tiểu luận môn học định tính vi khuẩn listeria monocytogenes trong sản phẩm từ sữa thông qua kỹ thuật pcr

Việc sữa không được bảo quản đúng cách hoặc bị nhiễm sau khi đã thanh trùng sữa do nhà ché biến sữa không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm sẽ dễ gây ra các vấn đề sức khoẻ.. Vấn đề sức

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO _ ~ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HQC SINH HQC

TIEU LUAN MON HOC

DINH TINH VI KHUAN Listeria monocytogenes TRONG SAN PHAM TU SUA THONG QUA KY THUAT PCR

Nganh hoc : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môn học : THIẾT BỊ & KỸ THUẬT CNSH Nhóm : Thứ 5 ca 3

Tháng 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO _ ~ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HQC SINH HQC

TIEU LUAN MON HOC

DINH TINH VI KHUAN Listeria monocytogenes TRONG SAN PHAM TU SUA THONG QUA KY THUAT PCR

TS HUỲNH VĂN BIẾT TRƯƠNG LỆ XUYÉN KIM

NGUYÊN NGOC ANH THI NGUYEN NGOC NHU Y

Thang 10/2023

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Chương 1 MỞ ĐẦU

ST cố ố ố 6.6 ẽ ẽ (4‹.AŒđg HH 1.2 Mục tiêu đề tài cà 2 nong ng HH ng ng re 2

lì, y0) 0cse0 1 äyrì 005 Sẽ 4IäAd Ỏ 3

2.1 Khái quát về vi khuẩn Listeria monocy†Ogenes -s-2cs 22s H211

2.1.1 Đặc điểm HH HH 2 ng rà 3

P}N câu 6e ha -‹.ä3kgœgẶ.,., )HàHBH.),H.HDHẬH,),H., 5

2.2.1 Thành phần PCR - 22-222 222 213122122131111271111 T1 11E1 1E1 11E1 11.11E 1.1 me 6

2.2.3 Ứng dụng PCR - 2-2: 222 2132221221311E1.7111T1 T1 11 1E 11ETE.11E.1.1 1EE TT 7

Chương 3 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ, 50 th 2H erreeeeeree 8

kh cái na - T.A , H,.)H)HỤ,HẤAA 8

3.2 Đề nghị se 222 132222213 111.211 D11 nee 8

F503100107/1)0047/ (9115 .,HẬHHà 9

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Listeria monocytogenes, vi khuẩn gram dương - 2 +22222 3 22253112211 12112 2111121211111 ce 3 Hình 2.2 L monocytogenes nhuộm dưới kính hiến vi -.- -c :Sc S11 S42 11 1125111251112211122111221212212111 xxx: 4 Hình 2.3 Các giai đoạn trong kỹ thuật PCR 2Q 0002222211221 122 221111211111 vn H1 TH 6

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Tổ chức nông nghiệp và lương thực (FAO) nhắn mạnh sữa là một trong các cách để giúp mọi người thuộc các thành phần dân só đáp ứng đủ nhu cầu cơ thể về Canxi, Magie,

Selen, Vitamin B2, B5, B12 (hay axit pantothenic) Sữa cũng là một trong những mỗi

trường dinh dưỡng của nhiều vi sinh vật cả có lợi và gây hại Mặc dù sữa đã được thanh

trùng nhưng vi khuẩn vẫn có thê tồn tại Việc sữa không được bảo quản đúng cách hoặc

bị nhiễm sau khi đã thanh trùng sữa do nhà ché biến sữa không đảm bảo an toàn vệ sinh

thực phẩm sẽ dễ gây ra các vấn đề sức khoẻ Vấn đề sức khoẻ do thực phẩm được Tô chức Y tế Thé giới định nghĩa là các bệnh thường xảy ra bởi nhiễm trùng hoặc nhiễm

độc gan do các tác nhân xâm nhập vào cơ thê thông qua hoạt động an uống Tác nhân gây bệnh bao gồm vi khuẩn, ký sinh trùng, vi rút, chất độc, kim loại và prion (Thomas

va ctv, 2013) Trong đó tác nhân vi khuẩn khá phố biến và vi khuân Listeria

monocytogenes là một tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở người và động vật thông qua

việc tiêu thụ sữa hay các sản phẩm từ sữa không chát lượng Tý lệ mắc bệnh sẽ cao hơn

