ppxnsh chiều thứ 2 nhóm 3

Phương pháp nghiên cứu Phản ứng nhận diện các liên kết peptide; biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu; biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng; định lượng Albumin trên thi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM

SINH HÓA

Hướng dẫn khoa học:

TS TRỊNH THỊ PHI LY

ThS NGUYỄN THỊ VÂN ANH

Nhóm sinh viên thực hiện:

VĂN HOA XUÂN - 22126226 NGUYỄN THỊ MỸ NGỌC – 21126425 TRẦN HÀ CHI – 21126290

DIỆP HOÀNG QUÂN - 21126478

TP.Thủ Đức, 07/2024

MỤC LỤC

BÀI 1 CHUẨN ĐOÁN PROTEIN VÀ ĐỊNH LƯỢNG ALBUMIN 6

1.1 Đặt vấn đề 6

1.2 Phương pháp nghiên cứu 6

1.3 Thực hiện phản ứng 6

1.3.1 Phản ứng nhận diện liên kết peptide 6

1.3.2 Biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu 7

1.3.3 Biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng 9

1.3.4 Định lượng Albumin trên thiết bị sinh hóa bán tự động 10

BÀI 2 CHẨN ĐOÁN GLUCOSE VÀ ỨNG DỤNG 12

2.1 Đặt vấn đề 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3 Thực hiện phản ứng 12

2.3.1 Phản ứng định tính glucose 12

2.3.2 Định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động 14

BÀI 3 CHUYỂN HÓA LIPID 16

3.1 Đặt vấn đề 16

3.1.1 Khảo sát tính hòa tan của lipid 16

3.1.2 Sự hình thành nhũ tương 16

3.1.3 Xác định chỉ số acid và hàm lượng acid béo tự do 16

3.1.4 Định lượng Cholesterol toàn phần trên thiết bị sinh hóa bán tự động 17

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3 Thực hiện phản ứng 17

3.3.1 Khảo sát tính hòa tan của lipid 17

3.3.2 Sự hình thành nhũ tương 18

3.3.3 Xác định chỉ số acid và hàm lượng acid béo tự do 19

3.3.4 Định lượng Cholesterol toàn phần trên thiết bị sinh hóa bán tự động 21

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Kết quả của phản ứng (ống bên phải) và đối chứng (ống bên trái) 7 Hình 1.2 Kết quả 5 ống nghiệm sau khi được đun nóng 8 Hình 1.3 Kết quả của phản ứng sau khi lắc (ống bên trái) và đối chứng (ống bên phải) 10 Hình 1.4 3 lọ dung dịch được chuẩn bị trước khi đo lần lượt là mẫu chuẩn (1) và mẫu nước tiểu (2), (3) 11 Hình 2.1 Kết quả 1 thu được với thuốc thử Benedict 14 Hình 2.2 Kết quả thu được với thuốc thử Fehling 14 Hình 2.3 Sau khi cho hóa chất vào và lắc đều (a) Ống chứa chất chuẩn, (b) Ống chứa mẫu C, (c) Ống chứa mẫu E 15 Hình 2.4 Kết quả thu được bằng thiết bị sinh hóa bán tự động 15 Hình 3.1 Tính tan của dầu ăn với dung môi Nước cất (ống 1), Dietyl ete (ống 2), Ethanol (ống 3), Chloroform (ống 4) 18 Hình 3.2 Sự hình thành nhũ tương của lipid Nước cất (ống 1), Na2CO3 10 % (ống 2), NaOH 2 % (ống 3) 19 Hình 3.3 Kết quả thí nghiệm 20 Hình 3.4 Kết quả thu được bằng thiết bị sinh hóa bán tự động 21

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Quy trình thực hiện ở thí nghiệm 1 17 Bảng 3.2 Giải thích hiện tượng ở 4 ống nghiệm khác nhau 18 Bảng 3.3 Quy trình thực hiện ở thí nghiệm 2 19

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

BÀI 1 CHUẨN ĐOÁN PROTEIN VÀ ĐỊNH LƯỢNG

ALBUMIN

1.1 Đặt vấn đề

Protein ảnh hưởng trực tiếp đến các hoạt động sinh lý bình thường Protein chiếm khoảng 15% trọng lượng cơ thể người bình thường, nó được tìm thấy ở rất nhiều nơi trên cơ thể: tóc, xương, da, cơ… Muốn duy trì sự sống của enzyme thì đây là một yếu

tố không thể thiếu Mặt khác, hầu hết hormone trong cơ thể đều là protein, giữ nhiệm

vụ điều hòa quá trình trao đổi chất trong tế bào để cơ thể có được sự hấp thụ và phát triển tốt nhất Cuối cùng, đây còn là chất dinh dưỡng đa lượng cung cấp nguồn năng lượng cho cơ thể

