Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau. Các hợp chất này bao gồm những đại phân tử như protein, acid nucleic, lipid,… cũng như các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ. Những hợp chất trên có thể hiện diện ở số lượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme) hay ở số lượng nhiều (các protein cấu tạo). Người ta muốn biết các thành phần hóa học của tế bào, nhằm hiểu rõ các quy trình biến đổi căn bản của nó, qua đó giúp cuộc sống ngày càng thêm tốt đẹp. Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách các tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học. Từ đó, kỹ thuật tách riêng các hợp chất ra đời với tên gọi sắc ký (chromatography). Ngày nay, sắc ký đã được sử dụng để tách tất cả các hợp chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn.
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ TRONG NGHIÊN CỨU HÓA SINH HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU NỘI DUNG .5 Tổng quan kỹ thuật sắc ký 1.1 Lịch sử sắc ký .5 1.2.Định nghĩa sắc ký 1.3 Phân loại phương pháp sắc ký 1.3.1 Theo chất vật lý pha 1.3.2.Theo tượng sắc ký 1.3.3.Theo kỹ thuật phương tiện sắc ký .8 Các kỹ thuật sắc ký 10 2.1.Sắc ký giấy 10 2.2.Sắc ký lớp mỏng 12 2.3.Sắc ký cột: 16 2.4 Sắc ký trao đổi ion 18 2.5.Sắc ký gel .20 2.6 Sắc ký lực 21 HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 2.7 Sắc ký tương tác kỵ nước 22 2.8 Sắc ký khí 23 2.9 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 25 2.9.1 Sắc ký phân bố hiệu nâng cao .27 2.9.2 Sắc ký hấp phụ hiệu nâng cao (sắc ký lỏng - rắn LSC) 27 2.9.3.Sắc ký trao đối ion hiệu nâng cao (IEC) 27 2.9.4 Sắc ký lỏng hiệu nâng cao gel (sốc ký loại cỡ SEC) 27 2.10 So Sánh Giữa Kỹ Thuật Sắc Ký Lỏng Cao Áp (HPLC) Sắc Ký Khí (GC) 28 Ứng dụng 29 3.1 Ứng dụng phân tích 29 3.1.1 Ứng dụng sắc ký lực phân tích thực phẩm .29 3.2 Ứng dụng thu nhận tinh 30 3.2.1 Ứng dụng sắc ký cột .30 3.2.1.1.Tinh chế acid amin 30 3.2.1.2 Ứng dụng tinh kháng sinh 31 3.2.1.3 Phân tách glucose fructose 32 3.2.1.4 Tinh glycerol 33 3.2.1.5 Tinh fructose syrup 34 3.2.1.6 Tinh protein 34 3.2.1.6.Tách chiết hợp chất rượu cao phân tử 35 3.2.1.7.Quá trình tái sinh nhựa trao đổi ion 36 3.2.1.8.Tách chiết glucose từ mật rỉ đường .36 HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang 3.3.2 Ứng dụng sắc ký lực 37 3.2.2.1 Tinh protein 39 3.2.2.2.Tinh interferon 41 3.2.2.3.Tinh kháng thể 42 Một số ứng dụng cụ thể phương pháp sắc ký 43 4.1.Ứng dụng sắc ký lực tinh protease 43 4.1.1.Nguyên lý 43 4.1.2 Các matrix thường dùng .46 4.2.3 Ligand sử dụng để tinh protease sắc ký lực .47 4.1.4 Một số phương pháp cố định ligand matrix 49 4.1.4.1 Cố định ligand thơng qua tác nhân hoạt hóa cyanogen bromide .50 KẾT LUẬN 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .55 HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang MỞ ĐẦU Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác Các hợp chất bao gồm đại phân tử protein, acid nucleic, lipid,… hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ Những hợp chất diện số lượng nhỏ, dạng vết (enzyme) hay số lượng nhiều (các protein cấu tạo) Người ta muốn biết thành phần hóa học tế bào, nhằm hiểu rõ quy