——————^>-=>«:!‹»=—= == Si TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẢN THƠ WĐ KHOA DƯỢC LBM HOA PHAN TÍCH - KIỀM NGHIỆM - ĐỘC CHẤT BAI BAO CAO SEMINAR DOC CHAT HOC UNG DUNG CAC KY THUAT SAC KY DE PHAN TICH CHAT DOC PSILOCYBIN VA PSILOCIN TRONG “NAM THAN”
Hướng dẫn: PGs.Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ
Thực hiện: Nhóm 5 — Dược K45
ý
Y h
A
ý
Y ;
Can Thơ — 8/2022
=o S(O —
Trang 2TRUONG DAI HOC Y DUOC CAN THO KHOA DƯỢC LBM HOA PHAN TÍCH - KIEM NGHIEM - ĐỘC CHAT «ee BAI BAO CAO SEMINAR DOC CHAT HOC UNG DUNG CAC KY THUAT SAC KY DE PHAN TICH CHAT DOC PSILOCYBIN VA PSILOCIN TRONG “NAM THAN”
STT Họ và tên MSSV
1 Huynh Thanh Huynh 1953030019
3 Huynh Kim Lan 1953030027
5 Nguyên Hồ Trung Nhân 1953030042
7 Truong Phu Vinh 1953030096
Trang 3MUC LUC
Trang
Trang phu bia
MUC LUC <4 A4 ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTT 2-2-©2+z2cszseczxesrx iii ID.9/:8)/10/09 (0:79) 4.4 v 9:8)00/99 (0.1.0 .- vi 0v À0) 08 ốố 1
1 Nguồn gốc, thành phần hóa học, tính chất lý h6a .cc.cccsccccsssesssessssssessseesssessesssseesseen 3
By on 3
1.2 Thanh phan hoa học trong cây “nắm thẦn” 2:22 5++V++2E++EE+++Ex++Exrrzrrerxersrer 4
In oan nổ ố ố ố ố .ằ.ằ- 5 1.2.2 PSIÌOCIT Ăn HT nh TH HH HH TH TH HH TH HH Hà Hi Hà kh 7
1.3 Điều chế và tổng hợp -¿ -s:- +: 22++S+tSE13211921112211211121122111211211E 111111211211 11 cre 7
Trang 4DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHU VIET TAT Stt Chir viet Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt tắt 1 5-HT 5-hydroxytryptamine 2 CE Collision Energy 3 DMT N-dimethyltrytamine
4 DP Decoding Potential Tiém nang giai ma
5 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Phản ứng miễn dịch
Assay enzyme
6 GC-MS Gas Chromatography— Mass hé thong sắc ký -
Spectrometry quang khoi pho
7 HAT Hypoxanthine-Aminopterin-
Thymidine
8 HPLC High-Performance Liquid Sac ky long hiéu nang
Chromatography cao
9 IS Internal Standard Tiêu chuẩn nội
10 LC-MS Liquid Chromatography— Mass Sắc ký lỏng - khối phố
Spectrometry
11 LC-MS/MS Liquid Chromatography - Tandem Sắc ký lỏng khối phố
Mass Spectrometry song song
Trang 5
Stt Chir viet — Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt tất
19 RT Retention Time Thời gian lưu
20 SIM Selected lon Monitoring Kĩ thuật phân tích dầu
vết
21 TMS Trimethylsilyl
22 UGTs Uridine 5'-diphospho-
Trang 6DANH MUC CAC BANG
Bảng 3 1 Tiến trình rửa giải gradient cho hiệu suất cực cao sắc ký lỏng — khéi phé song bUI800050 40060.570.101 22 Bảng 3 2 Quá trình chuyên đổi theo dõi nhiều phản ứng (MRM) và thời gian lưu của
Trang 7DANH MUC CAC HINH
¡S80 0.10) N6 6 “4dHẠAHHAHÂẲH HH 3 Hình 1 2 Nắm phiến đốm xanh - 2-2 22522 S222 E+EEZEEEE2E22212122112242212223222222Xe2 4 Hình 1 3 Cầu trúc của psiloeybin 2 2¿2s-©s<22222k2212221221122122112212211 221 21.224.2Xe2 5 Hình 1 4 Con đường sinh tông hợp của psilocybin ở “nắm thần” -. - 6 Hình 1 5 Cầu trúc của psiloei - 2-22 ©7s2x222122k221222122112212211221221111 21.221 1e 7
Hình 2 1 Sự chuyên hóa của psilocybin trong cơ thẺ .2222552©2s+2sz2csz>se2 9
Hình 3 1 Đặc điểm hình thái của các loại nắm được sử dụng trong nghiên cứu này l1 Hình 3 2 Tóm tắt tông hợp các dẫn xuất haptenic và sự liên hợp của chúng với các protein mang dé tao ra mAbs chong lại Pyb (tuyến A) và Psi (tuyến B) 12
Hinh 3 3 ELISA đề xác định hàm lượng Pyb và Psi trong nắm - 2-2 13
