thực hành công nghệ di truyền ii

Kiểm tra GMO trên cây ngô Ngô biến đổi gen là những loại ngô đã được được tạo ra bằng cách thay đổi gen – DNA dưới tác động của các kỹ thuật sinh học hiện đại phương pháp chuyển gen, gây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM

MỤC LỤC

Trang

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iiv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1 Tổng quan về GMO 1

1.1 Khái niệm về sinh vật biến đổi gen - GMO 1

1.2 Tại sao phải kiểm tra GMO 1

1.3 Kiểm tra GMO trên cây ngô 1

1.4 Phương pháp xác định GMO trên ngô 2

2 Mục tiêu: 3

3 Nội dung thực hiện: 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 5

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 5

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 5

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 5

3.3 Các bước tiến hành 6

3.3.1 Ly trích DNA……… 4

3.3.2 Điện di định tính DNA ly trích 13

3.3.3 PCR 14

3.3.4 Điện di phát hiện mẫu GMO 15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

4.1 Kết quả 16

4.2 Thảo luận 16

4.2.1 Điện di định tính DNA 16

4.2.2 Xác định mẫu ngô GMO 17

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

GMO : Sinh vật biến đổi gene GMO (Genetically modified organ isms)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Bảng thành phần hỗn hợp các chất trong PCR 14

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Quy trình xác định ngô GMO bằng kỹ thuật PCR 2

Hình 3.1 Mẫu bắp Non-GMO và GMO 6

Hình 3.2 Mẫu bắp Non-GMO và GMO sau khi nghiền 6

Hình 3.3 Non-GMO và GMO sau khi thêm 600µl dịch trích 7

Hình 3.4 Non-GMO và GMO sau khi nghiền 7

Hình 3.5 Non-GMO và GMO sau khi thêm 600µl PCI 8

Hình 3.6 Non-GMO và GMO sau khi lắc mạnh 8

Hình 3.7 Sau khi ly tâm 9

Hình 3.8 Sau khi hút 400µl dịch nổi qua eppendorf mới 9

Hình 3.9 Non-GMO và GMO sau khi thêm CI và lắc mạnh 8

Hình 3.11 Sau khi hút dịch nổi qua eppendorf mới 11

Hình 3.12 Sau khi thêm Isopropanol và lắc mạnh 11

Hình 3.13 Sau khi ly tâm 10 phút 12

Hình 3.14 Sau khi thêm 500µl Ethanol 70o 12

Hình 3.15 Sau khi thêm TE vào 13

Hình 4.1: Kết quả điện di định tính DNA ( Trong khung đỏ từ phải sang trái lần lượt là non-GMO và GMO) 16

Hình 4.2: Kết quả điện di phát hiện GMO (Trong khung đỏ từ phải sang trái lần lượt là non-GMO và GMO) 16

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Tổng quan về GMO

1.1.1 Khái niệm về sinh vật biến đổi gen - GMO

Sinh vật biến đổi gene - GMO (Genetically modified organ isms) là sinh vật có bộ gene được chèn một hoặc nhiều đoạn DNA làm bộ gene của sinh vật biến đổi, nhằm tăng các đặc tính ưu việt có chọn lọc

1.1.2 Tại sao phải kiểm tra GMO

- Công nghệ sinh học phát triển: ngày càng nhiều thực phẩm có nguồn gốc là cây trồng GMO

- Quan điểm xã hội: chưa quen, không thích nghi kịp, tâm lý lo sợ

- Lợi ích và tác hại chưa xác định rõ ràng: mất cân bằng tự nhiên, nguy cơ gây gây hại cho sức khỏe và đa dạng sinh học

1.1.3 Kiểm tra GMO trên cây ngô

Ngô biến đổi gen là những loại ngô đã được được tạo ra bằng cách thay đổi gen – DNA dưới tác động của các kỹ thuật sinh học hiện đại (phương pháp chuyển gen, gây đột biến gen hoặc chỉnh sửa gen)

Chúng được tạo ra với một số mục tiêu cơ bản như:

- Tăng khả năng chống lại sâu bệnh

- Sinh trưởng và phát triển tốt hơn

- Thích nghi tốt với khí hậu hơn

- Màu sắc đẹp hơn

- Tăng kích thước

- Tăng sản lượng

- Chứa hàm lượng dinh dưỡng cao hơn

Đến nay nhiều nơi vẫn tranh cãi về việc có nên dùng ngô GMO hay không do những nghi ngờ về tính an toàn của nó Mặc khác, lượng hạt giống ngô biến đổi gen đã cung cấp

ra thị trường Việt Nam khoảng 200 tấn tương ứng với diện tích trồng khoảng 100.000 ha (thống kê vào năm 2020) Vì vậy để đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng được biết rõ nguồn gốc thực phẩm mình sử dụng đã đặc ra vấn đề cần có phương pháp kiểm tra ngô GMO trên thị trường

Hình 1.1 Minh họa về ngô GMO 1 1.4 Phương pháp xác định GMO trên ngô

Kỹ thuật PCR, đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt Sau đó tiến hành điện di và đọc kết quả

Hình 1.2 Quy trình xác định ngô GMO bằng kỹ thuật PCR

PCR Điện di lần 2

Đọc kết quả

1.2 Mục tiêu:

Xác định được ngô GMO, phân biệt được ngô GMO với ngô hữu cơ bằng phương pháp PCR

1.3 Nội dung thực hiện:

- Thu mẫu: tiến hành thu mẫu lá, thân của ngô GMO và ngô hữu cơ nhằm so sánh kết quả

- Ly trích DNA: tiến hành ly trích DNA từ 2 mẫu ngô làm nguồn nguyên liệu cho điện di và PCR

- Điện di lần 1: Tiến hành điện di nhầm kiểm tra mẫu ly trích có chưa DNA hay không

- PCR: nhầm khuếch đại vật liệu DNA, các đoạn gene mong muốn bằng các cặp mồi chuyên biệt

- Điện di lần 2: tiến hành điện di mẫu PCR nhầm phát hiện GMO

- Đọc kết quả: đọc kết quả dựa vào đối chứng dương của cây GMO

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Lương thực thực phẩm là các loại cây trồng mà sản phẩm dùng làm lương thực cho người

và thức ăn cho động vật Ngành lương thực thực phẩm là một ngành đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế - xã hội của thế giới, là nguồn nuôi sống cho hơn 7 tỉ người trên thế giới Vấn đề đặt ra ở đây là để đảm bảo cho sự tồn tại của xã hội loài người trong giai đoạn hiện nay và tương lai thì con người phải được cung cấp đầy đủ hương thực thực phẩm và nhiều nhu cầu khác Ở một số quốc gia, để tăng sản lượng hương thực người ta đã trồng những cây hương thực thay thế cho cây công nghiệp Ví dụ ở Hoa Kỳ: nhờ thành tựu trong lĩnh vực công nghệ người ta đã sản xuất được các loại sợi hóa học thay thế cho sợi bông Vậy nên những vùng trồng bông khi xưa đã được thay thế bằng trông cây lương thực Còn ở Nhật thì chấm dứt trồng dâu để trồng lương thực Từ đó ta thấy vai trò cực kỳ quan trọng của ngành lương thực thực phẩm đối với sự tồn tại và phát triển của xã hội loài người

Ngô là cây lương thực quan trọng trên toàn thế giới bên cạnh lúa gạo và lúa mỳ Chính vì tầm quan trọng của nó nên cây ngô đã được toàn thế giới gieo trống trên 4 vùng sinh thái bao gồm ôn đới, nhiệt đới, nhiệt đới cao và nhiệt đới thấp Việt Nam là một nước xuất phát từ một nền nông nghiệp, nên ngôi cũng là một trong những cây lương thực quan trọng đứng vào hàng thứ 2 sau gao Đặc biệt đối với một số đồng bào dân tộc miền núi, thì ngô như một nguồn lương thực, thực phẩm chính Hiện nay ngô vẫn là cây ngủ cốc có vai trò quan trọng đối với nước ta

