Bài giảng di truyền thực vật nhóm 8 một số kỹ thuật phổ biến trong công nghệ di truyền

MỘT SỐ KỸ THUẬT PHỔ BIẾN TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN Thành viên nhóm 1) Lê Cơng Phúc 2) Trần Văn Phong 3) Nguyễn Thiện Phước 4) Nguyễn Thị Thùy Phương Giảng Viên TS Nguyễn Phương Giới Thiệu Với phát triển mạnh mẽ nghành khoa học khác vật lý học, tốn học, hóa học, di truyền học khám phá nhiều quy luật tồn lưu truyền sống trở thành mũi nhọn nghiên cứu sinh học Những thành tựu rực rỡ di truyền học đem lại nhận thức cấu tạo vận hành máy di truyền thể sống Cùng với phát triển mạnh mẽ di truyền học, lĩnh vực nghiên cứu di truyền học đời, kỹ thuật di truyền hay cịn gọi cơng nghệ gen cơng nghệ di truyền Và hai kỹ thuật phổ biến công nghệ di truyền tạo vecto chuyển gen kỹ thuật nhân đoạn DNA_PCR 1.Tạo vecto chuyển gen Khái niệm vector chuyển gen: Vector phân tử DNA nhỏ (ngắn) dạng thẳng dạng vịng, đó, người ta cài mảnh DNA (gen quí) cần nghiên cứu Những mảnh DNA cài gọi đoạn cài (insert) DNA ngoại lai DNA lạ Các phân tử DNA nhỏ thường thực khuẩn thể plasmid mà gen chúng có tín hiệu cần thiết cho chúng tái bản, chúng lại tái (sinh sôi nẩy nở) Chúng cần đưa vào tế bào chủ (ví dụ tế bào vi khuẩn chẳng hạn) 1 Công nghệ tạo thực vật chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium) A.tumefaciens loại vi khuẩn gây bệnh khối u thực vật sống đất, lĩnh vực biến nạp gen sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo thực vật mang gen có đặc tính mong muốn Bản chất tự nhiên vi khuẩn A.tumefaciens xâm nhập vào chỗ vết thương, kích thích hình thành chất độc có chất phenolic, chất có tác dụng làm lành vết thương, vừa kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, lại có vai trị chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho cắt đoạn T-DNA (tại vùng bờ trái bờ phải) để gắn vào genom thực vật Ti-plasmid chuyển đoạn DNA Ti-plasmid nhập vào gen • Để khai thác sử dụng Agrobacterium vector chuyển gen, nhà khoa học loại bỏ gen gây khối u gen mã hóa opine T_DNA thay vào marker chọn lọc, trì vùng bờ phải bờ trái T_DNA với gen vir, Gen chuyển xen vào vùng bờ T_DNA, chuyển vào tế bào trở nên hợp với NST tế bào Tuy nhiên vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu biến nạp loại mô biến nạp, giai đoạn phát triển mô, mức độ khởi đầu vi khuẩn Agrobacterium sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau biến nạp, marker sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng kiểu gen thực vật Chọn lọc mô, tế bào biến nạp thành công Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành biến nạp hồn chỉnh Sau đó, từ chuyển gen thu được, cần đánh giá ổn định di truyền qua hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính để thu mang gen mong muốn Đồng thời đánh giá tác động môi trường chuyển gen để đưa sản xuất cung cấp cho thị trường 1.2 Một số ứng dụng vector chuyển gen - Một ứng dụng để tiến hành trình gọi tách dòng nhằm khuếch đại lượng lớn DNA xác định - Nghiên cứu biểu đoạn DNA chưa biết - Đưa gen mà người cần nghiên cứu vào tế bào chủ - Sản xuất protein từ gen tạo dòng - Sản xuất RNA với khối lượng lớn từ DNA tạo dòng Kỹ thuật nhân đoạn DNA_PCR 2.1 Định nghĩa Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) Là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà không qua tạo dịng Phương pháp PCR thực hồn tồn eppendoff thời gian ngắn ta thu nhận nhiều DNA Kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính phơi, giải mã di truyền, tạo giống với đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hoá sinh vật mức độ phân tử,… 2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 2.2.1 DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy DNA thật tinh Nhiều kỹ thuật chẩn đoán PCR đạt kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng có xu hướng giảm (1µg xuống cịn 100ng) với việc sử dụng DNA polymerase có hiệu cao 2.2.2 Primer nhiệt độ lai Primer chìa khóa quan trọng cho thành cơng hay thất bại thí nghiệm PCR Nếu primer thiết kế cách xác thí nghiệm mang lại kết khuếch đại mảnh DNA đơn Kết luận: việc đề xuất phương pháp PCR tạo bước tiến mang tính cách mạng sinh học phân tử nói riêng sinh học nói chung nhờ việc cho phép phân lập, xác định gen, sâu nghiên cứu chức biển gen trình phát triển phản ứng gen điều kiện mơi trường, cho phép tiến hành nghiên cứu mà trước không thực Kỹ thuật ứng dụng nhiều lĩnh vực sinh học phân tử cho kết cao ... máy di truyền thể sống Cùng với phát triển mạnh mẽ di truyền học, lĩnh vực nghiên cứu di truyền học đời, kỹ thuật di truyền hay cịn gọi cơng nghệ gen công nghệ di truyền Và hai kỹ thuật phổ biến. .. sử dụng kiểu gen thực vật Chọn lọc mô, tế bào biến nạp thành công Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành biến nạp hồn chỉnh Sau đó, từ chuyển gen thu được, cần đánh giá ổn định di truyền qua hệ, sử... thực vật chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium) A.tumefaciens loại vi khuẩn gây bệnh khối u thực vật sống đất, lĩnh vực biến nạp gen sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển gen ngoại lai vào thực vật