Bài Báo Cáo Seminar Độc Chất Học Ứng Dụng Các Kỹ Thuật Sắc Ký Để Phân Tích Chất Độc Psilocybin Và Psilocin Trong “Nấm Thần”.Pdf

Có nhiều trường hợp tử vong do sử dụng quá liều “nắm thần”, trong đó psilocin và psilocybin là hai hoạt chất có trong cây nắm đã bị đưa vào Công ước Liên Hiệp Quốc từ năm 1971 và hiện bị

CHAT DOC PSILOCYBIN VA PSILOCIN TRONG “NAM THAN”

Hướng dẫn: PGs.Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ

TRUONG DAI HOC Y DUOC CAN THO

KHOA DƯỢC LBM HOA PHAN TÍCH - KIEM NGHIEM - ĐỘC CHAT

«ee

BAI BAO CAO SEMINAR DOC CHAT HOC

UNG DUNG CAC KY THUAT SAC KY DE PHAN TICH CHAT DOC PSILOCYBIN VA PSILOCIN TRONG “NAM THAN”

MUC LUC

Trang

Trang phu bia

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTT 2-2-©2+z2cszseczxesrx iii ID.9/:8)/10/09 (0:79) 4.4 v 9:8)00/99 (0.1.0 .- vi 0v À0) 08 ốố 1

1 Nguồn gốc, thành phần hóa học, tính chất lý h6a .cc.cccsccccsssesssessssssessseesssessesssseesseen 3

1.2 Thanh phan hoa học trong cây “nắm thẦn” 2:22 5++V++2E++EE+++Ex++Exrrzrrerxersrer 4

In oan nổ ố ố ố ố .ằ.ằ- 5 1.2.2 PSIÌOCIT Ăn HT nh TH HH HH TH TH HH TH HH Hà Hi Hà kh 7

1.3 Điều chế và tổng hợp -¿ -s:- +: 22++S+tSE13211921112211211121122111211211E 111111211211 11 cre 7

2 Độc tính, cơ chế gây độc và xử trí ngộ độc “Nắm thẳn” -2-©2cc+2ccccccecrcee 8

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHU VIET TAT

5 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Phản ứng miễn dịch

6 GC-MS Gas Chromatography— Mass hé thong sắc ký -

Thymidine

10 LC-MS Liquid Chromatography— Mass Sắc ký lỏng - khối phố

Spectrometry

11 LC-MS/MS Liquid Chromatography - Tandem Sắc ký lỏng khối phố

12 LLOQ Lower Limit Of Quantification Gidi han Dinh luong

Stt Chir viet — Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt tất

vết

glucuronosyltransferase

DANH MUC CAC BANG

Bảng 3 1 Tiến trình rửa giải gradient cho hiệu suất cực cao sắc ký lỏng — khéi phé song bUI800050 40060.570.101 22 Bảng 3 2 Quá trình chuyên đổi theo dõi nhiều phản ứng (MRM) và thời gian lưu của

chất phân tích và chất chuẩn nội (IS) cho UHPLC—MS/MS -5 5-55-55z25+2 22

DANH MUC CAC HINH

¡S80 0.10) N6 6 “4dHẠAHHAHÂẲH HH 3 Hình 1 2 Nắm phiến đốm xanh - 2-2 22522 S222 E+EEZEEEE2E22212122112242212223222222Xe2 4 Hình 1 3 Cầu trúc của psiloeybin 2 2¿2s-©s<22222k2212221221122122112212211 221 21.224.2Xe2 5 Hình 1 4 Con đường sinh tông hợp của psilocybin ở “nắm thần” -. - 6 Hình 1 5 Cầu trúc của psiloei - 2-22 ©7s2x222122k221222122112212211221221111 21.221 1e 7

Hình 2 1 Sự chuyên hóa của psilocybin trong cơ thẺ .2222552©2s+2sz2csz>se2 9

Hình 3 1 Đặc điểm hình thái của các loại nắm được sử dụng trong nghiên cứu này l1 Hình 3 2 Tóm tắt tông hợp các dẫn xuất haptenic và sự liên hợp của chúng với các protein mang dé tao ra mAbs chong lại Pyb (tuyến A) và Psi (tuyến B) 12

Hinh 3 3 ELISA đề xác định hàm lượng Pyb và Psi trong nắm - 2-2 13

Hình 3 4 Phản ứng nhóm Hydroxyl (Silyl hóa) với MSTFA -.2 52©5<552 l5

Hình 3 5 So sánh khối phô của dẫn xuất psiloeybin-TMS và của một hợp chất từ dịch Chit MUG COU fWNNnả ÔÒỎ 18 Hình 3 6 Sắc ký đồ ion của dịch chiét huyét thamh 0 0 0c.ccccccccccesseessecsesseesseseeeeeeens 18

