Kỹ Thuật Phổ Biến Trong Công Nghệ Di Truyền

Kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật tái tổ hợp ADN ( Recombinant DNA technology) là một hệ thống kỹ thuật nhằm kết hợp một gen hay vài gen của loài này vào gen của loài khác và chuyển ADN tái tổ hợp đến một nơi nó sẽ được tái bản và biểu hiện.Khái niệm DNA tái tổ hợp: Là kỹ thuật thao tác và tổ hợp ADN từ hai nguồn khác nhau (thường là của hai loài khác nhau) Kỹ thuật tái tổ hợp ADN còn được gọi là kỹ thuật tạo dòng gen, gồm các bước

Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM

Thành viên nhóm

1 Trần Nguyễn Bảo Trân 15145079

2 Nguyễn Thị Tuyết Nhi 15145050

- Kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật tái tổ hợp ADN

( Recombinant DNA technology) là một hệ thống kỹ thuật nhằm kết hợp một gen hay vài gen của loài này vào gen của loài khác và chuyển ADN tái tổ hợp đến một nơi nó sẽ được tái bản và biểu hiện

- Sự ra đời được coi là vào năm 1972 - 1973, khi nhóm nghiên cứu của Berg, Boyer và Cohen ở Mỹ đã tạo nên phân tử ADN tái

tổ hợp invitro từ ba nguồn vật liệu di truyền khác nhau: nguyên

bộ gen của virus SV 40 gây ung thư ở khỉ, một phần bộ gen của phage trung hòa λ và các gen của operon lactose của vi khuẩn E coli.

- Năm 1973-1974 nhóm Cohen, Henlinski, Boyer lần đầu tiên đã nhận được các sản phẩm có hoạt tính từ ADN tái tổ hợp.

II Kỹ Thuật Tái Tổ Hợp DNA

Khái niệm DNA tái tổ hợp:

-Là kỹ thuật thao tác và tổ hợp ADN từ hai nguồn khác nhau (thường là của hai loài khác nhau)

-Kỹ thuật tái tổ hợp ADN còn được gọi là kỹ thuật tạo dòng gen, gồm các bước:

- Tạo ADN tái tổ hợp:

+ Tách chiết thể truyền và gen cần chuyển ra khỏi tế bào

+ Xử lí bằng một loại enzim giới hạn (restrictaza) để tạo ra cùng 1 loại đầu dính

+ Dùng enzim nối để gắn chúng tạo ADN tái tổ hợp

+ Dùng muối CaCl 2 hoặc xung điện cao áp làm dãn màng sinh chất của

tế bào để ADN tái tổ hợp dễ dàng đi qua màng

-Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận:

- Phân lập dòng tế bào chứa ADN tái tổ hợp:

+ Để nhận biết được các tế bào vi khuẩn nào nhận được AND tái

tổ hợp thì các nhà khoa học thường sửa dụng thể truyền là các gen đánh dấu chuẩn hoặc các gen đánh dáu nhờ đó ta có thể dễ dàng nhận biết được sự có mặt của các AND tái tổ hợp trong tế bào các gen đánh dấu chuẩn có thể là các gen kháng kháng sinh

+ Bằng các kỹ thuật nhất định nhận biết được sản phẩm đánh dấu + Phân lập dòng tế bào chứa gen đánh dấu.

Enzyme cắt giới hạn (enzymes restriction

là enzyme cắt giới hạn.

Tính chất của enzyme cắt giới hạn:

- Các enzyme giới hạn chỉ cắt DNA lạ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn mà không cắt DNA của mình

- Mỗi một enzyme giới hạn đặc hiệu với một đoạn trật

tự cụ thể - trật tự cắt ( điểm nhận biết), vì thế số điểm cắt trên một phần tử DNA đem xử lý phụ thuộc vào số trật tự cắt có trên phần tử DNA đó

Theo phương thức cắt ADN, các enzyme giới hạn được chi thành 2 nhóm:

- Nhóm 1: gồm các enzyme có khả năng nhận biết một đoạn trình tự đặc biệt về các cặp nucleotide (điểm nhận biết) và sau đó cắt ADN ở vị trí không đặc hiệu cách xa điển nhận biết

- Nhóm 2: gồm các enzyme đặc hiệu là cắt ADN tại

điểm nhận biết đặc hiệu

Restriction Enzymes Action of EcoRI

E NGUỒN TRÌNH TỰ NHẬN BIẾT VÀ VỊ TRÍ CẮT

Alu I Athrobacter lutues 5’ - A G C T - 3’3’ - T C G A - 5’

Bal I Brevibaterium 5’ - T G G C C A - 3’3’ - A C C G G T - 5’

Bam H I amyloliquefaci Bacillus ens 5’ - G G A T C C - 3’

3’ - C C T A G G - 5’

Eco RI Escherichia coli 3’ - C T T A A G - 5’5’ - G A A T T C - 3’

Hae III Haemophylus aegypticus 5’ - G G C C - 3’3’ - C C G G - 5’

Hind III Haemophylus influenzae 3’ - T T C G A A - 5’5’ - A A G C T T - 3’