trình biến đổi nó, qua giúp sống ngày thêm tốt đẹp Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học Từ đó, kỹ thuật tách riêng hợp chất đời với tên gọi sắc ký (chromatography) Ngày nay, sắc ký sử dụng để tách tất hợp chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang NỘI DUNG Tổng quan kỹ thuật sắc ký 1.1 Lịch sử sắc ký Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett cho dung dịch sắc tố thực vật ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy sắc tố bị hấp phụ lên đầu cột Khi cho ete dầu hoả lên cột, sắc tố di chuyển cột từ xuống dưới, sắc tố có tốc độ riêng, tách thành vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành hệ mà Tvest gọi sắc đồ Ơng đặt tên cho phương pháp tách sắc ký (Chromatography) Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa chất màu, graphein có nghĩa viết Tên gọi ngày sử dụng phương pháp dùng tách chất không màu Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách hợp chất mang điện tích theo trọng lượng phân tử chúng Đến năm 1964, Moor gọi “gel permeation chromatography” hay gọi sắc ký lọc gel Năm 1906, sắc ký khí biết đến đến 1952, kỹ thuật phát triển mạnh mẽ, thập niên 1960 Năm 1967, Horvath C tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp 1.2.Định nghĩa sắc ký HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang Sắc ký nhóm phương pháp hoá lý dừng để tách thành phần hỗn hợp Sự tách sắc ký dựa phân chia khác chất khác vào hai pha ln tiếp xúc khơng hồ lẫn vào nhau: pha tĩnh pha động (Trong thí nghiệm Tvest: pha tĩnh canxi cacbonat, pha động ete dầu hoả) Pha tĩnh trì hỗn di chuyển thành phần mẫu Khi thành phần di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng tách khỏi theo thời gian Mỗi thành phần qua hệ thống khoảng thời gian riêng biệt, gọi thời gian lưu Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp chuyên chở chất lỏng khí thành phần tách phân bố khác pha chất hòa tan chúng chảy qua pha tĩnh rắn lỏng Nhiều kỹ thuật khác dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa tính khác chất mơi trường động khí lỏng môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua giấy, gelatin hay gel magnesium silicate, Sắc ký phương pháp để phân tách tinh phân tử sinh học Sắc ký phương pháp nhanh, dễ dàng không ảnh hưởng đến protein, phương pháp đề nghị nghiên cứu định lượng protein hay phân tử Các giai đoạn trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm giai đoạn chính: a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat) Các chất giữ pha tĩnh b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động kéo theo chất di chuyển pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi có vị trí khác pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram) Giai đoạn gọi khai triển sắc ký Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua chất bị kéo ngồi pha tĩnh (ví dụ: khỏi cột) Đó q trình rửa giải HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang dung mơi dùng dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng cuối cột gọi dịch rửa giải (eluate) Nếu chất tách pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta lấy phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột cột) đem