BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ-BÁN CÔNG TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ VI KHUẨN CÓ TRÊN CÁ VÀ TRONG AO NUÔI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA
TOÅNG QUAN
Khái quát về bệnh trên cá
1 1 Những nguyên nhân làm cho cá bệnh
Cá và môi trường sống là một thể thống nhất, khi chúng mắc bệnh là kết quả tác động qua lại giữa cơ thể và môi trường sống Hay nói cách khác cá bệnh là sự phản ứng của cơ thể với sự biến đổi của các yếu tố ngoại cảnh, cơ thể thích nghi thì tồn tại nếu chúng không thích nghi sẽ bị bệnh và chết
Khi cá mắc bệnh phải có 3 yếu tố:
Nhiệt độ nước quá cao hay quá thấp đều không thuận lợi cho đời sống của cá Sự thay đổi nhiệt độ đột ngột có thể làm cá bị sốc mà chết, thường nhiệt độ thích hợp để nuôi cá dao động khoảng: 25-32 o C
1.1.1.2 Độ pH của nước Độ pH của nước ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của động vật thủy sinh Tuy phạm vi thích ứng độ pH của cá tương đối rộng phần lớn thích ứng với độ pH từ 7-9 Nhưng nếu pH thấp dưới 5 hoặc cao quá 9,5 có thể làm cho cá yếu hoặc cheát
Cá sống trong nước nên hàm lượng oxy hoà tan trong nước rất cần thiết cho đời sống của cá Nhu cầu oxy phụ thuộc vào từng loài, từng giai đoạn phát triển, trạng thái sinh lý, nhiệt độ
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
Nhu cầu oxy hoà tan trong nước tối thiểu của cá là 3 mg/l, với cá nuôi bè (lồng) là 5 mg/l Trường hợp oxy hòa tan thấp hơn mức gây chết kéo dài làm cá bị sốc, ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ sống, tăng trưởng và phát dục của chúng
Trong nước, khí cacbonic (CO2) chủ yếu có nguồn gốc từ quá trình hô hấp của cá và phân hủy các hợp chất hữu cơ Nồng độ CO2 hòa tan tự do thông thường trong nước dao động từ 1,5 đến 5,0 mg/l Khi hàm lượng CO2 vượt quá 25 mg/l, nó có thể gây độc hại cho cá.
Amoniac (NH3) được tạo thành trong nước do các chất thải của các nhà máy hóa chất và sự phân giải các chất hữu cơ trong nước :
Sự tồn tại NH3 và NH4 + trong nước phụ thuộc vào độ pH và nhiệt độ của nước, NH3 rất độc với cá Nước càng chuyển sang NH4 + ít độc, môi trường càng kiềm NH3 càng bền vững và gây độc cho cá
Thường nồng độ NH3 trong các ao hồ nuôi cá thường nhỏ hơn 0,02 mg/l
Khí H2S được tạo ra từ nước thải chăn nuôi và quá trình phân hủy chất hữu cơ mục nát Mùi hôi thối đặc trưng của H2S gây sốc và làm suy yếu cá, cuối cùng dẫn đến tử vong.