Hình 3 7 Các sắc ký đồ theo dõi ion đã chọn của psilocin (a) va psilocybin (b) trong nam gây ảo giác được phân tích bằng công nghệ sắc ký khí - khối phô 25

vi

DAT VAN DE

Trong “trào lưu” sử dụng một số ma túy mới như bánh lười, lá khát hiện nay “nắm

thần” cũng đang nổi lên như một thú vui sành điệu của bộ phận giới trẻ Điều nguy hiểm

hơn là có rất nhiều trang mạng giới thiệu cách trồng, nơi mua, thậm chí cam kết sẵn sảng vận chuyển cho những ai đặt từ 3 gam nắm trở lên, đồng thời có nhiều video chia sẻ cách chuân bị, cách sử dụng và báo trước những “trải nghiệm” khi sử dụng loại nắm này [15]

Được trồng làm chất gây nghiện và ứng dụng điều trị cho một số bệnh lý thần kinh trung

ương nên “ngộ độc nắm” là việc không thể tránh khỏi và thường gặp nhất ở các nước chau Au

“Nam than” là một loại ma túy mới nguy hiểm hay còn được gọi dưới nhiều tên như:

“Nắm áo giác”, “Nắm ma thuật”, “Nắm thức thần” mọc tự nhiên tại khả nhiều nơi trên

thế giới như Bắc mỹ, Mexico, Nam Mỹ, bán đảo Scandinavia và vài vùng tại Châu Á,

người dân Châu Mỹ đã sử dụng nấm thần rất lâu trước khi người Châu Âu đặt chân đến

vùng đất mới này [43] Có nhiều trường hợp tử vong do sử dụng quá liều “nắm thần”, trong đó psilocin và psilocybin là hai hoạt chất có trong cây nắm đã bị đưa vào Công

ước Liên Hiệp Quốc từ năm 1971 và hiện bị cấm tại hầu hết các quốc gia trên thế giới

Ở Viét Nam, psilocybin va psilocin co trong danh myc cam từ năm 1995 [44] Với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, con người biết ứng dụng các phương pháp

kỹ thuật sac ky dé phan tich chat déc psilocin va psilocybin có trong “nam than” Năm 1981, Michael Wiliam Beug va Jeremy Bigwood da str dung phuong phap sac

ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng đề phân tích định lượng psiloeybin va psilocin

co trong loai Psilocybe baeocystis [5] Nam 1999, Thomas Keller va cong sự đã phân tich psilocybin va psilocin trong cây Psilocybe subecubensis bằng phép đo phô di động

ion và sắc ký khí - khối phố [21] Năm 2021, Liying Zhou và cộng sự đã ứng dụng ưu

thế của kỹ thuật sắc ký trong việc phân tích định lượng chất độc psilocin và psilocybin

x À

có trong tóc người sử dụng “nắm thần” [42] Đặc biệt có thể tìm thấy khá nhiều trong tự

nhiên ở Việt Nam [44] Tuy nhiên chưa có một công bô nào trong nước về việc sử dụng

x Alo

phương pháp sắc ký trong phân tích chất độc trong “nấm thần” Vì thế chúng tôi quyết

định tiễn hành bàn luận về việc “Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký để phân tích chất độc

3092

psilocybin va psilocin trong “nam than”” dé lam tiên đề cho các nghiên cứu về sau

1 Nguồn gốc, thành phần hóa học, tính chất lý hóa

1.1 Nguồn gốc [44]

“Nấm thần” còn được gọi với nhiều cái tên nhu “Nam Psilocybe”, “Nam ảo giác”,

“Nấm ma thuật” hay “Nắm thức thần” mọc tự nhiên tại khá nhiều nơi trên thế giới như

Bắc my, Mexico, Nam My, ban dao Scandinavia va vài vùng tại Châu A, dac biét cũng

có thể tìm thay trong tự nhiên ở Việt Nam

x Ao

Trong tự nhiên “nâm thân” có rât nhiêu loại, ở Việt Nam có loại khá phô biên:

— Nấm vàng Cuba (Psilocybe cubensis): có màu nâu đỏ phớt hoặc nâu phớt vàng

Mũ nắm rộng từ 1,5 —- I0 cm, hình nón hoặc hình oval Khi khô màu sắc biến đôi

sang trắng nâu hoặc trắng vàng, cũng có thể vàng hoàn toàn hoặc nâu vàng Thịt nắm

có màu trắng, đối màu xanh dương khi bị đập Bào tử có màu nâu tím thẫm cho tới đen Thường mọc trên phân gia xúc như trâu, bò, ngựa hoặc trên các chất nền như xác thực vật, như xơ dừa

Hinh 1 1 Nam vang Cuba

— Nam phién dém xanh (Panaeolus cyanescens): mi nam cé duong kinh từ 1,5 — 4

cm, không dẻo, có màu hơi nâu khi âm, màu xám hoặc trắng khi khô Bảo tử có màu tham den, khi bam dập có màu xanh dương, mặt dưới mũ màu xám cho tới đen, mặt

có vết chấm Thường mọc trên hoặc gần các bãi phân gia xúc Phân bố ở các vùng

khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt ở cả 2 bán câu Băc Nam

Hinh 1 2 Nam phién dém xanh 1.2 Thành phần hóa học trong cây “nắm thần”

Trong “nắm thần” có rất nhiều hoạt chất điên hình như: baeocystin, norbaeoeystin, psilocybin, psilocin, aeruginascin, các chất này là các tryptamine alkaloid ảnh hưởng lên hệ thần kinh và gây ra “một trải nghiệm ảo giác” cho những người dùng

Psilocybe pelliculosa chứa hợp chất psiloeybin và baeocystin, và được sử dụng như một thuốc tiêu khiến [15] Về hiệu lực thần kinh, nó được coi là loài “tương đối yếu” Nông độ psilocybin đã được báo cáo nằm trong khoảng từ 1,2 —- l,7 mg trên l g nắm

khô, trong khi baeocystin được đo là 0,04% [6] Theo một số báo cáo từ những năm

1960, nam khéng tao ra psilocybin khi qua thể được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

[25]

Beug va Bigwood ciing bao cao vé néng d6 cua cac hop chat nay trong Psilocybe baeocystis bằng cách sử dụng HPLC pha đáo và sắc ký lớp mỏng [5] Khoảng nồng độ của các hợp chất tác động đến thần kinh từ các nghiên cứu này được báo cáo là 0,15 — 0,85% psilocybin, lên đến 0,59% psilocin và 0,10% baeocystin

Ngoài ra aeruginascin — mét dẫn xuất tương tự psilocybin cũng được tìm thấy trong nam Inocybe aeruginascens [19]

Trong chu dé nảy nhóm chúng tôi chỉ bàn luận xoay quanh 2 hoạt chất được tìm thay

ở hơn 200 loài “nấm thần” đó là psilocybin và psilocin

4

1.2.1 Psilocybin

a Tính chất vật lý

Psilocybin tinh khiét là một loại bột kết tỉnh, màu trắng [35] Có hai dạng đa hình

tinh thé đã biết của psilocybin, cũng như các pha ngậm nước được báo cáo [34] Hợp chất được báo cáo có điểm nóng chảy từ 220 — 228°C [30], và có vị hơi giống amoniac

Psilocybin là một alkaloid có thể hòa tan trong nước, metanol, etanol và cồn nước,

nhưng không tan trong các dung môi hữu cơ như cloroform và ete dầu mỏ [41] Giá trị

pKa của nó được ước tính là 1,3 và 6,5 đối với hai nhóm OH photphat liền kể và 10,4

đôi với nitơ dimetylamin, vì vậy nói chung nó là một ion lưỡng tính [32]

làm chất chuân phân tích [2]

b Tính chất hóa hoc

Psilocybin (N - dimethyvianptamine) là một tiền chất được chuyên đổi thành psiloein

có hoạt tính được lý trong cơ thể bằng phản ứng dephosphoryl hóa Phản ứng hóa học này diễn ra trong điều kiện có tính acid mạnh, hoặc trong điều kiện sinh lý trong cơ thê, thông qua hoạt động của các enzym được gọi là phosphatase kiềm [13]

Psilocybin là một hợp chất tryptamine có cấu trúc hóa học chứa một vòng indole liên kết với một nhóm thể etylamin Nó có liên quan về mặt hóa học với axit amin tryptophan,

và có cầu trúc tương tự như serotonin dẫn truyền thần kinh Psilocybin là một thành viên của nhóm các hợp chất dựa trên tryptophan nói chung, ban đầu có chức năng như chất chống oxy hóa ở các dạng sống sớm hơn trước khi đảm nhận các chức năng phức tạp hơn ở các sinh vật đa bào, bao gồm cả con người [3]