ở nhóm người dễ mắc bệnh như phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người lớn trên 65 tuổi và

người có hệ thống miễn dịch suy yếu So với các bệnh do tác nhân khác hiện nay thì bệnh Listeriosis tý lệ bùng phát rát thấp Mặc dù bệnh Listeriosis không phố biến ở

người nhưng đây là căn bệnh cần quan tâm do mức độ nghiêm trọng và tý lệ tử vong

cao Một số báo cáo cho thấy khoảng 20% trường hợp bị nhiễm vi khuân Listeria monocytogenes, tir do có thẻ tiến triên thành viêm não - màng não, áp xe não, với các

di chứng như động kinh, di chứng về vận động, cảm giác, tôn thương dây thần kinh sọ Nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời, thì tỷ lượng tử vong cao Bệnh có thẻ từ

nhiễm trùng nhẹ, tại chỗ đến bệnh cảnh xâm lắn như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết

với tôn thương đa cơ quan, trường hợp nặng có thê gây suy đa tạng, tử vong Đề phát hiện kịp thoi va han ché tac hai cua Listeria monocytogenes, viéc dinh tinh vi khuan trén

trong san pham từ sữa cần được đặt lên hàng đầu

1.2 Mục tiêu đề tài

Dinh tinh vi khuan Listeria monocytogenes trong san phẩm từ sữa thông qua kỹ thuật

PCR Tir do xac dinh chat lugng cua san pham, nhanh chóng có biện pháp xử lý đối với

cac san pham tir sira bi nhiém vi khuan Listeria monocytogenes

Chương 2 TÔNG QUAN TAI LIEU

2.1 Khái quát về vi khuẩn Listeria monocyftogenes

2.1.1 Đặc điểm

Vi khuẩn Listeria monocytogenes là vi khuân gram dương, hình que, không có vỏ bọc,

không hình thành bảo tử, tan máu beta, hiếu khí tuy tiện, có khả năng di động và

kháng acid Vi khuẩn Listeria monocytogens có nội độc tô gây hoại tử, không tiết

ngoại độc tó Trong tự nhiên, tồn tại khắp nơi trong môi trường như đắt, nước, phân,

động vật, thực phẩm như rau hỏng, sữa, phô mai, thực phẩm đóng hộp không đảm bảo

vệ sinh Nó còn hiện diện ca trong ruột con người, động vật có vú, chim và động vat giáp xác

Vi khuẩn dễ phát triển ở nhiệt độ từ 1 —- 459C Nhiệt độ tối ưu từ 30-37°C, chét ở nhiệt

độ cao 60°C Nó có khả năng chóng chịu tương đối ở điều kiện khắc nghiệt pH khoảng

từ 4,5 — 9, khả năng chịu muối 10% NaC] và tăng trưởng tối ưu ở pH trung tính

khoảng từ 6 - 8

Ngoài ra, vi khuẩn còn nhạy cảm với kháng sinh Trong một số loài Listeria, vi khuân

L monocytogenes là màm bệnh chính ở người

Hinh 2.1 Listeria monocytogenes, vi khuan gram duong

At a - sm x K1 ie! ee Af? TC

rò Ỳ PC ` NG 7s a

Ros ' 2 2ñ Se fe , _

pre

¢ ~ ~" aa oe

lpg ze ates Be TINH 446070 on a o gL, a) eo ws of Loe š `

^ 1 = vs ei" J “

Na n n

- t ** ‘> es Soe — » v48, + Ấy :

4 ra ` „4® + \ , aie

ee aan PS oe eet

: ể “> J/ *, ` + ` te

)ỊV 8 02 3 tpt vy ° Ae ae See ;® yale v

~~ WK Ode ta, h- + -

Hình 2.2 L monocytogenes nhuộm dưới kính hiển vi

2.1.2 Bénh Listeriosis

Listeria monocytogenes Ia vi sinh vat gây bénh Listeriosis, can bénh cé thé tra nén nghiêm trọng và gây tử vong cho con người và động vật Ngược lại với hầu hét các màm

bệnh truyền qua thực phẩm, L monocytogenes sé phat triển trong thực phẩm có độ am thấp và khả năng chịu mặn cao Điều đáng chu y la L monocytogenes phat triển tốt ở

