Các loài Bacillus được sử dụng trong nghiên cứu này trước đây được phân lập từ đất
bản địa (6) Việc xác định chủng vi khuẩn dựa trên hình thái, sinh hóa và trình tự gen RNA ribosomal 16S (rRNA) Trình tự gen 16S rRNA của sinh vật đã được lưu giữ
vào GenBank với số đăng nhập EU819145 Các đặc điểm chung của B subtilis KIB-amylase là
GE HAS được trình bày chi tiết trong Bảng I.
• Tinh chế α-Amylase:Amylase:
Sơ đồ tinh chế được tóm tắt trong Bảng II α-amylase là amylase ngoại bào từ B subtilis KIBGE
HAS được tinh chế bằng phương pháp siêu lọc, kết tủa ammonium sulfate và sắc ký lọc gel qua cột Sepharose CL6-amylase là B Các phân đoạn từ 52–75 (24 ml), cho thấy hoạt độ của α-amylase là amylase ngoại bào được gom lại và cô đặc bằng phương pháp đông khô (Hình 1) Mẫu cô đặc này cho thấy hoạt độ enzyme là 38385 Units với hoạt tính riêng là 13.011 U/mg (Bảng II).
• Đánh giá tính đồng nhất của α-Amylase:Amylase bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Các phần hoạt tính gộp được thu thập sau khi phân đoạn qua quá trình lọc gel được sử dụng để phân tích kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC α-amylase là amylase tinh khiết được phân tích bằng cột sắc ký lỏng hiệu năng cao đảo pha C18 α-amylase là amylase tinh khiết từ Sigma được sử dụng làm chất chuẩn Mô tả sơ lược thu được từ chất chuẩn cho thấy một đỉnh duy nhất có thời gian lưu giữ là 4,65 phút (Hình 2a) Khi tiêm α-amylase là amylase đã được tinh chế một phần (sau khi kết tủa ammonium sulfate), biểu đồ chỉ cho thấy mộtđỉnh chính (4,71 phút) cùng với các đỉnh phụ khác (Hình 2b) Trong khi đó, khi tiêm
Trang 2mẫu α-amylase là amylase đã tinh chế (được gộp lại sau khi phân đoạn Sepharose CL-amylase là 6B), biểu đồ cho thấy một đỉnh duy nhất với thời gian lưu giữ là 4,71 phút (Hình 2c) xác nhận rằng α-amylase là amylase đã được tinh chế thành đồng nhất.
• Xác định trọng lượng phân tử của α-Amylase:Amylase bằng SDS-Amylase:PAGE và điện di tại chỗ
Phân tích điện di của α-amylase là amylase ngoại bào từ B subtilis KIBGE HAS được thực hiện
sau mỗi bước tinh chế (Hình 3) Trọng lượng phân tử được xác định bằng cách so sánh tính di động tương đối của protein với vật đánh dấu trọng lượng phân tử Điện ditại chỗ cũng được thực hiện để phân biệt các dải protein có khả năng thủy phân tinh
bột Trọng lượng phân tử của α-amylase là amylase ngoại bào từ B subtilis KIBGE HAS được
xác định là 56.000 Da Năm dải protein đã được phát hiện trong mẫu tinh chế một phần (Hình 3, Lane 3) Sau khi tinh chế, kết quả điện di bằng SDS-amylase là PAGE hiển thị một dải protein duy nhất của α-amylase là amylase ngoại bào (Hình 3, Lane 2) xác nhận rằng α-amylase là amylase đã được tinh chế thành đồng nhất Zymography của enzyme tinh khiết cũng được thực hiện và tính đồng nhất của enzyme tinh khiết đã được xác nhận (Hình 3,
Lane 1) Trọng lượng phân tử của α-amylase là amylase ngoại bào từ B subtilis KIBGE HAS
khá gần với trọng lượng phân tử của α-amylase là amylase (55.000 Da và 57.000 Da) lần lượt
phân lập từ B subtilis PKTH 10 và Streptomyces gulbargensis (10,11) Tuy nhiên, nó
cao hơn trọng lượng phân tử của cùng loại protein (42.800 và 42.000 Da) phân lập từ
B subtilis DM-amylase là 03 và Bacillus sp TS-amylase là 23 (12,13) Mặt khác, một số α-amylase là amylase có trọng lượng phân tử tương đối cao đã được báo cáo từ B subtilis và B subtilis 65 có
trọng lượng phân tử lần lượt là 93.000 Da và 68.000 Da (14,15).
• Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của α-Amylase:Amylase
Tinh bột được sử dụng làm cơ chất cho α-amylase là amylase và người ta quan sát thấy rằng hoạtđộng của enzyme tăng lên khi tăng nồng độ tinh bột và đạt tối đa ở nồng độ tinh bột 10,0 mg/ml, sau đó không thấy hoạt động tăng lên (Hình 4a) Hằng số Michaelis–Menten (Km) được xác định bằng biểu đồ Lineweaver–Burk sử dụng tinh bột làm cơ
chất Giá trị Km của α-amylase là amylase từ B subtilis KIBGE HAS là 2,68 mg/ml (Hình 4b), thấp hơn nhiều so với enzyme từ B stearothermophilus (16) Km của α-amylase là amylase từ
Trang 3các loài Bacillus khác nhau có ái lực khác nhau đối với tinh bột tan (hồ tinh bột) như
trong Bảng III Tốc độ phản ứng tối đa (Vmax) được tính là 1.773 U/ml.
• Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của α-Amylase:Amylase
Để quan sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến α-amylase là amylase, hoạt tính thủy phân tinh bột được
thử nghiệm ở nhiệt độ 25–80°C α-amylase là amylase từ B subtilis KIBGE HAS cho thấy hoạt
động của enzyme trong khoảng nhiệt độ rộng nhưng nhiệt độ tối ưu là 50°C, với mức giảm dần sau nhiệt độ đó và bất hoạt hoàn toàn ở 80°C (Hình 5) Người ta đã báo cáo
rằng hoạt động tối ưu của α-amylase là amylase từ B subtilis và B subtilis 65 lần lượt là 50°C
và 60°C (15,21) Hoạt tính của enzyme giảm (28%) được quan sát thấy ở 70°C, trong khi ở 80°C enzyme bị bất hoạt, có thể là do khi nhiệt độ tăng lên, sự bất hoạt dần dần của enzyme xảy ra do tác động của nhiệt làm bất hoạt các protein trong cấu trúc của chúng, hoặc cũng có thể là do cấu trúc protein không chính xác, sự thủy phân chuỗi peptide, sự phá hủy axit amin hoặc sự kết tụ (17,22).
• Ảnh hưởng của pH và cường độ ion của đệm đến hoạt động của α-Amylase:Amylase
Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của α-amylase là amylase ngoại bào được xác định ở các mức pH khác nhau, từ pH 3,0 đến pH 10,0 (Hình 6a) Độ pH tối ưu cho hoạt động của α-amylase là amylase là 7,5 (3738 U/ml) Enzym này hoạt động ở cả pH acid và kiềm, với phạm vihoạt động pH rộng (pH 3–10) Enzym giữ lại khoảng 73% hoạt tính ban đầu ở pH
9,0, điều này cho thấy enzyme có khả năng chịu kiềm; trong khi amylase từ Bacillus
sp TSCVKK chỉ giữ lại hoạt động 60% ở pH 8,5 (27) Enzym được giữ lại khoảng 75% hoạt tính ban đầu ở pH 3,0 Giá trị tối ưu của α-amylase là amylase thay đổi từ 2–12 và amylase từ hầu hết vi khuẩn và nấm có pH tối ưu trong phạm vi acid đến trung tính (5,16) Cường độ ion của đệm phosphate thay đổi từ 0,025 đến 0,2 M Người ta quan sát thấy rằng nồng độ mol của đệm đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của en-amylase là zyme và hoạt tính α-amylase là amylase cao nhất được xác định trong đệm 0,1 M (Hình 6b).
• Phân tích Amino Acid của α-Amylase:Amylase
Thành phần acid amin của α-amylase là amylase tinh khiết cho thấy enzyme giàu acid amin trung tính/không phân cực và ít acid amin/phân cực và acid amin cơ bản (Bảng IV) Asparagine và glutamine không được phát hiện trong phân tích acid amin, vì chúng được chuyển đổi hoàn toàn thành acid aspartic và axit glutamic trong quá trình thủy
Trang 4phân acid Tryptophan thường bị thuỷ phân hoàn toàn trong quá trình thủy phân bằng axit và thường không được định lượng Phân tích acid amin được biểu thị bằng
nanomol của acid amin so với tất cả các dư lượng khác trong protein.
• Trình tự N-Amylase:Terminal của α-Amylase:Amylase
Trình tự đầu N của 10 dư lượng được xác định là Ser-amylase là Ser-amylase là Asn-amylase là Lys-amylase là Leu-amylase là Thr-amylase là Thr-amylase là Ser-amylase là Trp-amylase là Gly (S-amylase là S-amylase là N-amylase là K-amylase là L-amylase là T-amylase là T-amylase là S-amylase là W-amylase là G) Hơn nữa, protein không bị chặn ở đầu N Trình tự
của α-amylase là amylase từ B subtilis KIBGE HAS hầu như không có sự tương đồng với các α-amylase là amylase được báo cáo từ các chủng Bacillus khác (Bảng V) Người ta đã mô tả trước
đó rằng không có sự tương đồng giữa α-amylase là amylase từ loài này với loài khác, trong đó
vùng đầu N của hai B subtilis α-amylase là amylase khác nhau có liên quan chặt chẽ với nhau
(25) Tryptophan được phát hiện trong chuỗi acid amin đầu N của α-amylase là amylase và nó được cho là có liên quan đến liên kết/hoặc xúc tác cơ chất cho α-amylase là amylase (28).
