nghiên cứu khả năng sinh protease acid trên bã bia và rỉ đường từ nấm mốc aspergillus tuyển chọn được

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀEnzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm, t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ BÁN CÔNG TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH PROTEASE ACID TRÊN BÃ BIA VÀ RỈ ĐƯỜNG TỪ NẤM

MỐC ASPERGILLUS TUYỂN CHỌN ĐƯỢC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

CHUYÊN NGÀNH : VI SINH VẬT HỌC

KHÓA HỌC : 2000 4 2004

LỜI CẢM ƠN

Thành kính biết ơn gia đình và người thân đã lo lắng, tạo mọi điều kiện

cho con có được ngày nay

Xin cảm ơn sâu sắc Thầy Phan Hữu Nghĩa đã tận tình chỉ dẫn, giúp

em hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Mở Bán Công

Thành Phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả

quý thầy cô đã chỉ dạy, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường

Xin cảm ơn Ks Lưu Ngọc Anh, PGS TS Đồng Thị Thanh Thu, TS Nguyễn

Ngọc Kiểng đã có nhiều giúp đỡ trong thời gian qua

Xin cảm ơn Nhà Máy Đường Biên Hòa đã cung cấp mật rỉ đường, Nhà

Máy Bia DESSACO đã cung cấp bã bia

Xin cảm ơn các bạn và anh, chị em phòng 309 (Trường Đại Học Mở Bán

Công TpHCM) đã quan tâm, chia sẻ trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Một lần nửa xin tất cả hãy nhận đây lòng biết ơn sâu sắc

Tác giả Nguyễn Văn Đinh

MỤC LỤC

Trang

2.1.1- Giới thiệu chung về nấm mốc 7

2.2.2- Phân loại – cách gọi tên enzyme 12

2.2.3- Cơ chế tác dụng của enzyme 13

2.2.4- Đặc điểm của nguồn protease từ vi sinh vật 14

2.2.5- Những nghiên cứu về protease vi sinh vật 15

2.2.6- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease

2.2.7- Ưùng dụng của chế phẩm protease 25

PHẦN 3 – NGUYÊN VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 - Nguyên Vật Liệu 27

3.1.3- Nguyên liệu dùng nuôi cấy 27

3.1.4- Nguồn gốc các chủng nấm mốc 27

3.1.5- Môi trường sử dụng 33

3.2- Phương Pháp Nghiên Cứu 34

3.2.2- Sơ tuyển giống phân giải protein cao từ 10 chủng ban đầu- phương

pháp định tính tương đối căn cứ vào vòng phân giải của khuẩn lạc 35

3.2.3- Định tính aflatoxin trên môi trường nước cốt dừa 36

3.2.4- Tuyển chọn chủng có hoạt tính protease cao 36

3.2.4.1- Nuôi cấy nấm mốc ly trích enzyme theo phương pháp

3.2.4.2- Chiết rút enzyme 37

3.2.4.3- Xác định hoạt tính proteolytic theo phương pháp Anson

3.2.5- Tối ưu hóa quá trình quá trình nuôi cấy bề mặt - nấm mốc

để thu protease acid có hoạt tính cao 42

3.2.5.1- Thành phần môi trường nuôi cấy 42

3.2.5.2- Nuôi cấy- ly trích enzym 43

3.2.5.3 - Đặc tính enzym thu được 43

3.2.6- Phương pháp xử lý số liệu 47

4.1- Làm thuần chủng giống 48

4.2- Sơ tuyển giống phân giải protein cao từ 10 chủng nấm mốc ban đâàu 48

4.3- Định tính aflatoxin trên môi trường nước cốt dừa 49

4.4- Tuyển chọn chủng có hoạt tính proteolytic cao nhất 49

4.5- Chọn thành phần môi trường thích hợp để thu được enzyme

protease có hoạt tính cao nhất 50

4.6- Đặc tính của protease thu được 51

4.6.1- Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính proteolytic

của dịch chiết enzyme thu được 51

4.6.2-Hàm lượng protein tương ứng của mẫu dịch chiết enzyme 52

4.6.3- Hoạt tính đông tụ sữa của dịch chiết enzyme 52

PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

Phụ lục 1: Thành phần chính của mật rỉ đường 56

Phụ lục 2: Thành phần chính của bã bia 57

Phụ lục 3: Dung dịch đệm Britton-Robison 58

Phụ lục 4: Thuốc thử Folin – Ciocalteau 58

Phụ lục 5: Kết quả xử lý số liệu bảng 4.1 59

Phụ lục 6: Kết quả xử lý số liệu bảng 4.2 60

Phụ lục 7: Kết quả xử lý số liệu bảng 4.3 60

Phụ lục 8: Kết quả xử lý số liệu bảng 4.4 62

Phụ lục 9 : Một số hình ảnh thí nghiệm 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

DANH SÁCH BẢNG, BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ HÌNH

Trang

Bảng 2.1- Aûnh hưởng của tinh bột đến sự tổng hợp protease

của Aspergillus lerricola 23

Bảng 2.2- Các lĩnh vực ứng dụng của enzyme protease 26

Bảng 3.1- Các bước lập đồ thị chuẩn tyrosine 39

Bảng 3.2- Các bước xác định hoạt tính proteolytic 40

Bảng 3.3- Thành phần môi trường tốu ưu hóa nuôi cấy nấm mốc 42

Bảng 3.4- Thí nghiệm tìm khoảng nhiệt độ và pH tối thích 44

Bảng 3.5- Các bước lập đồ thị chuẩn Albumin 45

Bảng 4.1- Kết quả định tính protease trên môi trường gelatin 48

Bảng 4.2- Hoạt tính proteolytic của Aspergillus candidus T31s-9

và Aspergillus candidus BB1s-5 49

Bảng 4.3- Hoạt tính proteolytic tương ứng thành phần môi trường

Bảng 4.4- Aûnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính proteolytic 52

