cây cỏ linh lăng, cà rốt, cần tây, măng tây, thông trầm hương, vân sam (Redenbaugh và cộng sự, 1991) Tuy nhiên, cho đến thời điểm năm 1991, ngoại trừ các kết quả nghiên cứu của Redenbaugh cùng cộng sự (1991) và của Kamada và cộng sự (1988) thì không có một báo cáo nào công bố về sự biến đổi hoàn chỉnh phôi thành cây (Redenbaugh và cộng sự, 1991)
Redenbaugh và cộng sự (1987, 1991) đã khảo sát việc sử dụng các vỏ calcium alginate để bao bọc phôi sinh dưỡng của cỏ linh lăng và cần tây bằng cách trộn lẫn phôi sinh dưỡng với dung dịch sodium alginate rồi nhỏ giọt vào dung dịch muối calcium Các dữ liệu công bố cho thấy tần số biến đổi in vitro của hạt nhân tạo thay đổi từ 40 - 50% đối với cỏ linh lăng và 60 - 90% đối với cần tây Kết quả chỉ ra rằng phôi vô tính biến đổi sẽ không xảy ra khi không có các muối chính (potassium nitrate, magnesium sulfate và calcium chloride) và nếu thiếu muối ammonium phosphate thì sự biến đổi giảm từ 30% xuống còn 5%
Trong những năm 1980, kỹ thuật làm khô phôi sinh dưỡng bắt đầu được chú ý sau những báo cáo của Kitto và Janick (1982, 1985) về cây cà rốt Các nghiên cứu sau đó trên nhiều loại cây trồng khác nhau được trình bày trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1: Sự làm khô phôi sinh dưỡng Đối tượng Kết quả Tác giả
33% hạt biến đổi sau bước làm khô;
21% hạt biến đổi khi không có bước làm khô
Fujii và Redenbaugh (không biết thời gian)
65% hạt biến đổi sau bước làm khô;
65% hạt biến đổi khi không có bước làm khô
Cà rốt Tỉ lệ sống sót của phôi có lớp phủ polyoxyethylene đạt 3%; phôi không có lớp phủ không sống sót
Cần tây Cây con được sản xuất sau bước làm khô phôi với lớp phủ polyoxyethylene
20% hạt biến đổi sau khi làm khô và dự trữ 21 ngày, 34% hạt biến đổi sau khi làm khô và dự trữ 7 ngày, 5% hạt biến đổi sau bước làm khô
4% hạt biến đổi sau khi làm khô và dự trữ 21 ngày; 8% hạt biến đổi sau khi làm khô và dự trữ 7 ngày; 32% hạt biến đổi khi không có bước làm khô
30% hạt biến đổi sau bước làm khô;
60% hạt biến đổi khi không có bước làm khô
Lúa mì 50% hạt biến đổi sau bước làm khô Carman và cộng sự
Nghiên cứu chỉ ra rằng phôi sinh dưỡng dễ bị tổn thương mặc dù chúng có thể phục hồi sau quá trình làm khô Tổn thương xảy ra có thể do mất nước và hấp thụ nước trở lại hoặc do phôi chưa phát triển đủ để có sức chịu đựng tối đa với tình trạng khô hạn.
Gần đây, công nghệ hạt nhân tạo, hay nói cách khác là việc tạo vỏ bao bằng alginate cũng được ứng dụng rất thành công trong sự bảo quản lạnh (cryopreservation) chất mầm thực vật Fukai và cộng sự (1994) đã tiến hành tạo hạt nhân tạo trên đối tượng hoa cẩm chướng (Dianthus hybridus cv Sakuranadesiko) Các đốt thân không chứa lá của chồi in vitro 4 - 6 tuần tuổi được bọc vỏ alginate với nồng độ sodium alginate 3% Hạt được nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung 0.1 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 20 g/l sucrose và 8 g/l agar (môi trường ST) trong 2 ngày và được sấy khô nhiều giờ Sau đó, cho hạt vào các ống trữ lạnh có thể tích 2 ml và đặt trực tiếp ống vào dung dịch nitrogene lỏng Sau 15 phút, các ống trữ lạnh được giải đông nhanh trong nước ấm (25 - 30 o C) và hạt sau khi giải đông được nuôi cấy trên môi trường ST Kết quả cho thấy hầu hết hạt chịu đựng được sự khô hạn và có khả năng sống sót sau khi nhúng chìm trực tiếp vào nitrogene lỏng nếu hàm lượng nước trong hạt chiếm 5 - 10% trọng lượng hạt
Cho đến nay, công nghệ hạt nhân tạo cũng chỉ mới gặt hái được một số ít thành công trên đối tượng hoa phong lan Việc sản xuất hạt nhân tạo sử dụng các protocorm-like body (PLB) được bọc vỏ bao đã được thực hiện trên một vài loài lan như Dendrobium wardianum (Sharma và cộng sự, 1992), Phaius tankervillae
(Malemngaba và cộng sự, 1996), Spathoglottis plicata (Singh, 1991) Tiếp nối các nghiên cứu này, năm 1999, Datta và cộng sự [Internet] đã phát triển một phương thức sản xuất hạt nhân tạo cho một loài phong lan thuộc vùng đồi Terai (phía đông bắc dãy Himalaya) đang có nguy cơ tuyệt chủng – cây Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr Việc sản xuất hạt nhân tạo được thực hiện bằng cách bọc vỏ bao sodium alginate cho các PLB Phần vỏ hạt bao gồm môi trường KnC (Knudson, 1946) và bột sodium alginate với nồng độ 4% Dung dịch CaCl2.2H2O có nồng độ 50 mM Sau khi được giữ 15 - 20 phút trong dung dịch CaCl2.2H2O trên máy lắc với tốc độ 80 vòng/phút, hạt nhân tạo được rửa bằng nước cất 2 lần vô trùng và làm khô bề mặt bằng giấy thẩm tách (blotting paper) vô trùng Các hạt nhân tạo này được cấy trực tiếp vào môi trường KnC với các thành phần dinh dưỡng, nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện nuôi cấy tương tự như khi nuôi cấy hạt hữu tính Kết quả cho thấy 88% hạt nhân tạo nảy mầm và các cây con phát triển đầy đủ được thu nhận sau 6 - 8 tuần
Nghiên cứu của Stephen và Jayabalan (2000) về cây rau mùi chỉ ra nồng độ alginate 4% cho hiệu quả tạo hạt tốt nhất, với phôi đảm bảo khả năng nảy mầm thành cây có đủ chồi và rễ Năm 2003, Ipekci và Gozukirmizi đã tiến hành nghiên cứu đầu tiên về hạt của cây hông, với tỷ lệ sống sót và nảy mầm cao nhất đạt được từ phôi không có vỏ bao (89,8% và 65,8%) Ngược lại, đối với cây sâm Siberia, phôi được bọc trong dung dịch sodium alginate 3,0% có khả năng phát triển thành cây con với sự hỗ trợ của nguồn碳 sucrose bổ sung.