Máu gồm có 3 thành phần protein chính: albumin, globulin và fibrinogen (ảnh hưởng đến việc đông máu)

Nồng độ protein trong máu thay đổi hoặc xuất hiện protein trong nước tiểu biểu hiện dấu hiệu bất thường về sức khỏe

Protein trong máu: 60 - 80 g/L, trong đó albumin từ 38 - 54 g/L và globulin từ 26

- 42 g/L Protein trong máu có thể tăng hoặc giảm do: viêm tụy cấp, viêm tủy xương, loét dạ dày tá tràng, đái tháo đường, hội chứng thận hư, viêm cầu thận mạn

Protein nước tiểu: bình thường trong nước tiểu sẽ không có protein hoặc có một lượng rất nhỏ dưới dưới 150 mg/24 giờ Nếu protein xuất hiện trong nước tiểu: Nhiễm trùng đường tiết niệu, các bệnh lý suy giảm chức năng thận, mang thai

1.2 Phương pháp nghiên cứu

Phản ứng nhận diện các liên kết peptide; biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu; biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng; định lượng Albumin trên thiết bị sinh hóa bán tự động

1.3 Thực hiện phản ứng

1.3.1 Phản ứng nhận diện liên kết peptide

Mục đích: nhận diện nhanh sự có mặt protein trong máu hoặc nước tiểu

Vật liệu:

- Lòng trắng trứng

- NaOH 40%  Pha 20ml dung dịch NaOH 40% với 8g NaOH

- CuSO4 1%  Pha 20ml dung dịch CuSO4 1% với 0.2g CuSO4

Các bước thực hiện:

Bước 1: Cho 1mL lòng trắng trứng vào ống nghiệm

Bước 2: Sau đó cho 10 giọt NaOH 40% vào ống nghiệm trên

Bước 3: Thêm 10 giọt CuSO4 1% Lắc đều và quan sát màu

Kết quả và biện luận:

Có sự hiện diện của các liên kết peptit trong lòng trắng trứng vì có sự hình thành phức chất giữa ion Cu2+ và cấu trúc peptit Trong phản ứng, Cu2+ sẽ liên kết với nhóm amine (-NH2-) và nhóm peptit (-CO-NH-) của cấu trúc peptit tạo phức màu tím quan sát thấy

ở Hình 1.1

1.3.2 Biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu

Mục đích: khảo sát tính chất của protein

Vật liệu:

- Lòng trắng trứng

- CH3COOH 1%  Pha 20ml CH3COOH 1% với 0,2g CH3COOH

- CH3COOH 10%  Pha 20ml CH3COOH 10% với 2g CH3COOH

Hình 1.1 Kết quả của phản ứng (ống bên phải) và đối chứng (ống bên trái)

- NaOH 10% Pha 20ml NaOH 10% với 2g NaOH

- NaCl bão hòa  Pha 20ml NaCl bằng cách hòa tan NaCl cho tới khi muối NaCl trong cốc không tan được nữa

Các bước thực hiện:

Cho 1mL lòng trắng trứng vào 5 ống nghiệm, sau đó cho các hóa chất lần lượt như sau:

- Ống 1: Không cho thêm gì cả

- Ống 2: Thêm 2 giọt CH3COOH 1%

- Ống 3: Thêm 5 giọt CH3COOH 10%

- Ống 4: Thêm 5 giọt CH3COOH 10% và 2 giọt dung dịch NaCl bão hòa

- Ống 5: Thêm 2 giọt NaOH 10%

 Đun cách thủy 1 phút, quan sát và mô tả hiện tượng

- Ống nghiệm 2: Có hiện tượng tách nước, kết tủa không mịn bằng ống 1

- Ống nghiệm 3: Kết tủa màu trắng sữa, có khí bên trong

- Ống nghiệm 4: Kết tủa màu trắng sữa, kết cấu xốp, tách nước và bay hơi khi đun

Hình 1.2 Kết quả 5 ống nghiệm sau khi được đun nóng

1 2 3 4 5

- Ống nghiệm 5: Còn màu vàng tự nhiên của lòng trắng trứng trước khi đun nhưng

có hiện tượng keo lại và có bọt khí, tồn tại ở trạng thái bán lỏng

Biện luận:

- Ống nghiệm 1: kết tủa vì protein bị biến đổi cấu trúc dưới tác động của nhiệt, mạch protein bị giãn nở các liên kết thứ cấp bị phá vỡ, từ đó protein bị vón cục không theo quy luật nào, tạo kết tủa

- Ống nghiệm 2: có kết tủa trắng đục vì khi cho CH3COOH 1% sẽ tạo nên môi trường axit yếu, ức chế sự phân ly của nhóm -COO- trong protein, làm mất điện tích của tiểu phân tử protein và dẫn đến sự kết tụ khi pH gần điểm đẳng điện

- Ống nghiệm 3: khi cho CH3COOH 10% sẽ tạo môi trường axit mạnh Do có tính háo nước của axit và môi trường axit mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước, các nhóm -COO- được trung hòa và nhóm NH3+ không được trung hòa Phân tử protein vẫn còn tích điện dương, do đó có bọt khí

- Ống nghiệm 4: khi cho CH3COOH 10% sẽ tạo môi trường axit mạnh Do có tính háo nước của axit và môi trường axit mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước Các nhóm -COO- được trung hòa và nhóm NH3+ không được trung hòa, phân tử protein vẫn còn tích điện dương Sau đó cho 10 giọt NaCl bão hòa sẽ gây trung hòa về diện nên tạo kết tủa

- Ống nghiệm 5: khi cho NaOH 10% sẽ gây ra môi trường kiềm Nhóm NH3+ được trung hòa Vì vậy khi đun sôi điện từ âm của phân tử protein vẫn còn, protein tích điện âm không tạo tủa

1.3.3 Biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng

Mục đích, ứng dụng:

- Khả năng hòa tan  Sản xuất thực phẩm lỏng, đồ uống

- Tính chất điện ly/ kết muối: tách riêng các loại protein khác nhau

- Biểu hiện quang học: tinh sạch và xác định protein

- Biến tính protein: bảo quản chế phẩm

- Kết tủa thuận nghịch và không thuận nghịch: thu nhận chế phẩm protein

- Sự hấp thụ và giữ nước/ tạo nhũ/ tạo bọt/ cố định mùi  sản xuất thực phẩm Vật liệu: lòng trắng trứng, HNO3 đậm đặc

Các bước thực hiện:

- Bước 1: Cho vào ống nghiệm 2mL lòng trắng trứng

- Bước 2: Thêm 1mL HNO3 đậm đặc

→ Lắc đều và quan sát màu

Kết quả:

Biện luận: Khi cho axit mạnh vào, axit này có tính háo nước, sẽ lấy nước của protein trong lòng trắng trứng làm cho protein bị biến tính, protein bị khử nước và trung hòa điện tích gây kết tủa

1.3.4 Định lượng Albumin trên thiết bị sinh hóa bán tự động

Mục đích: Định lượng Albumin là một trong những xét nghiệm quan trọng trong các xét nghiệm sinh hóa khi kiểm tra sức khỏe, có tác dụng chuẩn đoán, theo dõi bệnh lý

- Dải tuyến tính: 0.000 ~ 3.000 Abs

- Độ chính xác quang học: ± 2% từ 0-1,5 Abs, ± 3% từ 1.5 đến 3.0 Abs

- Đo quang học: Diode phát quang

Chuẩn bị 3 lọ thủy tinh:

- Lọ 1: 10µL chất chuẩn + 1 µL thuốc thử Albumin

- Lọ 2 và 3: 10 µL mẫu nước tiểu + 1 µL thuốc thử Albumin

Kết quả: Nồng độ Albumin có trong mẫu nước tiểu sau 2 lần đo lần lượt là 1,188 g/dl

và 1.154 g/dl được ghi nhận ở Hình 1.5

Biện luận: Nồng độ Albumin của người trưởng thành bình thường dao động từ 3,5 – 5,0 g/dl Có thể do quá trình lấy mẫu và pha mẫu mang đi đo có xảy ra sai lệch nên nồng

độ Albumin do được trong mẫu nước tiểu thấp hơn

Nồng độ Albumin giảm: Do bệnh ở gan (nghiện rượu, viêm gan, xơ gan), đái tháo đường, bệnh thận, sốc, suy dinh dưỡng, viêm, đặc biệt là sau phẫu thuật Các tình trạng sức khỏe như bị bỏng, bệnh về đường ruột gây mất protein, bệnh đường tiết niệu, ung thư hạch bạch huyết Hodgkin, nhược giáp, suy tim, đa u tủy xương, bệnh rối loạn tự miễn như lupus ban đỏ hoặc viêm khớp dạng thấp cũng có thể làm giảm nồng độ Albumin trong máu, kể cả khi bệnh nhân ăn uống đầy đủ chất đạm