Bảng 4.5- Hàm lượng protein của mẫu dịch chiết enzyme (mẫu T11) 52

Bảng 4.6- Hoạt tính đông tụ sữa tại pH=2,5 và nhiệt độ 41oC61oC 53

Hình 1- Aspergillus candidus trên môi trường Czapek 64

Hình 2- Aspergillus niger trên môi trường Czapek 64

Hình 3- Aspergillus awamori trên môi trường Czapek 64

Hình 5- Hình dạng vi thể của Aspergillus candidus 65

Hình 7- Hình dạng vi thể Aspergillus awamori 67

Hình 9- Vòng phân giải protein trên môi trường thạch gelatin (7 ngày) 69

Hình 10- Aspergillus candidus trên môi trường nước cốt dừa 70

Hình 11- Thí nghiệm lập đồ thị chuẩn tyrosine 71

Hình 12- Thí nghiệm định lượng protein theo phương pháp Lowry 71

Hình 13- Khả năng đông tụ sữa của dịch chiết enzyme 71

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh

trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò quan trọng trong công

nghệ thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và

trong bảo vệ môi trường Enzyme đã trở thành đối tượng rất quan trọng trong

nghiên cứu không chỉ các nhà khoa học sinh học, công nghệ sinh học mà còn là

mối quan tâm lớn của những nhà khoa học trong nhiều lĩnh vực khoa học có liên

quan

Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ

đầu thế kỷ 20 đến nay Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận

rất lớn cho nhiều nước Việt Nam là một trong nhiều nước có rất nhiều nghiên

cứu và ứng dụng enzyme Tuy nhiên, ở Việt Nam công nghệ enzyme chưa phát

triển Các nghiên cứu có đề cập đến hầu hết các loại enzyme của động vật, thực

vật và vi sinh vật, nhưng chưa có enzyme nào được sản xuất theo quy mô công

nghiệp Việt Nam vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nước ngoài

Điều đó cho thấy việc hiểu biết, nghiên cứu, phát triển sản xuất enzyme tại Việt

Nam là điều rất cần thiết

Việc khai thác enzyme từ nguồn động vật và thực vật khó đưa vào một

quy trình công nghệ theo quy mô công nghiệp hoàn chỉnh và còn phụ thuộc rất

nhiều vào thời tiết, vào bệnh tật Nhiều yếu tố rủi ro, nhiều khó khăn trong đầu

tư trang thiết bị Nguồn enzyme từ vi sinh vật rất phong phú và hoàn toàn có thể

tự động hóa, cơ giới hóa và có thể kiểm soát được toàn bộ quá trình tạo ra sản

phẩm enzyme

Cũng chính những lý do này Được sự cho phép của khoa Công Nghệ Sinh

Học Trường Đại Học Mở Bán Công Thành Phố Hồ Chí Minh, cùng với sự hướng

dẫn tận tình của Thầy Phan Hữu Nghĩa, Tôi tiến hành thực hiện đề tài :” Nghiên

Cứu Khả Năng Sinh Protease Acid Trên Môi Trường Bã Bia Và Rỉ Đường

Từ Nấm Mốc Aspergillus Tuyển Chọn Được” Như chúng ta đã biết quá trình

đông tụ protein sữa là quá trình quan trọng trong sản xuất phomat Enzyme được

biết từ lâu là renin được dùng làm tác nhân đông tụ sữa Song, hiệu quả kinh tế

không cao Vì vậy, các nhà khoa học đã nghiên cứu protease acid nhằm thay thế

một phần renin Mục tiêu của đề tài là tìm được công thức môi trường thích hợp

để chủng nấm mốc tuyển chọn, sản sinh enzyme cao nhất, đồng thời nhằm góp

phần làm tăng thêm bộ sưu tập giống vi sinh vật có khả năng sinh enzyme làm

đông sữa để được chủ động hơn cho việc sản xuất phomat – vốn là một thứ thực

phẩm rất giàu giá trị dinh dưỡng Nội dung của đề tài bao gồm:

- Làm thuần chủng giống từ giống ban đầu

- Sơ tuyển giống có khả năng sinh protease trên thạch gelatin

- Định tính độc tố aflatoxin

- Tuyển chọn chủng có hoạt tính protease cao nhất trên môi trường

cám gạo, bột ngô, khô đậu tương

- Tối ưu hóa thành phần môi trường là bã bia và mật rỉ đường để thu

được công thức sản xuất enzyme có hoạt tính cao nhất

- Đặc tính của dịch chiết enzyme thu được

Với thời gian nghiên cứu hạn hẹp và lượng kiến thức còn non cạn, chắc

rằng còn nhiều thiếu sót Rất mong được sự góp ý của qúi thầy cô và bạn đọc

PHẦN 2: TỔNG QUAN

2.1- VỀ NẤM MỐC

2.1.1- Giới Thiệu Chung Về Nấm Mốc

Nấm mốc là một nhóm các loài vi nấm, những sinh vật đơn bào và đa bào,

phân bố rộng rãi khắp nơi trong thiên nhiên Nấm mốc không chứa diệp lục tố

(chlorophil), cơ thể nấm phát triển thành dạng sợi có vách ngăn hoặc không có

vách ngăn Những sợi nấm này phân nhánh, hình thành từng đám chằng chịt gọi

là hệ sợi nấm (khuẩn ty) Khi phát triển trên môi trường đặc, khuẩn ty thường

chia làm hai phần:

- Khuẩn ty dinh dưỡng nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất

dinh dưỡng cho toàn bộ hệ sợi

- Khuẩn ty khí sinh nằm bên trên môi trường, chủ yếu giữ vai trò sinh sản

Nấm mốc trao đổi chất với môi trường ngoài thông qua vách sợi nấm Chúng

vừa giữ vai trò hấp thu chất dinh dưỡng, vừa làm nhiệm vụ thải các chất bã, các

sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ra môi trường xung quanh

Nấm mốc sinh sản chủ yếu thông qua việc hình thành bào tử bằng nhiều con

đường:

- Sinh sản vô tính: tạo ra bào tử trần hay bào tử kín

- Sinh sản hữu tính: tạo ra bào tử tiếp hợp, bào tử túi(ascospores), bào tử

trứng (oospores)

Các bào tử này phát tán ra khắp nơi Khi gặp điều kiện thích hợp (ẩm độ,

nhiệt độ,…), chúng sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm đầu tiên của toàn bộ hệ

sợi nấm sau này

Ngoài ra, Nấm mốc cũng có thể phát triển từ một đoạn khuẩn ty hay từ hạch

nấm (kiểu sinh sản dinh dưỡng).[1]

2.1.2 - Aspergillus

Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu tiên năm 1729 Fries (1832) chấp

nhận chi nấm này của Micheli, như vậy theo luật quốc tế về danh pháp thực vật

(điều 13f), chi Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries

Thom và Church (1926) nghiên cứu phân loại học các loài đã được mô tả của chi

Aspergillus, đề nghị chấp nhận 69 loài trong tổng số 350 loài đã mô tảvà đã sắp

xếp 69 loài này vào 11 tập hợp dưới chi (nhóm loài, group) Thom và Raper

(1945) đề nghị chấp nhận 80 loài và xếp thành 14 nhóm loài Chuyên luận về

chi Aspergillus xuất bản gần đây nhất và vẫn đang được sử dụng rộng rãi để định

loại các loài của chi nấm này là chuyên luận của Raper và Fennell (1965), gồm

136 loài và được xếp trong 18 nhóm loài

Chi Aspergillus Mich ex Fr đặc trưng bởi những đặc điểm sau :

- Hệ sợi Nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt

hoặc trong một số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất

định của khuẩn lạc Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân (foot cell), như là

một nhánh của sợi Nấm, gần thẳng góc với trục của tế bào chân và thường ở

trên mặt cơ chất Giá bào tử trần không có nhánh, không có hoặc có ít vách

ngang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chùy, hình ellip, hình nửa cầu hoặc

hình cầu Bọng mang các thể bình Các thể bình này hoặc song song và hợp

thành cụm ở phần đỉnh bọng, hoặc xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ bề

mặt bọng Thể bình hoặc chỉ có 1 hoặc 2 tầng Trong trường hợp sau, mỗi thể

bình cấp 1 (cũng gọi là cuống thể bình, metula) mang một cụm gồm 243 (hoặc

thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng gốc (bào tử ở ngay

miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình càng già), không

phân nhánh Bào tử trần không ngăn vách, thay đổi về hình dạng, kích thước,

màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài (nhẵn, có gai, có nốt sần), tùy từng loài Tất cả các

chuỗi bào tử trần tạo thành từ các thể bình của một bọng đỉnh giá họp thành khối

bào tử trần đỉnh bọng (conidial head) Khối bào tử trần đỉnh bọng, có thể có các

dạng hình cột (các chuỗi bào tử trần song song, sát nhau), hình cầu hoặc hình tia

tỏa tròn Một số loài có bào tử túi (ascosporum) trong các quả kín

(cleitothecium)