Ngoài ra, một số nguyên liệu tạo vỏ hạt khác cũng được khảo sát như polyethyleneimine trong quy trình hai bước (Kersulec và cộng sự, 1993) hay chitosan (Tay và cộng sự, 1993; Nhut và cộng sự, 2005); và nhiều phương thức tạo hạt khác nhau cũng được các nhà nghiên cứu so sánh như sự làm đặc từ bên ngoài vào bên trong để tạo hạt hoặc từ bên trong ra bên ngoài để tạo hạt rỗng có một lớp màng alginate bao xung quanh nhân ở dạng lỏng (Patel và cộng sự, 2000)
Nieves và cộng sự (2003) đã tiến hành khảo sát khả năng sống sót ngoài đồng ruộng của cây mía (Saccharum spp.) có nguồn gốc từ hạt nhân tạo Phát hoa non lấy từ cây mía lai thương mại dòng CP-5243 được cảm ứng tạo mô sẹo Phôi soma phát sinh từ mô sẹo này được bọc vỏ alginate với nội nhũ nhân tạo được làm giàu bằng 90 g/l succrose và 0,5 mM IAA Vitrofural G-1 [1-(5- bromofur-2il)-2-bromo-2-nitroetene], một sản phẩm có nguồn gốc từ vảy mía có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm phổ rộng, được sử dụng để chống nhiễm Hạt nhân tạo mía được cho nảy mầm trong điều kiện nhà kính thu nhỏ với cơ chất không khử trùng, độ ẩm cao và dưới ánh sáng tự nhiên Sau khi hạt nảy mầm (10 ngày sau khi tạo vỏ alginate), cây con được đem trồng trong nhà kính 2 tháng 15 ngày trước khi chuyển ra đồng ruộng Ở tháng thứ 8, cây mía có nguồn gốc từ hạt nhân tạo ốm hơn và có đường kính thân nhỏ hơn so với các cây mía của 2 nghiệm thức đối chứng (có nguồn gốc từ phương pháp nhân giống truyền thống của Cuba và có nguồn gốc từ chồi nách của những cây mía mọc ngoài đồng) Nhưng ở tháng thứ 12 sau khi trồng ra đồng (thời điểm thu hoạch mía), không còn sự khác biệt về đường kính thân, chiều dài thân, hàm lượng đường và năng suất (biểu thị bằng số tấn đường/ha) giữa các cây mía có nguồn gốc từ hạt nhân tạo và các cây mía đối chứng Đồng thời, cây mía có nguồn gốc từ hạt nhân tạo có trọng lượng tươi cao hơn so với các cây có nguồn gốc từ chồi Ngoài ra, một trong những khác biệt lớn nhất đó là cây có nguồn gốc từ hạt nhân tạo có chỉ số ra hoa thấp nhất so với cây đối chứng và đây là một thuận lợi để cải thiện chất lượng giống (vì CP-5243 là một dòng trưởng thành sớm và ra hoa nhiều vào tháng 11 dương lịch) Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trên sự nuôi cấy in vitro và sự biệt hóa mô trong kiểu genee của dòng mía thương mại này nhưng đây là báo cáo đầu tiên về khả năng sống sót của cây mía CP-5243 có nguồn gốc từ hạt nhân tạo
Một nghiên cứu mới nhất được thực hiện thông qua công nghệ hạt nhân tạo đó là sự bảo quản (storage) ở 4 o C các chồi dây tây và phúc bồn tử (raspberry) in vitro trong các hạt calcium alginate Để tiến hành nghiên cứu này, Lisek và Orlikowska (2004) đã bao bọc các mẫu chồi ngọn dài 3 mm của giống dâu tây và giống phúc bồn tử (raspberry) in vitro trong các hạt calcium alginate Những hạt này được bảo quản ở 4 o C trong tối Các mẫu cấy dùng để thu nhận chồi ngọn được trải qua một thời gian nuôi cấy trước khi tạo vỏ bao Môi trường sử dụng cho mẫu chồi dõu tõy là mụi trường Boxus với 2,2 àM BAP; 2,46 àM IBA và cú bổ sung 10 g/l mannitol hay 1,7 àM paclobutrazol Mụi trường dựng cho mẫu chồi phúc bồn tử là môi trường MS với các muối NH4NO3 và KNO3 giảm cũn 50%; đồng thời, mụi trường này cũn chứa 3,55 àM BAP; 0,49 àM IBA và cú bổ sung 10 g/l mannitol hay 3,4 àM paclobutrazol Sodium alginate được hòa tan trong nước, nước đường hoặc trong môi trường nuôi cấy không chứa các chất điều hòa tăng trưởng Sau một khoảng thời gian bảo quản, khả năng tái sinh của các mẫu chồi được bảo quản và hệ số nhân in vitro trong 3 lần cấy chuyền được ghi nhận Kết quả cho thấy những chồi ngọn có vỏ bao có thể bảo quản được 9 tháng khi phần vỏ hạt chứa đường hay môi trường nuôi cấy Việc nuôi cấy trên môi trường chứa manitol trước khi tạo vỏ bao rất có lợi cho khả năng tái sinh của chồi ngọn được tạo vỏ bao Hệ số nhân của các mẫu chồi dâu tây và phúc bồn tử trong lần cấy chuyền đầu tiên sau khi bảo quản thấp hơn so với các mẫu chồi không được bảo quản Thật vậy, hệ số nhân rất thấp khi chồi ngọn dâu tây được bảo quản 9 tháng và khi chồi ngọn phúc bồn tử được bảo quản 3 và 6 tháng với phần vỏ của các hạt này được sản xuất bằng cách hòa tan alginate với nước Trong lần cấy chuyền thứ hai, hệ số nhân của dâu tây cao hơn so với các chồi không được bảo quản, nhưng hệ số nhân của phúc bồn tử vẫn thấp hơn các chồi không được bảo quản ngoại trừ sự kết hợp việc bảo quản 9 tháng và sự tiền nuôi cấy trên mannitol Ở lần cấy chuyền thứ ba, hệ số nhân chồi của cả dâu tây và phúc bồn tử tương đương với hệ số nhân của các chồi không được bảo quản.
Sơ lược một số các nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, năm 1992, Phân viện Công nghệ sinh học cũng đã thực hiện việc sản xuất hạt nhân tạo trên đối tượng cây cà phê Môi trường tạo hạt là sodium alginate 4% hòa vào 100 ml môi trường MS có bổ sung nước dừa 20%,
10 mg/l BA; 0,4 mg/l IBA; 40 mg/l adenin; vitamin Morel giống như môi trường nuoõi caỏy phoõi (Nguyeón Vaờn Uyeồn, 1992)
Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2004) cũng đã tạo thành công hạt nhân tạo từ vảy củ của hoa Lily (Lilium spp.) Theo nghiên cứu này, nồng độ 30 g/l alginate lại thích hợp hơn cho sự tái sinh ex vitro, hạt với nồng độ alginate 50 g/l sinh trưởng tốt trong điều kiện in vitro
Ngoài ra, theo nghiên cứu của Nhựt và cộng sự (2005), hạt nhân tạo của PLB địa lan Cymbidium spp cũng được bọc bằng dung dịch sodium alginate với nhiều nồng độ khác nhau Tỷ lệ sống sót của các hạt nhân tạo trong điều kiện in vitro là 100% và khả năng tái sinh cũng khá cao Hạt nhân tạo không bị giảm khả năng sống sót sau khi được bảo quản một năm trong môi trường lỏng không chứa sucrose Tỷ lệ sống sót của hạt là 35,5% và tỷ lệ tạo chồi là 45,8% khi chuyển hạt trực tiếp sang giá thể dớn không khử trùng sau khi được bọc lớp vỏ chitosan Cây con tạo ra từ những hạt nhân tạo này đều sống tốt sau sáu tháng ngoài nhà kính.