chiết lấy chất Nếu chất tách pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta hứng thu lấy phân đoạn dịch rửa giải có chất cần phân tích c) Phát chất: Các chất màu phát dễ dàng, chất khơng màu phát đèn tử ngoại hay thuốc thử Trong sắc ký rửa giải phát chất chúng khỏi cột cách cho dung dịch rửa giải qua phận phát gọi detector đặt sau cột 1.3 Phân loại phương pháp sắc ký 1.3.1 Theo chất vật lý pha Pha động chất lỏng hay chất khí Pha tĩnh chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay chất lỏng (được giữ chất mang rắn) Do đó, dựa vào chất pha ta phân biệt phương pháp (trong tên phương pháp, pha động nêu trước pha tĩnh): Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC) Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC) Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC) Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC) 1.3.2.Theo tượng sắc ký HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh chất rắn có khả hấp phụ, phương pháp sắc ký lỏng - rắn khí - rắn Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh chất lỏng không hoà lẫn với pha động, chất lỏng bao bề mặt chất rắn gọi giá hay chất mang phải chất trơ, không tham gia vào sắc ký Sắc ký phân bố bao gồm sắc ký lỏng - lỏng sắc ký khí - lỏng Sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh chất nhựa trao đổi ion chớp chất cao phân tử có mang ion có khả trao đổi với ion dấu dung dịch hỗn hợp sắc ký) Sắc ký theo loại cỡ (size - exclusion chromatography): gọi sắc ký gel Các phân tử cỡ lớn loạt phân tử nhỏ tách theo kích thước phân tử nhỏ di chuyển chậm 1.3.3.Theo kỹ thuật phương tiện sắc ký Phương pháp giữ pha tĩnh: Sắc ký cột (column chromatography: CC) pha tĩnh chứa cột kim loại hay thuỷ tinh Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh tráng giữ mặt phẳng thuỷ tinh, nhựa hay nhôm Lớp mỏng pha tĩnh thường là: silicagel, nhôm oxit, cenlulose, chất nhựa trao đổi lớn có chiều dày khoảng 0,25 - 0,5mm Sắc ký giấy (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) thấm loại giấy lọc đặc biệt gọi giấy sắc ký Theo cách cho pha động chạy: HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép chất chạy tách pha tĩnh (Sắc đồ nằm pha tĩnh) Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy kép chất ngồi pha tính (ra khỏi cột, khỏi giấy) Tốc độ di chuyển chất, peak hình dáng peak Tốc độ di chuyển chất Tốc độ di chuyên chất đặc trưng hệ số phân bố hai pha đại lượng lưu giữ chất pha tĩnh (thời gian lưu, thể tích lưu) a Thời gian lưu thể tích lưu Thời gian lưu thời gian cần để chất di chuyển qua cột sắc ký, khỏi cột nhờ thiết bị detector ghi nhận tín hiệu xuất rực sắc đồ (tính từ lúc bơm mẫu đến xuất peak) Tm thời gian lưu chất không bị lưu giữ, nghĩa tốc độ di chuyển tốc độ di chuyển trung bình dung mơi, thời gian gọi thời gian chết tR lớn, chất bị lưu giữ mạnh tốc độ di chuyển nhỏ b Hệ số phân bố Trong đó: Cs Cm nồng độ chất tan pha tĩnh pha động cân thiết lập Khi nồng độ nhỏ K phụ thuộc vào chất pha, chất tan nhiệt độ K lớn chất phân bố nhiều pha tĩnh di chuyển chậm Peak hình dáng peak a Hình dáng peak: Hình dáng lý tưởng tức lực đối xứng, thực tế lúc sắc ký gần đối xứng Chiều rộng tục đo 1/10 chiều cao