- Về phân loại chi Aspergillus sẽ được trình bày chi tiết trong phần 3.1.4

- Về các đặc điểm hóa sinh, một số nhà Nấm học Nhật Bản trên cơ sở nghiên

cứu phân loại học nhóm loài Aspergillus flavus kết luận rằng có thể kết hợp các

đặc điểm sinh lý – hóa sinh với các đặc điểm hình thái để ngăn cách các loài

trong nhóm loài này (O’Hara 19511952, Murakami 19701973, v.v.) Cùng

nghiên cứu theo hướng đó với cùng nhóm loài, các kết quả lại cho kết luận

ngược lại (Heseltine, Sorensen et Smith, 1970) Cho đến nay, vẫn chỉ có tính

chất thăm dò, chưa có công trình nào cho kết quả có ý nghĩa phân loại học rõ

rệt

Vì những lẽ trên, hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper và Fennell

(1965) gồm 18 nhóm loài đến nay vẫn ổn định và được sử dụng rộng rãi, không

sửa đổi về cơ bản, mặc dù một số loài mới thuộc chi nấm này đã được công bố ở

một số nước

Nhiều loài thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên,

trong các sản phẩm nông công nghiệp, ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế

công nghệ lên men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước Châu Aù

như Việt Nam (làm tương) , Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia, Philipin, v.v

Hiện nay, công nghệ sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ

yếu là các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae trong công nghiệp sản xuất

enzyme (-amlase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase) Trong công

nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid

citric, acid gluconic,v.v Một số loài khác có khả năng tạo thành kháng sinh, như

Aspergillus humicola, Aspergillus nidulans tạo thành lần lượt humicolin, nidulin

có tác dụng ức chế với một số loài vi nấm, Aspergillus candidus tạo thành

candidulin, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamatii và một số loài khác tạo thành

acid kojic có tác dụng ức chế đối với một số loài vi khuẩn, v.v Trong đó đã thực

sự được dùng trong công nghệ dược phẩm chỉ có loài Aspergillus fumigatus để

sản xuất fumagilin làm thuốc chữa lị amip Nhiều loài thuộc chi Nấm này có

hoạt tính biến đổi sinh học, một số loài tạo thành các độc tố (mycotoxin), đặc

biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các độc tố gây ung thư gan như các loài

Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus tạo thành aflatoxin …[2].

2.2- VỀ ENZYM

2.2.1- Khái Quát

Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác Enzyme đã xúc tác cho hầu hết các

phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình chuyển hóa

các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối, theo những

chiều hướng xác định Như vậy, enzyme đã đảm bảo cho sự trao đổi thường

xuyên giữa cơ thể sống và môi trường bên ngoài, nghĩa là đảm bảo cho sự tồn

tại của cơ thể sống

Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn Nó có thể gấp hàng trăm, hàng

nghìn, hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ khác Ví dụ : trong phản ứng thủy

phân saccharose nếu dùng saccharase làm chất xúc tác thì tốc độ phản ứng tăng

nhanh gấp 2.1012 lần so với khi dùng acid làm chất xúc tác

Điều quan trọng nữa là enzyme có thể thực hiện hoạt đọâng xúc tác trong điều

kiện nhẹ nhàng, ở áp suất thấp và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi

trường gần như pH sinh lý Hơn nữa enzyme lại có khả năng lựa chọn cao đối với

kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng

Ví dụ: -amylase chỉ có khả năng xúc tác việc phân cắt các mối liên kết -1-4

glucoside ở bất kỳ chỗ nào trong phân tử tinh bột, còn glucoamylase lại có thể

phân cắt các mối liên kết -1-4 và -1-6 từ đầu không khử của phân tử tinh bột

Do những đặc điểm trên, việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme có ý nghĩa to

lớn về mặt lý thuyết cũng như về mặt thực tế áp dụng [3]

Các nhà khoa học tại Diversa Corp đang thử nghiệm các enzyme không gây

độc hại cho môi trường trong phòng thí nghiệm tại San Diego Một ngày nào đó,

những enzyme này sẽ thay thế các hóa chất độc hại hiện đang sử dụng trong

ngành giấy để từ đây sản xuất ra giấy in báo, khăn giấy, văn phòng phẩm… Oâng

Jay M.short-Giám đốc điều hành của Diversa dự đoán “ công nghệ sinh học

trong sản xuất công nghiệp sẽ tăng trưởng nhanh và làm thay đổi các ngành

công nghiệp”

Trong 30 năm qua, các công ty công nghệ sinh học đã khai sinh ngành dược

phẩm trị giá 40 tỷ USD nhờ tạo ra các tế bào sống sản xuất những loại thuốc bán

chạy nhất thế giới Diversa và các công ty khác tin rằng công nghệ sinh học có

thể tạo ra điều kỳ diệu tương tự đối với các ngành đang phát triển ì ạch như giấy,

chất xúc tác protein thúc đẩy tốc độ các phản ứng hóa học trong tế bào Trong

ngành dệt, enzyme giúp tẩy trắng sợi, cải thiện chất lượng nhuộm, làm mòn

hoặc bạc màu vải…Nhờ đó, nhà sản xuất có thể cắt giảm tiêu thụ điện năng, tiết

kiệm đủ điện để cung cấp cho 28.120 hộ gia đình trong một năm Trong ngành

giấy, các công ty có thể sử dụng enzyme thay chất tẩy trắng để giảm tiêu thụ

nhiên liệu, tiết kiệm khoảng 75 tấn Clo và Co dioxide mỗi năm Trong công

nghiệp chế biến thực phẩm, enzyme được sử dụng để thay thế các chất xử lý

nước và lọc dầu giúp cắt giảm lượng nước sử dụng trong ngành này khoảng 50%

Vì thế các công ty công nghệ sinh học, kể cả Diversa đang nghiên cứu những

vi sinh vật mới để sản xuất hàng loạt các siêu enzyme bằng cách trộn lẫn và tổ

hợp DNA từ các sinh vật khác nhau [4]

2.2.2- Phân Loại Và Cách Gọi Tên Enzyme

Theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc

hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia Theo đó, tên

enzyme thường có 2 phần:

- Phần đầu là tên cơ chất: Trong trường hợp phản ứng đó là phản ứng lưỡng

phân thì phần thứ nhất là tên gọi của 2 cơ chất viết cách nhau hai chấm

- Phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng và cuối tên có đuôi là “ase”

Ví dụ: enzyme urease có tên hệ thống là carbamite amideohyrolase

Ngoài ra, một số enzyme vẫn còn dùng tên thông dụng như : papain, pepsin…

Năm 1960, Hiệp hội nghị hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại

enzyme ra làm 6 lớp như sau:

1- Oxidoreductase: Là nhóm enzyme xúc tác các phản ứng oxy hóa – khử

Nhóm này gồm các enzyme như: dehydrogenase, oxidase, peroxidase,

2- Transpherase: Thuộc lớp enzyme phức tạp, xúc tác cho phản ứng chuyển vị

Gồm các enzyme: acyltranspherase, glucosyltranspherase, aminotranspherase,

phosphotranspherase

3- Hydrolase: Là nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân các hợp chất

hữu cơ như: peptide hydrolase, lipase

4- Liase : Là nhóm enzyme xúc tác sự tách một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất

mà không có sự tham gia của H2O hoặc acid phosphoric, cũng có thể xúc tác

phản ứng loại nước của phân tử tạo nối đôi hoặc kết hợp nước vào nối đôi Ví

dụ: decarboxidase, hidrolase…

5- Izomerase: Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp

giữa gatactose và glucose

6- Ligase : Enzyme này tham gia cho phản ứng carboxyl hóa acid pyruvic tạo

thành acid oxaloacetic [5]

2.2.3- Cơ Chế Tác Dụng Của Enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc

điểm của chất xúc tác nói chung

Các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản

ứng phải va chạm với nhau ở vị trí xảy ra phản ứng và phải ở trạng thái hoạt

động Muốn hoạt hóa các phân tử thì cần cung cấp năng lượng cho chúng Năng

lượng đó gọi là năng lượng hoạt hóa Ví dụ trong phản ứng thủy phân H2O2

thành H2O và O2, nếu không có chất xúc tác thì năng lượng hoạt hóa là

18Kcal/mol, nếu có chất xúc tác là keo platin thì năng lượng hoạt hóa là 11,7

Kcal/mol, còn nếu có enzyme catalase xúc tác thì năng luợng hoạt hóa chỉ còn

5,5 Kcal/mol

Sự tạo thành phức ES và biến đổi phức này thành sản phẩm P trải qua 3 giai

đoạn sau:

E + S → ES → P + E Trong giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo

thành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và đòi

hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

Trong giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng và

phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng này Kết quả là làm cho cơ

chất được hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn

Trong giai đoạn thứ ba: sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải phóng

dưới dạng tự do [3]

2.2.4- Đặc Điểm Của Nguồn Protease Từ Vi Sinh Vật

Khác với protease của thực vật (papain, bromelin) và động vật (trypsin,

pepsin, renin), protease của vi sinh vật là những enzyme ngoại bào và có tính

đặc hiệu rộng rãi

Dựa vào đặc trưng của tâm hoạt động người ta cũng có thể phân protease của

vi sinh vật thành protease serine, protease thiol, peptidase chứa kim loại và

protease tác dụng trong môi trường acid

Nếu dựa vào pH tác dụng tối ưu thì người ta chia protease của vi sinh vật

thành protease acid, protease trung tính, protease kiềm

Trong chế phẩm từ mốc đen (Aspergillus niger, Aspergillus awamori,

Aspergillus saitoi, Aspergillus usamii, Rhizopus javanicus) chứa chủ yếu là các

protease có pH tối ưu từ 2,543 Enzyme này đã được tách ra ở trạng thái kết tinh

và được gọi là Aspergillopeptidase A Còn trong chế phẩm từ mốc vàng

terricola) thì chứa các protease có pH tối ưu gần 6,5 Người ta cũng đã xác định

rằng tác dụng tối ưu của enzyme cũng phụ thuộc vào bản chất của cơ chất Vì lẽ

cùng một enzyme, nhưng khi thủy phân casein, hemoglobin và gelatin sẽ thể

hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau

Chế phẩm protease từ Bacillus mesentericus cũng thủy phân được các protein

của động vật và thực vật đến acid amine và peptide

Điều đáng chú ý là các chế phẩm protease từ những vi khuẩn này còn có khả

năng làm đông tụ sữa Do đó trong sản xuất phomat người ta đang thay thế một

phần enzyme đông tụ sữa bằng chế phẩm từ Bacillus mesentericus này

Ngoài ra, một số chế phẩm protease của vi khuẩn còn có hoạt độ elastase,

nghĩa là chỉ có thể thủy phân các liên kết peptide kề liền bên gốc amino acid

trung tính Đây cũng là điểm khác với protease nấm mốc [6]

2.2.5- Những Nghiên Cứu Về Protease Vi Sinh Vật

Các protease xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)

trong phân tử protein

Protease đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới, trong đó protease của hệ

tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả Ngay từ cuối thế kỷ 18 đầu thế kỷ 19 đã

tách được chế phẩm pepsin từ dịch vị dạ dày, trypsin từ dịch tụy tạng của động

vật ăn thịt

Các protease của thực vật được phát hiện muộn hơn Cuối thế kỷ 19 đầu thế

kỷ 20, các nhà khoa học mới tách được papain từ nhựa cây đu đủ (carica

papaya) Bromelin trong các phần khác nhau của cây dứa, urease từ đậu tương…

Protease từ vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950 Tuy

vậy, số các công trình nghiên cứu về protease của vi sinh vật tăng lên rất nhiều

Phần lớn protease được sản xuất nhờ quá trình nghiên cứu vi sinh vật ở qui

mô công nghiệp Hiện nay, hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 600 tấn

protease tinh khiết từ vi sinh vật, trong đó khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn

từ nấm mốc Nhịp độ sản xuất enzyme ở qui mô công nghiệp tại các nước phát

triển tăng trung bình hàng năm từ 5%415%, và doanh thu từ sản xuất enzyme

hàng năm ở các nước này khoảng 1,5 tỷ USD

Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến trên thế

giới hiện nay là: Nhật, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đan Mạch, Đức,

Aùo Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng

dụng các chế phẩm protease của vi sinh vật – nguồn nguyên liệu rất dồi dào để

sản xuất enzyme nói chung và protease nói riêng

Một nhóm các nhà khoa học của Trường Đại Học Nông Nghiệp TOKYO –

Nhật Bản đã tách được enzyme-prolyl dipeptidyl-aminopeptitdase từ môi trường

rắn nuôi cấy Aspergillus oryzae Enzyme này được tinh chế bằng phương pháp

điện di trên gel poly acrylamit (PAGE - Poly Acrylamit Gel Electrophoresis) ở

pH = 9,4 và đã xác định được phân tử lượng của enzyme này là 280.000 đơn vị

Klaus Prommer cho biết các loại protease kiềm được ứng dụng nhiều trong

sản xuất bột giặt vì có các tính chất sau: bền vững ở nhiệt độ cao, bền vững

trong môi trường kiềm (pH = 9411), và bền vững với các yếu tố tạo phức Tuy

nhiên các protease kiềm không bền vững với các chất hoạt động bề mặt Các

chủng vi sinh vật thường dùng để sản xuất protease kiềm là vi khuẩn Bacillus

như: Bacillus licheniformis, Bacillus amiloliquafaciens, Bacillus megaterium, các

chủng nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus sojae Các

protease trung tính được sản xuất từ các chủng Bacillus subtilis, Bacillus cereus,