Ngô có thể được chế biến thành yến mạch, bột mịn hay tinh bột mì và là thành phần trong bánh kếp, bánh muffin, bánh rán, bánh mì và các loại bột làm bánh, cũng như thực phẩm trẻ em, các sản phẩm thịt, ngũ cốc và một số sản phẩm lên men Bột masa từ ngô được sử dụng để sản xuất vỏ taco, bim bim ngô và bánh ngô

Tuy nhiên, ngô được sử dụng làm thực phẩm và rượu etylic đã được biến đổi gen để dung nạp các loại thuốc diệt cỏ khác nhau và để thể hiện protein từ Bacillus thuringiensis (Bt) tiêu diệt một số côn trùng nhất định

Năm 2010 khoảng 90% ngô trồng ở Mỹ đã được biến đổi gen Ở Mỹ năm 2015, 81% diện tích ngô có tính trạng Bt và 89% diện tích ngô có tính trạng chịu được glyphosate Hiện nay, ngô chuyển gen cũng đã được trồng phổ biến ở nước ta Có 2 nhóm gen thường được thấy nhất đó là nhóm gen kháng sâu bệnh và nhóm gen chống chiu, ngoài ra còn có các gen khác nữa được chuyển tùy vào nhu cầu sử dụng Việc xác định các gen được chuyển vào cây giúp người sử dụng có hướng sử dụng cây trồng chuyển gen có hiệu quả hơn

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: 11/05/2023 – 12/05/2023

- Địa điểm nghiên cứu: phòng 105, tòa A2, viện CNSH & MT, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: mẫu bắp GMO và non-GMO

- Vật liệu nghiên cứu:

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Dùng kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA tổng số Xuất hiện band sáng là do có

DNA trong mẫu, DNA sẽ được glycerol nặng hơn kéo lắng xuống đáy giếng, giúp DNA tránh khuếch tán ra bên ngoài, đồng thời làm băng điện di đẹp và gọn hơn Cuối cùng, để quan sát được DNA cần phải nhuộm phân tử này bằng các chất nhuộm như gelred, Và ngược lại nếu không có DNA trong mẫu những phản ứng trên sẽ không xảy ra và đồng thời band sáng cũng không xuất hiện

- Điện di sản phẩm PCR kiểm tra DNA ly trích có dương tính hay âm tính với gen chuyển vào hay không Thông qua điện di sản phẩm PCR có ladder, có band sáng xuất hiện nếu mẫu ly trích DNA dương tính Và ngược lại nếu mẫu âm tính, band sáng không xuất hiện

3.3 Các bước tiến hành

3.3.1 Ly trích DNA

Bước 1: Chuẩn bị 2 mẫu bắp GMO và non-GMO, nghiền nhỏ sau đó cho vào tube một lượng nhỏ

Hình 3.1 Mẫu bắp Non-GMO và GMO

Hình 3.2 Mẫu bắp Non-GMO và GMO sau khi nghiền

Non-GMO

GMO

Bước 2: Thêm 600µl dịch trích vào từng tube

Hình 3.3 Non-GMO và GMO sau khi thêm 600µl dịch trích

Bước 3: Dùng chày để nghiền mẫu trong dịch trích

Hình 3.4 Non-GMO và GMO sau khi nghiền

Bước 4: Thêm 600µl PCI tỷ lệ 25:24:1, sau đó lắc mạnh

* PCI Buffer ( Phenol Chloroform Isoamyl alcohol ): gồm có phenol và

chloroform gây biến tính protein, tuy nhiên phenol làm biến tính mạnh hơn Bên cạnh đó, Chloroform còn giúp giảm sự giao pha ( tức là phân lớp rõ ràng hơn với các phân tử không

xác định tồn tại ở pha nào như protein biến tính, ) Ngoài ra còn có isoamyl alcohol giúp làm giảm bọt khí và làm quá trình tách lớp diễn ra tốt hơn

Hình 3.5 Non-GMO và GMO sau khi thêm 600µl PCI

Hình 3.6 Non-GMO và GMO sau khi lắc mạnh

Hình 3.7 Sau khi ly tâm

Hình 3.8 Sau khi hút 400µl dịch nổi qua eppendorf mới.

