1 tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây dừa cạn catharanthus roseus l g don apocynaceae

Từ những năm 60 của thế kỉ trước, các nhà khoa học đã tìm ra được công dụng giúp điều trị ung thư của các hợp chất vinca alkaloid trong Dừa cạn.. Thế nhưng, hàm lượng các alkaloid này tr

BO GIAO DUC VA DAO TAO

TRUONG DAI HOC NGUYEN TAT THANH

DUONG PHUONG QUYNH

TOI UU HOA QUY TRINH CHIET XUAT ALKALOID

TRONG CAY DUA CAN

( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON APOCYNACEAE)

KHOA LUAN TOT NGHIEP DUGC SI DAI HOC

TP Hồ Chí Minh — 2018

BO GIAO DUC VA DAO TAO

TRUONG DAI HOC NGUYEN TAT THANH

DUONG PHUONG QUYNH

TOI UU HOA QUY TRINH CHIET XUAT ALKALOID

TRONG CAY DUA CAN

( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON APOCYNACEAE)

Chuyên ngành: Sản xuất và phát triển thuốc

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hướng dẫn khoa học: Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc

TP Hồ Chí Minh - 2018

LOI CAM DOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Chit ko SV

DƯƠNG PHƯƠNG QUỲNH

LOI CAM ON

Không có thành công nào mà không có những bản tay dìu dắt và giúp đỡ Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu của trường Đại học Nguyễn Tắt Thành đã tạo

cơ hội và điều kiện để em có thể thực hiện đề tài này

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến

Cô PGS TS Võ Thị Bạch Huệ

Cô Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc

đã dìu đắt và chỉ dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và giúp em hoàn thành

khóa luận này

Em xin cam on Thây, Cô trong hội đồng đã đồng ý phản biện cho đề tải của em

Em cũng xm gởi lời cảm ơn tới các anh chị kỹ thuật viên bộ môn đã giúp đỡ vào tạo điều kiện về cơ sở vật chất và dụng cụ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài này

Em xin gởi lời cảm ơn đến các Thay, Cô ở các bộ môn của khoa Dược — trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã cho em mượn thiết bị, dụng cụ và hóa chất nhằm phục vụ cho mục đích nghiên cứu

Em xin trân trọng cảm ơn

MUC LUC LỜI CAM ĐOAN 22002222202 2210212 1002211212122 iii LOL CAM ON nents iv DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iti DANH MUC HINH ANH oneness iv DANH MỤC BẢNG BIẾU _. v DAT VAN DE 222222222 ke l CHƯƠNG I TÔNG QUAN TÀI LIỆU -2222222222222222222 2 re 2 1.1 TÔNG QUAN THỰC VẬT 222.222222222222222 22222222 ren re, 2

INNHG , ng 2 1.1.2 Catharanthus roseus (L.) Œ Don 02222222 ee 3 1.1.3 Cac hop chat alkaloid trong cay Catharanthus roseus (L.) G Don 6 1.1.4 Cac Vinea alkaloid chit 2222222222512222221112221212222212222222222 222 xe 10 1.2 Phương pháp chiết xuất, định tính va dinh luong alkaloid 14

bàn» ca 14 1.2.2 Định tính Q.0 222222 re 18

1.2.3 Định lượng -2222222222222211111222211112211222222222222222222 2e xe 20 1.3 Tối ưu hóa bằng phần mềm 3222222222122 222222222 2n re re 22

1.3.1 Giới thiệu chung -0222222222222222222122.2.2.22.22220021 002g 22

1.3.2 Phương pháp tôi ưu hóa 3 2222222228222 22g He reo 22 1.3.3 Phần mềm tối ưu hóa Modde §.0 222221222222222222122222 xe 23

CHƯƠNG 2 ĐỒI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.1 Nguyên liệu 222222222222 2222222222 ree 24

2.1.2 Dung môi, hóa chất 3.21222222222222 ree 24

2.1.3 Trang thiết bị 2122222122222 222222222 n2 ng 2n re rse 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 02022222222222222222222222 222222 26 2.2.1 Chon alkaloid dé dinh hướng chiết 222 2222222222222 26 2.2.2 Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dược liệu Dừa cạn 28

2.2.3 Tôi ưu hóa quy trình chiết alkaloid (định hướng vinblastin) từ Dừa cạn

30

CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 222.222222222222 22 re re 32

