Ôn tập thi thực hành miễn dịch học

HA/HI HA/HI dùng để làm gì, ngun lí, bước làm (tại sao)? - Nguyên lý: Do capxit virus có bán kháng nguyên HN (Haemagglutinin Neuraminidaza) có khả gắn với thụ thể hồng cầu làm hồng cầu dính kết với nhau, sau cắt đứt thụ thể hồng cầu để chúng lại rời Các bước kỹ thuật làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA – Haemagglutination test) - Cho nước muối sinh lý vào mỗi giếng 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚC ĐỆM) (0,8-0,85%) (nước muối sinh lí môi trường đẳng trương nên không làm vỡ hồng cầu, mỗi nồng độ khác cho môi trường khác nhau) (không dùng nước cất bước hồng cầu ngậm nước dẫn đến vỡ) - Cho kháng nguyên cần kiểm tra vào giếng (25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl) - Pha loãng kháng nguyên: trộn đều kháng nguyên với nước sinh lý giếng 1, hút 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl chuyển sang giếng trộn đều, hút 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl chuyển sang giếng trộn đều, tiếp tục làm đến giếng 11, đổ bỏ 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl Nếu không pha loãng vaccine ( HA chuẩn) mà cho vào phản ứng xảy tượng ngưng kết, dư nhiều kháng nguyên tự TÙY TRƯỜNG HỢP MÀ TRẢ LỜI HEHE - Cho hồng cầu: Mỗi giếng 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl, lắc nhẹ phút Để đĩa phản ứng nhiệt độ phòng Sau 15 – 30 phút đọc kết (CHẤT CHỈ THỊ MÀU VÀ LÀ THÀNH PHẦN CỦA P/Ư) - Đọc kết quả: + Phản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm + Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn - Hiệu giá ngưng kết tính độ pha loãng kháng nguyên cao còn xuất ngưng kết hồn tồn Ví dụ: 1/256 giếng cuối còn có ngưng kết - Nhận định kết quả: + Nếu HA dương tính: Kết luận có virus gây bệnh Để xác định virus Newcastle cần phải làm phản ứng HI với kháng huyết dương tính chuẩn Newcastle + Nếu phản ứng HA âm tính: Có thể bệnh phẩm khơng có mặt virus Newcastle hoặc lượng virus q Vì vậy, cần tiêm phôi trứng lần nữa Các bước kỹ thuật làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI – Haemagglutination Inhibition test) Trình tự tiến hành phản ứng: - Cho nước sinh lý vào mỗi giếng 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl từ giếng đến giếng 12 - Cho huyết cần kiểm tra vào giếng ( 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl ) - Pha loãng huyết thanh: Trộn đều huyết với nước sinh lý giếng 1, hút 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl chuyển sang giếng trộn đều, hút 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl chuyển sang giếng tiếp tục làm đến giếng 11, đổ bỏ 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl - Cho kháng nguyên đơn vị HA vào giếng từ đến 11, mỗi giếng 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl - Lắc nhẹ, để 30 phút nhiệt độ phòng - Cho hồng cầu: Mỗi giếng 25 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl, lắc nhẹ phút Để đĩa phản ứng nhiệt độ phòng Sau 15-30 phút đọc kết - Đọc kết quả: + Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên kháng thể tương ứng + Phản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm Chứng tỏ khơng có kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể phản ứng CHỜ 30P CHO KN KT TƯƠNG TÁC