oryzae, Aspergillus sojae và periculria oryzae Các protease trung tính kém bền

hơn, cần Ca++ để ổn định hoạt tính và cần Zn++ để hoạt hóa, mất hoạt tính nhanh

khi tăng nhiệt độ và do tác động của protease kiềm Vì vậy, chúng được sử dụng

hạn chế, chủ yếu trong công nghiệp thuộc da và sản xuất bánh mì Các protease

acid được sản xuất từ các chủng Aspergillus, có pH tối ưu từ 243 Hầu hết được

sử dụng để thủy phân gluten bánh mì và sản xuất phomat

Trong thời gian gần đây, người ta đã nghiên cứu được các phương pháp thích

hợp để thu nhận các chế phẩm protease không tan – protease được cố định trên

các chất mang như : cellulose, poly acrylamit, agarose, acid alginic, DAEA –

cellulose, DAEA – sephadex Nhờ những kết quả này mà có thể tái sử dụng chế

phẩm enzyme nhiều lần để sản xuất các sản phẩm một cách liên tục và tự động

hóa quá trình sản xuất sản phẩm, do vậy giảm được giá thành sản phẩm

Ơû Việt Nam, những nghiên cứu về enzyme nói chung và protease nói riêng

đã thu hút sự quan tâm của đông đảo các nhà khoa học thuộc lĩnh vực hóa sinh

học và vi sinh vật học Các nghiên cứu tập trung theo các hướng : tách ; tinh chế

enzyme từ các cơ quan nội tạng động vật và các mô thực vật, tạo các sản phẩm

có độ sạch khác nhau; nghiên cứu cấu trúc, tính chất của protease, sự liên quan

giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của chúng và khả năng ứng dụng protease

vào các lĩnh vực khác nhau, có thể thấy rõ qua một số công trình nghiên cứu đã

được công bố

Trương Thị Hòa và cộng sự (1991) đã nghiên cứu phát triển khả năng sinh

tổng hợp protease của chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 938/2 và nâng cao

hoạt lực của nó, đã chọn được môi trường nuôi cấy tối ưu cho chủng này là : 70%

bã bia, 20% bột ngô, 10% bột đậu tương Hoạt lực protease tăng lên 21% so với

Các nhà khoa học thuộc viện công nghiệp thực phẩm Hà Nội đã tuyển chọn

được chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 29B Chủng này có hoạt tính sinh tổng

hợp protease ổn định trên môi trường cám gạo bổ sung bột ngô, bột đậu tương và

bã bia

Theo đáng giá của các nhà khoa học, ở Việt Nam, tuy đã có một số công

trình nghiên cứu thu nhận và bảo quản protease từ các chế phẩm lên men bề mặt

của Bacilus subtilis Kết quả nghiên cứu cho thấy dùng dung dịch đệm phosphate

có pH = 6,4 với tỷ lệ chế phẩm thô / dung dịch đệm bằng ¼ là tốt nhất Chế

phẩm protease bán tinh khiết thu được có nhiệt độ thích hợp trong khoảng

48oC452oC, pH thích hợp trong khoảng 6,447 Ơû nhiệt độ 50oC hoạt độ protease

không giảm sau 6 giờ Chế độ bảo quản tốt nhất với môi trường C6H5ONa, ở

nhiệt độ 5oC410oC

Qua các dẫn liệu đã nêu ở trên cho thấy cần chú ý nghiên cứu hơn nữa về

protease từ vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng, góp phần thúc đẩy

ngành công nghệ sinh học nói chung và công nghệ enzyme nói riêng phát triển

để phục vụ tốt hơn cho đời sống kinh tế, xã hội của đất nước

Các tài liệu công bố mới đây cho thấy các protease của nấm mốc có khoảng

pH hoạt động rộng hơn so với protease của động vật và vi khuẩn Protease của

vi khuẩn hoạt động ở vùng pH=748 Còn protease của nấm mốc Aspergillus

Oryzae hoạt động trong khoảng pH =3,549 Nhờ vậy mà protease của nấm mốc

nói chung và Aspergillus oryzae nói riêng có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực

khác nhau, như trong việc ổn định bia (pH=445), trong việc làm mềm

da(pH=849), trong sản xuất nước mắm (pH=647,5) Protease của Aspergillus

oryzae có tính đặc hiệu rộng hơn so với protease của động vật và vi khuẩn,

endo-protease Chính vì vậy, dưới tác dụng của protease nấm mốc, thì protein bị

thủy phân sâu sắc hơn

Các chế phẩm protease của nấm mốc được sử dụng trong thực tế dưới nhiều

dạng khác nhau Trong một số trường hợp, tạp chất không gây tác hại đáng kể

cho sản phẩm và kỹ thuật sản xuất, như trong thuộc da, người ta sử dụng trực

tiếp môi trường nuôi cấy có chứa protease (gọi là chế phẩm thô) mà không cần

tách tạp chất Cũng có nhiều trường hợp, cần sử dụng chế phẩm tinh khiết với

mức độ khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng Khi đó ta phải chiết suất và tinh

chế enzyme

Việc tinh chế protease có thể tiến hành theo nhiều phương pháp và qua nhiều

giai đoạn, nhằm loại bỏ các tạp chất và các enzyme khác Có thể dùng phương

pháp tách phân đoạn khác nhau nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ, bằng muối

trung tính, hấp phụ chọn lọc, trao đổi ion, để thu được chế phẩm protease có hoạt

lực cao nhất

Như chúng ta đã khẳng trên đây việc thu nhận enzyme nói chung và protease

nói riêng từ vi sinh vật là kinh tế nhất, trong đó nấm mốc là nguồn quan trọng,

đây là một trong những hướng có nhiều triển vọng ở Việt Nam

Trong vài thập kỷ gần đây, việc sản xuất protease từ vi sinh vật được chú ý

hơn cả, do có nhiều ưu điểm hơn các nguồn nguyên liệu khác như :

- Chủ động về nguồn nguyên liệu, chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn Do

vậy có thể thu hoạch hàng chục lần trong một năm

- Có thể dễ dàng nhanh chóng điều hòa định hướng sự tổng hợp enzyme cần

thiết trên cơ sở thay đổi môi trường, chọn lọc hoặc gây đột biến ở chủng vi sinh

vật

- Phổ phân bố enzyme rộng, điều đó cho phép có thể sử dụng một chủng vi

sinh vật để sản xuất nhiều chế phẩm enzyme

- Sự tích lũy số lượng lớn enzyme trong môi trường tạo điều kiện thuận lợi

cho việc thu nhận chúng

Tuy nhiên, không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh tổng hợp

enzyme như nhau, mà ngay cả khi cùng một giống cũng khác nhau Trong số vi

sinh vật dùng làm nguồn nguyên liệu sản xuất protease thì nấm mốc trở thành

đối tượng quan trọng

Để đạt hiệu quả cao trong sản xuất protease từ nấm mốc, ta phải tiến hành

phân lập, tuyển chọn những chủng có khả năng sinh tổng hợp protease cao

Đồng thời cần nghiên cứu tìm điều kiện nuôi cấy tối ưu, để những chủng đó sinh

tổng hợp protease có hoạt tính cao nhất

Để ứng dụng protease của nấm mốc vào lĩnh vực chế biến các sản phẩm từ

sữa, thịt, cá … Cần nghiên cứu tách chiết protease ra khỏi môi trường nuôi cấy

và xác định một số tính chất đặc trưng của chế phẩm enzyme thu được

Tóm lại, các chủng vi sinh vật được chọn làm nguồn để sản xuất enzyme

phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Có thể sinh trưởng trên môi trường đơn giản, rẻ tiền

- Có khả năng sinh tổng hợp enzyme mạnh trong thời gian ngắn

- Dễ cơ giới hóa và tự động hóa quá trình nuôi cấy

- Dễ tách chiết enzyme và không sinh độc tố [7]

