miễn dịch bài 3

Trang 1 KỸ THUẬT NGƯNG KẾT THƯỜNG SỬ DỤNG HA, HICHUẨN BỊ VẬT LIỆU Kháng nguyên chuẩn  Kháng thể gà cần chẩn đoán  Hồng cầu 1%, 10% Trang 2 CHUẨN BỊ DỤNG CỤ Vỉ nhựa 96 lỗ, đáy hình t

KỸ THUẬT NGƯNG KẾT

THƯỜNG SỬ DỤNG (HA, HI)

CHUẨN BỊ VẬT LIỆU

 Kháng nguyên chuẩn

 Kháng thể gà cần chẩn đoán

 Nước muối sinh lý ( 1 lít ) vô trùng

CHUẨN BỊ DỤNG CỤ

 Vỉ nhựa 96 lỗ, đáy hình tròn

 Micropipette một kênh lượng tối thiểu 50µl

 Đầu côn (tip)

 Bình tam giác hoặc cốc đong lọai 50cc

PHẢN ỨNG HA (Haemagglutination test)

Phản ứng ngưng kết hồng cầu

1) MỤC ĐÍCH CỦA PHẢN ỨNG HA

Giúp chúng ta nhận biết được :

 Sự hiện diện kháng nguyên

 Biết được hiệu giá của kháng nguyên

1) NGUYÊN LÝ Trên bề mặt virus Newcastle có cấu trúc kháng

nguyên Haemagglutine, có khả năng kết hợp với các thụ

thể trên bề mặt hồng cầu của loài gà, vịt làm ngưng

kết các loại hồng cầu này lại với nhau.

2) NGUYÊN TẮC CỦA PHẢN ỨNG

Là sự kết hợp trực tiếp giữa kháng nguyên và hồng

cầu Khi kháng nguyên và hồng cầu kết hợp với nhau sẽ

tạo những hạt lợn cợn màu hồng xung quanh thành giếng

của vỉ gọi là phản ứng HA dương, nếu không có kháng

nguyên thì hồng cầu tự đóng nút xuống đáy giếng gọi là

phản ứng HA âm, do đó phản ứng HA người ta gọi là

phản ứng ngưng kết hồng cầu.

THỬ PHẢN ỨNG HA NHANH TRÊN PHIẾN KÍNH

Đây là một test nhanh để xác định cĩ sự hiện diện của

kháng nguyên hay khơng Chuẩn bị:

 Phải có kháng nguyên cần sử dụng

CÁCH CHUẨN BỊ DUNG DỊCH HỒNG CẦU GÀ 1%

(tiếp theo)

CÁCH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG

Lấy một giọt kháng nguyên trước Cho một giọt hồng cầu 10%

KẾT QUẢ HA

HA DƯƠNG TÍNH

Lắc nhẹ lame để yên 1-2 phút đọc

kết quả, phản ứng ngưng kết lợn cợn

THỬ PHẢN ỨNG HA ĐỂ ĐỊNH HIỆU GIÁ

KHÁNG NGUYÊN Chuẩn bị:

 Phải có kháng nguyên cần sử dụng

SƠ ĐỒ PHẢN ỨNG HA

Lỗ

Các chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 Nước muối sinh lý

(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

2 Kháng nguyên

(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

3 Hồng cầu 1% (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Độ pha lỗng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 ĐC

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Bước 1: cho 50µl nước muối sinh lý vào giếng 1 đến

giếng 12

Bước 2: cho 50µl kháng nguyên vào giếng 1 sau đó

trộn đều bằng cách hút lên hút xuống nhiều

lần, hút 50µl qua giếng thứ 2 trộn đều, hút

qua giếng thứ 3, tiếp tục lập lại cho đến giếng

11 trộn đều hút 50µl bỏ đi, giếng 12 chỉ có

nước sinh lý.

Bước 3: cho 50µl hồng cầu vào giếng 1 cho đến giếng

12, lắc đều để yên từ 20-25 phút đọc kết quả

CÁCH ĐỌC KẾT QUẢ

CÁCH ĐỌC KẾT QUẢ

Theo hình trên ta đọc kết quả như sau:

 Dãy A có hiệu giá HA =1/512

 Dãy B có hiệu giá HA = 1/512

 Dãy C có hiệu giá HA = 1/512

Để có KN có độ pha loãng làm HI, được tính theo

công thức HA= n-2 (n là những giếng có HA dương

tính)

Theo kết quả trên hiệu giá HA =1/512 ta có n=9

HA= 9-2=7 vậy HA pha loãng đẻ làm HI=1/128

(dung dịch HA= 1cc kháng nguyên + 127 cc sinh lý)

PHẢN ỨNG HI (Haemagglutination inhibition test)

Phản ứng ngăn trở ngưng kết

hồng cầu

2) NGUYÊN TẮC CỦA PHẢN ỨNG

Là sự kết hợp trực tiếp giữa kháng

nguyên và kháng thể.

3) CÁCH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG

Chuẩn bị:

 Kháng thể cần chẩn đoán

 Kháng nguyên pha loãng

 Chuẩn bị hồng cầu 1%

MỤC ĐÍCH CỦA PHẢN ỨNG

- Xác định được hiệu giá của kháng thể

- Đáng giá được hiệu lực của vaccin

Các chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 Nước muối sinh lý

(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

2 Huyết thanh gà

(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

3 Kháng nguyên

pha lỗng (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Để yên 5 phút

4 Hồng cầu 1% (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Độ pha lỗng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 ĐC

Để yên ở nhiệt độ phịng 20  25 phút Đọc kết quả.

SƠ ĐỒ PHẢN ỨNG HI

…

…

… … …

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Bước 1: cho 50µl nước muối sinh lý từ giếng 1 đến

giếng 12

- Bước 2: cho 50µl kháng thể vào giếng 1 sau đó trộn

đều bằng cách hút lên hút xuống nhiều lần, hút 50µl qua giếng thứ 2 trộn đều, hút qua giếng thứ 3, tiếp tục lập lại cho đến giếng 10 trộn đều hút 50µl bỏ đi, giếng 11và12 chỉ có nước sinh lý.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Bước 3: cho 50µl kháng nguyên pha loãng vào giếng

1 cho đến giếng 11, lắc đều để yên 5 phút để

kháng nguyên và kháng thể tương ứng sẽ kết

hợp với nhau.

- Bước 4: cho 50µl hồng cầu vào giếng 1 cho đến giếng

12, lắc đều để yên từ 20-25 phút đọc kết quả.

CÁCH ĐỌC KẾT QUẢ

Giếng 12: đối chứng dương của HI (hồng cầu + sinh lý)

CÁCH ĐỌC KẾT QUẢ

kháng nguyên và kháng thể, hồng cầu tự do nên tự động đóng nút, HI dương tính (có nghĩa là trong cơ thể thú có kháng thể chống lại kháng nguyên đó)

kháng nguyên và kháng thể, hồng cầu sẽ kết hợp với kháng nguyên gây hiện tượng ngưng kết gọi là HI âm (có nghĩa là cơ thể thú không có kháng thể chống lại kháng nguyên đó)

CÁCH ĐỌC KẾT QUẢ

Hàng A: HI=1/256

Hàng B: HI=1/512

Hàng C: HI=1/1024

Hàng D: HI=1/256

Hàng E: HI=1/128

Hàng F: HI=1/1024

Hàng G: HI=1/1024