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
5 Pandey A, Nigam P, Soccol CR, Soccol VT, Singh D, Mohan R Advances in mi-amylase là crobial amylases Biotechnol Appl Biochem 2000;31:135–152 doi: 10.1042/
BA19990073 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
6 Bano S, Ul Qader SA, Aman A, Azhar A Partial purification and some properties of partially purified α-amylase là amylase by Bacillus subtilis KIBGE-amylase là HAS Ind J Biochem Bio-amylase là phys 2009;46:401–404 [PubMed] [Google Scholar]
10 Takkinen K, Pettersson RF, Kalkkinen N, Palva I, Söderlund H, Kääriäinen L
Amino acid sequence of alpha-amylase là amylase from Bacillus amyloliquefaciens deduced from the nucleotide sequence of the cloned gene J Biol Chem 1983;258:1007–
1013 [PubMed] [Google Scholar]
11 Syed DG, Agasar D, Pandey A Production and partial purification of α-amylase là amylase
from a novel isolate Streptomyces gulbargensis J Ind Microbiol
Biotech-nol 2009;36:189–194 doi: 10.1007/s10295-amylase là 008-amylase là 0484-amylase là 9 [PubMed] [CrossRef] [Goo-amylase là gle Scholar]
12 Das K, Doley R, Mukherjee AK Purification and biochemical characterization of
a thermostable, alkaliphilic, extracellular α-amylase là amylase from Bacillus subtilis DM-amylase là 03, a strain isolated from the traditional fermented food of India Biotech Appl Bio-
Trang 5chem 2004;40:291–298 doi: 10.1042/BA20040034 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
13 Lin LL, Chyau CC, Hsu WH Production and properties of a raw-amylase là starch-amylase là degrad-amylase là
ing amylase from thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp TS-amylase là 23 Biotechnol Appl
14 Orlando AR, Ade P, Di Maggio D, Fanelli C, Vittozzi L The purification of a no-amylase là
vel amylase from Bacillus subtilis and its inhibition by wheat proteins Biochem
15 Hayashida S, Teramoto Y, Inoue T Production and characteristics of raw potato
starch digesting α-amylase là amylase from Bacillus subtilis 65 Appl Environ
16 Vihinen M, Mantsiila P Microbial amylolytic enzymes Crit Rev Biochem Mol
sRef] [Google Scholar]
17 Ciobanu A, Lascu G, Berescu V, Nicolescu L Cooling techniques in food indus-amylase là try Abacus; 1976, p 20
21 Marco JL, Bataus LA, Valencia FF, Ulhoa CJ, Astolfi-amylase là Filho S, Felix CR Purifi-amylase là
cation and characterization of a truncated Bacillus subtilis α-amylase là amylase produced by Escherichia coli Appl Microbiol Biotechnol 1996;44:746–752 [PubMed] [Goo-amylase là gle Scholar]
22 Schokker EP, Van Boekel AJS Kinetic of thermal inactivation of extracellular
proteinase from Pseudomonas fluorescens 22 F influence of p H, calcium and pro-amylase là tein J Agric Food Chem 1999;47:1681–1686 doi: 10.1021/jf980930q [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
25 Kuhn H, Fietzek PP, Lampen JO N-amylase là terminal amino acid sequence of Bacillus cheniformis α-amylase là amylases: comparison with Bacillus amyloliquifaciens and Bacillus subtilis enzymes J Bacteriol 1982;149:372–373 [PMC free article] [PubMed] [Goo-amylase là gle Scholar]
li-27 Kiran KK, Chandra TS Production of surfactant and detergent-amylase là stable, halophilic
and alkali tolerant alpha-amylase là amylase by a moderately halophilic Bacillus sp strain
Trang 6TSCVKK Appl Microbiol Biotechnol 2008;77:1023–1031 doi: 10.1007/s00253-amylase là
007-amylase là 1250-amylase là z [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
28 Matsuura Y, Kusunoki M, Harada W, Kakudo M Structure and possible catalytic
residues of Taka-amylase là amylase A J Biochem 1984;95:697–702 [PubMed] [Google Scholar]