peak HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 10 Wash with 12.5 liters of 0.15 and 0.5 M NaCl Elute with 12.5 liters of M NaCl Concentrate on Pellicon cassette system to 500 ml Pasteurize with addition of citrate to 0.5 M pH 7.55, 10 h 60oC Desalt on Sephadex G-50 2.5 liter column 750ml solution Sterile filter Lyophilize Fisher Newsholme (72) phát triển quy trình kết hợp rửa tách enzyme adenosine kinase từ hệ thống sắc ký lọc gel vào hấp phụ enzyme lên 5’ – AMP – Sepharose 4B cột sắc ký lực Dung dịch đệm sử dụng suốt trình tinh bao gồm 4mM Na2H2PO4, 2mM EDTA 5% glycerol pH 7.0 nhiệt độ oC Enzyme adenosine kinase rửa tách khỏi cột sắc ký thu dung dịch đệm chứa 0.6mM enzyme Quá trình sắc ký lực calmodulin cố định xem phương pháp tinh nhanh seminalplasmin bò đến độ tinh 99% Quá trình rửa giải seminalplasmin khỏi calmodulin cố định địi hỏi cần phải có mặt EDTA 4M urea dung dịch đệm Hai loại enzyme malate dehydrogenase 3-hydroxybutyrate dehydrogenase thu từ chất chiết Rhodopseudomonas spheroides tinh cột sắc ký lực phối tử màu liên tiếp Enzyme 3-hydroxybutyrate dehydrogenase rửa tách dung dịch KCl 1M enzyme malate dehydrogenase tách sau dung dịch đệm có chứa thêm 2mM NADH Với kỹ thuật sắc ký lực thu 3-hydroxybutyrate dehydrogenase với hiệu suất 80% dùng phương pháp khác trình tinh phải trải qua giai đoạn riêng biệt hiệu suất đạt 9% HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang 41 3.2.2.2.Tinh interferon Knight Fahey (75) sử dụng Blue Sepharose Cl-4B trình tinh lực interferon từ nguyên bào sợi người Interferon hấp phụ lên vật liệu lực dung dịch NaCl 2M protein tạp khác khơng Interferon tinh khiết sau rửa tách khỏi Blue Sepharose dung dịch ethylen glycol 50% Dung dịch khỏi cột sắc ký thu nhận vào dung dịch đệm cho tạo dung dịch có chứa 37% ethylen glycol interferon bền dung dịch ethylen glycol 37% Thêm cột sắc ký sử dụng nhằm thu dung dịch có nồng độ interferon cao Sản phẩm thu có hoạt tính 5x108 đơn vị/mg Bảng 3: Purification of Human Fibroblast Interferon (75) 3.2.2.3.Tinh kháng thể Sắc ký lực sử dụng cho việc tinh kháng thể với kháng nguyên chất mang Những kháng thể cố định sử dụng tinh protein enzyme Trong điều kiện lý tưởng, cột sắc ký lực giúp phân tách kháng thể khỏi hỗn hợp thô qua bước thực Proteins Purified on Immuno Affinity Columns (38) HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 42 Một số ứng dụng cụ thể phương pháp sắc ký 4.1.Ứng dụng sắc ký lực tinh protease 4.1.1.Nguyên lý Đầu tiên ligand liên kết đồng hóa trị với matrix khơng hịa tan, hạt agarose, sau matrix cho vào cột sắc k…Hỗn hợp dung dịch chứa protein cần tinh cho vào cột xảy tương tác protein với ligand cố định matrix, protein bị giữ lại matrix, chất không tương tác với matrix chảy qua cột Sự tương có tính đặc HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 43 thù thuận nghịch Protein tách khỏi matrix cách làm yếu liên kết chúng phương pháp giửa giải khác Sự tương tác sinh học ligand phân tử tinh kết liên kết tĩnh điện tương tác kỵ nước, lực van der Waals liên kết hydro Để rửa giải sử dụng ligand cạnh tranh đặc trưng, không cạnh tranh cách thay đổi pH, nồng độ ion phân cực để phá vỡ liên kết Qui trình