Ngoài ra còn một số yếu tố môi trường khác làm ảnh hưởng đến đời sống phát triển của cá như khí clo, các kim loại nặng…
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
Mầm bệnh là các yếu tố hữu sinh làm cho cá mắc bệnh gọi chung là tác nhân gây bệnh Những tác nhân gây bệnh này do sự cảm nhiễm của cá là vật chủ hoặc sự xâm nhập của chúng vào vật chủ Các tác nhân gây bệnh được chia ra 3 nhớm
-Tác nhân gây bệnh truyền nhiễm: Virus, vi khuẩn, nấm
-Tác nhân gây bệnh ký sinh: Nguyên sinh động vật (động vật đơn bào), giun sán, đỉa, giáp xác… (động vật đa bào)
-Một số sinh vật trực tiếp ăn động vật thuỷ sinh hay uy hiếp đông vật thuỷ sinh: Côn trùng nước, rong tảo, cá dữ, rắn, ba ba, chim…
Các yếu tố ngoại cảnh (yếu tố vô sinh và hữu sinh) đều tác động trực tiếp lên cá Nhưng khả năng mắc bệnh phụ thuộc vào sức đề kháng của cơ thể với từng bệnh vật chủ thường biểu hiện bằng những phản ứng với môi trường thay đổi Những phản ứng của cơ thể có thể kéo dài 2-3 ngày hoặc 2-3 tuần tuỳ theo mức độ của bệnh
1.2 Mối quan hệ giữa các yếu tố gây bệnh cho cá
Cá mắc bệnh là kết quả tác dụng lẫn nhau giữa cơ thể, tác nhân gây bệnh và môi trường sống Khi hội đủ 3 yếu tố gây bệnh thì cá mới có thể mắc bệnh nếu thiếu một trong ba yếu tố thì cá khôâng bị mắc bệnh Tuy cá có mang mầm bệnh nhưng môi trường thuận lợi cho cá và bản thân cá có sức đề kháng với mầm bệnh thì bệnh không thể phát sinh được
Do đó khi xem xét nguyên nhân gây bệnh cho cá không nên kiểm tra một yếu tố đơn lẻ nào mà phải xem xét cả 3 yếu tố : môi trường, mầm bệnh, vật chủ Đồng thời khi đưa ra biện pháp phòng và trị bệnh cũng phải quan tâm đến ba
Để phòng bệnh cho cá hiệu quả, việc sử dụng hóa chất để tiêu diệt mầm bệnh được khuyến cáo thực hiện Các loại thuốc này sẽ ngăn chặn sự phát triển của bệnh, ngăn ngừa bệnh trở nên nghiêm trọng Bên cạnh đó, lựa chọn các giống cá có sức đề kháng cao với các loại bệnh thường gặp cũng là một biện pháp phòng ngừa hiệu quả.
1.3 Một số điểm chú ý trong việc nuôi, phòng và điều trị bệnh cho cá Đối với cá nuôi bè, bệnh thường xuất hiện vào mùa mưa nhưng vào mùa nắng do lưu tốc nước yếu làm cho cá thường bị thiếu oxy, nhiệt độ nước cao… nên dễ dẫn đến bệnh cho cá
Khi mua cá giống, nếu thấy trong đàn cá có một số con xuất hiện những bệnh lý như lở loét, tuột nhớt, vây đuôi bị đứt, bị gãy, trên thân có những chóm đỏ… thì phải loại bỏ những cá thể đó ngay vì chúng là nguồn lây lan bệnh tật cho những cá thể khác Trước khi thả cá vào ao hoặc bè cần phải làm “vệ sinh” cho cá như taém thuoác…
Vật liệu
1.1 Dụng cụ bắt và bảo quản cá
+Thùng giữ mẫu (ướp đá)
+Chai thuỷ tinh: chứa nước ao nuôi
1.2 Vật liệu trong phòng thí nghiệm
Dụng cụ lấy mẫu để phân lập
Dụng cụ nuối cấy, phân lập, định danh và dụng cụ pha chế môi trường
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
+Nước muối 9 ‰ (dùng pha loãng mẫu)
+ Thiosulfate Citrate Bilsalt Sucrose Agar (TCBS)
+ Brain Heart Infusion Broth (BHI)
+ Eozin Methyl Blue Agar (EMB)
+ Tryptose Sulfite Cycloseric Agar (TSC)
+ Các môi trường thử sinh hoá
Hoá chất nhuộm Gram Đĩa kháng sinh các loại
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
Nội dung và phương pháp thí nghiệm
Dùng chai thuỷ tinh đã được thanh trùng lấy nước tại ao nuôi cá Dùng chai trực tiếp lấy nước giữa ao ở cả 3 tầng nước (tầng mặt, tầng giữa, tầng đáy) trộn 3 tầng này lại thành 1 mẫu Mẫu sau khi lấy xong cần đem đi xét nghiệm ngay, nếu chưa thể xét nghiệm ngay được thì phải để chai vào tủ lạnh nhằm ức chế hoạt động vi sinh vật Kết quả càng chính xác khi thời gian từ lúc lấy mẫu đến lúc tiến hành xét nghiệm càng ngắn
Số mẫu tiến hành lấy 5 mẫu từ các ao hồ khác nhau của công ty
Cá được bắt lên bằng vợt hay lưới, từ các ao chọn những con cá nghi ngờ bệnh, có những triệu chứng khác thường, cho cá vào bao nylon sạch
Ghi vào phiếu lấy mẫu: ngày, giờ, địa điểm lấy mẫu đính kèm , Sau đó bảo quản mẫu trong thùng ướp đá Trong một vùng phải lấy từ nhiều ao, mẫu đem về phải tiến hành xét nghiệm ngay để đạt kết quả chính xác nhất Phương pháp lấy mẫu này dùng để lấy mẫu cá có biểu hiện bệnh và mẫu cá chưa biểu hiện bệnh Bên cạnh đó mẫu cá còn được lấy từ các con cá do các khách hàng nuôi cá ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu long gởi về công ty để xét nghiệm
Ngoài ra, một số mẫu cá được lấy từ cá mua tại chợ Hoàng Hoa Thám Trong tất cả các trường hợp, khi lấy mẫu cá, cần tiến hành quan sát tình trạng biểu hiện bên ngoài của cá trước khi mổ cá để làm thí nghiệm.