Hình 3 4 Phản ứng nhóm Hydroxyl (Silyl hóa) với MSTFA -.2 52©5<552 l5
Hình 3 5 So sánh khối phô của dẫn xuất psiloeybin-TMS và của một hợp chất từ dịch Chit MUG COU fWNNnả ÔÒỎ 18 Hình 3 6 Sắc ký đồ ion của dịch chiét huyét thamh 0 0 0c.ccccccccccesseessecsesseesseseeeeeeens 18
Hình 3 7 Các sắc ký đồ theo dõi ion đã chọn của psilocin (a) va psilocybin (b) trong nam gây ảo giác được phân tích bằng công nghệ sắc ký khí - khối phô 25
Trang 8DAT VAN DE
Trong “trào lưu” sử dụng một số ma túy mới như bánh lười, lá khát hiện nay “nắm
thần” cũng đang nổi lên như một thú vui sành điệu của bộ phận giới trẻ Điều nguy hiểm
hơn là có rất nhiều trang mạng giới thiệu cách trồng, nơi mua, thậm chí cam kết sẵn sảng vận chuyển cho những ai đặt từ 3 gam nắm trở lên, đồng thời có nhiều video chia sẻ cách chuân bị, cách sử dụng và báo trước những “trải nghiệm” khi sử dụng loại nắm này [15]
Được trồng làm chất gây nghiện và ứng dụng điều trị cho một số bệnh lý thần kinh trung
ương nên “ngộ độc nắm” là việc không thể tránh khỏi và thường gặp nhất ở các nước chau Au
“Nam than” là một loại ma túy mới nguy hiểm hay còn được gọi dưới nhiều tên như:
“Nắm áo giác”, “Nắm ma thuật”, “Nắm thức thần” mọc tự nhiên tại khả nhiều nơi trên
thế giới như Bắc mỹ, Mexico, Nam Mỹ, bán đảo Scandinavia và vài vùng tại Châu Á,
người dân Châu Mỹ đã sử dụng nấm thần rất lâu trước khi người Châu Âu đặt chân đến
vùng đất mới này [43] Có nhiều trường hợp tử vong do sử dụng quá liều “nắm thần”, trong đó psilocin và psilocybin là hai hoạt chất có trong cây nắm đã bị đưa vào Công
ước Liên Hiệp Quốc từ năm 1971 và hiện bị cấm tại hầu hết các quốc gia trên thế giới
Ở Viét Nam, psilocybin va psilocin co trong danh myc cam từ năm 1995 [44] Với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, con người biết ứng dụng các phương pháp kỹ thuật sac ky dé phan tich chat déc psilocin va psilocybin có trong “nam than”
Năm 1981, Michael Wiliam Beug va Jeremy Bigwood da str dung phuong phap sac ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng đề phân tích định lượng psiloeybin va psilocin co trong loai Psilocybe baeocystis [5] Nam 1999, Thomas Keller va cong sự đã phân tich psilocybin va psilocin trong cây Psilocybe subecubensis bằng phép đo phô di động
ion và sắc ký khí - khối phố [21] Năm 2021, Liying Zhou và cộng sự đã ứng dụng ưu
thế của kỹ thuật sắc ký trong việc phân tích định lượng chất độc psilocin và psilocybin
x À
Trang 9nhiên ở Việt Nam [44] Tuy nhiên chưa có một công bô nào trong nước về việc sử dụng
x Alo
phương pháp sắc ký trong phân tích chất độc trong “nấm thần” Vì thế chúng tôi quyết
định tiễn hành bàn luận về việc “Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký để phân tích chất độc
3092
Trang 101 Nguồn gốc, thành phần hóa học, tính chất lý hóa
1.1 Nguồn gốc [44]
“Nấm thần” còn được gọi với nhiều cái tên nhu “Nam Psilocybe”, “Nam ảo giác”,
“Nấm ma thuật” hay “Nắm thức thần” mọc tự nhiên tại khá nhiều nơi trên thế giới như
Bắc my, Mexico, Nam My, ban dao Scandinavia va vài vùng tại Châu A, dac biét cũng
có thể tìm thay trong tự nhiên ở Việt Nam
x Ao
Trong tự nhiên “nâm thân” có rât nhiêu loại, ở Việt Nam có loại khá phô biên:
— Nấm vàng Cuba (Psilocybe cubensis): có màu nâu đỏ phớt hoặc nâu phớt vàng
Mũ nắm rộng từ 1,5 —- I0 cm, hình nón hoặc hình oval Khi khô màu sắc biến đôi