thực Hình 1: Các bước sắc ký lực Bước 1: Chọn môi trường lực Chọn mơi trường có sẵn (ligand liên kết sẵn với matrix) Nếu khơng có phải chọn ligand thích hợp để tạo môi trường lực đặc hiệu Ổn định môi truờng lực dung dịch đệm liên kết (binding buffer) Bước 2: Chuẩn bị môi trường dung dịch đệm HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 44 Việc tái sử dụng mơi trường lực cần phải phụ thuộc vào chất mẫu Lưu tránh chất béo Bước 3: Chuẩn bị mẫu chạy mẫu Chuẩn bị mẫu: Mẫu cần làm trước chạy sắc k Nếu nên kiểm tra lực ligand với protease cần tách Sau đó, hiệu chỉnh pH mẫu loại bỏ thành phần gây gián đoạn liên kết Chạy mẫu: Chạy mẫu dưói điều kiện tối ưu cho tr.nh liên kết phân tử cần tách với ligand Cần phải kiểm sốt tốc độ d.ng chảy, thể tích mẫu không ảnh hưởng đến hiệu liên kết Bước 4: Rửa giải Thu hồi protease mục tiêu cách thay đổi điều kiện thích hợp cho q trình rửa giải Có nhiều phương pháp rửa giải, khơng có phương pháp chung định Có thể tiến hành tr.nh rửa giải đặc hiệu cách sử dụng ligand cạnh tranh tr.nh rửa giải không đặc hiệu cách thay đổi pH, lực ion độ phân cực Kết thu protease dạng tinh cô đặc Phương pháp 1: Thay đổi dung dịch đệm Phương pháp 2: Thay đổi pH nồng độ tác nhân cần cho trình rửa giải Phương pháp gây hại cho ligand Phương pháp 3: Thêm chất cạnh tranh liên kết Phương pháp cải thiện tính đặc hiệu mơi trường mà sử dụng nhóm ligand đặc hiệu Các phương pháp rửa giải có tính chọn lọc ứng dụng kết hợp với nhóm ligand đặc hiệu - Rửa giải pH Sự thay đổi pH có ảnh hưởng đến mức độ ion hố cac nhóm ligand protease liên kết Sự thay đổi tác động trực tiếp đến vị trí liên kết, tác động gián tiếp đến thay đổi lực thay đổi cấu h.nh Giảm pH phương pháp thường sử dụng để rửa giải Tuy nhiên việc thu phân đoạn phải tiến hành điều kiện pH trung tính (ví dụ Tris-HCl 1M, pH 9) HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang 45 - Rửa giải lực ion Thường sử dụng NaCl (dung dịch đệm) để làm tăng lực ion Các enzym thường rửa giải với nồng độ thấp 1M NaCl - Rửa giải cạnh tranh Thường sử dụng để tách chất liên kết mơi trường đặc hiệu nhóm lực liên kết protein mục tiêu với ligand tương đối cao Chất rửa giải cạnh tranh liên kết với protein mục tiêu ligand Có thể sử dụng chất với nồng độ tăng theo gradient dạng xung Thường sử dụng nồng độ xấp xỉ với nồng độ ligand Nếu chất liên kết yếu phải sử dụng với nồng độ cao - Rửa giải với chất rửa giải có độ phân cực thấp: Thường sử dụng dioxane (≤10%) ethylen glycol (≤50%) - Rửa giải chaotroptic: Chỉ sử dụng không dùng phương pháp khác Phương pháp làm thay đổi cấu trúc protein rửa giải Các tác nhân thường dùng guanidin hydrocloride, ure Bước 5: Ổn định lại môi trường lực binding buffer 4.1.2 Các matrix thường dùng Matrix lực thường chuẩn bị liên kết đồng hóa trị ligand với chất rắn hỗ trợ Agarose hay Sepharose, Sephadex tinh bột chất rắn hỗ trợ tốt v chúng dễ tạo dẫn xuất với ligand khác Tuy nhiên gel agarose sử dụng nhiều v có độ bền cao cho phép đại phân tử xâm nhập dễ dàng Để chuẩn bị cột lực, matrix phải hoạt hóa để gắn ligand liên kết đồng hóa trị Trong số trường hợp, spacer arm dùng tr.nh hoạt hóa, sau ligand liên kết đồng hóa trị Liên kết thực nhiều phương