2.2.6- Các Yếu Tố Aûnh Hưởng Đến Quá Trình Sinh Tổng Hợp Protease

Ơû Vi Sinh Vật

Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh

vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm, nhiệt độ, pH, độ

thông khí, thành phần môi trường v.v…

Nắm vững được quy luật ảnh hưởng của các yếu tố này, chúng ta có thể điều

khiển hoạt động tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo ý muốn Sau đây chúng ta

sẽ xét chi tiết hơn ảnh hưởng của một số yếu tố

• Aûnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng

sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng

hợp Tùy từng vi sinh vật, nhiệt độ thích hợp có khác nhau; các loại nấm mốc

phát triển thích hợp ở nhiệt độ: 22oC432oC Còn các vi khuẩn ở nhiệt độ cao hơn

35oC455oC Khi tăng nhiệt độ nuôi cấy Aspergillus candidus hay Mucor sp

Reninus đến 36oC, sẽ làm mất hoàn toàn hoặc giảm khả năng làm đông sữa của

dịch môi trường Nhìn chung các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với

nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp

• Aûnh hưởng pH môi trường : Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH

môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật Hơn nữa

pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật

Đối với các nấm mốc, pH thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease vào

khoảng 646,5 Các vi khuẩn phát triển tốt và tạo thành nhiều enzyme ở pH gần

trung tính, từ 6,647,4

Khi dùng phương pháp bề sâu, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi

có vai trò quyết định đối với sự tích lũy protease trong môi trường PH ban đầu

của môi trường thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật khác nhau không

giống nhau Đối với các nấm mốc pH này vào khoảng 3,845,6 Còn đối với vi

• Độ thông khí trong môi trường: Có ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp

protease Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo vi sinh vật Trong

một số trường hợp, thiếu oxygen tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật

nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease Trong một số trường hợp, sự

hiếu khí mạnh lại kìm hãm sự tổng hợp protease

• Aûnh hưởng của thành phần môi trường:

Thành phần môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn carbon,

nitrogen, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ nồng độ thích hợp giữa các thành

phần này và đặc biệt là cần sử dụng các chất cảm ứng

+ Aûnh hưởng của nguồn carbon: Nguồn carbon thường dùng để nuôi cấy vi

sinh vật là các glucid : monose-di và cả polisaccharide (tinh bột) Các chất này

có ảnh hưởng khác nhau đến sự tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp

protease ở vi sinh vật Đặc tính tác dụng của nguồn carbon tùy thuộc vào bản

chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật

Nguồn carbon và nitrogen tự nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là

bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng Có khi môi trường chỉ cần

có nước chiết ngô mà không cần có muối khoáng lại tổng hợp protease tốt nhất

(Ortrosko và tập thể ,1977)

Nồng độ glucid thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cũng thay

đổi tùy loại vi sinh vật Ví dụ đối với Aspergillus awamori 200 và Aspergillus

flavus 74, nồng độ glucose trong môi trường từ 5%46% là thích hợp nhất, nhưng

đối với Aspergillus flavus 116 thì nồng độ glucose thích hợp là 3%

Polisaccharide tinh bột cũng có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

protease ở một số loài nấm mốc Tuy nhiên ảnh hưởng của nó còn tùy thuộc vào

loại tinh bột (bảng 2.1) và loài nấm mốc

Bảng 2.1- Aûnh hưởng của tinh bột đến sự tổng hợp protease của Aspergllus

lerricola

Nguồn glucid Nồng

độ

PH môi trường dịch thể

Hoạt độ protease (đv/100ml)

Sinh khối (g/100ml)

Tinh bột đại mạch

Tinh bột đại mạch

Tinh bột khoai tây

Tinh bột khoai tây

Ngoài glucid có thể sử dụng hydrocarbon làm nguồn carbon duy nhất trong

môi trường sinh dưỡng cho một số vi sinh vật tổng hợp protease như

Pseudomonas aeruginosa 3454, Pseudomonas aegurinos IFO 3455

+ Aûnh hưởng nguồn nitrogen: Trong các nguyên liệu này đều có hàm lượng

acid amine tự do tương đối thấp

Các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả đã đi đến một số nhận xét về ảnh

hưởng các nguồn nitrogen đến quá trình sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật như

sau:

Đối với các loài Aspergillus (Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori,

Aspergillus niger, Aspergillus flavus) Đạm hữu cơ là thành phần quan trọng nhất

của môi trường đối quá trình sinh tổng hợp protease acid Khi thay NaNO3 trong

môi trường Czapek bằng casein sẽ làm tăng đáng kể lượng protease acid trong

môi trường nuôi cấy Protein và peptone là nguồn dinh dưỡng nitrogen tốt nhất

đối với các loài Aspergillus kể trên Theo một số tác giả khi sử dụng phối hợp

nguồn nitrogen hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp

protease Ví dụ khi thêm HNO3 hoặc NH4 với lượng 0,6%43,8% vào môi trường

có chứa nguồn nitrogen hữu cơ làm tăng khoảng 140%4190% protease acid trong

môi trường nuôi cấy của nhiều loài thuộc giống Aspergillus

Theo Kônôvalôv và Đôrôkhôv (1969), các acid amine như valine, cystine và

một số acid amine khác thường kích thích quá trình sinh tổng hợp protease acid

Aspergillus flavus 74, Aspergillus flavus 88, Aspergillus oryzae 79, Aspergillus

niger 50, Aspergillus flavus 74 Trong khi đó cystine lại kìm hãm quá trình tổng

hợp protease acid ở tất cả các loài kể trên

Tóm lại: nồng độ dạng nitrogen trong môi trường có ảnh hưởng rõ rệt và có

quy luật đến quá trình tổng hợp protease ngoại bào ở vi sinh vật

Ngoài việc chọn nguồn và lượng carbon, nitrogen thích hợp còn cần phải

chọn tỷ lệ thích hợp giữa C : N Có như vậy mới đảm bảo tổng hợp được nhiều

protease Theo Iulius (1969), tỷ lệ C : N thích hợp cho quá trình tổng hợp

protease ở Bacillus mesentericus là 20 : 1 đến 40 : 1, protease acid là từ 8 : 1 đến

2 :1 Theo Aleeva và tập thể (1973), tăng lượng carbon quá nồng độ tối thích

không ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease Tuy nhiên, nếu tăng

lượng nitrogen trong môi trường quá nồng độ thích hợp sẽ kìm hãm sinh tổng

Ngoài nitrogen và carbon ra, phosphor và lưu huỳnh cũng có ảnh hưởng quan

trọng đến quá trình tổng hợp protease acid

Ngoài các yếu tố kể trên, các nguyên tố vi lượng (Steiner 1961), NaCl

(Kovalleva và tập thể 1977), vitamine (Emxêva 1975), và một số yếu tố khác

(Aravina và tập thể 1977) cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi

trường nuôi cấy vi sinh vật

Hiện nay, người ta có thể sử dụng những bộ phận tự động nối liền với nồi lên

men để có thể thay đổi thành phần môi trường và điều kiện muôi cấy trong quá

trình lên men Do đó có thể thay đổi từ môi trường thuận lợi cho tế bào sinh

trưởng nhanh chóng sang một môi trường thuận lợi cho sự tổng hợp enzyme với

độ thông khí ít để enzyme khỏi bị kìm hãm do các bọt khí (Johnson 1971) [8]