nhiệt độ lạnh Khả năng tồn tại và nhân lên trong môi trường thực phâm này khiến L monocytogenes đặc biệt khó kiểm soát Theo một cuộc khảo sát khác kéo dai hai nam được thực hiện, tý lệ ô nhiễm cao nhát trong ngành công nghiệp thực phẩm Trung Quốc

là L monocytogenes, với tỷ lệ ô nhiễm khoảng 20% (Shamloo và ctv, 2019) Ngoài ra,

theo CDC ước tính Listeriosis là nguyên nhân đứng thứ 3 gây tử vong do bệnh từ thực

phẩm ở Hoa Kỳ, có khoảng 1600 người mắc bệnh hăng năm và khoảng 260 người tử

vong Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở trẻ sơ sinh, người ở độ tuổi 65 tuổi, và ở những bệnh

nhân suy giảm miễn dịch Phụ nữ mang thai có nguy cơ nhiễm bệnh cao gap 24 lan so với những người khác (Ryser, E.T và ctv, 2007) Nó ảnh hưởng trực tiếp đến trẻ sơ sinh Nếu trẻ sơ sinh bị nhiễm bệnh này có thê phát triển các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng Bệnh có thê được chuẩn đoán băng nuôi cấy vi khuân Listeria monocytogenes từ mô cơ thê hoặc chất lỏng như máu, dịch tuỷ sóng hoặc nhau thai Xét nghiệm máu thường hiệu quả nhất đề xác định xem người đó có nhiễm khuân này hay không Trong một số trường hợp, mẫu nước tiêu hoặc dịch tủy sống cũng sẽ được xét nghiệm Hiện nay, kỹ thuật

4

Real-time PCR cũng có thê được áp dụng tuy nhiên đây là kỹ thuật mới, yêu cầu thiết

bị hiện đại, công nghệ cao, khó áp dụng rộng rãi trong chân đoán nhiễm trùng do Listeria

monocytogenes Viéc diéu trị đối với bệnh Listeriosis thường dùng các loại kháng sinh khác nhau đề kiêm soát màm bệnh Một số loại thuốc được sử dụng rộng rãi để điều trị

bénh Listeriosis, chang han nhv penicillin, ampicillin, gentamycin, meropenem Diéu trị

kháng sinh dugc khuyén cáo càng sớm càng tốt nhằm han ché nguy co bién chứng Hiện

nay chưa có vaccine phòng bệnh đặc hiệu Các biện pháp phòng bệnh không đặc hiệu như thực hiện an toàn thực phẩm, nâng cao kiến thức và hiểu biết, tiếp cận chuẩn đoán

và điều trị kịp thời Việc phân tích các sản phâm thực phẩm đẻ tìm hiện diện của vi sinh vật gây bệnh là một trong những bước cơ bản để quản lý an toàn thực phẩm, kiêm soát

và giảm thiêu ca bệnh

Cac con duong phoi nhiém voi vi knuan Listeria monocytogenes

Qua đường tiêu hoá: Vi khuẩn xâm nhập thông qua thực phẩm, nước và nhiễm khuẩn Thực phâm như thịt nguội và các sản phẩm ăn liền từ thịt (xúc xích, thịt đóng hộp thịt lên men, ), các sản phâm từ sữa (phô mai) và các sản phẩm cá xông khói dễ phơi nhiễm

với Listeria monocytogenes

Qua nhau thai: Truyền từ mẹ sang con trong quá trình sinh đẻ

2.2 Kỹ thuật PCR

Nguyên lý hoạt động của PCR: việc tống hợp DNA dựa trên mạch khuôn - một trình tự

đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu

bản sao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mùi đặc hiệu cho đoạn

DNA này

= ms ee) Til

^~ a ® | osc Strands Separate 1 Denaturing

DNA Sample Primers Nucleotides

& : lÑ | SS°C - Primers Bind Template 2 Annealing Taq Polymerase Mix Buffer PCR Tube Ty

| 72°C - Synthesise New Strand 3 Extension

PCR Cycle Dini

Bề

Thermal Cycler hi

Hình 2.3 Các giai đoạn trong kỹ thuật PCR

2.2.1 Thành phần PCR

Dung dịch ADN mẫu (DNAtemplate) chứa đoạn ADN cụ thẻ đã được tinh sạch để nhân

bản

Primers: là các đoạn ADN mỗi, thường có độ dài vài chục Kbp, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu và điểm kết thục của đoạn ADN mẫu