pháp Bảng 4.10 đưa tác nhân HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 46 thường dùng để hoạt hóa matrix cố định ligand Tuy nhiên, matrix hoạt hóa đ thương mại hóa sử dụng tiện lợi phù hợp với ligand chọn Sản phẩm thương mại thường gặp là: Sepharose 4B, 6B: agarose liên kết ngang 4%, 6% tương ứng AH Sepharose: Sepharose có nhóm amine tự CH Sepharose: Sepharose có nhóm carboxyl tự CNBr-activated Sepharose: Sephaose hoạt hoá CNBr… Bảng 2: Một số tác nhân hoạt hóa matrix cố định ligand phổ biến 4.2.3 Ligand sử dụng để tinh protease sắc ký lực Với protease khác có ligand tương ứng Trong sắc k lực để tinh sạch, phân tách protease từ nguồn khác nhau, ligand thường sử dụng polypeptide antibiotics gramicidin S bacitracin Ngồi người ta cịn nghiên cứu tổng hợp ligand lực đặc hiệu từ dẫn xuất polypeptide Các peptide có cấu trúc giống cấu trúc chất enzym, đồng thời chứa liên kết kháng lại thuỷ phân protein Bảng 3: Một số ligand thường sử dụng sắc k lực HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang 47 Một số chất tổng hợp tương ứng với protease khác nhau: Subtilisin thermitase: Z-Ala-AIa-Leu-pNA (p-nitroanilide) Subtilisin-like serine protease: Ala-Ala-Leu-pNA Enzyme từ rễ bồ công anh kininase X: Glp-Ala-Ala-Leu-pNA α-Chymotrypsin: Suc-Phe-pNA Kallikrein: Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA Leu-aminopeptidase: Leu-pNA Trypsin b cua: Bz-D,L-Arg-pNA Protease PC papain: Glp-Phe-Ala-pNA Carboxypeptidase PC: DNP-Ala-Ala-Leu Tổng hợp số ligand: * Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O HOBt (1-hydroxybenzotriasol) (0.69 g, 5.16 mmol) hoà tan 5ml hỗn hợp THF (tetrahydrofuran)-DMF (1:10) (1) Boc-Leu-OH (1 g, 4.3 mmol) hoà tan 5ml THF (2) Hoà trộn (1) với (2) Hỗn hợp thu đem làm lạnh đến oC Sau thêm DCC hoà tan 3ml THF vào Cuối thêm mopholine (473 μL, 5.4 mmol) vào khuấy 15 phút 20oC Dicyclohexylurea kết tủa lọc ra, tách lấy dung mơi Phần cặn dầu c.n lại hồ tan 120ml HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang 48 ethylacetate Dung dịch sau rửa nước, b.o hồ NaHCO3 nước, làm khô với MgSO4 Cuối bốc dung môi, thu 0.91g Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O, hiệu suất 81% * H-Leu-N(CH2CH2)2O *HCl Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O (0.91 g, mmol) hoà tan 15ml HCl 3.4M dioxane Hỗn hợp khuấy 20oC Sau đó, dung mơi HCl bốc áp suất thấp HCl tách cách rửa lại bốc với methanol Phần c.n lại đem sấy khô chân không, thu 0.642g H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl, hiệu suất 90% * Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O 0.425g (3.15mmol) HBOt hoà tan trước 5ml hỗn hợp THF-DMF (5:1), thêm vào (ở 0oC) 0.926g (3.15 mmol) Z-Ala-Ala-OH 20ml THF khô Tiếp tục cho vào hỗn hợp 0.779 g (3.78 mmol) DCC (đ hoà tan 20ml THF), 0.749 g (3.15 mmol) H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl với 484 μL (3.46 mmol) triethylamine Khuấy hỗn hợp 20oC 15 giờ, sau lọc dicyclohexylurea Dịch lọc bốc áp suất thấp, hoà tan phần cặn dầu c.n lại 130ml ethyl acetate Dung dịch rửa với nước, b.o hoà với NaHCO3 làm khô với MgSO4 Cuối bốc áp suất thấp, thu 0.83g Z-Ala-Ala-LeuN(CH2CH2) 2O, hiệu suất 56% * Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O 