SODIUM ALGINATE
Để đáp ứng yêu cầu của một hạt nhân tạo, phần vỏ bao của hạt phải không gây tổn thương cho phôi vô tính Vỏ hạt phải bảo vệ được phôi và vẫn cho phép phôi phát triển Ngoài ra vỏ bao phải đủ bền trong suốt các quá trình dự trữ, vận chuyển và gieo trồng Tùy vào mục đích sử dụng, phần vỏ bao của hạt phải chứa và có thể phân phối chất dinh dưỡng, các nhân tố kiểm soát tăng trưởng cũng như các thành phần khác cần thiết cho hạt nảy mầm và biến đổi Tùy theo từng ứng dụng cụ thể, một số nguyên liệu hữu hiệu có thể được bổ sung vào vỏ hạt như các vi sinh vật kiểm soát sự tăng trưởng (các loài vi khuẩn rễ), kháng sinh và các hóa chất nông nghiệp (như chất diệt nấm, diệt côn trùng) (Redenbaugh và cộng sự, 1987, 1991; Saiprasad, 2001)
Chính vì thế, các phương pháp tạo vỏ bao bao gồm hai loại phản ứng: phản ứng trao đổi ion và phản ứng thay đổi nhiệt độ, sự hình thành giọt tụ phức hợp và sự polymer hóa ở mặt phân cắt pha đã được thử nghiệm để sản xuất hạt nhân tạo Trong số đó, chỉ có phương pháp làm đông keo được công nhận là kỹ thuật thích hợp vì nó cho phép phôi sinh dưỡng sống sót (Redenbaugh và cộng sự, 1987, 1991)
Người ta đã tiến hành khảo sát sự sống sót của phôi trong 27 loại gel và phương pháp trao đổi ion được dùng để ước định tính hữu hiệu của gel đối với việc tạo hạt nhân tạo Trong số 11 gel cho thấy có sự hình thành vỏ bao thì có 6 gel (bao gồm agar, alginate, alginate kết hợp với gelatin, carrageenan kết hợp với locust bean gum, gelrite và sodium pectate) cho phép phôi sống sót (Redenbaugh và cộng sự, 1987) Sự biến đổi từ phôi thành cây con xảy ra khi sử dụng alginate, alginate kết hợp với gelatin, carrageenan kết hợp với locust bean gum để tạo vỏ bao cho hạt nhân tạo (Redenbaugh và cộng sự, 1987, 1991) Tuy nhiên, sodium alginate được xem là tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu sâu hơn trên hạt nhân tạo do tính chất đông keo nhanh chóng, dễ sử dụng, không gây độc cho phôi sinh dưỡng, giá thành thấp và có các đặc tính tương hợp sinh học (Redenbaugh và cộng sự, 1987, 1991; Saiprasad, 2001) Hơn nữa, tính cứng của vỏ bao alginate còn giúp bảo vệ phôi sinh dưỡng tránh các tổn thương cơ học Saiprasad cho biết việc kết hợp than hoạt tính vào vỏ bao alginate làm gia tăng sức sống, sự hô hấp cũng như khả năng biến đổi của phôi sinh dưỡng do than hoạt tính có thể bẻ gãy alginate Mặt khác, than giúp giữ chất dinh dưỡng trong vỏ bao và phóng thích chúng rất chậm cho phôi phát triển (Saiprasad, 2001)
Alginate là muối của acid alginic, đây là một polysaccharide có nhiều trong tự nhiên (Lê Quang Luân, 2002) Trong tự nhiên, alginate là một polyanionic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) (Aoyagi và cộng sự, 1998) Alginate chủ yếu được tách chiết từ tảo nâu (Sargassum spp.) do Standford phát hiện vào năm 1881 Công thức phân tử là
C5H7O4COONa Alginate gồm 3 loại khối (block) trong mạch polymer: polyguluronate (poly-G), polymannuronate (poly-M) và co-polymer của poly-G và poly-M (poly-GM) liên kết ngẫu nhiên trong chuỗi mạch (Lê Quang Luân, 2002), mức độ polymer hóa từ 80 đến 750 Alginate có dạng bột màu trắng hay hơi vàng, không mùi, hầu như không tan trong ethanol, ether và chất hữu cơ hòa tan, nhưng có thể tan trong nước tạo thành chất keo sền sệt Sau khi hấp thu một số nước, thể tích của nó có thể tăng lên gấp mười lần Tính sệt khi hòa tan trong nước của sodium alginate thay đổi theo mức độ polymer hóa và nồng độ [internet]
Sodium alginate tan được trong protein, gelatin, tinh bột, đường, glycerine Đây là một hợp chất dạng chuỗi cao phân tử có khả năng hình thành sợi và màng [internet]
Aoyagi và cộng sự (1998) cho rằng alginate kích thích sự sản xuất nhiều enzyme khác nhau bởi các tế bào cây dừa cạn (Catharanthus roseus) Khi 1,0 g/l alginate được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào Catharanthus roseus L., nhiều protein được phóng thích khỏi tế bào và điều này được phát hiện bằng kỹ thuật chạy điện di trên gel SDS polyacrylamide Thật vậy, sự sản xuất và hoặc sự phóng thích enzyme 5'-phosphodiesterase (5'-PDase), catalase và chitinase bởi tế bào C roseus L được kích thích bằng việc bổ sung alginate Các tác dụng kích thích của alginate trên sự sản xuất 5'-PDase được ghi nhận trên các dòng tế bào C roseus khác nhau và các kết quả tương tự cũng xảy ra khi sử dụng alginate với các tỉ lệ mannuronate/guluronate và độ nhớt khác nhau Việc kích thích sự sản xuất 5'-PDase không phải do sự đột biến tế bào mà là do alginate hoạt động gần như một loại elicitor Trong suốt 82 lần cấy chuyền (577 ngày) trên môi trường MS chứa 1,0 g/l alginate, sự sản xuất và phóng thích 5'-PDase bởi tế bào C roseus L được kích thích mà vẫn không kìm hãm sự tăng trưởng của tế bào
Phản ứng hóa học của alginate
Tính chất quan trọng nhất của alginate là chúng ở dạng hòa tan trong nước khi kết hợp với các ion hóa trị I (Na + , K + , NH4 +…) và lập tức chuyển sang không tan trong nước khi kết hợp với các ion hóa trị II hoặc đa hóa trị (Ca 2+ , Mg 2+ ,
Al 3+ ) Do đó, nếu nhỏ một giọt dung dịch sodium alginate vào dung dịch calcium clorur thì sodium alginate ở phần điện tích ngoài của giọt sẽ chuyển hóa ngay thành calcium alginate tạo nên một màng không thấm nước, và khi đó, các viên alginate được hình thành (Nguyễn Văn Uyển, 1992).
CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG
Các chất hấp thụ phenol
Khi phát triển phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống Phalaenopsis, vấn đề thường gặp nhất là hàm lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao Phenol sẽ khuyếch tán vào môi trường, làm oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nuôi cấy, kết quả là mẫu cấy sẽ bị hóa nâu hoặc đen và chết (Morel, 1974; Flamee và Boesman, 1977; Fast, 1979)
Nhiều phương pháp loại trừ chất tiết này và đặc biệt là các sản phẩm oxy hóa của chúng được thực hiện, chẳng hạn như dùng chất chống oxy hóa, enzym ức chế phenol, polyvinylpyrrolidone, than hoạt tính, và nhiều loại chất hấp phụ khác Hầu hết các phương pháp này đều được ứng dụng kết hợp với việc cấy chuyền mẫu sang môi trường mới sau 2 – 3 tuần nuôi cấy
Sử dụng than hoạt tính là biện pháp rất phổ biến trong nuôi cấy mô thương mại Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ xác định và môi trường nuôi cấy mô Phalaenopsis các hợp chất phenol trong môi trường sẽ được loại bỏ, giúp mô sinh trưởng tốt (Arditti và Ernst, 1993; Park và cộng sự, 2000).
Cytokinin
Cytokinin cần cho sự phân chia tế bào, khi nuôi cấy mô cây một lá mầm cần bổ sung thêm nước dừa vào môi trường để tăng sự phân chia tế bào Cytokinin cần trong phản ứng phosphoryl hóa, tác dụng trên sự di chuyển Ca 2+ vào diệp lạp, giữ màu xanh cho lá, cũng như tính bán thấm cho tế bào, làm rộng tế bào, kích thích quá trình sinh tổng hợp protein Như vậy, ảnh hưởng của cytokinin được chia làm 2 giai đoạn: nhân đôi nhiễm sắc thể và thêm chất tạo phân bào (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2002).
Nước dừa
Các hoạt chất trong nước dừa đã được chứng minh là myo-inositol (m-inositol) cùng một số axit amin khác Tỷ lệ nước dừa sử dụng trong môi trường nuôi cấy tương đối lớn, thường từ 10% đến 20% thể tích môi trường Nên dùng nước dừa tươi, không bảo quản quá một tháng (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961).
Carbohydrate
Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon được mô, tế bào dùng để tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối Hai dạng đường thường sử dụng nhất là sucrose và glucose nhưng hiện nay sucrose được dùng phổ biến hơn Tùy theo mục đích nuôi cấy, nồng độ sucrose biến đổi từ 1 – 6% (w/v) thông dụng nhất là 2% (w/v) tương ứng với 58,4 mM (1 mM = 1 milimol/l)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU
Trong đề tài này, đối tượng được chọn để nghiên cứu tạo hạt nhân tạo là
Nguồn nguyên liệu ban đầu của Phalaenopsis amabilis là phát hoa của những cây khỏe mạnh, không biểu hiện bệnh, cho hoa đẹp, được trồng trong các vườn ươm có lưới che chắn.
Phát hoa của cây trưởng thành khỏe mạnh được nuôi cấy in vitro để nghiên cứu khả năng tạo chồi Sau 8 tuần nuôi cấy, chọn các lá dài khoảng 2 cm tạo từ chồi để nghiên cứu khả năng tạo PLB Sau 8 tuần nuôi cấy tiếp theo, các PLB tạo từ lá in vitro được nuôi cấy trên môi trường thích hợp để tạo mô sẹo
Mô sẹo tạo thành từ PLB là nguồn nguyên liệu cho thí nghiệm tạo hạt nhân tạo
Mô sẹo được hình thành từ PLB có dạng tơi xốp, màu vàng được sử dụng để tạo phôi, phôi sẽ biệt hóa thành PLB Các phôi và PLB tạo thành được sử dụng cho thí nghiệm tạo hạt nhân tạo
2.1.3 Môi trường tạo nguyên liệu
Sử dụng môi trường MS 1/2 (pH 5,7 ± 0,1) được bổ sung: 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l BA, 2 g/l peptone, 0,9 mg/l thiamine, sucrose 30 g/l, 9 g/l agar
Môi trường được ký hiệu là LI Sử dụng bình thủy tinh có thể tích 100 ml có chứa 15 ml môi trường
Sử dụng môi trường MS 1/2 (pH 5,7 ± 0,1) được bổ sung: 1 mg/l NAA, 1,0 mg/l BA, 20% (v/v) nước dừa, 30 g/l sucrose, 9 g/l agar
Môi trường được ký hiệu là PL Dùng các bình thủy tinh có thể tích 100 ml có chứa 15 ml môi trường
2.1.3.3 Tạo mô sẹo từ PLB
Sử dụng môi trường MS (pH 5,7 ± 0,1) được bổ sung: 0,3 mg/l NAA, 1 mg/l BA, 20% (v/v) nước dừa, 30 g/l sucrose, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính
Môi trường được ký hiệu là MO Dùng bình thủy tinh có thể tích 250 ml có chứa 30 ml môi trường
2.1.3.4 Phát sinh phôi từ mô sẹo
Sử dụng môi trường MS 1/2 (pH 5,7 ± 0,1) được bổ sung: 0,5 mg/l NAA,
2 mg/l BA, 20% (v/v) nước dừa, 1 g/l than hoạt tính, 9 g/l agar
Môi trường được ký hiệu là PM Dùng bình thủy tinh 250 ml có chứa 30 ml môi trường
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo
NT Môi trường Nồng độ sucrose
2.1.3.5 Môi trường tạo vỏ alginate
Dung dịch vỏ bao alginate bao gồm: 3 g/l Hyponex (6,5 N – 6 P – 19 K); 0,1 mg/l thiamine; 100 mg/l myo-Inositol; 0,5 mg/l pyridoxine; 0,5 mg/l nicotinic acid; 2,0 mg/l glycine; 30 g/l khoai taây; 30 g/l sucrose
Môi trường được ký hiệu là SA Sau đó bổ sung alginate với các nồng độ khác nhau
2.1.3.6 Môi trường tái sinh cây Để tái sinh cây con, hạt nhân tạo lan hồ điệp được nuôi cấy trên môi trường SA có hoặc không bổ sung sucrose, agar và than hoạt tính tùy mục đích thớ nghieọm
Phần vỏ cứng của hạt nhân tạo được hình thành khi xảy ra phản ứng trao đổi ion giữa dung dịch muối calcium và dung dịch sodium alginate Ở đây, dung dịch muối calcium là dung dịch CaCl2.H2O 100 mM và CaCl2.2H2O dạng tinh thể được hòa với nước để tạo nên dung dịch này
2.1.3.8 Các vật liệu dùng làm giá thể
Hạt nhân tạo lan hồ điệp được nuôi cấy trên các giá thể in vitro agar, giấy lọc hoặc bông gòn
Dụng cụ, thiết bị được sử dụng trong quá trình tạo hạt nhân tạo gồm có dao cắt phẫu thuật, kẹp cấy, pipette 10 ml, đĩa cấy nhôm, đĩa petri vô trùng, bình tam giác 350 ml, bình thủy tinh 250 ml và 100 ml, đèn cồn và tủ cấy vô trùng.