1 2 3

Hình 1.4 3 lọ dung dịch được chuẩn

bị trước khi đo lần lượt là mẫu chuẩn (1) và mẫu nước tiểu (2), (3)

BÀI 2 CHẨN ĐOÁN GLUCOSE VÀ ỨNG DỤNG

2.1 Đặt vấn đề

Glucose là một monosaccharide có trong thực phẩm và có khả năng chuyển hóa thành năng lượng trong cơ thể Các loại thực phẩm giàu carbohydrate như bánh mì, khoai tây và trái cây được phân hủy trong hệ tiêu hóa thành glucose và các monosaccharide khác, di chuyển đến ruột và hấp thụ vào trong máu

Khi vào trong máu, đi đến các tế bào, glucose được gọi là đường huyết Cơ thể có chức năng duy trì lượng đường huyết luôn ổn định Hầu hết các tế bào sử dụng glucose cùng với các acid amin và chất béo để cung cấp năng lượng cho cơ thể Sau khi cơ thể

đã sử dụng đủ năng lượng, lượng glucose còn lại sẽ được insullin tuyến tụy chuyển hoá thành glycogen dự trữ trong gan hoặc được chuyển hóa thành acid béo ở các mô mỡ Glucose ảnh hưởng trực tiếp đến các hoạt động sinh lý của cơ thể Nồng độ glucose trong máu thay đổi hoặc xuất hiện glucose trong nước tiểu cho thấy dấu hiệu bất thường

về sức khỏe Nồng độ glucose bình thường trong máu: 3,9 – 5,5 mmol/l Tăng hoặc giảm nồng độ glucose trong máu do: tiểu đường, stress, nhiễm độc, suy gan, dùng insullin quá liều,…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phản ứng định tính glucose bằng thuốc thử Benedict và thuốc thử Fehling, định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động bằng phương pháp GOD – POD 2.3 Thực hiện phản ứng

 Cân 5 g Na2CO3 và 8,65 g Natri citrate dihydrate, sau đó khuấy tan trong 42,5

ml nước cất Cân 0,865 g CuSO4 và khuấy tan trong 5 ml nước cất

 Cho hỗn hợp đã khuấy ở trên vào bình định mức 50 ml

- Thuốc thử Fehling:

 Cân 1 g CuSO4.5H2O và khuấy tan trong 25 ml nước cất

 Cân 5 g Kali natri tartrate và 3,75 g NaOH, khuấy tan trong 25 ml nước cất

 Trộn 2 hỗn hợp đã khuấy ở trên với nhau

Các bước thực hiện với thuốc thử Benedict:

Bước 1: Hút 0,2 ml mẫu vào năm ống nghiệm và đánh dấu thứ tự

Bước 2: Hút 2 ml thuốc thử Benedict cho vào mỗi ống nghiệm Lắc đều các ống nghiệm Bước 3: Đun cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút Quan sát màu

Các bước thực hiện với thuốc thử Fehling:

Bước 1: Hút 0,2 ml mẫu vào năm ống nghiệm và đánh dấu thứ tự

Bước 2: Hút 2 ml thuốc thử Fehling cho vào mỗi ống nghiệm Lắc đều các ống nghiệm Bước 3: Đun cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút Quan sát màu

Kết quả và biện luận

Kết quả 1 với thuốc thử Benedict

- Ống nghiệm 1: Không có hiện tượng Kết quả cho thấy trong ống nghiệm A không có glucose

- Ống nghiệm 2: Xuất hiện kết tủa đỏ gạch Kết quả cho thấy trong ống nghiệm

B có glucose nhưng nồng độ không cao

- Ống nghiệm 3: Xuất hiện kết tủa đỏ gạch Kết quả cho thấy trong ống nghiệm

C có glucose nhưng nồng độ không cao, khá tương đồng với ống nghiệm B

- Ống nghiệm 5: Dung dịch mất màu, xuất hiện kết tủa đỏ gạch nhiều hơn Kết quả cho thấy nồng độ glucose trong ống nghiệm D cao hơn các ống khác nên

đã tạo kết tủa hoàn toàn Cu2+ trong thuốc thử làm cho dung dịch mất màu

- Ống nghiệm 6: Xuất hiện kết tủa đỏ gạch Kết quả cho thấy nồng độ glucose trong ống nghiệm E thấp hơn các ống C và B nên tạo kết tủa ít hơn