508g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O hoà tan 7ml methanol, sau khí với ảgon thêm 50mg ch vào Dẫn H2 qua dung dịch 48 20oC Rồi thêm HCOOH để hạ pH xuống c.n 2-3 Lọc hỗn hợp bốc dung môi dưói áp suất thấp, thu 0.33g Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O, hiệu suất 95% 4.1.4 Một số phương pháp cố định ligand matrix HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 49 4.1.4.1 Cố định ligand thông qua tác nhân hoạt hóa cyanogen bromide Tác nhân phổ biến để liên kết ligand với matrix cyanogen bromide (CNBr) Nó phản ứng với nhóm hydroxyl Sepharose pH kiềm Phản ứng: Phản ứng CNBr phức tạp H.nh 4.9 thể chế việc hoạt hóa Agarose matrix chứa hydroxyl khác CNBr pH cao (khoảng 11), CNBr phản ứng với nhóm hydroxyl matrix để tạo thành phần hoạt hóa chính, cyanate ester, thành phần phụ khác, imidocarbonate (cyclic acyclic), carbamate carbonate Tuy nhiên, v.ng imidocarbonate chiếm ưu việc hoạt hóa dextran liên kết ngang cellulose Trong điều kiện kiềm nhẹ (pH 9-10), cyanate ester v.ng imidocarbonate phản ứng dễ dàng với nhóm amine ligand, kết tạo dẫn xuất isourease imidocarbonate thay tương ứng (h.nh 2) Các nhóm amino phản ứng trung tâm phản ứng này, v cần thiết phải tiến hành phản ứng pH – 10 Ở pH nhóm amino không nhận thêm proton Phản ứng cặp đôi không nên tiến hành dung dịch đệm chứa amine bản, tris, glycine ethanol amine V tác nhân cạnh tranh với ligand cố định Dung dịch đệm chọn thuồng sodium carbonate bicarbonate, điều kiện cặp đôi tối ưu pH 8.3 Sau ligand liên kết loại bỏ ligand thừa, nhóm hoạt hóa c.n lai matrix bị khóa lại cách thêm vào lượng dư amine nhỏ tris, glycine, ethanolamine… Ưu điểm: Việc hoạt hóa CNBr đơn giản ơn h.a cho việc liên kết phân tử sinh học nhạy cảm enzym, lectin kháng thể Hoạt hóa CNBr ứng dụng không với agarose, dextran hay Sephadex, mà c.n ứng dụng cho polymer tổng hợp chứa nhóm hydroxyl Một hoạt hóa ligand HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 50 nhỏ ligand có khối lượng phân tử lớn chứa amine liên kết Nhược điểm: Một nhược điểm matrix lực hoạt hóa CNBr ligand đ cố định bị rơi liên tục Liên kết yếu nguyên nhân không ổn định liên kết isoureas matrix hoạt hóa ligand Một nhược điểm khác matrix chúng hoạt động chất trao đổi anion yếu, làm thúc đẩy liên kết không đặc hiệu Điều làm cho dẫn xuất isourease tích điện dương pH trung h.a Hình 2: Cơ chế hoạt hóa agarose (hoặc polymer có nhóm hydroxyl) HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 51 CNBr Quy trình làm việc: Các tác nhân: - Cyanogen bromide (Aldrich, Milwaukee, WI) - Sepharose 4B 6B (Pharmacia) Sự hoạt hóa: (Lưu: CNBr có độc tính cao, phải tiến hành hoạt hóa CNBr thiết bị kín có van thơng tốt) B1 Rửa 100ml Sepharose 4B với lít nước đ de-ion hóa phễu thủy tinh làm khô B2 Tạo huyền phù gel 100ml sodium carbonate 2M becher B3 H.a tan 10g CNBr 5ml acetonitrile thêm dung dịch CNBr vào huyền phù gel khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy overhead paddle (Chú : không dùng cánh khuấy từ để tránh làm vỡ hạt gel) B4 Để phản ứng hoạt hóa tiếp tục phút nhiệt độ ph.ng B5 Rửa nhanh hạt gel đ hoạt hóa với lít nước đá lạnh, sau rửa với dung dịch đệm