PHƯƠNG PHÁP
2.3.1.1 Nuôi cấy phát hoa để tạo lá in vitro
Mẫu phát hoa ban đầu được thu nhận từ cây trưởng thành 5 – 6 tuổi, chọn hoa chưa nở và chọn phần phát hoa mang chồi bên từ nốt thứ 3 từ dưới lên,
2 nốt phần gốc thường không tạo chồi sẽ được bỏ đi, phần phía trên mang hoa cũng không sử dụng được, chỉ sử dụng phần phát hoa từ 4 – 6 nốt
Thao tác ngoài tủ cấy
Tiến hành cắt phát hoa thành các đoạn khoảng 8 cm mang một chồi bên giữa đoạn, rửa sạch với nước máy, cẩn thận gỡ bỏ lá bắc, ngâm mẫu trong bình tam giác chứa dung dịch pha loãng nước tẩy rửa thương mại, lắc mạnh 10 phút và sau đó rửa lại thật sạch với nước máy Bịt kín bình tam giác chứa mẫu sạch và đưa vào tủ cấy
Thao tác trong tủ cấy Đầu tiên rửa mẫu bằng dung dịch cồn 70 o trong 30 giây, rửa lại bằng nước cất Sau đó khử trùng mẫu với HgCl2 0,1% trong 10 phút Cuối cùng rửa lại bằng nước cất vô trùng nhiều lần trước khi cấy
Sau khi khử trùng, cắt mẫu thành các đoạn 2 cm mang một chồi bên giữa đoạn cắt Cấy mẫu vào môi trường LI sao cho chồi hướng lên
Sau khoảng 8 tuần nuôi cấy, chồi bên sẽ phát triển thành chồi mang lá Các lá dài 2 cm mới tạo thành được sử dụng để tạo PLB
2.3.1.2 Nuôi cấy lá in vitro để tạo PLB
Cắt lá in vitro thành 6 mảnh Cấy các mảnh cắt vào môi trường PL, đặt mặt dưới của lá tiếp xúc với môi trường Cấy vào mỗi bình môi trường một mẫu mô lá
Sau 4 tuần nuôi cấy, bề mặt các mẫu lá bắt đầu hình thành những vùng phồng lên, các vùng này tiếp tục phát triển thành cấu trúc hình tròn xanh đậm gọi là PLB sau 8 tuần Vào tuần thứ 12, các mẫu lá hầu như phủ đầy PLB Các
PLB sẽ được tách rời và chuyển sang môi trường nhân PLB để làm vật liệu cho thí nghiệm hình thành mô sẹo
2.3.1.3 Hình thành mô sẹo từ PLB
Các mẫu PLB thu nhận từ lá được cắt đôi và chuyển lên môi trường MO Mỗi bình môi trường được cấy 10 mẫu PLB cắt đôi Sau 4 tuần mô sẹo bắt đầu hình thành trên bề mặt PLB Sau 8 tuần, mô sẹo tạo thành nhiều và phủ trên bề mặt môi trường
Mô sẹo tạo thành có màu vàng, tơi xốp và mang lông Đây là dạng mô sẹo có khả năng phát sinh phôi (embryogenic callus) Mô sẹo này được chọn cho thí nghiệm tạo hạt nhân tạo
2.3.1.4 Phát sinh phôi từ mô sẹo
Nghiên cứu của Ishii và cộng sự (1997) chỉ ra rằng mô sẹo có khả năng sinh phôi khi được nuôi cấy trong môi trường thích hợp Do đó, trong nghiên cứu này, các nhà khoa học sẽ đánh giá ảnh hưởng của sucrose lên quá trình sinh phôi từ mô sẹo nhằm lựa chọn môi trường tạo phôi chất lượng cao, đồng nhất phục vụ cho mục đích tạo hạt nhân nhân tạo.
Mỗi môi trường khảo sát (Bảng 2.1) sẽ được cấy 100 mg mô sẹo, sau 5 tuần ghi nhận kết quả về trọng lượng tuơi của phôi hình thành, tiếp tục theo dõi sự phát triển của mô sẹo, phôi trong các môi trường trong các tuần tiếp theo
Hình 2.1: Nguyên liệu tạo hạt nhân tạo ai, a2, as: mô sẹo bi, b2, bs: phôi
2.3.1.5 Pha dung dịch tạo vỏ alginate
- Pha môi trường SA và chỉnh pH về 5,4 – 5,5
- Thêm bột sodium alginate vào môi trường với nồng độ sodium alginate 30 g/l, 40 hoặc 50 g/l tùy mục đích thí nghiệm
- Đun cách thủy môi trường cho đến khi tan hết alginate, khuấy đều dung dịch trong lúc đun Dung dịch vỏ bao alginate ở dạng keo sệt trong và có màu hơi vàng nâu, mùi thơm
- Hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 35 phút
2.3.1.6 Môi trường tái sinh cây
Tùy vào tính chất của từng môi trường mà các thành phần có nồng độ và thứ tự bổ sung như sau:
Bảng 2.2: Các môi trường được sử dụng cho hạt nhân tạo lan hồ điệp
Môi trường nuôi cấy Ký hiệu Bình chứa
Môi trường lỏng SA không đường A1 Ống nghiệm đặt giá thể cầu giấy lọc Bình thuỷ tinh 250 ml đặt giá thể cầu giấy lọc hoặc bông gòn
Môi trường lỏng SA có đường A2 Ống nghiệm đặt giá thể cầu giấy lọc Bình thuỷ tinh 250 ml jđặt giá thể cầu giấy lọc hoặc bông gòn
Môi trường rắn SA không đường A3 Bình thủy tinh 250 ml
Môi trường thạch SA có sucrose A4 Bình thủy tinh 250 ml
Môi trường rắn SA không sucrose, có bổ sung than hoạt tính A5 Bình thủy tinh 250 ml
Môi trường rắn SA có đường, có bổ sung than hoạt tính
2.3.1.7 Pha dung dòch CaCl 2 2H 2 O 100 mM
Khuấy tan 1,47 g CaCl2.2H2O dạng tinh thể trong 100 ml nước cất, sau đó, đem hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 35 phút
2.3.1.8 Chuẩn bị các loại giá thể
Giấy lọc Đối với bình thủy tinh 100 ml: đặt một mẩu giấy lọc 55 × 55 mm vào bình, sau đó, môi trường lỏng được bổ sung vào bình với thể tích môi trường tùy mục đích thí nghiệm Hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 35 phút Đối với ống nghiệm: giấy lọc cắt thành hình vuông 55 × 55 mm, bịt kín miệng một ống nghiệm (hoặc một ống tròn) có đường kính 22 mm, rút giấy lọc ra (giữ nguyên hình dạng cuốn tròn) rồi cho vào gần sát đáy ống nghiệm có đường kính 25 mm, bề mặt ngang của giấy lọc hướng lên trên Sau đó bổ sung 10 ml môi trường lỏng vào mỗi ống nghiệm Hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 35 phút
Bông gòn được cắt thành hình vuông 55 × 55 × 10 (mm), lót một lớp bên trong và sát đáy bình thủy tinh hoặc bình tam giác Hấp khử trùng ở 121 o C,
Ủ mẫu trong tủ cấy vô trùng ở áp suất 1 atm trong vòng 35 phút Sau đó, bổ sung môi trường dạng lỏng vào từng bình, đủ ướt bông gòn (khoảng 30 - 40 ml).
2.3.2 Quy trình tạo hạt nhân tạo
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Quy trình thực hiện được mô tả trong hình 2.2.