Số mẫu cá tại công ty: 25 mẫu cá basa
Số mẫu cá mua tại chợ Hoàng Hoa Thám: 25 mẫu cá rô
Số mẫu cá mua tại chợ Hoàng Hoa Thám: 25 mẫu cá trê
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
2.2.1 Phương pháp xét nghiệm mẫu nước Đối với mẫu nước, xét nghiệm những chỉ tiêu thông thường để đánh giá tình trạng vệ sinh của mẫu nước, các chỉ tiêu đó bao gồm những chỉ tiêu vi sinh và lý hoá
Các chỉ tiêu lý hoá gồm
Các chỉ tiêu vi sinh gồm
Phương pháp tiến hành như sau
Pha loãng mẫu xét nghiệm
Chuẩn bị 3 ống nghiệm có chứa dung dịch nước muối sinh lý 9 ‰ trong điều kiện vô trùng Mỗi ống chứa 9ml dung dịch này Ống 1: Cho 1ml nước ở ao cá vào ống
=> pha loãng ở nồng độ 1/10 Ống 2: Lắc đều ống 1, lấy 1ml cho vào ống 2
=> pha loãng ở nồng độ 1/100 Ống 3: Lắc đều ống 2, lấy 1ml cho vào ống 3
=> Độ pha loãng tại ống 3 là 1/1000
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
Tuỳ theo nhận xét cảm quan mà có thể pha loãng mẫu ở nồng độ 10 -1 ,10 -2 ,
Các chỉ tiêu hoá lý như nhiệt độ và pH dùng nhiệt kế và máy đo pH để xác ủũnh
Các chỉ tiêu vi sinh:
⮘ Kiểm tra Coliforms và E.Coli để có thể xác định mức độ vệ sinh của nguồn nước
Coliforms là nhóm trực khuẩn đường ruột, gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí tuỳ nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở
Escherichia coli có thể phát triển được ở 44 0 C, lên men sinh hơi đường lactose, sinh nhiều acid, không sử dụng citrat làm nguồn carbon duy nhất
Môi trường tăng sinh LTB (Lauryl Tryptose Broth)
Môi trường chuyên biệt : EC (Enrichment Coli)
Môi trường phân lập EMB Agar ( Eozin Methyl Blue Agar )
Môi trường sinh hoá Indol, MR_VP, Simon , s Citrat Agar, KIA (Kligler Iron Agar)
Thuốc thử : dung dịch mêthyred, dung dịch NaOH 40 %, dung dịch thuốc thử α- naphtol, thuốc thử Kowacs
Pha loãng mẫu, chọn nồng độ pha loãng thích hợp Nguyên tắc là phải chọn 3 nồng độ pha loãng liên tục nhau tuỳ theo mức độ nhiễm của vi sinh vật mà chọn
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
Dùng 9 ống nghiệm chứa sẵn môi trường LTB, có ống durham úp ngược, mỗi ống cho vào 1 ml mẫu pha loãng (dùng 3 ống nghiệm cho mỗi nồng độ pha loãng) để tủ ấm 37 0 C/24 giờ đọc kết quả Coliforms
- Ống (+): Các ống durham có sinh hơi, môi trường đục
- Ống (-): Môi trường không đục, không sinh hơi ống durham
Tính ống (+) của 3 nồng độ, đem tra bảng Mac Cardy và nhân với hệ số pha loãng ít nhất, từ đó tính được tổng số Coliforms trên 1 ml dung dịch mẫu
Tiếp theo tiến hành định lượng E.coli theo phương pháp MPN
Những ống từ môi trường LTB sinh hơi hút 0,1 ml dung dịch mẫu cấy sang môi trường chuyên biệt EC, để tủ ấm 44 o C/24h Từ EC chọn ống (+) cấy phân lập trên môi trường thạch đĩa EMB (Eozin Methylene Blue), để tủ ấm 37 o C/24h Trên môi trường EMB : E.Coli có khóm tím ánh kim tròn, dẹt, đường kính 1-