liên kết lạnh (sodium bicarbonate 0.1M, chứa NaCl 0.5M, pH 8.5) B6 Tiến hành cố định ligand Cố định ligand: B7 Tạo huyền phù gel đ hoạt hóa dung dịch đệm liên kết (sodium bicarbonate 0.1M, chứa NaCl 0.5M, pH 8.5) chứa protein (5-10mg/ml gel) Tiếp tục tạo phản ứng liên kết nhiệt độ ph.ng (hoặc qua đêm 4oC), khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy paddle B8 Rửa gel đ liên kết với dung dịch đệm liên kết, để loại bỏ ligand khơng liên kết B9 Khóa nhóm hoạt động c.n lại gel cách tạo huyền phù 100 HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 52 ml ethanolaminr 1M glycerine 0.2M, pH 8.0 nhiệt độ phòng B10 Rửa gel với dung dịch đệm liên kết, sau rửa với dung dịch đệm acetate 0.1M (pH 4.0) chứa NaCl 0.5M Và rửa lại với dung dịch đệm liên kết B11.Cuối rửa gel với nước Rửa tiếp với dung dịch đệm chọn cho trình sắc ký lực lectron, bỏ qua N-hydroxy-succinimide HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang 53 KẾT LUẬN Sắc ký kỹ thuật ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực giới Việt Nam tiếp cận kỹ thuật vào năm thập niên 80 Vì điều kiện sống ngày cao, nên địi hỏi phải có cơng nghệ kỹ thuật đáp ứng nhu cầu Bên cạnh có số người, lợi nhuận cá nhân mà bất chấp tất Ngày nay, để kiểm soát kiểm tra tình hình chất lượng hàng hố để đáp ứng nhu cầu sống như: thực phẩm, dược phẩm, hoá chất… Vì kỹ thuật sắc ký có vai trị lớn cơng tác kiểm tra, giám sát chất lượng mà kỹ thuật hoàn toàn đảm đương yêu cầu Ví dụ như: kiểm tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu bị cấm có thực phẩm mỹ phẩm như: Sudan có trứng gia cầm son mơi, MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) có nước tương, formone có bánh phở, xác định số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ phát triển nấm mốc gây độc (có độc tố Aflatoxin) lô hàng nông sản dự trữ xuất đặc biệt đậu tương lạc …Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất dược phẩm, dư luợng chất gây độc hại… Ngồi ứng dụng nhiều lĩnh vực khác quan trắc, mơi trường… Vì vậy, với mục đích sử dụng mà ta chọn phương pháp sắc ký phù hợp để phân tích mẫu tương ứng HVTH : Huỳnh Cơng Tài – Lê Hồng Thanh Vy Trang 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Separation and Purification technique in Biotechnology, Frederick Dechow, 1989 [2] Doury-Berthod, M., Poitrenaud, C., Tremillon, B., J Chromatography, 179:37 (1979) [3] Dutcher, J.D., Hosansky, N., Donin, M.H., et al., J Am Chem Sot, 73:1384 (1951) [4] Ghim, Y.S., Chang, H.N., Ind Eng Chem Fundam, 21:369 (1982) [5] Pietrzyk, D.J., Cahill, W.J., Jr., Stodola, J.D., J Liquid Chromatography, 5(3):443 (1982) HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang 55 ... 1.3.3.Theo kỹ thuật phương tiện sắc ký .8 Các kỹ thuật sắc ký 10 2.1 .Sắc ký giấy 10 2.2 .Sắc ký lớp mỏng 12 2.3 .Sắc ký cột: 16 2.4 Sắc ký trao... (sốc ký loại cỡ SEC) 27 2.10 So Sánh Giữa Kỹ Thuật Sắc Ký Lỏng Cao Áp (HPLC) Sắc Ký Khí (GC) 28 Ứng dụng 29 3.1 Ứng dụng phân tích 29 3.1.1 Ứng dụng sắc ký. .. Một nghiên cứu gần ứng dụng kỹ thuật sắc ký công nghiệp xử lý mật rỉ Neuzil Fergin (162), họ áp dụng kỹ thuật sắc ký liên tục UOP để thu hồi sucrose từ mật rỉ Trong phương pháp này, họ sử dụng