- Dùng dao phẫu thuật tách rời mô sẹo, phôi, PLB của P amabilis
- Dùng kẹp cấy gắp các mẫu cho vào dung dịch tạo vỏ alginate đã được hấp khử trùng Dùng pipette hút dung dịch alginate có chứa PLB, phôi, mô sẹo rồi nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2.2H2O
- Sau 30 phút, dùng panh cấy gắp hạt vào đĩa petri vô trùng
- Rửa hạt 3 – 4 lần bằng nước cất vô trùng nhằm làm sạch lượng CaCl2.2H2O còn sót lại bên ngoài vỏ hạt
- Sau khi thực hiện xong giai đoạn tạo hạt nhân tạo, hạt được cấy vào các môi trường tương ứng tùy mục đích thí nghiệm
- Thao tác tiến hành trong tủ cấy vô trùng
- Giai đoạn từ lúc cắt mẫu đến khi cho vào dung dịch vỏ bao alginate cần thực hiện nhanh để tránh các mẫu bị mất nước
Dung dịch vỏ bao alginate Bột alginate
Dung dòch alginate 1 Đun cách thủy, khuấy đều cho tan
Maóu caỏy (PLB, moõ seùo, phoõi lan hoà ủieọp in vitro) Dùng pipette nhỏ giọt
Dung dịch CaCl 2 2H 2 O 100 mM 30 phút 30 phút Hạt nhân tạo ủieọp in vitro)
Các bước tạo nhân tạo cây hoa lan hồ điệp (Phalaenopsis spp.):* Nguồn mẫu: cụm PLB, cụm mô sẹo, cụm phôi.* Dùng kẹp gắp mẫu vào dung dịch alginate.* Hút dung dịch alginate chứa mẫu cho vào dung dịch CaCl2 2H2O 100 mM.* Gắp hạt ra khỏi dung dịch CaCl2.
2H;O c Sản phẩm: (C1) Hạt nhân tạo từ PLB; (C2) Hạt nhân tạo từ mô sẹo; (cs)Hạt nhân tạo từ phôi
Chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận trong các thí nghiệm gồm:
- Tỷ lệ hạt sống sót (%) và tỷ lệ hạt nhiễm nấm (%) trên tổng số hạt khảo sát
- Tỷ lệ hạt nảy chồi (%), tỷ lệ chồi ra lá (%) và tỷ lệ chồi ra rễ trên tổng số hạt sống sót
2.3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của sucrose lên sự phát sinh phôi từ moõ seùo
- Thí nghiệm được thiết lập để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên sự phát sinh phôi của mô sẹo
- Cấy mô sẹo vào các môi trường PM2 – PM5 (bảng 2.1) và môi trường đối chứng PM1
- Sau 5 tuần, thu nhận trọng lượng tươi của toàn bộ mô sẹo tạo thành Đến tuần thứ 11 và 16 tiếp tục thu nhận kết quả Các nghiệm thức được lặp lại
2 lần Kết quả thí nghiệm phải được theo dõi liên tục trong quá trình thí nghieọm
THÍ NGHIỆM 2: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ SODIUM
ALGINATE LÊN KHẢ NĂNG SỐNG SÓT VÀ TÁI SINH IN
VITRO CỦA HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP Đối với hạt nhân tạo từ phôi lan hồ điệp
⮚ Môi trường tạo vỏ hạt là SA
Khả năng sống sót và tái sinh của hạt nhân tạo từ phôi lan hồ điệp với các nồng độ sodium alginate khác nhau, được thể hiện trên bảng 3.2a và biểu đồ 3.2a Trong thí nghiệm này, hạt nhân tạo lan hồ điệp được nuôi cấy trên môi trường A3 và A4
Bảng 3.2a: Ảnh hưởng của các nồng độ sodium alginate khác nhau lên khả năng sống sót và tái sinh in vitro của hạt nhân tạo từ phôi lan hồ điệp
Tỷ lệ hạt sống sót (%) 49,3 47,2 44,4 32,6 25,0 12,5 Tỷ lệ hạt nảy chồi (%) 62,9 65,3 62,1 40,0 22,2 - Tỷ lệ hạt ra lá (%) 31,4 11,8 34,5 26,7 11,1 - Tỷ lệ hạt ra rễ (%) 5,7 2,9 3,4 33,3 33,3 -
Biểu đồ 3.2a: Ảnh hưởng của các nồng độ sodium alginate khác nhau lên khả năng sống sót và tái sinh in vitro của hạt nhân tạo từ phôi lan hồ ủieọp
Bảng 3.2a cho thấy ở môi trường A3, tỷ lệ hạt sống sót 49,3% ở nồng độ 30 g/l alginate là cao hơn hai nồng độ còn lại Hầu hết hạt đều phát sinh đa chồi (4 – 5 chồi) Số lượng lá trên mỗi hạt 3 – 4 lá và lá dài nhất đạt 1,6 cm Mỗi hạt trung bình ra một rễ và rễ dài nhất đạt 1,6 cm
Trong trường hợp nồng độ alginate của vỏ hạt là 40 g/l, tỷ lệ hạt nảy chồi đạt mức cao (65,3%) Tuy nhiên, tỷ lệ ra lá và rễ lại thấp, kích thước lá trung bình chỉ khoảng 0,5 cm và chiều dài rễ khoảng 0,3 cm.
Còn trong trường hợp vỏ hạt có nồng độ alginate là 50 g/l Tỷ lệ nảy chồi đạt 62,1%, phát sinh đa chồi (4 chồi), mỗi chồi có từ 1 – 2 lá, lá dài nhất đạt 1,3 cm, rễ dài nhất đạt 1 cm
Tỷ lệ hạt sống sót (%) Tỷ lệ hạt nảy chồi (%) Tỷ lệ hạt ra lá (%) Tỷ lệ hạt ra rễ (%)
Môi trường Ở môi trường có đường (A4) tỷ lệ hạt sống sót thấp, tỷ lệ nảy chồi ở nồng độ 30 g/l alginate tương đối cao (40%) so với 2 nồng độ còn lại Tuy nhiên tỷ lệ ra rễ 33,3% là cao so với các nồng độ alginate ở môi trường không đường
Nồng độ alginate trong vỏ hạt ảnh hưởng đến chất lượng tái sinh cây Nồng độ sodium alginate 5-50 g/l tạo vỏ hạt cứng, duy trì sức sống của phôi Ở nồng độ alginate thấp (10-25 g/l), vỏ hạt chưa hoàn chỉnh, làm giảm tỷ lệ nảy mầm Các nghiên cứu trên địa lan, cúc và lily cho thấy nồng độ alginate tối ưu để tạo hạt là 30 g/l.
Trong thí nghiệm này, hạt nhân tạo lan hồ điệp được chế tạo với các nồng độ alginate trong vỏ bao khác nhau, bao gồm 30 g/l, 40 g/l và 50 g/l Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt có nồng độ alginate trong vỏ bao là 30 g/l có khả năng tái sinh và phát triển tốt hơn so với các hạt có nồng độ alginate cao hơn (40 g/l và 50 g/l) Phát hiện này mở ra triển vọng ứng dụng hạt nhân tạo lan hồ điệp với nồng độ alginate 30 g/l trong kỹ thuật nhân chồi in vitro.