Kết quả 2 với thuốc thử Fehling

- Ống nghiệm 1: Không có hiện tượng Kết quả cho thấy trong ống nghiệm A không có glucose

- Ống nghiệm 2: Xuất hiện kết tủa đỏ gạch Kết quả cho thấy trong ống nghiệm

B có glucose nhưng nồng độ không cao

- Ống nghiệm 3: Xuất hiện kết tủa đỏ gạch Kết quả cho thấy trong ống nghiệm

C có glucose nhưng nồng độ không cao

- Ống nghiệm 4: Dung dịch mất màu, xuất hiện kết tủa đỏ gạch nhiều hơn Kết quả cho thấy nồng độ glucose trong ống nghiệm D cao hơn các ống khác nên đã tạo kết tủa hoàn toàn Cu2+ trong thuốc thử làm cho dung dịch mất màu

- Ống nghiệm 5: Xuất hiện kết tủa đỏ gạch Kết quả cho thấy ống nghiệm E có glucose nhưng nồng độ không cao, khá tương đồng với ống nghiệm C

2.3.2 Định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động

Mục đích: Xác định nồng độ glucose trong mẫu

- Hút 1 ml thuốc thử vào ba ống nghiệm và đánh dấu thứ tự

Hình 2.1 Kết quả 1 thu được với thuốc thử Benedict

Hình 2.2 Kết quả thu được với thuốc thử Fehling

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

- Hút 10 µl chất chuẩn glucose vào ống nghiệm thứ nhất

- Hút 10 µl mẫu cho vào các ống còn lại Lắc đều các ống nghiệm

Sau đó định lượng trên thiết bị sinh hóa bán tự động Ghi nhận kết quả

Kết quả: Hình 2.4 cho kết quả nồng độ glucose đo được trong mẫu C là 218,4 mg/dl, trong mẫu E là 242,6 mg/dl

Hình 2.4 Kết quả thu được bằng thiết

bị sinh hóa bán tự động

Hình 2.3 Sau khi cho hóa chất vào và lắc đều (a) Ống chứa chất chuẩn, (b) Ống chứa mẫu C, (c) Ống chứa mẫu E

BÀI 3 CHUYỂN HÓA LIPID

3.1 Đặt vấn đề

3.1.1 Khảo sát tính hòa tan của lipid

Lipid có một tên gọi quen thuộc khác là chất béo Nó là triester của glycerol với các axit monocarboxylic có chuỗi cacbon không phân nhánh được gọi chung là triglyceride hoặc triacylglycerol Nếu thiếu nó cơ thể của chúng ta sẽ không thể hoạt động bình thường và thậm chí có thể tử vong

Lipid có thể được coi là các chất hữu cơ tương đối không hòa tan trong nước, hòa tan trong dung môi hữu cơ (rượu, ether, v.v.) thực sự hoặc có khả năng liên quan đến axit béo và được sử dụng bởi các tế bào sống Lipit hầu như xuất hiện ở tất cả các loại thực phẩm dù là thực vật hay động vật với hàm lượng nhiều ít khác nhau Chất béo mà

ta dễ nhận biết nhất ở động vật là mỡ, còn đối với thực vật là dầu

Các phân tử nước chỉ tạo thành các lực liên kết hiđrô trong khi các phân tử lipid (mỡ) chỉ tạo thành các lực Van der Waals Chất nhũ hóa như xà phòng có thể liên kết các chất lỏng này

3.1.3 Xác định chỉ số acid và hàm lượng acid béo tự do

Acid béo tự do (FFA) thuộc nhóm acid béo trong acylglycerol Cấu trúc của chúng bao gồm một chuỗi hydrocarbon với một nhóm carboxyl Chuỗi hydrocacbon còn có thể chứa nhiều liên kết đôi và được phân nhánh hoặc tuyến tính và có thể có các nhóm thế chứa oxy, chẳng hạn như các nhóm hydroxyl Các acid béo tự do không bị ràng buộc với các thành phần lipid khác như phospholipid hoặc glycerolipids Căn cứ vào số lượng nối đôi trong phân tử, axit béo được chia thành axit béo bão hòa và không bão hòa

Độ acid béo tự do là một chỉ tiêu chất lượng quan trọng đối với dầu Giá trị này được sử dụng để theo dõi thời hạn sử dụng của dầu Nếu acid béo tự do trong dầu cao,