SAU ĐĨ MỚI CHO HỒNG CẦU ( VÌ SỢ KN BẮT CẶP VỚI HỒNG CẦU GÂY NGƯNG TỤ) Tại gọi nước muối sinh lí: Vì dung dịch đẳng trương, có áp suất thẩm thấu tương đương với cách dịch thể (máu, nước mắt, ) điều kiện bình thường Hờng cầu gà 1%: - Lấy 10ml máu gà + 5ml Citrat Na 5% để chống đông - Ly tâm 1000 vòng/5-10 phút, bỏ bạch cầu huyết tương - Cho nước sinh lý vào rửa hồng cầu ly tâm tiếp, loại bỏ phần nước Làm lần - Lấy hồng cầu đặc pha với nước sinh lý thành nồng độ 1% 1.1 Gà lấy máu gà trống đã trưởng thành, khoẻ mạnh, chưa tiêm phòng Newcastle 1.2 Nuôi gà chuồng an toàn, dùng để lấy máu thường xuyên 1.3 Sát trùng vị trí lấy máu (tĩnh mạch cánh hoặc tim) bằng cồn 70% 1.4 Dùng bơm tiêm từ 5ml đến 10ml hút sẵn 1ml (10 % thể tích) dung dịch chống đơng (Natri xitrat 4%, Alserver…) hút lấy máu gà Cho máu vào ống nghiệm 1.5 Rửa hồng cầu: Cho nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào ống lấy máu, lượng gấp đôi lượng máu ống, lắc đều Ly tâm từ 1.500 vòng/phút đến 2.000 vòng/phút, 10 phút, đổ bỏ huyết tương Rửa từ lần đến lần Sau lần ly tâm cuối, bỏ nước trên, lấy hồng cầu để pha 1.6 Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% Ví dụ: ml hồng cầu 99 ml nước sinh lý 1.7 Bảo quản huyễn dịch hồng cầu nhiệt độ từ 40 C đến 80 C Hồng cầu sau pha dùng tuần (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết loại bỏ) Hồng cầu không dùng hết, cần cho nước sinh lý vào bảo quản Khi cần, ly tâm lại để dùng Phương pháp HA/HI dùng thực tiễn để làm gì? Tìm kháng nguyên, kháng thể đối tượng mệt mỏi, đánh giá hhiệu tiêm phòng Phương pháp HA/HI dùng cho đối tượng nào? HA chủ yếu dùng cho virus thuộc Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae Tại phải thực HA trước HI sau? Để xác định kháng nguyên chuẩn nhiễm virus cần đến 10 ngày để tạo kháng thể, chuẩn đốn khơng đồng nghĩa máu có kháng ngun, kháng thể trung hòa vius, KT xuất sau từ đến ngày sau KN xuất có KN chưa có KT, kháng thể tồn thể theo thời gian định Tại lại dùng đáy chữ U? Vì đáy chữ U tối ưu nhất, đáy chữ V ( độ dốc cao, trượt nhanh, khó thao tác, trọng lực hồng cầu), đáy phẳng (không thấy rõ ngưng tụ, hồng cầu dễ bị lọt vào khe giếng) Đọc kết quả? HA: Mẫu dương tính với kháng thể (NDV) với hiệu giá HI: Phương pháp HI xác định mẫu có KT (viuss) đặc hiệu với hiệu giá 1/256 Tại phải có giếng đối chứng hồng cầu HA HI? Hồng cầu làm chất thị màu, thấy lắng động tự nhiên hồng cầu, tùy vào phản ứng (VD: HI thấy đc lắng hồng cầu cho thấy có tương tác giữa KN-KT còn HA có lắng HCau có kháng nguyên mẫu) 10 HI có tìm kháng ngun khơng? HI tìm KN KT ( HA tìm KN): Là mua kháng thể chuẩn xong trộn với KN cần tìm rơi bỏ hồng cầu vơ xem mà khơng có làm cách tốn tiền 11 Tại lại dùng vaccine để làm đối chứng dương? Vì chắn vaccine có chứa cần tìm, hoặc mơi trường nước virus, hoặc nước trứng muối 12 Tại phải pha lỗng vaccine? Nếu khơng pha loãng vaccin ( HA chuẩn) mà cho vào phản ứng xảy tượng ngưng kết, dư nhiều kháng nguyên tự 13 Khi nồng độ virus thấp: Mới nhiễm, nhiễm lâu rồi, virus vaccine 14 Chẩn đốn có kháng thể chưa có virus sao? Vì kháng thể đã trung hòa virus hoặc mẫu đã có kháng thể di truyền, hoặc hình thành từ trước 15 Chẩn đốn có virus chưa có kháng thể ? Vì vật nhiễm virus qua 3-7 ngày có kháng