sang trắng nâu hoặc trắng vàng, cũng có thể vàng hoàn toàn hoặc nâu vàng Thịt nắm có màu trắng, đối màu xanh dương khi bị đập Bào tử có màu nâu tím thẫm cho tới đen Thường mọc trên phân gia xúc như trâu, bò, ngựa hoặc trên các chất nền như xác thực vật, như xơ dừa
Hinh 1 1 Nam vang Cuba
— Nam phién dém xanh (Panaeolus cyanescens): mi nam cé duong kinh từ 1,5 — 4 cm, không dẻo, có màu hơi nâu khi âm, màu xám hoặc trắng khi khô Bảo tử có màu tham den, khi bam dập có màu xanh dương, mặt dưới mũ màu xám cho tới đen, mặt có vết chấm Thường mọc trên hoặc gần các bãi phân gia xúc Phân bố ở các vùng
Trang 11Hinh 1 2 Nam phién dém xanh 1.2 Thành phần hóa học trong cây “nắm thần”
Trong “nắm thần” có rất nhiều hoạt chất điên hình như: baeocystin, norbaeoeystin, psilocybin, psilocin, aeruginascin, các chất này là các tryptamine alkaloid ảnh hưởng lên hệ thần kinh và gây ra “một trải nghiệm ảo giác” cho những người dùng
Psilocybe pelliculosa chứa hợp chất psiloeybin và baeocystin, và được sử dụng như một thuốc tiêu khiến [15] Về hiệu lực thần kinh, nó được coi là loài “tương đối yếu” Nông độ psilocybin đã được báo cáo nằm trong khoảng từ 1,2 —- l,7 mg trên l g nắm
khô, trong khi baeocystin được đo là 0,04% [6] Theo một số báo cáo từ những năm
1960, nam khéng tao ra psilocybin khi qua thể được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
[25]
Beug va Bigwood ciing bao cao vé néng d6 cua cac hop chat nay trong Psilocybe baeocystis bằng cách sử dụng HPLC pha đáo và sắc ký lớp mỏng [5] Khoảng nồng độ của các hợp chất tác động đến thần kinh từ các nghiên cứu này được báo cáo là 0,15 — 0,85% psilocybin, lên đến 0,59% psilocin và 0,10% baeocystin
Ngoài ra aeruginascin — mét dẫn xuất tương tự psilocybin cũng được tìm thấy trong nam Inocybe aeruginascens [19]
Trong chu dé nảy nhóm chúng tôi chỉ bàn luận xoay quanh 2 hoạt chất được tìm thay
ở hơn 200 loài “nấm thần” đó là psilocybin và psilocin
Trang 121.2.1 Psilocybin a Tính chất vật lý
Psilocybin tinh khiét là một loại bột kết tỉnh, màu trắng [35] Có hai dạng đa hình
tinh thé đã biết của psilocybin, cũng như các pha ngậm nước được báo cáo [34] Hợp chất được báo cáo có điểm nóng chảy từ 220 — 228°C [30], và có vị hơi giống amoniac
Psilocybin là một alkaloid có thể hòa tan trong nước, metanol, etanol và cồn nước,
nhưng không tan trong các dung môi hữu cơ như cloroform và ete dầu mỏ [41] Giá trị
pKa của nó được ước tính là 1,3 và 6,5 đối với hai nhóm OH photphat liền kể và 10,4
đôi với nitơ dimetylamin, vì vậy nói chung nó là một ion lưỡng tính [32]
Hinh 1 3 Cau tric cha psilocybin
Tiếp xúc với ánh sáng có hại cho sự ôn định của dung địch nước psilocybin, và sẽ làm cho nó bị oxy hóa nhanh chóng - một điều quan trọng cần cân nhắc khi sử dụng nó
làm chất chuân phân tích [2]
b Tính chất hóa hoc
Trang 13Psilocybin là một hợp chất tryptamine có cấu trúc hóa học chứa một vòng indole liên kết với một nhóm thể etylamin Nó có liên quan về mặt hóa học với axit amin tryptophan, và có cầu trúc tương tự như serotonin dẫn truyền thần kinh Psilocybin là một thành viên của nhóm các hợp chất dựa trên tryptophan nói chung, ban đầu có chức năng như chất chống oxy hóa ở các dạng sống sớm hơn trước khi đảm nhận các chức năng phức tạp hơn ở các sinh vật đa bào, bao gồm cả con người [3]
Về mặt sinh tông hợp, ở “nắm thần” sự biến đổi sinh hóa từ tryptophan thành psilocybin liên quan đến một số phản ứng enzym như: khử cacboxyl hóa; metyl hóa ở vị