2.2.7- Ưùng Dụng Của Chế Phẩm Protease

Các chế phẩm protease có nhiều ứng dụng rộng rãi trong các ngành khác

nhau Các lĩnh vực ứng có thể được tóm tắt trong bảng 2.2 như sau:

Bảng 2.2- Các lĩnh vực ứng dụng của enzyme protease

Lĩnh vực công nghiệp sử dụng

Enzyme được sử dụng Của thực vật Của nấm mốc Của vi khuẩn Thịt

Chế biến cá

Chế biến sữa

Bánh mì và bánh kẹo

Sản xuất bia

Sản xuất sữa khô và bột trứng

Hương phẩm và mỹ phẩm

+

động vật

+ + + + + + + + + + +

+ + + +

+ + +

PHẦN 3: NGUYÊN VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGIÊN CỨU

3.1 - NGUYÊN VẬT LIỆU:

3.1.1- Dụng CuÏ

3.1.1.1- Dụng cụ thủy tinh

- Oáng Nghiệm - Lọ Thủy Tinh -Pipet, Micropipet

- Đĩa Petri - Đũa Thủy Tinh - Que Cấy - Đèn UV

- Becher - Erlen - Phễu - Cuvette

- Oáng Đong - Đèn Cồn - Lame, Lamel - Nhiệt kế

3.1.1.2- Các dụng cụ và thiết bị khác

- Cân Kỹ Thuật - Cân Phân Tích - Bếp Điện - Tủ Sấy - Bóp Cao Su

- Tủ Lạnh - Tủ Cấy Vô Trùng - Tủ Aám - Kẹp - Máy Ly Tâm

- Nồi Hấp Triệt Trùng - Nồi Chưng Cách Thủy

- Máy Đo PH - Giấy lọc - Máy Đo Mật Độ Quang…

3.1.2- Hóa Chất

K2HPO4, KH2PO4, NaNO3, Na2CO3 K2SO4, NaCl, KCl, FeSO4.7H2O,

MgSO4.7H2O, HCl, NaOH, HgCl2, Acid Tricloacetic, Tyrosine, Folin-Ciocateau,

BSA, Cồn, H3PO3, Acid acetic, Acid Boric, (NH4)2SO4, Glucose, Peptone, …

3.1.3- Nguyên Liệu Dùng Nuôi Cấy

- Cám gạo - Bột ngô - Khô đậu tương - Trấu - Nước cốt dừa (hộp)

- Bã bia (phụ lục 1) - Mật rỉ đường (phụ lục 2)

3.1.4- Nguồn Gốc Các Chủng Nấm Mốc (do Trung Tâm Công Nghệ Sau

Thu Hoạch cung cấp)

1- Aspergillus oryzae BC : Từ bột cá của công ty CP-VN

2- Aspergillus oryzae (28)-1: Từ thức ăn hỗn hợp cho gà của công ty Higrô 352

3- Aspergillus oryzae BKMCP-5: Từ bã khoai mì của công ty CP-VN

4- Aspergillus awamori TAP-3 : Từ tấm lấy tại An Phú

5- Aspergillus awamori 544-2: Từ thức ăn hỗn hợp cho vịt của công ty CP-VN

6- Aspergillus awamori BSCC-2: Từ nguyên liệu bột sò lấy tại củ chi

7- Aspergillus niger BD16s-3: Từ nguyên liệu bánh dầu lấy tại Hố Nai

8- Aspergillus niger T14 C2-10: Từ thức ăn hỗn hợp cho vịt của công ty Con Cò

9- Aspergillus candidus BB1s-5: Từ nguyên liệu bột bắp lấy tại Đồng Tháp

10- Aspergillus candidus T31s-9: Từ nguyên liệu tấm lấy tại Hóc Môn

• Đặc Điểm Các Loài Nấm Mốc Đã Chọn

1-Aspergillus oryzae :(Ahlburg) Cohn

a)- Đặc điểm nuôi cấy

- Khuẩn lạc trên môi trường Czapek (25oC 61oC, 10 ngày tuổi)

+ Tốc độ mọc: nhanh

+ Kích thước: (56)cm

+ Dạng khuẩn lạc: bột mịn, dày

+ Màu sắc: Mặt phải: màu xanh green, khi non màu vàng lục sáng (olive yellow,

khi già màu deep olive-buff

Mặt trái: không màu hay màu của khuẩn lạc

+ Sắc tố ra môi trường: không có

+ Số lượng, cách sắp xếp của đầu, hạch nấm, thể quả: mọc từ môi trường, đầu

tỏa tia

- Đầu: hình cầu tỏa tia, hình trụ khi già Kích thước (200400)x(50120)µm-hình

trụ hoặc (75200)µm – hình cầu

- Cuống: màu nâu vàng, vách tương đối mỏng, có gai nhám Kích thước

(500750)x(7,522,5)µm

- Bọng: hình cầu đến nửa cầu Kích thước (2537,5)µm Vùng sinh sản chiếm ¾

mặt bọng đến khắp mặt bọng

- Thể bình: 1 tầng (đa số) hoặc 2 tầng

+ lớp 1: hình trụ Kích thước (33,5)x(810)µm

+ lớp 2: hình chai, cổ hơi thuôn Kích thước (2,53)x(7,510)µm

- Bào tử: hình ellip (đa số) đến cầu, gần cầu khi già, vách dày, có gai Kích

thước (5,57,5)x5µm – ellip, (35,5)µm – hình cầu

b)- Đặc điểm phân loại

Giới : Mycotae (Fungi)

Ngành : Amastigomycota (Deuteromycota)

Lớp : Deuteromycetes (Fungi imperfecti)

Bộ : Plectascales (Moniliales = Eurotiales = Aspergillales)

Họ : Moniliaceae (Aspergillaceae)

Giống : Aspergillus

Loài : Aspergillus oryzae

2-Aspergillus awamori :Nakazawa

a)- Đặc điểm nuôi cấy

- Khuẩn lạc trên môi trường Czapek (25oC 61oC, 6 ngày tuổi)

+ Tốc độ mọc: trung bình

+ Kích thước: (66,4)cm

+ Dạng khuẩn lạc: bột , phân vánh rõ, gồ ở trung tâm

Mặt trái: trắng bẩn, phân vành rõ, nhăn nhúm ở giữa

+ Sắc tố ra môi trường: không có

+ Số lượng, cách sắp xếp của đầu, hạch nấm, thể quả: mọc từ môi trường, đầu

tỏa tia đa số, khi già xé rách nhiều tạo dạng cột

- Đầu: hình tỏa tia, xé rách khi già Kích thước (100200)x(100175)µm

- Cuống: màu nâu Kích thước (125650)x(12,515) µm

- Bọng: hình cầu, vách mỏng Kích thước (4052,5)µm Vùng sinh sản khắp mặt

bọng

- Thể bình: 2 tầng

+ lớp 1: hình tam giác ngược Kích thước (7,214)x(2,53)µm

+ lớp 2: hình chai, cổ thót lại thành ống dài Kích thước (4,89,6)x(2,5)µm

- Bào tử: hình cầu, gần cầu, có gai xù xì Kích thước (33,5)µm

b)- Đặc điểm phân loại

Giới : Mycotae (Fungi)

Ngành : Amastigomycota (Deuteromycota)