DNA polymerase: là enzyme có nhiệm vụ tổng hợp các đoạn ADN mới là bản sao của trình tự ADN ban dau Enzyme nay có khả năng chịu nhiệt cao và thường sử dụng trong PCR là Taq polymerase

Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm 4 loại (A, T, G, C) la các thành phần cơ bản, được xem như những “viên gạch” cầu tạo nên câu trúc của DNA,

DNA polymerase sử dụng các đNTPs đề tông hợp nên các trình tự ADN bản sao

Dung dịch đệm (buffer solution): cung cap môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase

Ông PCR (PCR tube): là dụng cụ plastic chuyên dụng dùng đề phối trộn dung dịch phan

ứng PCR trước khi cho vào thiết bị thực hiện PCR (Thermal cycler)

2.2.2 Chu trinh nhiệt

1 - Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 95°C, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ

khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn

2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 50 - 63°C, các đoạn môi sẽ bắt cặp bô sung vao 2 dau trình tự mục tiêu

3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được dua lén 72°C, Taq polymerase sé su dung dNTP

để kéo dài đầu 3' của mài và tạo ra mạch bỏ sung

2.2.3 Ứng dụng PCR

PCR được dùng dé khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần Đó có

thẻ là một gen đơn, hay một phần cua gen

PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như kiểm định an toàn thực phẩm, xác định sinh vật GMO, định danh thịt, kiểm nghiệm nguồn nguyên liệu đầu, phát hiện vi sinh tạp nhiễm gây bệnh, phát hiện các bệnh

di truyền, nhận dạng, tách dòng gene, và xác định huyết thống

Ngoài ra, phương pháp PCR còn được áp dụng trong việc sản xuất các bộ kit chân đoán

mam bénh trong đa dạng lĩnh vực khác bao gồm: Xác định bệnh trên người, thú y, thủy

sản, vi sinh thực phâm, định danh,

Phân tích pháp y: Xác định dấu vân tay di truyền, xét nghiệm DNA, quan hệ huyết thống, điều tra tội phạm

PCR có thê cho cả kết quá định tính và định lượng, nhưng thông thường PCR được Sử dụng để cho kết quả định tính: phát hiện hoặc không phát hiện, chỉ một số có thẻ cho

kết quả định lượng Phương pháp kiểm tra nhạy và nhanh Tuy nhiên kết quả tuỳ thuộc

trình độ của kỹ thuật viên và máy móc, thiết bị Chi phí thực hiện khá cao

Một phản ứng PCR hoàn chỉnh có thê được thực hiện trong vài giờ, hoặc thậm chí ít hơn

một giờ với một só máy tốc độ cao nhất định

Sau khi phản ứng khuếch đại được hoàn thành trong máy luân nhiệt, phương pháp điện

di trên gel agarose có thẻ được sử dụng đề kiêm tra số lượng và kích thước của các đoạn

DNA được tạo ra

Chương 3 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ

3.1 Kết luận

Listeria là một trong những tác nhân truyền nhiễm thực phẩm quan trọng có ảnh hưởng

quan trọng đến sức khỏe cộng đồng và kinh tế Dân số ngày càng tăng để đáo ứng nhu cầu lượng thực, thực phẩm, nhà máy sản xuất thực phâm mở ra càng nhiều với quy mô

lớn Vì thé, an toàn thực phẩm là điều hét sức cần thiết trong toàn bộ chuỗi sản xuất thực

phẩm đề đảm bảo sức khoẻ cộng đồng và phòng ngừa bệnh Listeria Trong só các bệnh

lây truyền qua thực phẩm, bệnh ít được chú ý nhát là bệnh Listeriosis mặc dù căn bệnh

nguy hiêm với tỷ lệ tử vong cao Tác nhân gây bénh Listeria monocytogenes có thẻ tồn tại ở môi trường khắc nghiệt và nguy hiểm đối với sức khỏe con người Đề kiếm soát sự lây nhiễm, cần quan tâm các điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm mục đích ngăn

chặn sự xâm nhiễm và nhân lên của Listeria monocytogenes trong sira va cac loai thyc

phẩm khác

3.2 Đề nghị

San phâm hậu PCR có thê tạo dòng thuần cua chung vi khuẩn gây bệnh làm tiền đề cho các nghiên cứu có ứng dụng liên quan đến độc tính chủng vi khuẩn Listeria

monocytogenes trong các điều kiện môi trường khác