Về mặt sinh tông hợp, ở “nắm thần” sự biến đổi sinh hóa từ tryptophan thành psilocybin liên quan đến một số phản ứng enzym như: khử cacboxyl hóa; metyl hóa ở vị

trí N số 9; 4 - hydroxyl hóa và O - phosphoryl hóa Các thí nghiệm dán nhãn đồng vị từ

những năm 1960 gợi ý rằng quá trình khử carboxyl tryptophan là bước sinh tông hợp ban đầu và quá trình O - phosphoryl hóa là bước cuối cùng [1], [9], nhưng các phân tích

gần đây về các enzym phân lập chứng minh rằng quá trình khử O - phosphoryl hóa là

budc thir ba 6 P cubensis [12] Trinh ty cua cac bước enzym trung gian đã được Fricke

và cộng sự chứng minh là có sự tham gia cua 4 loai enzym khac nhau (PsiD, PsiH, Psik

va PsiM) 6 P cubensis và P cyanescens, mặc dù con đường sinh tông hợp có thể khác nhau giữa các loài [12], [20] Các enzym này được mã hóa trong các cụm gen ở Psilocybe, Panaeolus va Gymnopilus [33]

L-Tryptophan Tryptamine Dimethyltryptamine Psilocin Psilocybin

Hình 1 4 Con đường sinh tông hợp của psilocybin 6 “nam than”

1.2.2 Psilocin

a Tính chất vật lý

Psilocin tương đổi không bền trong dung dịch do nhóm hydroxy phenol (-OH) của

nó Khi có oxy, nó đễ dàng tạo thành các sản phâm phân hủy màu xanh và đen sẫm [22] Các sản phẩm tương tự cũng được tạo thành trong môi trường acid với sự có mặt của

oxy và ion Fe 3+ (thuốc thử Keller)

b Tính chất hóa hoc

Psilocin là một alkaloid gây ảo giác được phân lập với lượng rất ít từ nắm Psilocybe

Nó có vai trò như chất gây ảo giác, chất chủ vận hệ serotonergie, chất chuyên hóa từ nắm, chất chuyên hóa xenobiotie ở người và chất chuyên hóa thuốc Nó là một alkaloid tryptamin mang nhóm thế hydroxy bồ sung ở vị trí 4, một hợp chất amin bậc ba, một dẫn xuất của hydroxyindoles và của phenol Nó có nguồn gốc từ N, N - đimethyvianptamine [24I

Osamu Shirota và các đồng nghiệp đã báo cáo một phương pháp tông hợp quy mô

lớn psilocybin mà không cần tính chế sắc ký vào năm 2003 [35] Bắt đầu với 4 -

hydroxyindole, ho tạo ra psilocybin từ psilocin với năng suất 85%, một sự cải thiện rõ

rệt so với sản lượng được báo cáo từ tong hop truée do [21], [26], [38]

7

là phụ thuộc vào liều lượng Liều uống độc hại có thê gây buồn ngủ, tăng thay đổi tâm

trạng, thay đôi trạng thái ý thức, suy nhược, chóng mặt, buồn nôn và nôn [16] Nghiên cứu còn chỉ ra, các liều vượt quá l5 mg tạo ra trải nghiệm ảo giác mạnh mẽ

được gọi là “chuyến đi nắm” trong đó có sự kích động mạnh, phương thức cảm giác

được trộn lẫn, các ảo ảnh và những thay đôi về cảm xúc được tăng lên, thời gian bị biến dạng và thay đổi nhận thức thị giác Những tác động này có thể kết hợp và dẫn đến tử

vong hoặc tai nạn không chủ y [16]

2.2 Cơ chế gây độc

Phân tử psilocybin là nguyên nhân gián tiếp gây ra các đặc tính gây ảo giác của Psilocybe Sau khi uống hợp chất psilocybin, các phosphatase kiềm có trong hệ tiêu hóa của cơ thé, thận và có thê trong máu sẽ dễ dàng phân cắt liên kết phosphoryl ester khỏi psilocybin, tạo ra hop chat hydroxyl, psilocin Psilocin là chất hóa học chịu trách nhiệm chính cho tác dụng gây ảo giác của Psilocybe [27]

