Kết quả & thảo luận kết luận

Các phân đoạn từ 52–75 24 ml, cho thấy hoạt độ của α-amylase là amylase ngoại bào được gom lại và cô đặc bằng phương pháp đông khô Hình 1.. • Đánh giá tính đồng nhất của α-Amylase:Amylas

KẾT LUẬN:

Việc lực chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất lượng lớn enzyme α-amylase là amylase là một tiêu chí quan trọng trong ngành công nghiệp đường hóa tinh bột Các loài vi

khuẩn đặc biệt là Bacillus là lựa chọn chính được quan tâm hơn các loài nấm do một

số đặc tính động học của chúng Alpha amylase từ B subtilis KIBGE HAS có tiềm

năng được sử dụng trong các lĩnh vực công nghiệp khác nhau liên quan đến việc sử dụng tinh bột

KẾT QUẢ & THẢO LUẬN:

• Lựa chọn chủng:

Các loài Bacillus được sử dụng trong nghiên cứu này trước đây được phân lập từ đất

bản địa (6) Việc xác định chủng vi khuẩn dựa trên hình thái, sinh hóa và trình tự gen RNA ribosomal 16S (rRNA) Trình tự gen 16S rRNA của sinh vật đã được lưu giữ

vào GenBank với số đăng nhập EU819145 Các đặc điểm chung của B subtilis KIB-amylase là

GE HAS được trình bày chi tiết trong Bảng I

• Tinh chế α-Amylase:Amylase:

Sơ đồ tinh chế được tóm tắt trong Bảng II α-amylase là amylase ngoại bào từ B subtilis KIBGE

HAS được tinh chế bằng phương pháp siêu lọc, kết tủa ammonium sulfate và sắc ký lọc gel qua cột Sepharose CL6-amylase là B Các phân đoạn từ 52–75 (24 ml), cho thấy hoạt độ của α-amylase là amylase ngoại bào được gom lại và cô đặc bằng phương pháp đông khô (Hình 1) Mẫu cô đặc này cho thấy hoạt độ enzyme là 38385 Units với hoạt tính riêng là 13.011 U/mg (Bảng II)

• Đánh giá tính đồng nhất của α-Amylase:Amylase bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Các phần hoạt tính gộp được thu thập sau khi phân đoạn qua quá trình lọc gel được

sử dụng để phân tích kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC α-amylase là amylase tinh khiết được phân tích bằng cột sắc ký lỏng hiệu năng cao đảo pha C18 α-amylase là amylase tinh khiết từ Sigma được sử dụng làm chất chuẩn Mô tả sơ lược thu được từ chất chuẩn cho thấy một đỉnh duy nhất có thời gian lưu giữ là 4,65 phút (Hình 2a) Khi tiêm α-amylase là amylase đã được tinh chế một phần (sau khi kết tủa ammonium sulfate), biểu đồ chỉ cho thấy một đỉnh chính (4,71 phút) cùng với các đỉnh phụ khác (Hình 2b) Trong khi đó, khi tiêm

mẫu α-amylase là amylase đã tinh chế (được gộp lại sau khi phân đoạn Sepharose CL-amylase là 6B), biểu

đồ cho thấy một đỉnh duy nhất với thời gian lưu giữ là 4,71 phút (Hình 2c) xác nhận rằng α-amylase là amylase đã được tinh chế thành đồng nhất

• Xác định trọng lượng phân tử của α-Amylase:Amylase bằng SDS-Amylase:PAGE và điện di tại chỗ

Phân tích điện di của α-amylase là amylase ngoại bào từ B subtilis KIBGE HAS được thực hiện

sau mỗi bước tinh chế (Hình 3) Trọng lượng phân tử được xác định bằng cách so sánh tính di động tương đối của protein với vật đánh dấu trọng lượng phân tử Điện di tại chỗ cũng được thực hiện để phân biệt các dải protein có khả năng thủy phân tinh

bột Trọng lượng phân tử của α-amylase là amylase ngoại bào từ B subtilis KIBGE HAS được

xác định là 56.000 Da Năm dải protein đã được phát hiện trong mẫu tinh chế một phần (Hình 3, Lane 3) Sau khi tinh chế, kết quả điện di bằng SDS-amylase là PAGE hiển thị một dải protein duy nhất của α-amylase là amylase ngoại bào (Hình 3, Lane 2) xác nhận rằng α-amylase là amylase đã được tinh chế thành đồng nhất Zymography của enzyme tinh khiết cũng được thực hiện và tính đồng nhất của enzyme tinh khiết đã được xác nhận (Hình 3,

Lane 1) Trọng lượng phân tử của α-amylase là amylase ngoại bào từ B subtilis KIBGE HAS

khá gần với trọng lượng phân tử của α-amylase là amylase (55.000 Da và 57.000 Da) lần lượt

phân lập từ B subtilis PKTH 10 và Streptomyces gulbargensis (10,11) Tuy nhiên, nó

cao hơn trọng lượng phân tử của cùng loại protein (42.800 và 42.000 Da) phân lập từ