Bước 6: Bổ sung thêm 400µl CI vào và lắc mạnh

Hình 3.9 Non-GMO và GMO sau khi thêm CI và lắc mạnh

Bước 7: Tiếp tục đem đi ly tâm ở 12000rpm trong 1 phút, sau đó hút dịch nổi qua eppendorf mới ( Non-GMO hút 250µl, còn GMO hút 250 µl)

Hình 3.10 Sau khi ly tâm

GMO Non-GMO Non-GMO

GMO

Hình 3.11 Sau khi hút dịch nổi qua eppendorf mới

Bước 8: Bổ sung Isopropanol ( Vmẫu*0,6=VIsopropanol), như vậy GMO và Non-GMO

sẽ thêm 150µl Isopropanol sau đó lắc mạnh và quan sát, có lợn cợn thì đó là DNA

* Isopropanol: kết tủa DNA ( DNA ít tan hơn trong isopropanol nên nó kết tủa

nhanh hơn với nồng độ thấp hơn so với ethanol ), tuy nhiên muối ở trong mẫu cũng

bị kết tủa nhanh theo DNA

Hình 3.12 Sau khi thêm Isopropanol và lắc mạnh

Bước 9: Đem đi ly tâm ở 12000rpm trong 10 phút, sau đó đổ từ từ dịch ra ( đổ nhẹ

vì đổ mạnh có thể làm cho DNA đi ra ngoài) Tiếp theo thêm 500µl Ethanol 70o

vào

* Ethanol 70%: hòa tan muối Nacl đã bị kết tủa cùng với DNA, giúp tránh nhiễm

muối trong mẫu DNA

Bước 10: Đem đi ly tâm ở 12000rpm trong 2 phút, sau đó đổ dịch ra và sấy khô Tiếp theo hút 30µl TE cho vào 2 tube

* TE : cân bằng pH và bảo quản DNA

- Sau khi tách chiết được DNA của hai loại bắp, ta tiến hành thực hiện điện di

3.3.3 PCR

- Nguyên lý hoạt động: việc tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự

đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn

Bước 1: Biến tính tách đôi sợi DNA: Được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng

chảy của phân tử (94 - 95°C) trong vòng 30 - 60 giây Lúc này, phân tử DNA mạch kép sẽ được tách thành hai mạch đơn (đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới)

Bước 2: Bắt cặp mồi: Được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn so với nhiệt độ nóng chảy (Tm)

của các Primer, nhiệt độ dao động trong khoảng 55 - 65°C Thời gian bắt cặp kéo dài từ

30 - 60 giây tùy vào Tm của các primer

Bước 3: Kéo dài: Được thức hiện ở nhiệt độ 72°C giúp cho DNA polymerase có môi

trường hoạt động tốt nhất Lúc này, dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide

sẽ lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại

3.3.4 Điện di phát hiện mẫu GMO

- Thực hiện điện di lần 2 để phát hiện xem độ khuếch đại của mẫu bắp thường có trùng với độ khuếnh đại của GMO hay không (dựa vào promoter 35S) Vì chúng ta không biết bắp thường có GMO hay không Việc mẫu có band sáng có cùng độ khuếch đại với promoter 35S là dương tính (mẫu bắp GMO) Ngoài ra, việc điện di lần 2, đối với mẫu từ cây bắp GMO, giúp ta quan sát được ngoài promoter 35S còn có các promoter khác

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

- Mẫu non-GMO cho kết quả rõ ràng có DNA được li trích ra

- Mẫu GMO cho kết quả mờ hơn , không có band rõ ràng như mẫu non-GMO

4.2.2 Xác định mẫu ngô GMO

- Ở mẫu ngô non-GMO do không có sự bắt cặp với primers do không có chứa gene mục tiêu nên không tạo thành sản phẩm PCR sau PCR nên không phát hiện được qua điện di

- Ở mẫu ngô GMO có phát hiện được sản phẩm PCR tạo thành, có thể kết luận là mẫu ngô có chuyển gene tuy nhiên chưa xác định được gene được chuyển là gene nào