3.1 Chon alkaloid dé dinh hướng chiết 2 2222222222222 re 32 3.1.1 Dinh tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 222222222 z2 32 3.1.2 Chiét alkaloid trong thuốc tiêm 2222222222278222 are 34 3.1.3 Xác định khối lượng phân tử của chất chiết được từ thuốc tiêm bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (MS ) -222222222 s2 34 3.1.4 Khảo sát cực đại hấp thụ cua alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/ 10ml bang phuong phap quang pO cc ccccsecssecssesseesseeseenteeseeee 35 3.1.5 Xây đựng đường chuẩn alkaloid sulfat trong nước 2.2222 z2 36 3.2 Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dược liệu Dừa cạn 38 3.2.1 Sơ bộ khảo sát thực vật 2211222122212 222222221222 xe 38 3.2.2 Dinh tinh alkaloid trong dược liệu Dừa cạn 2222222222222 e2 40 3.2.3 Xây dựng quy trình chiết alkaloid (định hướng vinblastin) từ cây Dừa

CON n 49

3.3.1 Xây dựng các thí nghiệm tối ưu hóa 2222222222222 reo 49 3.3.2 Kết quả tối ưu hóa -2222222122222122222222 2 re nen rreee 51

3.3.3 Phân tích tương tác ảnh hưởng giữa các yếu tố -21222 222m2 se 54

3.3.4 Kết quả dự đoán 222222222222 2222222 rreree 56 3.4 Bam WAI .ĂĂ 57 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ .s2 222222222 2m re re 58

lì N{(G) s4 58

TAI LIEU THAM KHAO

DANH MUC KY HIEU, CHU VIET TAT

5 HPLC chromatography Sac ky long hiéu nang cao

Electrospray Ionization - Phương pháp khối phố với

6 ESI-MS Mase Spectrometer ion hóa phun điện

11

DANH MUC HINH ANH Hình 1 I Công thức cấu tạo Vinblastin 2 2222222222 re 10 Hình 1 2 Công thức cấu tạo Vincristin 2.22212222.122222 are 12 Hinh 1 3 So dé chiét xuat alkaloid bang dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm

Hình 3 9 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết ở bước L -:: ¿+22 44

Hình 3 10 Sắc ký đề địch dung môi loại chlorophyvll (địch A) . 22-z 5z: 46 Hình 3 II Sắc ký đồ dịch alkaloid toàn phần (địch B) 22222 2 s2s2222£2222252 47 Hình 3 12 Sắc ký đồ so sánh dụng môi chiết tách alkaloid base toàn phần (dịch B)

48

Hình 3 13 Sắc ký đồ của các dung dịch trons thí nehiệm 222222s2E2E2£2222 51 Hinh 3 14 Kết quả thê hiện mức ảnh hưởng của các yếu tô tối ưu hóa 33 Hình 3 15 Hệ số biến thiên của các yếu tố ảnh hưởng 22222222222 me 53 Hình 3 16 Đường cons thê hiện tương tác øiữa các yếu tô khảo sát - 34

Hình 3 17 Đường thắng thê hiện mối quan hệ siữa kết quả dự đoán và kết quả thực

DANH MUC BANG BIEU Bảng 2 1 Dung môi và hóa chất cần dùng . 5s 21T 22121211211 11c xe 24

Bảng 2 2 Các thiết bị sử dụng s5 2111111 111211111 1121111 12211012211 rau 25

Bảng 2 3 Nong độ các dung dịch thu được - c5 2c 222k 27

Bảng 2 4 Các yếu tô ánh hưởng và mức độ biến đối . 55- 5c sec sec 31

Bảng 3 1 Kết quả định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng phương pháp hóa học 2 2 2010201121 12011111211 11111111111 111 111111111 111111111111 1111111111 1 xka 32 Bang 3.2 D6 hap thy cua cac dung dich từ mẫu thuốc thử Cytoblastin 36 Bang 3 3 Két qua dinh tinh alkaloid trong bot duge liéu oo cece cece 40

Bảng 3 4 Kết quả khảo sát đung môi chiết ở bước | (theo hình 2.) 44

Bảng 3 5 Kết quả khảo sát đung môi loại chlorophyll ở bước 2 -ss¿ 46 Bảng 3 6 Kết quá khảo sát dung môi chiết tach alkaloid base ở bước 3 48 Bảng 3 7 Các thí nghiệm tối ưu hóa đã xây đựng được -cccccsererriee 30 Bảng 3 8 Kết quả các thông số đánh giá mô hình thiết kế tối ưu hóa 52 Bang 3 9 Điều kiện tối ưu hóa dự đoán - 2 2221111252151 11 1151218121111 1xee 56 Bang 3 10 Két quả thực hiện 3 lần điều kiện tôi ưu 5 SE nen 57