B subtilis DM-amylase là 03 và Bacillus sp TS-amylase là 23 (12,13) Mặt khác, một số α-amylase là amylase có trọng lượng phân tử tương đối cao đã được báo cáo từ B subtilis và B subtilis 65 có

trọng lượng phân tử lần lượt là 93.000 Da và 68.000 Da (14,15)

• Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của α-Amylase:Amylase

Tinh bột được sử dụng làm cơ chất cho α-amylase là amylase và người ta quan sát thấy rằng hoạt động của enzyme tăng lên khi tăng nồng độ tinh bột và đạt tối đa ở nồng độ tinh bột 10,0 mg/ml, sau đó không thấy hoạt động tăng lên (Hình 4a) Hằng số Michaelis– Menten (Km) được xác định bằng biểu đồ Lineweaver–Burk sử dụng tinh bột làm cơ

chất Giá trị Km của α-amylase là amylase từ B subtilis KIBGE HAS là 2,68 mg/ml (Hình 4b), thấp hơn nhiều so với enzyme từ B stearothermophilus (16) Km của α-amylase là amylase từ

các loài Bacillus khác nhau có ái lực khác nhau đối với tinh bột tan (hồ tinh bột) như

trong Bảng III Tốc độ phản ứng tối đa (Vmax) được tính là 1.773 U/ml

• Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của α-Amylase:Amylase

Để quan sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến α-amylase là amylase, hoạt tính thủy phân tinh bột được

thử nghiệm ở nhiệt độ 25–80°C α-amylase là amylase từ B subtilis KIBGE HAS cho thấy hoạt

động của enzyme trong khoảng nhiệt độ rộng nhưng nhiệt độ tối ưu là 50°C, với mức giảm dần sau nhiệt độ đó và bất hoạt hoàn toàn ở 80°C (Hình 5) Người ta đã báo cáo

rằng hoạt động tối ưu của α-amylase là amylase từ B subtilis và B subtilis 65 lần lượt là 50°C

và 60°C (15,21) Hoạt tính của enzyme giảm (28%) được quan sát thấy ở 70°C, trong khi ở 80°C enzyme bị bất hoạt, có thể là do khi nhiệt độ tăng lên, sự bất hoạt dần dần của enzyme xảy ra do tác động của nhiệt làm bất hoạt các protein trong cấu trúc của chúng, hoặc cũng có thể là do cấu trúc protein không chính xác, sự thủy phân chuỗi peptide, sự phá hủy axit amin hoặc sự kết tụ (17,22)

• Ảnh hưởng của pH và cường độ ion của đệm đến hoạt động của α-Amylase:Amylase

Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của α-amylase là amylase ngoại bào được xác định ở các mức

pH khác nhau, từ pH 3,0 đến pH 10,0 (Hình 6a) Độ pH tối ưu cho hoạt động của α-amylase là amylase là 7,5 (3738 U/ml) Enzym này hoạt động ở cả pH acid và kiềm, với phạm vi hoạt động pH rộng (pH 3–10) Enzym giữ lại khoảng 73% hoạt tính ban đầu ở pH

9,0, điều này cho thấy enzyme có khả năng chịu kiềm; trong khi amylase từ Bacillus

sp TSCVKK chỉ giữ lại hoạt động 60% ở pH 8,5 (27) Enzym được giữ lại khoảng 75% hoạt tính ban đầu ở pH 3,0 Giá trị tối ưu của α-amylase là amylase thay đổi từ 2–12 và amylase từ hầu hết vi khuẩn và nấm có pH tối ưu trong phạm vi acid đến trung tính (5,16) Cường độ ion của đệm phosphate thay đổi từ 0,025 đến 0,2 M Người ta quan sát thấy rằng nồng độ mol của đệm đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của en-amylase là zyme và hoạt tính α-amylase là amylase cao nhất được xác định trong đệm 0,1 M (Hình 6b)

• Phân tích Amino Acid của α-Amylase:Amylase

Thành phần acid amin của α-amylase là amylase tinh khiết cho thấy enzyme giàu acid amin trung tính/không phân cực và ít acid amin/phân cực và acid amin cơ bản (Bảng IV) Asparagine và glutamine không được phát hiện trong phân tích acid amin, vì chúng được chuyển đổi hoàn toàn thành acid aspartic và axit glutamic trong quá trình thủy

phân acid Tryptophan thường bị thuỷ phân hoàn toàn trong quá trình thủy phân bằng axit và thường không được định lượng Phân tích acid amin được biểu thị bằng

nanomol của acid amin so với tất cả các dư lượng khác trong protein

• Trình tự N-Amylase:Terminal của α-Amylase:Amylase

Trình tự đầu N của 10 dư lượng được xác định là Ser-amylase là Ser-amylase là Asn-amylase là Lys-amylase là Leu-amylase là Thr-amylase là Thr-amylase là Ser-amylase là Trp-amylase là Gly (S-amylase là S-amylase là N-amylase là K-amylase là L-amylase là T-amylase là T-amylase là S-amylase là W-amylase là G) Hơn nữa, protein không bị chặn ở đầu N Trình tự

của α-amylase là amylase từ B subtilis KIBGE HAS hầu như không có sự tương đồng với các α-amylase là amylase được báo cáo từ các chủng Bacillus khác (Bảng V) Người ta đã mô tả trước