Chọn khóm điển hình cấy vào môi trường sinh hoá KIA (Kligler’s Iron Agar), ủ 37 o C/24 giờ
Trên KIA : EColi có biểu hiện vàng/vàng (acid/acid)
Chọn từ KIA, có những biểu hiên vàng/vàng thử phản ứng sinh hoá E.Coli bằng IMVIC, đồng thời tiến hành nhuộm gram
Cho kết quả : Indol (+), Citrate (-), Methylred (+), VP (-), trực khuẩn gram aâm
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
Phản ứng Dung dịch thử Kết quả
Indol Kowacs Vòng không màu
Vòng đỏ xuất hiện trên mặt môi trường
MR Mêthyl red Môi trường có màu vàng
Môi trường có màu đỏ
Môi trường có màu vàng
Môi trường có màu đỏ cam
Simon ’ s citrat Khoõng duứng Khoõng chuyeồn màu
Môi trường chuyển màu:xanh lá cây sang xanh dửụng đậm
Dựa vào các phản ứng trên ta đọc được E.coli tra bảng Mac Cardy và nhân với hệ số pha loãng ít nhất trên Coliforms, từ đó tính được E.coli trong 1 ml maãu
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
Sơ đồ 2 1 : Sơ đồ kiểm tra Coliforms
90 ml nước muối sinh lý
3/ Cấy sang LTB có chứa saỹn oỏng durhamvoõ truứng moãi oáng caáy 1 ml maãu ủ 37 0 C/24 giờ
1/ Đồng nhất mẫu và pha loãng 10 -1
4/ Đọc kết quả Coliforms :(+) môi trường đục sinh hơi 321 tra bảng Mac-crady tính số lượng Coliforms trong 1 ml mẫu
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
Sơ đồ 2 2 : Sơ đồ kiểm tra E.coli
3/ Chọn khóm điển hình: tím ánh kim cấy giữ giống trên TSA, rồi tiến hành thử sinh hoá
4/ Thử phản ứng sinh hoá
Sau khi xác định coliforms từ LTB được kết quả ống dửụng 321
Enrichment coli Chọn ống dương cấy vàoEMB
2/ Cấy vào EMB giữ ấm 37 0 C/24 giờ
Luận văn tốt nghiệp GVHD : TS NGUYỄN VĂN KHANH
Clostridium perfringens vi khuẩn có nhiều trong ruột cá Một số type có khả năng gây bệnh hoại tử ruột ở cá Nó cũng là chỉ tiêu xác định mức độ vệ sinh của nguồn nước
Thuộc loại trực khuẩn Gram (+), kớch thước lớn 0,8-1,5 x 4-8 àm, cú bào tử Bào tử lớn dạng ovan đứng gần đầu hay trung tâm của tế bào, không di động và không có capsul
⬧ Tính xâm nhập vi sinh vật phân bố khắp nơi, sống chủ yếu ở đường tiêu hóa
⬧ Đặc tính nuôi cấy và sinh hoá
Vi khuẩn là loại kị khí không triệt để, nhiệt độ thích hợp 37 o C, mọc tốt ở pH 7,2 -7,6 Bào tử hình thành ở pH = 6,6 Ở nhiệt độ 100 o C/60 phút mới diệt được nha bào
Leân men sinh hôi glucose, fuctose, galactose, maltose, lactose, saccarose,… khoâng leân men manitol, glycerol, …
Thử phản ứng sinh hoá: Indol (-), MR và VP (-), H2S (+), Catalaza (-)
Mẫu sau khi được pha loãng ở nồng độ 10 -1 dùng pipet hút 1 ml vào ống nghiệm có nút vặn kín chứa thạch đứng TSC, đun 85 0 C/15 phút, sau đó đặt vào tủ ấm 37 0 C/24 giờ