thể 16 Có thể xem hồng cầu đối chứng âm HA khơng? Được HA khơng có KN 17 Trong HI hờng cầu đóng vai trị gì? Hồng cầu vừa thành phần phản ứng vừa chất thị màu Cho hồng cầu vào để kiểm tra xem còn kháng nguyên tự hay không( ngưng kết =>kháng thể hoăc ko có ) 18 Xác định HAU cách nào? Làm phản ứng HA dương tính đâu có HAU Xác định hàm lượng virus thể bằng hiệu giá HA dương tính Hiệu giá xem HA 19 Đối chứng dương HA dùng loại nào? Gồm vacxin ELISA Hai kit khác ở chỗ nào? - kit phát kháng thể FMDV type O - kit phát kháng thể FMDV type Asia Các bước thực Elisa Mục đích: xác định kháng nguyên hoặc kháng thể mẫu Các bước: Giữ kit nhiệt độ phòng 30 phút trước • Pha loãng mẫu: pha theo tỷ lệ 1/200 với dung dịch diluent bằng cách: • 5μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl serum: 95 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCldiluent 1X (1) 10μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl (1): 90 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl diluent 1X • Tởng thể tích cho vào mỡi giếng 100μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl • Pha dung dịch rửa, 1ml washing solution 25X + 24ml nước cất đã khử ion • Pha loãng diluent (10X) diluent 1X bằng cách: 1ml diluent 10X + 9ml nước cất đã khử ion • Pha loãng conjugate: pha theo tỷ lệ 1/100 với dung dịch diluent 1X: 10 μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl conjugate + 990μl từ giếng đến giếng 12 (BƯỚCl diluent 1X • Conjugate sử dụng sau pha loãng • Các chất khác khơng pha loãng - Ủ tiếng (để có thời gian KT bám KN (BẮT CẶP KN)) - Rửa (bỏ pro tạp chất, rửa KT k bám vào KN) - Cho dung dịch Stop (khống chế thời gian phản ứng để phân biệt nhiều hay KT mỡi giếng) Loại Elisa gì? Nó tìm gì? ELISA ức chế (blocking) Đi tìm kháng thể heo kháng FMDV Mẫu KT tham gia P/Ứ? Đặc hiệu cho gì? KT heo trung hòa, đặc hiệu cho Asia cho FMDV Cơ chất tên gì? Tên TMB 6.Kit Elisa FMDV type O ? Cái phũ đáy giếng? Kháng nguyên cốt đáy giếng ( kháng nguyên FMDV ) ( Protein) RP13C protein Đọc kết quả thế nào? Khi bổ sung KT mẫu dính với KN cốt giếng phần khơng dính bị rửa trơi Sau bở sung KT có gắng enzyme conjugate Sau TMB, phản ứng tạo màu với enzyme có KT có gắn enzyme Nếu tạo màu nhiều đậm có nhiều KT gắn enzyme, KT mẫu nên âm Còn màu KT gắn enzyme, nhiều KT mẫu nên dương xanh âm, đỏ dương BLOCKING: khơng màu dương tính GIÁN TIẾP: có màu dương tính Tên KT cho PƯ (ng̀n gốc,đặc hiệu cho gì) FMDV: LỠ MỒM LƠNG MĨNG gây bệnh lồi thú có móng chẵn…bệnh có nhiều genotic :có genotic 10 Ưu nhược điểm loại Elisa (4 loại)? ELISA trực tiếp: Ưu điểm: - Tiết kiệm thời gian có lần ủ - Tối thiểu việc kiểm sốt điều kiện q trình thực Nhược điểm: - Các kháng thể phải đánh dấu riêng, nên tốn nhiều thời gian không linh hoạt thực nhiều thí nghiệm - Kỹ thuật có độ nhạy thấp tín hiệu khuếch đại hơn, nghĩa độ nhạy thấp - Không linh hoạt việc lựa chọn chất gắn - Độ đặc hiệu bị giới hạn thường kháng ngun có epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp sử dụng kháng thể gắn vào epitope - Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng ELISA gián tiếp: Ưu điểm: - Tính linh hoạt cao: kháng thể thứ cấp sử dụng cho nhiều loại kháng thể sơ cấp - Độ nhạy cao - nhiều kháng thể đánh dấu liên kết