Hình 2 1 Sự chuyên hóa của psilocybin trong co thé

Serotonin — một chất dẫn truyền thần kinh điều chính tâm trang của chúng ta, có cầu

trúc hóa học gần giông với psilocin Psilocin khác biệt chủ yếu bởi nhóm hydroxyl di

chuyên một carbon và bô sung hai nhóm metyl làm cho phân tử này càng thân dầu, có khả năng vượt qua vỏ màng lipid của hệ thần kinh trung ương [23] Sau khi psilocybin được tiêu hóa và khử phosphoryl thành psilocin, cơ chế gây độc cho não là chủ vận trực tiếp lên các thy thé serotonin 5-HT Dé giai thich cơ chế này, phân tử psiloein về cơ bán bắt chước phân tử serotonin, liên kết với các thụ thê 5-HT và bắt đầu phản ứng tương tự như serotonin và dẫn đến cảm giác hưng phân khi uống "chất chủ vận" này [27] Psilocybin và psilocin đều có hoạt tính chủ vận trên các thy thé serotonin 5-HT2A/C

và 5-HTIA trong não, với ái lực cao hơn với thụ thể 5-HT2A/C [39] Thụ thê này chịu

trách nhiệm gây ra các tác dụng gây ảo giác [11] Psilocin là một chất chủ vận từng phần

trên 5-HT2A, nhưng nó cũng có tính chủ vận ở các thụ thể serotonin khác, với ít tác dụng

dopaminergic hoặc noradrenergic [37] Thời gian khởi phát tác dung cua psilocin la tr

20 đến 40 phút, và nồng độ đỉnh đạt được sau khoảng 80 phút [10], [39] Những hoạt

động này giải thích sự khởi đầu của kích thích giao cảm, chẳng hạn như nhịp tim nhanh

và tăng huyết áp, cùng với các tác dụng gây ảo giác [37]

Trước khi bài tiết, psilocin được tiếp tục glucuronid bởi các enzyme nội chất - UDP glucuronosyltransferase (UGTs) thanh psilocin-o-glucuronide va 6 dang nay 80% nó được bài tiết ra khỏi cơ thé [39] Các tác dụng tâm sinh lý của psilocin thường giảm trong

vòng khoảng 3-6 giờ sau khi nó được bài tiết ra khỏi cơ thé [10]

sẽ giảm dần trong vòng 3-6 giờ [16]

Khi kích động, lo lắng, thay đôi tâm trạng và rồi loạn tâm thần là một số triệu chứng chính liên quan đến việc ăn phải chất độc, liệu pháp không dùng thuốc cho bệnh nhân có

thê bao gồm việc được đặt trong phòng ít ánh sáng, yên tĩnh để giảm kích thích

Rửa dạ dày, hoặc sử dụng 25-100g than hoạt tính trong nước, có thê được sử dụng

để loại bỏ bất kỳ chất nào còn sót lại trong dạ dày có thê có [10] Đề việc cấp cứu có

hiệu quá, bệnh nhân phái đến khoa cấp cứu trong vòng 60 phút sau khi uống

Một tỷ lệ lớn psiloein được đào thải qua thận, do đó chạy thận nhân tạo có thể là một lựa chọn, đặc biệt ở bệnh nhân suy thận

Benzodiazepine co thoi gian tac dụng dài hơn va lam tăng tác dụng phụ là những lựa

chọn phụ tối ưu đối với việc đào thải nhanh của psilocin ra khỏi cơ thê Tuy nhiên, nếu bệnh nhân không đáp ứng với liệu pháp benzodiazepine, thuốc chống loạn thần như

haloperidol, ziprasidone và olanzapine là những lựa chọn hiệu quả khác |4], [40]

10

3 Phan tích, so sánh các phương pháp định tính, định lượng psilocybin và psilocin trong “nam thần”

3.1 Phuong phap mién dich

3.1.1 Chuan bi mau

Mẫu nắm

P cubensis, một loại nằm ma thuật thường được tiêu thụ, được nuôi trồng trong NIHS

(Hình 3 7 A) Bốn loại nấm sau đây được trồng đề làm thực phẩm được mua tai thi

trường Nhật Bản (Hình 3 7 Ø): Lentinula edodes (nắm đông cô), Agaricus bisporus (nam trang), Grifola frondosa (nắm khiêu vũ), và một biến thể của Aurieularia aurieula- judae (nấm tai mây) Toàn bộ quá thê của những cây nắm này được làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày, và sau đó ở 49C trong 4 ngày Sau đó, chúng được nghiền thành bột đồng nhất bằng cối

đưới bên phải)

Chuẩn bị các chất liên hợp hapten-chất mang miễn dịch

Các liên hợp hapten-chất mang, Pyb-BSA, Psi-BSA, và Psi-KLH, được sử dụng cho chất sinh miễn dịch, được chuẩn bị như tóm tắt trong Hình 3 2

11