Sau 3A Staphylococcus aureus 5’ - G A T C - 3’3’ - C T A G - 5’

Taq I Thermus aquaticus 3’ - A G C T - 5’5’ - T C G A - 3’

Một số enzyme giới hạn và trật tự cắt của chúng

- Cắt theo hình ziczac tạo đầu lệch gọi là đầu cố kết hay đầu dính (cohesive ends) vì các gốc bổ sung dễ bắt cặp với nhau để gắn lại Nếu hai ADN khác nhau được cắt bởi một enzyme tạo các đầu cố kết giống nhau, chúng dễ dàng nối với nhau tạo ADN tái tổ hợp Tính chất quan trọng này

được dùng để cắt và ghép gen

- Cắt thẳng tạo các dấu đứt tù, các đoạn ADN cắt có đầu

tù cần bổ sung thêm đoạn nối khi gắn nó với đoạn ADN khác

Enzyme giới hạn ở ADN cắt theo 2 cách:

- Thuật ngữ RELF (Restriction frament length

polymorphism) được hiểu là sự đa hình của các đoạn DNA bị cắt bởi restriction endonuclease

- Mỗi loại DNA của các sinh vật sẽ có những điểm nhận biết đặc hiệu đối với một loại restriction

endonuelease phân bố đặc trưng dọc theo chiều dài của phân tử Đặc điểm này được sử dụng để lập bản đồ

restriction (restriction map)

 Nguyên tắc lập bản đồ Restriction:

-Restriction enzym A cắt DNA thành

4 đoạn ở những điểm đặc trưng,

enzym B cũng đoạn DNA đó nhưng

ở 3 điểm đặc trưng khác Trình tự

các điểm cắt đặc trưng của cả 2

enzym phản ánh các đoạn DNA có

chiều dài khác nhau được cắt khác

nhau.→ các đoạn cắt được thực

hiện nhờ sử dụng điện di trên gel.

- So sánh 2 bản điện di riêng rẽ do phân

cắt bởi enzym A và B với các đoạn

DNA mẫu chuẩn → xác định độ

dài các đoạn bị cắt do enzym A và

B

Khi enzym restriction endonuclease cắt một mẫu DNA nào đó sẽ xuất hiện 1 sự

đa hình các đoạn DNA với độ dài khác nhau biểu hiện thành những vệt (band) đặc trưng trên gên điện di gọi là RELF

III Phản Ứng Chuỗi Trùng Hợp (PRC):

là một phương tiện cực kỳ nhạy để khuếch

đại một lượng tương đối lớn ADN

1985 (đến năm 1993 nhận giải thưởng

Nobel)

phát hiện ra enzyme Taq polymerase, một

loại ADN polymerase có trong vi khuẩn

Thermus aquaticus ở vùng suối nước nóng

Kary Mullis

Thermocycler

1 Sự tiến hành phản ứng chuỗi trùng hợp

- Sợi DNA kép ban đầu tách ra thành hai mạch đơn

- Các đoạn mồi tới bám vào đầu của đoạn nhân

Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt xúc tác tổng hợp hai sợi DNA mới

Sơ đồ phản ứng PCR nhiều chu kỳ

Phản ứng có thể diễn ra 30-60 chu kỳ Số lượng DNA nhân ( khuếch

đại) có thể tính theo công thức 2n -2

Sự tiến hành phản ứng chuỗi trùng hợp

2.Ưu và nhược điểm của phương pháp

PCRƯu điểm:

- Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm.

- Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực hiện trong ống

nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời)

- Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết).

Nhược điểm:

- Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại

- Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần) Sai sót còn do sử dụng E- Taq-polymerase khoảng 10  4  (sai sót cho một lần sao chép).

IV Ứng Dụng

Công nghệ sinh học (Biotechnology) sử dụng các tế bào sống

để tạo ra các nguyên liệu hữu dụng cho con người

 Nấm men được dùng sản xuất bia, rượu vang; vi khuẩn

được dùng sản xuất cheese, yogurt, v.v

 Các vi khuẩn được dùng sản xuất các chất kháng sinh, rượu

và một số sản phẩm khác

 Nhiều loại dược phẩm đã được tạo ra nhờ kỹ thuật tái tổ hợp ADN

Ví dụ:

TPA (tissue plasminogen

activator) đang được sản xuất từ

vi khuẩn E coli nhờ kỹ thuật tái

Gạo vàng giàu vitamin A  (beta-carotene)

 Cà chua giàu chất chống ôxi hóa

Những loại cây biến đổi gene 

Lúa chịu hạn và lụt Ngô chuyển gen giàu dưỡng chất

Giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng do virus

Ứng dụng của phản ứng trùng hợp

Ứng dụng trong y học

1 Phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây bệnh

2 Chẩn đoán và nghiên cứu các bệnh lí di truyền

3 Chẩn đoán và nghiên cứu một số bệnh ung thư

4 Pháp y, quan hệ huyết thống…

Ứng dụng dược học

1 Sản xuất thuốc

2 Sản xuất vaccin …

Cám ơn Thầy và các bạn đã lắng

nghe