với kháng thể - Phản ứng miễn dịch chọn lọc cao - khơng có nhiễu can thiệp vào vị trí kháng thể - Kinh tế - yêu cầu loại kháng thể đánh dấu (gắn enzyme) Nhược điểm: - Quy trình làm việc phức tạp - cần có thêm bước ủ cho kháng thể thứ cấp - Khả phản ứng chéo - tín hiệu khơng đặc hiệu phản ứng chéo với kháng thể thứ cấp - Sử dụng vật chủ ELISA sandwich: Ưu điểm: - Tính linh hoạt độ nhạy cao: sử dụng phương pháp trực tiếp (đơn lớp) gián tiếp (hai lớp) - Độ đặc hiệu cao - hai kháng thể sử dụng để phát kháng nguyên - Thích hợp cho mẫu phức tạp - không yêu cầu phải tinh kháng nguyên trước đo Nhược điểm: - Quy trình làm việc phức tạp - yêu cầu nhiều bước ủ so với định dạng ELISA khác - Quy trình phát triển KIT phức tạp – phải kiểm tra phản ứng chéo giữa kháng thể khác ELISA cạnh tranh: Ưu điểm: - Tính linh hoạt cao - dựa định dạng ELISA trực tiếp, gián tiếp hoặc sandwich - Độ đặc hiệu cao - kháng nguyên bắt phát cụ thể - Khuếch đại tín hiệu mạnh - giảm thiểu ảnh hưởng việc pha loãng mẫu hiệu ứng nền mẫu Nhược điểm: - Khá tốn thời gian – quy trình phức tạp - Phụ thuộc nhược điểm định dạng phát đã chọn BLOCKING: Sử dụng nhiều đối tượng, cần sử dụng kit, nhanh đặc hiệu, tối ưu CẠNH TRANH: Biến thiên lớn CHUNG MỘT GENOTIC LÀ CHUNG MỘT HUYẾT THANH 11 Hai loại KT ELISA? - Kháng thể mẫu FMDV - Kháng thể kit HRPO 12 KT mẫu bám vào đâu? - KT mẫu bám vào protein x RP13C VP1 - KT kit bám vào kháng nguyên 13 Tại lại dùng Elisa ức chế - Ức chế không cạnh tranh, độ biến thiên nhỏ dẫn đến việc đọc kết xác 14 Conjugate gì? Conjugate chứa kháng thể đơn dòng gắn enzyme 15 Elisa tìm gì? Đối với ở vật chủ nào? Tìm virus hay protein? Tìm kháng thể, động vật guốc chẳn, virus gây bệnh lỡ mồm lơng móng 16 Tại Elisa trực tiếp thường dùng để tìm KN? Vì tìm KN cần dùng KT KT gắn enzyme (dễ kháng nguyên) KT gắn enzyme tìm nhiều KN, KN khơng 17 Ngun nhân gây kết quả sai? Xét từ thao tác đến hóa chất 18 Giải thích kết quả dựa màu sắc? Trắng- Xanh: Enzyme phân giải chất Xanh- Vàng: Khi cho Stop Solution 19 Cách tính OD? Nguyên tắc đọc kết quả? SN=OD mẫu/OD đối chứng âm Nếu S/N < = 0,6 mẫu dương S/N > 0,6 mẫu âm 20 OD mẫu dương? OD mẫu âm? Mẫu dương : < 0,25 Mẫu âm : > 0,71 21 Pha loãng Washing Buffer cho 90 mẫu ? 300ul/ lần/1 mẫu đợt rửa lần đợt rửa 90 300.3.2= 162000 ul = 162 ml 22 Các pp ELISA PP tối ưu nhất? Phương pháp ELISA sandwich tối ưu 23 Trong ELISA có loại KT tham gia? KT huyết KT cần tìm 24 Phân biệt ELISA ức chế cạnh tranh? - ELISA ức chế ta cho mẫu vào trước cho kháng thể gắn enzyme vào tạo màu nhiều về đối chứng âm pp ELISA trực tiếp để tìm KT - ELISA cạnh tranh cho vào lúc , tạo màu nhiều dương tính kháng nguyên chồng KN 25 Tại dùng ELISA cho trâu bò heo dê? 26 Tại phải dùng Stop Solution ? Đây giải pháp dùng cho pư ELISA Sử dụng horseradish , peroxidase chất TMB ( HRP IMB ) => Mục đích để ngăn TMB bị oxi hóa bởi HRP => Ngăn phản ứng chất enzyme Trong mẫu đối chứng dương có KT đặc hiệu cho FMDV Trong mẫu đối chứng âm khơng có KT đặc hiệu cho virus FMDV Trong giếng đối chứng dương điều xảy ra: Màu nhạt KT FMDV bám hết, khơng cịn chỗ cho KT tiếp, rửa trơi nên màu nhạt ELISA sở lí thuyết làm mẫu gộp Tuy nhiên, KN &KT giống nhiều loại mẫu dẫn đến dương tính giả thường sd cho mẫu đơn