Khóa luận tốt nghiệp được s đại học - Năm gc 2017 — 2018 Té wu ó quy trìn c ết xuất alkaloid trong cay Dwa can (Catharanthus roseus (L.) G Don Apocynaceace)

Duong P wong Quynh

Hướng dẫn khoa học: Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc

DAT VAN DE

Ngày nay, ung thư đã trở thành căn bệnh nguy hiểm đe dọa đến tính mạng con người Tuy nhiên, các thuốc điều trị ung thư vẫn còn hạn chế Từ những năm 60 của thế kỉ trước, các nhà khoa học đã tìm ra được công dụng giúp điều trị ung thư của các hợp chất vinca alkaloid trong Dừa cạn Thế nhưng, hàm lượng các alkaloid này trong cây không nhiều, vì vậy, nhằm xác định những điều kiện tối ưu đề chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn, đề tài “Tố ưu ó quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn (Cøfharanthus roseus (L.) G Don)” đã được

thực hiện

ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

Đối tượng nghiên cứu: Dược liệu là toàn cây Dừa cạn khô mua tại hiệu thuốc đông y trên đường Hải Thượng Lan Ông, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh Chất đối chiếu là vinblastin

sulfat chiết từ dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin của công ty Cipla Pharma

Phương pháp nghiên cứu: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm; khảo sát các hợp chất alkaloid trong dược liệu Dừa cạn và tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn

KET QUA VA BAN LUAN

Đề tài đã hoản thành các mục tiêu đưa ra và thu được các kết quả như sau:

- Xác định vinblastin từ thuốc tiêm bằng: phản ứng hóa học, SKLM, khối phô MS Sử dụng

vinblastin nay làm chất đối chiếu trong dinh tinh alkaloid ti bét dược liệu Khảo sát được cực

dai hap thụ và xây dựng đường chuân vinblastin bằng phương pháp quang phô UV-Vis

- Định tính sơ bộ dược liệu Dừa cạn bằng phương pháp soi bột và định tính các alkaloid trong bột Dừa cạn bằng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng

- Khảo sát các dung môi và xây dựng được quy trình chiết xuất alkaloid toàn phân (định hướng vinblastin) với dung môi chiết ban đầu là ethanol 80 %, dung môi loại chlorophyll là

hexan và dung môi chiét tach alkaloid base tir dich acid la chloroform

- Tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid từ cây Dừa cạn bằng phần mềm Modde 5.0 và đã

chọn được điều kiện tối ưu đề chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn: tỷ lệ dung môt/ dược liệu là 5: l

(tt/kl), thời gian ngâm lạnh là 1§ giờ và pH kiềm hóa là 8

KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ

Sau 2 tháng, đề tài đã đã thực hiện được 3 mục tiêu đề ra: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm,

khảo sát các hợp chất alkaloid trong dược liệu Dừa cạn và tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cay Dwa can

Từ khóa: Dừa cạn, t6i wu héa, Catharanthus roseus, vinblastin, alkaloid

Final essay for the degree of BS Pharm - Academic year 2017 — 2018 Optimizing conditions for the extraction of alkaloid from periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G

Don Apocynaceace) Duong Phuong Quynh

Adviser: M.S.Pharm Nguyen Thi Hong Phuc INTRODUCTION

These days, cancer has become a life-threatening disease However, the cancer treatment is still limited Since the 1960s, scientists have found a therapeutic use of the vinca alkaloid

which is extracted from Catharanthus roseus However, the content of these alkaloids in the

plant is not much, so to determine the optimal conditions for alkaloid extraction from periwinkle, the subject "Optimizing conditions for the extraction of alkaloid from periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G Don Apocynaceace" was done

MATERIALS AND METHOD

Material: Dried periwinkle plants was purchased at herbal medicine store on Hai Thuong Lan Ong Street, District 5, Ho Chi Minh City The comparator is vinblastine sulfate extracted from the Cytoblastin injection solution of Cipla Pharma