Hình 3.2a: Sự nảy mầm của hạt nhân tạo từ phôi
30 (ai), 40 (as), 50 (as) g/1 alginate trên môi trường As
30 (bi), 40 (bí), 50 (bỉ) g/1 alginate trên môi trường As
⮚ Môi trường tạo vỏ hạt là SA có bổ sung than hoạt tính
Trong thí nghiệm này hạt nhân tạo từ phôi lan hồ điệp được nuôi cấy trên môi trường A5 và A6 ( môi trường thạch có đường và không đường có bổ sung than hoạt tính)
Bảng 3.2b : Ảnh hưởng của các nồng độ sodium alginate khác nhau lên khả năng sống sót và tái sinh in vitro của hạt nhân tạo từ phôi lan hồ điệp có bổ sung than hoạt tính trong vỏ
Tỷ lệ hạt sống sót (%) 52,1 27,1 25,3 39,6 20,8 15,7 Tỷ lệ hạt nảy chồi (%) 68,4 23,1 20,7 48,0 10,0 25,8 Tỷ lệ hạt ra lá (%) 23,7 46,2 28,6 40,0 55,1 37 Tỷ lệ hạt ra rễ (%) 7,9 30,8 5,4 12,2 25,3 18,9
Biểu đồ 3.2b: Ảnh hưởng của các nồng độ sodium alginate khác nhau lên khả năng sống sót và tái sinh in vitro của hạt nhân tạo từ phôi lan hồ điệp có bổ sung than hoạt tính trong vỏ
Tỷ lệ hạt sống sót (%) Tỷ lệ hạt nảy chồi (%) Tỷ lệ hạt ra lá (%) Tỷ lệ hạt ra rễ (%)
Các kết quả cho thấy, ở nồng độ alginate 30 g/l trong vỏ hạt trên môi trường không đường, tỷ lệ hạt sống sót đạt 52,1%, tỷ lệ nảy chồi cao (68,4%), tạo cụm PLB, kích thước lá dài nhất đạt 1,4 cm Trong trường hợp vỏ hạt có nồng độ alginate 40 g/l tỷ lệ hạt ra lá và rễ cao (46,2% và 30,8%)
Ngoài ra, ở môi trường có đường hạt phát sinh mô sẹo Nhiều nghiên cứu đã khẳng định rằng sucrose có ảnh hưởng lên sự hình thành cholorophyl trong mô cấy của một số thực vật, chẳng hạn ở rau diếp (Hildebrandt và cộng sự, 1963), ở thuốc lá (Kaul, 1971) Đối với Phalaenopsis, trên môi trường có sucrose ở nồng độ cao các PLB sẽ bị ức chế không thể tạo được chlorophyl, do vậy thay vì tạo nhiều PLB chúng lại có xu hướng hình thành nhiều mô sẹo trên bề mặt (Park và cộng sự, 2000) Với nồng độ alginate 30 g/l đa số hạt phát sinh đa chồi, đa rễ, lá dài nhất đạt 1,2 cm ; rễ dài nhất đạt 1,9 cm Ở nồng độ 40 và 50 g/l hạt phát sinh cụm mô sẹo to có kích thước 1,5 cm Rễ dài nhất là 2,4 cm và lá dài 1,3 cm
Như vậy, từ các số liệu cho thấy ở môi trường có đường hạt có tỷ lệ ra chồi, lá và rễ tương đối đều nhau Việc kết hợp than hoạt tính vào vỏ bao alginate làm gia tăng sức sống, sự hô hấp cũng như khả năng biến đổi của phôi vô tính do than hoạt tính có thể bẻ gãy alginate Mặt khác than giúp giữ chất dinh dưỡng trong vỏ bao và phóng thích chúng rất chậm cho phôi phát triển (Saiprasad, 2001) Trong trường hợp của thí nghiệm này, than hoạt tính đóng vai trò chất hấp thụ phenol và các sản phẩm thứ cấp của phenol, do vậy phôi trên môi trường có than hoạt tính tăng trưởng nhanh hơn hẳn so với môi trường không chứa than Kết quả này mở ra một hướng mới trong việc sử dụng hạt nhân tạo từ phôi có bổ sung than hoạt tính với nồng độ 30 g/l để nhân chồi và nồng độ alginate trong vỏ hạt là 40 g/l để tái sinh cây con in vitro ra vườn ươm
Hình 3.2b: Sự nảy mầm của hạt nhân tạo từ phôi
30 (ai), 40 (ai), 50 (as) g/1 alginate trên môi trường Afi
30 (bi), 40 (bí), 50 (bs) g/1 alginate trên môi trường Afi Đối với hạt nhân tạo từ PLB lan hồ điệp
Khả năng sống sót của hạt nhân tạo từ PLB lan hồ điệp trên môi trường thạch có đường và không đường được thể hiện trong bảng 3.3
Bảng 3.3 : Ảnh hưởng của các nồng độ sodium alginate khác nhau lên khả năng sống sót của hạt nhân tạo từ PLB lan hồ điệp
Tỷ lệ hạt sống sót (%) 40,5 10,1 8,3 30,2 8,7 2,9 Tỷ lệ hạt nảy chồi (%) 75,4 50,5 60,6 66,7 50,0 33,3
THÍ NGHIỆM 3: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP
NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP Đối với hạt nhân tạo từ PLB lan hồ điệp
Khả năng sống sót của hạt nhân tạo lan hồ điệp trên các môi trường nuôi cấy khác nhau được thể hiện trên bảng 3.5 Trong thí nghiệm này, hạt có nồng độ alginate trong vỏ hạt là 30 g/l Môi trường lỏng A1, A2 (không đường và có đường) được chứa trong ống nghiệm với giá thể là giấy lọc
Bảng 3.5 : Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau lên khả năng sống sót của hạt nhân tạo từ PLB lan hồ điệp
Tỷ lệ hạt sống sót (%) 5,3 3.4 40,2 30,0
Các kết quả cho thấy sau 2 tháng nuôi cấy trên các loại môi trường khác nhau, hạt nhân tạo lan hồ điệp có tỷ lệ sống sót là 40,2 % trên môi trường agar không đường và trên môi trường lỏng với giá thể cầu giấy lọc thì hạt hầu như không có khả năng sống sót Như vậy từ sự phát triển của hạt trên hai loại giá thể agar và giấy lọc, ta có thể rút ra kết luận giá thể agar là thích hợp hơn để hạt nhân tạo lan hồ điệp tái sinh chồi và rễ vì agar có tác động sinh lý trên mô thực vật Agar là một polyosid (có một glucid) có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidium Đối với hạt nhân tạo từ mô sẹo lan hồ điệp
Hạt nhân tạo có nguồn gốc từ mô sẹo lan hồ điệp được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau sau 2 tháng thể hiện trong bảng 3.6
Bảng 3.6 : Khả năng sống sót của hạt nhân tạo từ mô sẹo lan hồ điệp trên các môi trường nuôi cấy khác nhau
Tỷ lệ hạt sống sót (%) 1,4 3,5 7,8 12,7
Trên mỗi trường lỏng và đặc không đường hạt có tỷ lệ sống sót thấp hơn trên môi trường có đường, và môi trường đặc thì tỷ lệ sống sót cao hơn môi trường lỏng Hạt nhân tạo trước và một thời gian sau khi nảy mầm thì chưa thể nào tự dưỡng được, do đó môi trường gieo hạt vẫn phải có đường sucrose để cung cấp cho nó nguồn carbon cần thiết trong giai đoạn đầu hạt nảy mầm Vì vậy, hạt có tỷ lệ sống sót thấp trên môi trường không đường là do mô sẹo cần đường để tăng sinh (Kim, 1994)
Với đối tượng là lan hồ điệp, hạt nhân tạo sau quá trình nuôi cấy trên các loại môi trường cho kết quả đó là hạt nhân tạo từ PLB sống sót và tái sinh tốt trên môi trường thạch không đường Điều này phù hợp với những nghiên cứu trước đây của Hahn và Paek (2001) và của Kim (1994) vì PLB của cây hoa lan hồ điệp cần môi trường có hàm lượng đạm cao và lượng sucrose (carbohydrate) thấp để phát sinh cây Và hạt nhân tạo từ mô sẹo thì ngược lại, hạt có khả năng phát triển tốt trên môi trường có đường, tuy nhiên hạt nhân tạo từ mô sẹo không có khả năng sống sót cao Theo kết quả cho thấy môi trường thích hợp cho hạt phát triển là agar.
