Lý thuyết thực hành miễn dịch

Laboratory Exercise Detection and Identification of Hemagglutinating Isolates Nội dung Làm vacxin gà: phung sương, nhỏ mắt mũi, uống, tiêm Lấy máu: thu hồng cầu, huyết Thực phản ứng HA/HI Thực phản ứng ELISA USDA-APHIS Tương quan MD sinh bệnh học z NDV: Vắc-xin Lần vacxin thứ nhất: bị trung hòa nhiều, kích thích miễn dịch yếu  làm lúc ngày tuổi Gà dễ bệnh ND lúc 3-5 tuần tuổi Lần vacxin thứ hai nên làm trước tuần: khoảng 14-17 ngày NDV: Vắc-xin Lần vacxin thứ hai nên làm trước tuần: khoảng 14-17 ngày Twisting and circling of head and neck The bird displays Torticollis /tɔː.tɪˈkɒl.ɪs/ vẹo cổ Diarrhea with green bile pigment and white urates Square appearance of the head due to bilateral facial edema Postmortem Lesions • Edema of head, neck • Edema, hemorrhage, necrosis or ulceration of lymphoid tissue • Hemorrhagic lesions – Tracheal mucosa – Proventriculus – Intestinal mucosa Chương trình vacxin • Gà 3-5 ngày tuổi: Phịng bệnh Newcastle vaccine Newcastle chủng F • Gà ngày tuổi: Phịng bệnh đậu vaccine đậu gà • Gà 10 ngày tuổi: Phòng bệnh Gumboro vaccine Gumboro • Gà 21 ngày tuổi: phòng bệnh Newcastle vaccine Newcastle chủng Lasota • Gà 24 ngày tuổi: Phịng bệnh Gumboro vaccine Gumboro ( Nhắc lại lần nũa ) • Gà 30 ngày tuổi: Phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IB) vaccine IB (chủng H 120) • Gà 40 ngày tuổi: Phòng bệnh tụ huyết trùng vaccine tụ huyết trùng • Gà 60 ngày tuổi: Phịng bệnh Newcastle vaccine Newcastle chủng M Vaccination Program Type of Chicken Age day of age Broilers Vaccine Administration NOBILIS® MA5 + CLONE 30 Course spray or eye drop application Approx weeks NOBILIS® CLONE 30 (if ND endemic) day of age Layers / Breeders NOBILIS® MA5 + CLONE 30 Approx weeks NOBILIS® CLONE 30 (if ND Endemic) NOBILIS® MA5 + CLONE Approx weeks 30 Spray, or eye drop application Course spray or eye drop application Spray, or eye drop application Spray or eye drop application At least 103 EID50 Infectious Bronchitis virus strain Ma5 (serotype Massachusetts) and 106 EID50 of the Newcastle Disease strain Clone 30 - In layer: revaccinate every 5-8 week in drinking water Hemagglutinating Units (HAU) AIV • HI test for AIV – use HAU – To calculate the dilution to achieve HAU/0.025ml, divide the HA endpoint by – e.g HA of 1:64, divided by = (dilute the isolates in PBS 1:8 to obtain HAU/25 ul) USDA-APHIS Các loại ELISA I TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ELISA II ELISA TRỰC TIẾP III ELISA GIÁN TIẾP IV SANWICH ELISA V ELISA CẠNH TRANH ELISA: Mục đích ứng dụng Mục đích: xác định kháng nguyên kháng thể mẫu Ứng dụng: 1/ Xác định thú phơi nhiễm mầm bệnh hay chưa; 2/ Đánh giá hiệu tiêm phòng Vật liêu: - Mẫu: huyết chứa kháng nguyên KT - Kháng thể kháng nguyên biết - Kháng thể gắn enzyme + Cơ chất cho enzyme I TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ELISA Giới thiệu chung Nguyên tắc: Dựa kết hợp đặc hiệu KN-KT, phát kháng thể đánh dấu Khi cho thêm chất thích hợp (thường nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme thủy phân chất thành chất có màu • Phương pháp thiết kế cho việc phát định lượng vật chất peptides, protein, antibodies, hormone,… • Kĩ thuật nhạy đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (khoảng 0,1 ng/ml) Hình 1: Ví dụ phản ứng elisa I TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ELISA Bổ sung chất tạo màu (Substrate) Ủ tối Ly tâm Rửa Dừng phản ứng (Stop Solution) Pha loãng với Dilution buffer Ủ với kháng thể đánh dấu (Conjugate) Máy đọc Ủ (KN,KT,KN+ KT, mỏ neo) Rửa (Washing Buffer) Phân tích kết Mẫu ELISA Hình 2: Sơ đồ quy trình chung cho elisa (mẫu huyết mẫu mô) Các loại ELISA: loại Trực tiếp Gián tiếp Độ đặc hiệu: >99% ELISA kẹp chả (sandwich) ELISA cạnh tranh tìm KN (red) KN đỏ mẫu ức chế Kt bám KN code sẵn (xanh) II DIRECT ELISA (ELISA trực tiếp) III INDIRECT ELISA (ELISA gián tiếp) IV SANDWICH ELISA Sandwiche trực tiếp Kháng nguyên cần tìm phát thông qua kháng thể bắt giữ kháng thể đánh dấu Sandwiche gián tiếp - KN cần dị tìm phát thơng qua KT bắt giữ, KT thứ cấp KT đánh dấu (Phức hợp KT-KN-KT phát thông qua KT đánh dấu) V COMPETITIVE ELISA (ELISA CẠNH TRANH) 2A: KN đánh dấu gắn đáy giếng; KN cần tìm thêm vào đồng thời với KT gắn enzyme 2B: KT đặc hiệu gắn đáy giếng; KN cần tìm thêm vào đồng thời với KN đánh dấu gắn enzyme V COMPETITIVE ELISA (ELISA CẠNH TRANH) Tìm kháng thể ELISA dương mạnh  KT cần tìm KN gắn đáy giếng KT cần tìm thêm vào giếng trước KT đánh dấu gắn enzyme V COMPETITIVE ELISA (ELISA CẠNH TRANH) Ví dụ bơ kit sử dụng ngun lý ELISA blocking VDPro® CSF AB C-ELISA KIT Sample Conjugate Substrate E No Color + Recombinant gp55 - E E Color ELISA APP ELISA APP ELISA APP • Giữ kit nhiệt độ phịng 30 phút trước • Pha lỗng mẫu: pha theo tỷ lệ 1/200 với dung dịch diluent cỏch: ã 5àl serum: 95 àldiluent 1X (1) 10àl (1): 90 àl diluent 1X ã Tng th tớch cho vo mi ging l 100àl ã Pha dung dch ra, 1ml washing solution 25X + 24ml nước cất khử ion • Pha lỗng diluent (10X)  diluent 1X cách: 1ml diluent 10X + 9ml nước cất khử ion • Pha lỗng conjugate: pha theo tỷ lệ 1/100 với dung dịch diluent 1X: 10 µl conjugate + 990µl diluent 1X • Conjugate sử dụng sau pha lỗng • Các chất khác khơng pha lỗng