trí N số 9; 4 - hydroxyl hóa và O - phosphoryl hóa Các thí nghiệm dán nhãn đồng vị từ
những năm 1960 gợi ý rằng quá trình khử carboxyl tryptophan là bước sinh tông hợp ban đầu và quá trình O - phosphoryl hóa là bước cuối cùng [1], [9], nhưng các phân tích
gần đây về các enzym phân lập chứng minh rằng quá trình khử O - phosphoryl hóa là
budc thir ba 6 P cubensis [12] Trinh ty cua cac bước enzym trung gian đã được Fricke
và cộng sự chứng minh là có sự tham gia cua 4 loai enzym khac nhau (PsiD, PsiH, Psik
va PsiM) 6 P cubensis và P cyanescens, mặc dù con đường sinh tông hợp có thể khác nhau giữa các loài [12], [20] Các enzym này được mã hóa trong các cụm gen ở Psilocybe, Panaeolus va Gymnopilus [33] Decarboxylation Methylation Oxidation Phosphorylation \ \ l H, NH; NH; N- ‘N- HO v2 ‘NY r^ - ae 0 E fr \eo i [ i 0° | Ai ATA TS — y4 LAW LY | | H `ZN - ZN 3 `ZN 3 8\ ANN 7 H
L-Tryptophan Tryptamine Dimethyltryptamine Psilocin Psilocybin
Trang 141.2.2 Psilocin a Tính chất vật lý
Psilocin tương đổi không bền trong dung dịch do nhóm hydroxy phenol (-OH) của nó Khi có oxy, nó đễ dàng tạo thành các sản phâm phân hủy màu xanh và đen sẫm [22] Các sản phẩm tương tự cũng được tạo thành trong môi trường acid với sự có mặt của
oxy và ion Fe 3+ (thuốc thử Keller)
b Tính chất hóa hoc
Psilocin là một alkaloid gây ảo giác được phân lập với lượng rất ít từ nắm Psilocybe Nó có vai trò như chất gây ảo giác, chất chủ vận hệ serotonergie, chất chuyên hóa từ nắm, chất chuyên hóa xenobiotie ở người và chất chuyên hóa thuốc Nó là một alkaloid tryptamin mang nhóm thế hydroxy bồ sung ở vị trí 4, một hợp chất amin bậc ba, một dẫn xuất của hydroxyindoles và của phenol Nó có nguồn gốc từ N, N - đimethyvianptamine [24I H;C ọ \y-CH; Hinh 1 5 C4u trúc của psilocin 1.3 Điều chế và tổng hợp
Osamu Shirota và các đồng nghiệp đã báo cáo một phương pháp tông hợp quy mô
lớn psilocybin mà không cần tính chế sắc ký vào năm 2003 [35] Bắt đầu với 4 -
hydroxyindole, ho tạo ra psilocybin từ psilocin với năng suất 85%, một sự cải thiện rõ
Trang 152 Độc tính, cơ chế gây độc và xử trí ngộ độc “Nắm thần” 2.1 Độc tính
Độc tính nắm Psilocybe thê hiện sau khi ăn từ I-2g nắm khô; tương đương với khoáng 2-8mg psilocybin được chuyển đổi thành psilocin [37] Phần lớn psilocin được
bài tiết trong vòng 3-4 giờ sau khi uống và bị loại bỏ hoàn toàn khỏi cơ thể trong vòng
24 giờ [16]
Một nghiên cứu giả dược (2004) được Hasler và cộng sự thực hiện bằng cách chia psilocybin thành các mức liều khác nhau: rất thấp (45 ng/kg/“thê trọng), thấp (115 ug/kg/thé trọng), liều trung bình (215 ng/kg thê trọng) và liều cao (315 ng/kg/thê trọng) cho thấy được sự ảnh hưởng của psilocybin đến trạng thái ý thức và các thông số sinh lý là phụ thuộc vào liều lượng Liều uống độc hại có thê gây buồn ngủ, tăng thay đổi tâm
trạng, thay đôi trạng thái ý thức, suy nhược, chóng mặt, buồn nôn và nôn [16] Nghiên cứu còn chỉ ra, các liều vượt quá l5 mg tạo ra trải nghiệm ảo giác mạnh mẽ
được gọi là “chuyến đi nắm” trong đó có sự kích động mạnh, phương thức cảm giác
được trộn lẫn, các ảo ảnh và những thay đôi về cảm xúc được tăng lên, thời gian bị biến dạng và thay đổi nhận thức thị giác Những tác động này có thể kết hợp và dẫn đến tử
vong hoặc tai nạn không chủ y [16]
2.2 Cơ chế gây độc