THÍ NGHIỆM 4: ẢNH HƯỞNG CỦA GIÁ THỂ LÊN KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP
NĂNG SỐNG SÓT CỦA HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP Đối với hạt nhân tạo từ PLB lan hồ điệp
Khả năng sống sót của hạt nhân tạo lan hồ điệp trên các giá thể khác nhau được thể hiện trên bảng 3.7 Trong thí nghiệm này vỏ hạt có nồng độ alginate 30 g/l, hạt được nuôi cấy trên môi trường A3 (giá thể agar) và các giá thể còn lại được bổ sung môi trường A1 và A2
Bảng 3.7 : Khả năng sống sót của hạt nhân tạo từ PLB lan hồ điệp trên các giá thể nuôi cấy khác nhau
Giá thể Agar Cầu giấy lọc Bông gòn
Tỷ lệ hạt sống sót (%) 40 4,7 3,2 87,1 40,2
Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt nhân tạo lan hồ điệp có khả năng sống sót hiệu quả (87%) trên giá thể bông gòn có 30 ml môi trường A1 (Hình 3.4) Đối với hạt nhân tạo từ mô sẹo lan hồ điệp
Trong thí nghiệm này, hạt nhân tạo từ mô sẹo với nồng độ sodium alginate là 30, 40 và 50 g/l được nuôi cấy trên các giá thể khác nhau thể hiện ở bảng 3.8
Bảng 3.8 : Khả năng sống sót của hạt nhân tạo từ mô sẹo lan hồ điệp trên các giá thể nuôi cấy khác nhau
Giá thể Agar Cầu giấy lọc Bông gòn
Tỷ lệ hạt sống sót (%) 12,7 2,5 0,8 37,5 25 100
Vì hạt nhân tạo có nồng độ Sodium alginate 40 và 50 g/l hầu như chết hết nên chúng tôi không đưa vào bảng Nhìn vào bảng ta thấy tỷ lệ hạt có khả năng sống sót trên giá thể bông gòn với môi trường lỏng không đường Tuy nhiên hạt lại có khả năng sống sót là 100% trên giá thể bông gòn với môi trường chỉ là nước cất Vì vỏ hạt có đủ hàm lượng dinh dưỡng N-P-K cũng như sucrose, vitamin giúp mô sẹo phát triển tốt, cho nên môi trường tái sinh cây không cần dinh dưỡng (Hình 3.5)
Thử nghiệm các giá thể khác nhau để nuôi cấy hạt nhân tạo lan hồ điệp từ PLB và mô sẹo ta đều ghi nhận được kết quả tương tự là hạt có khả năng tái sinh cao khi được nuôi cấy trên giá thể bông gòn vì bông gòn nâng đỡ và giúp các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy khuếch tán đến vị trí của hạt tốt nhaát.
THÍ NGHIỆM 5: KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG BẢO QUẢN HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP
HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP Đối với hạt nhân tạo từ PLB lan hồ điệp
Trong thí nghiệm này, hạt nhân tạo được bảo quản trong môi trường lỏng không có giá thể với nồng độ 30 g/l alginate trong vỏ hạt
Hạt nhân tạo lan hồ điệp được bảo quản trong môi trường A1, A2 với hàm lượng giảm 1/2, 1/5 và 1/10 ở nhiệt độ phòng Với lượng hạt và thể tích môi trường bảo quản được minh họa trên hình 3.6 Trong khoảng thời gian 1,5 tháng, môi trường bảo quản trong, đồng thời tất cả các hạt vẫn sống và không biểu hiện sự tái sinh (không nảy chồi và không ra lá, rễ) Kể từ tháng thứ 2 trở đi một số ít PLB dần hóa vàng và ta nhận thấy ở môi trường có đường với hàm lượng giảm đi một nữa thì hạt có khả năng sống sót là 100% và hạt vẫn chưa có biểu hiện nảy mầm Khi ta thử nghiệm hạt nhân tạo bảo quản khô và trên nước cất thì chỉ trong 4 tuần hạt ở bình khô đã nảy mầm và sau 5 tuần hạt bắt đầu dần hóa đen; còn bảo quản trong nước cất thì sau 6 tuần hạt dần hóa nâu
Ta nên lưu ý lượng dung dịch cho vào hạt và số lượng hạt vì nếu như để hạt ngập sâu trong dung dịch thì hạt sẽ không thể hô hấp, dẫn đến hiện tượng hạt bị ngập úng và dần mất khả năng tái lập lại sự sống sau khi chuyển sang môi trường thích hợp cho nảy chồi Để có thể kéo dài thời gian bảo quản hạt trong môi trường cần chú ý tạo điều kiện thông thoáng cho hạt hô hấp, hay nói cách khác là ta cần thiết lập được một thể tích môi trường bảo quản phù hợp
Vì vậy thời gian bảo quản và thể tích dịch lỏng bảo quản có ý nghĩa quan trọng trong công tác nhân giống Đối với hạt nhân tạo từ mô sẹo lan hồ điệp
Hạt nhân tạo với nồng độ alginate trong vỏ hạt là 30, 40 và 50 g/l được bảo quản trong các môi trường A1 và A2 với hàm lượng dinh dưỡng giảm đi 1/2, 1/5 và 1/10
Ta nhận thấy trên hình 3.7 hầu hết trong các môi trường bảo quản hạt đều có khả năng sống trên 70% Tuy nhiên, hạt được bảo quản trong môi trường không đường với hàm lượng dinh dưỡng giảm đi một nửa sau 2 tháng tỷ lệ sống sót là 100% và so với các bình còn lại thì vẫn chưa có hiện tượng nảy mầm Kết luận chung:
Theo Ipekci và Gozukirmizi (2003), việc bảo quản hạt nhân tạo
Paulownia elongata ở 4 0 C cho kết quả phôi sống sót và nảy mầm tốt Hạt nhân tạo Santalum album có tỷ lệ nảy chồi đạt 18% sau khi bảo quản 45 ngày ở 4 0 C (Rao và Bapat, 1993) Thời gian bảo quản hạt nhân tạo cỏ linh lăng cũng rất ngắn (Redenbaugh và cộng sự, 1987) và tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo
Asparagus cooperi (Ghosh và Sen, 1994) và hạt nhân tạo Eucalyptus citrisdora
(Muralidharan và Mascarenhas, 1995) đều bị giảm ở 4 0 C Thế nhưng ở đối tượng lan hồ điệp, PLB được bảo quản trong môi trường A2 1/2 (có đường) ở điều kiện phòng trong thời gian 2 tháng hạt vẫn có tỷ lệ sống sót 100% và hạt nhân tạo từ mô sẹo trên môi trường A1 1/2 (không đường) bảo quản trong 2 tháng thì tỷ lệ sông là 100% Điều này co ý nghĩa quan trọng trong công tác nhân giông và bảo quản vì thời gian bào quàn làu dài giúp làm giâm chi phí nhàn công.