Lớp : Deuteromycetes (Fungi imperfecti)

Bộ : Plectascales (Moniliales = Eurotiales = Aspergillales)

Họ : Moniliaceae (Aspergillaceae)

Giống : Aspergillus

Loài : Aspergillus awamori

3-Aspergillus niger : VanTiegh

a)- Đặc điểm nuôi cấy

- Khuẩn lạc trên môi trường Czapek (25oC 61oC, 10 ngày tuổi)

Mặt trái: không màu, điểm rải rác đốm màu vàng

+ Sắc tố ra môi trường : không có

+ Số lượng, cách sắp xếp của đầu, hạch nấm, thể quả: mọc từ môi trường, đầu

hình cầu tỏa tia đa số, cuống thẳng Đầu xé rách nhiều khi già tạo dạng cột

- Đầu: hình cầu tỏa tia, hình trụ (xé rách khi già) Kích thước (450620)µm

- Cuống: vách cuống dày, màu nâu gần bọng Kích thước

(8501750)x(1524)µm

- Bọng: hình cầu Kích thước (4560)µm Vùng sinh sản khắp mặt bọng

- Thể bình: 2 tầng

+ lớp 1: hình trụ dài Kích thước (17,525,5)x(4,55,5)µm

+ lớp 2: hình chai Kích thước (710)x(33,5)µm

- Bào tử: hình cầu đa số, có gai rõ, vách dày, màu đen carbon Kích thước

(45)µm

b)- Đặc điểm phân loại

Giới : Mycotae (Fungi)

Ngành : Amastigomycota (Deuteromycota)

Lớp : Deuteromycetes (Fungi imperfecti)

Bộ : Plectascales (Moniliales = Eurotiales = Aspergillales)

Giống : Aspergillus

Loài : Aspergillus niger

4-Aspergillus candidus :Link

a)- Đặc điểm nuôi cấy

- Khuẩn lạc trên môi trường Czapek (nhiệt độ nuôi cấy 25oC61oC, 10 ngày tuổi)

+ Tốc độ mọc: chậm

+ Dạng khuẩn lạc: dạng nhung dày

+ Kích thuớc: (2,22,7)cm

+ Màu sắc: Mặt phải: màu vàng anh nhạt, gần Pale Ochraceus Buff và

Naphtalence Yellow

Mặt trái: màu vàng hơi ánh nâu, gần Amber Yellow và ở vùng

mép có màu Ivory Yellow, ở tâm màu vàng đậm hơn

+ Sắc tố ra môi trường : không có

+ Số lượng, cách sắp xếp của đầu, hạch nấm, thể quả: mọc từ môi trường, đầu

rất nhỏ, tỏa tia hình cầu, cuống dày

- Đầu: hình cầu tỏa tia, nhỏ Kích thước (2030)µm-đầu nhỏ, 100125µm -đầu

trung bình

- Cuống: cuống thẳng, có vách ngăn rõ, vách cuống dày (510)µm Kích thước

(120375)x(912)µm

- Bọng: hình cầu nhỏ Kích thước (9,626,4)µm Vùng sinh sản khắp mặt bọng

- Thể bình: 2 tầng, sắp xếp không đều về kích thước và hình dạng

+ lớp 1: hình trụ cụt, thỉnh thoảng có vách ngăn Kích thước (9,612)x(4,86)µm

+ lớp 2: hình chai Kích thước: (4,87,2)x2,4)µm

b)- Đặc điểm phân loại

Giới : Mycotae (Fungi)

Ngành : Amastigomycota (Deuteromycota)

Lớp : Deuteromycetes (Fungi imperfecti)

Bộ : Plectascales (Moniliales = Eurotiales = Aspergillales)

Họ : Aspergillaceae

Giống : Moniliaceae (Aspergillaceae)

Loài : Aspergillus candidus

3.1.5- Môi Trường Sử Dụng

1- Môi trường Czapek-Dox (g/l): saccarose : 30

NaNO3 : 3

K2SO4 : 1 MgSO4.7H2O : 0.5 KCl : 0.5 Fe.7H2O : 0.01 Agar : 20 Nuớc : 1lít

PH : 7,3

2- Môi trường PGA (Môi trường giữ giống)

Chất chiết khoai tây : 200ml Agar : 20g glucose : 20g Nước cất : 1 lít

Chuẩn bị chất chiết khoai tây: đun sôi 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ

trong 1lít nước cất sau 30 phút, lọc qua vải thưa lấy dịch lỏng Đó chính là chất

chiết khoai tây

Trộn đều với các thành phần khác rồi đun sôi để hòa tan Hấp triệt trùng ở

121oC/15 phút

3- Môi trường Gelatin (Môi trường định tính protease)

Nước cất :1 lít NaCl : 3g

K2HPO4 : 1,5g

KH2PO4 : 1,5g Gelatin : 10g Glucose : 0,05g Peptone : 0,1g Nước thịt : 5ml Agar : 15g

4- Môi trường nước cốt dừa

Dùng loại nước cốt dừa được đóng hộp sẵn (có thành phần chính trong 100g

như sau: chất béo 15g, carbonhydrat 3g, protein 2g) khi sử dụng pha thêm nước

theo tỉ lệ 1:1 và thêm agar 25g trong 1 lít môi trường

3.2- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1- Làm Thuần Chủng Giống

- Pha loãng bào tử nấm mốc trong dung dịch nước muối sinh lý 90/oo

- Vortex, dùng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ tế bào rồi pha

loãng ở những nồng độ thích hợp sao cho có thể thu được khuẩn lạc rời (15

- Cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường Czapek-Dox

- Uû ở nhiệt độ thường, sau 23 ngày, ta chọn khuẩn lạc mọc tốt nhất cấy

chuyền qua ống nghiệm chứa môi trường Czapek-Dox

- Chờ mọc rồi tiếp tục chọn, cấy khuẩn lạc mọc rời để chọn tiếp khuẩn lạc

tốt

- Qua 4 lần chọn, ta được dòng thuần và đem cấy vào ống nghiệm chứa môi

trường PGA – xem đây là ống gốc, trước khi thí nghiệm được cấy truyền sang

ống nghiệm chứa môi trường Czapek-Dox để thí ngghiệm

3.2.2- Sơ Tuyển Giống Phân Giải Protein Cao Từ 10 Chủng Ban Đầu -

Phương Pháp Định Tính Tương Đối Căn Cứ Vào Vòng Phân Giải Của

Khuẩn Lạc

3.2.2.1- Nguyên tắc:

Xác định khả năng phân giải protein của khuẩn lạc với nguồn cơ chất sử

dụng là gelatin (môi trường gelatin) Nếu chủng có khả năng phân giải gelatin

thì khi cho thuốc thử HgCl2 vào sẽ xuất hiện một vòng trong suốt xung quanh

khuẩn lạc Vòng càng lớn thì biểu hiện khả năng phân giải gelatin càng cao

Hiệu suất phân giải gelatin (a/b, cm) được thể hiện qua tỷ số giữa đường kính

vòng phân giải (a,cm) và đường kính khuẩn lạc (b, cm)

3.2.2.2- Thuốc thử HgCl 2

- HgCl2 : 15g

- HCl : 20ml (có thể thay HCl bằng acid picric 1% hay (NH4)2SO4 bão

hòa trong nước)

- Nước cất :100ml

3.2.2.3- Cách tiến hành