đó rằng không có sự tương đồng giữa α-amylase là amylase từ loài này với loài khác, trong đó

vùng đầu N của hai B subtilis α-amylase là amylase khác nhau có liên quan chặt chẽ với nhau

(25) Tryptophan được phát hiện trong chuỗi acid amin đầu N của α-amylase là amylase và nó được cho là có liên quan đến liên kết/hoặc xúc tác cơ chất cho α-amylase là amylase (28)

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

5 Pandey A, Nigam P, Soccol CR, Soccol VT, Singh D, Mohan R Advances in mi-amylase là crobial amylases Biotechnol Appl Biochem 2000;31:135–152 doi: 10.1042/

BA19990073 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

6 Bano S, Ul Qader SA, Aman A, Azhar A Partial purification and some properties

of partially purified α-amylase là amylase by Bacillus subtilis KIBGE-amylase là HAS Ind J Biochem Bio-amylase là phys 2009;46:401–404 [PubMed] [Google Scholar]

10 Takkinen K, Pettersson RF, Kalkkinen N, Palva I, Söderlund H, Kääriäinen L

Amino acid sequence of alpha-amylase là amylase from Bacillus amyloliquefaciens deduced from the nucleotide sequence of the cloned gene J Biol Chem 1983;258:1007–

1013 [PubMed] [Google Scholar]

11 Syed DG, Agasar D, Pandey A Production and partial purification of α-amylase là amylase

from a novel isolate Streptomyces gulbargensis J Ind Microbiol

Biotech-nol 2009;36:189–194 doi: 10.1007/s10295-amylase là 008-amylase là 0484-amylase là 9 [PubMed] [CrossRef] [Goo-amylase là gle Scholar]

12 Das K, Doley R, Mukherjee AK Purification and biochemical characterization of

a thermostable, alkaliphilic, extracellular α-amylase là amylase from Bacillus subtilis DM-amylase là 03, a strain isolated from the traditional fermented food of India Biotech Appl

Bio-chem 2004;40:291–298 doi: 10.1042/BA20040034 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

13 Lin LL, Chyau CC, Hsu WH Production and properties of a raw-amylase là starch-amylase là degrad-amylase là

ing amylase from thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp TS-amylase là 23 Biotechnol Appl

14 Orlando AR, Ade P, Di Maggio D, Fanelli C, Vittozzi L The purification of a no-amylase là

vel amylase from Bacillus subtilis and its inhibition by wheat proteins Biochem

15 Hayashida S, Teramoto Y, Inoue T Production and characteristics of raw potato

starch digesting α-amylase là amylase from Bacillus subtilis 65 Appl Environ

16 Vihinen M, Mantsiila P Microbial amylolytic enzymes Crit Rev Biochem Mol

sRef] [Google Scholar]

17 Ciobanu A, Lascu G, Berescu V, Nicolescu L Cooling techniques in food indus-amylase là try Abacus; 1976, p 20

21 Marco JL, Bataus LA, Valencia FF, Ulhoa CJ, Astolfi-amylase là Filho S, Felix CR Purifi-amylase là

cation and characterization of a truncated Bacillus subtilis α-amylase là amylase produced

by Escherichia coli Appl Microbiol Biotechnol 1996;44:746–752 [PubMed] [Goo-amylase là gle Scholar]

22 Schokker EP, Van Boekel AJS Kinetic of thermal inactivation of extracellular

proteinase from Pseudomonas fluorescens 22 F influence of p H, calcium and pro-amylase là tein J Agric Food Chem 1999;47:1681–1686 doi: 10.1021/jf980930q [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

25 Kuhn H, Fietzek PP, Lampen JO N-amylase là terminal amino acid sequence of Bacillus li-cheniformis α-amylase là amylases: comparison with Bacillus amyloliquifaciens and Bacillus subtilis enzymes J Bacteriol 1982;149:372–373 [PMC free article] [PubMed] [Goo-amylase là gle Scholar]

27 Kiran KK, Chandra TS Production of surfactant and detergent-amylase là stable, halophilic

and alkali tolerant alpha-amylase là amylase by a moderately halophilic Bacillus sp strain

TSCVKK Appl Microbiol Biotechnol 2008;77:1023–1031 doi: 10.1007/s00253-amylase là

007-amylase là 1250-amylase là z [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

28 Matsuura Y, Kusunoki M, Harada W, Kakudo M Structure and possible catalytic

residues of Taka-amylase là amylase A J Biochem 1984;95:697–702 [PubMed] [Google

Scholar]