Method: Determination of vinblastine from injection; examination of alkaloid compounds in periwinkle and optimization conditions of the alkaloid extraction process from periwinkle RESULTS AND DISCUSSTION

The project has achieved the following objectives and results:

- Determination of vinblastine from injection by: chemical reaction, thin layer chromatography, mass spectrometry Use vinblastine (which had been determinated) as a comparator to do alkaloid qualitative analysis in dried periwinkle plant Determination vinblastine's wavelength of maximum absorbance and preparation of calibration curve of vinblastine by UV-Vis spectroscopy

- Preliminary qualification of dried periwinkle powder and carry out the qualitative analysis of alkaloid in dried periwinkle powder by chemical method and thin layer chromatography

- Investigating the solvents and complete the alkaloid extraction proceduce (orientation of vinblastine) with an initial extraction solvent is ethanol 80%, chlorophyll removal solvent is hexane and the solvent using to extract based alkaloid from an acidic solution is chloroform

- Optimizing the proceduce to extract alkaloid from periwinkle plant using Modde 5.0 and selecting the optimal conditions for alkaloid extraction from periwinkle: ratio of solvent and dried periwinkle powder 5: 1 (vAv), extracting duration is 18 hours and pH is 8

CONCLUSION

After 2 months of researching on the subject, the essay have finished 3 target: determination

of vinblastine from injection; examination of alkaloid compounds in dried periwinkle and optimization conditions of the alkaloid extraction process from periwinkle

Keywords: Periwinkle, Catharanthus roseus, optimizing conditions, alkaloid, vinblastine

DAT VAN DE Hiện nay, khi thế giới ngày càng phát triển, con người ta tập quen dân với lối sống

hiện đại hơn Tuy nhiên, cũng từ những lối sống hiện đại này lại kéo theo những hệ

lụy khác nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe của con người Con người của thé

kỉ 21 càng ngày cảng bị đe dọa bởi các chứng bệnh nguy hiểm, mà một trong số đó

là ung thư Khác với ngày xưa, ung thư ngày nay đã trở thành một căn bệnh thé ki,

đe đọa đến tính mạng của hàng trăm triệu người trên khắp thế giới Dù là căn bệnh nguy hiểm nhưng đến nay, ung thư chỉ được điều trị triệt đề khi phát hiện bệnh ở những giai đoạn sớm Tuy nhiên, giới hạn các thuốc điều trị và giá cả các thuốc này

đã khiến cho việc điều trị trở nên càng khó khăn hơn

Thuốc điều trị ung thư, từ trước đến nay đều khá đắt đỏ bởi vì việc nghiên cứu các

loại thuốc này vẫn còn hạn chế và đòi hỏi phải có nguồn kinh phí lớn Tuy nhiên,

vào những năm 60 của thế kỉ trước, các nhà khoa học đã khám phá ra được công dụng thần kì giúp điều trị ung thư của các hợp chất vinca alkaloid (đặc biệt là vinblastin và vincristin) trong Dừa cạn, một loài cây tương đối thân quen, từ đó mở

ra một hướng đi mới cho việc nghiên cứu các loại thuốc chông ung thư

Các hợp chất vinca alkaloid trong cây Dừa cạn có tác động tốt trong điều trị ung thư, thế nhưng hàm lượng các alkaloid này trong cây không nhiều Vì vậy, nhằm nghiên cứu và xác định những điều kiện tối ưu đề chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn, chúng tôi đã thực hiện đề tải “Tố ưu ó quy trìn c ết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn”; với các mục tiéu cụ thê như sau:

- Xác định vinblastin từ thuốc tiêm

- Khảo sát các hợp chất alkaloid trong Dừa cạn

- Tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn

CHUONG 1 TONG QUAN TAI LIEU

1.1 TONG QUAN THUC VAT

1.1.1 Catharanthus

Chi Dừa cạn Madagascar (danh phap khoa hoc: Catharanthus) la mét chi g6m 8 loài cây thân thảo sống lâu năm, trong số này có 7 loài là đặc hữu của Madagascar Trong thực tế, các loài trong chỉ này chia sẻ cùng một tên gọi chung (Dừa cạn) với các loài trong chí Vinca (Dừa cạn Châu Âu)

Các loai trong chi:

+ Catharanthus coriaceus Marker, 1970

+ Catharanthus lanceus (Bojer ex A.DC.) Pichon, 1948

+ Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon, 1949

+ Catharanthus ovalis Marker, 1970

+Catharanthus pusillus (Murray) G Don, 1837

+ Catharanthus roseus (L.) Œ Don, 1837: Dừa cạn, trường xuân hoa, hải đẳng, bông dừa

+ Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon, 1949

+ Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon, 1949

Số lượng nhiễm sắc thế cho tất cả cdc loai Catharanthus déu là 2n = 16 Trong các loai cua chi Catharanthus thi Catharanthus roseus la loai c6 gia tri ing dung va kinh tế cao nhất Ngoài việc được biết đến như một loại cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid ttr Catharanthus roseus da duoc su dụng trong y hoc dân gian như một loại thuốc chống đái tháo đường, lợi tiêu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành, chống viêm mắt, làm se da và ngày nay người ta còn tìm được một công dụng hết sức quan trọng của loài Ca/hararrthus roseus, đó là khả năng điều trị bệnh ung thư rất hiệu quả

1.1.2 Catharanthus roseus (L.) G Don

Phân lớp: Hoa Môi (Lamiidae)

Bo: Truc Dao (Apocynales) Họ: Trúc đào (Apocynaceae) Chi: Catharanthus Loai: Catharanthus roseus (L.) G Don [30] 1.1.2.2 BO phan dung

Lá Dừa cạn được phơi nắng nhẹ hoặc sây ở 30-50 °C đến khô Lá chiếm 20-25 % so với toàn cây Lá phải chứa ít nhất 0,7 % alkaloid toàn cây

Rễ chiếm 14,5 % so với toàn cây [3]

Hoa trắng hoặc hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ ở kẽ lá phía trên, đài hợp thành ống

ngắn Tràng hợp hình đinh Phiến có 5 thùy, 5 nhị đính trên tràng, 2 lá noãn hợp với

nhau ở vol

Quả gồm 2 quả đại, dài 2,5-5 em, rộng 2-3 mm, mọc thang đứng hơi ngả sang hai bên, trong có 12-20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có những mụn nôi thành hàng dọc Mùa hoa, quả gần như quanh năm [6]

1.1.2.4 Phân bố và trồng trọt

Chi Catharanthus G Don có nguồn gốc ở đảo Madagascar với 8 loài, trừ loài C pusillus (Murr.) G Don có thể tìm thấy rải rác ở Ân Độ và Srilanca Từ Madagascar, mọc hoang và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới cũng như ôn đới

Ở nước ta, dừa cạn mọc hoang khá nhiều ở vùng bãi cát ven biên từ Hải Phòng đến

Kiên Giang Nơi tập trung nhiều nhất là các tỉnh Kiên Giang, đảo Phú Quốc và Côn Đảo, có nhiều ở Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam — Đà Nẵng, Binh Định, Phú Yên

Ở nguyên quán, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan cây bụi trên đất pha cát hoặc sỏi đá, độ cao tới 1500 m Dừa cạn là loài cây ưa sáng, ưa ấm và có khả năng chịu được hạn Cây ra hoa, quả nhiều hăng năm

Nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khâu sang Đông Âu Những năm gần đây, xuất khẩu sang Pháp thường xuyên hơn nhưng chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [3]

1.1.2.5 Công dụng chủ yếu

Trong dân gian

Tu xa xua, Catharanthus roseus da duoc su dung để chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau Loài cây này đã được ứng dụng rộng rãi trong y học dân gian

G Madagascar, chiết xuất của Dừa cạn đã được sử dụng từ lâu như một loại thuốc

an thần, hạ huyết áp, sát trùng và thuốc điều trị tiêu đường

Ở Ân Độ, chiết xuất từ lá của Dừa cạn đã được sử dụng đề xử lý vết ong đốt

Ở Trung Quốc, Dừa cạn được biết đến như một loài cây giúp lợi tiểu, trị ho và làm săn se niêm mạc

Ở Trung và Nam Mỹ, Dừa cạn được sử dụng để chữa viêm mắt và đau họng

Ở Việt Nam, Catharanthus roseus ti lau di được dung dé ha huyét ap, tri dai thao

đường, điều kinh, chữa ly, thông tiểu tiện Có người dùng để trị ung thư máu, ung thư phối có hiệu quả Cách dùng: Thường dùng thân và lá phơi khô sắc uống, có thê

dùng téi 50 g [4]

Trong y học hiện đại

Nghiên cứu về dược ly da tiết lộ rằng Dừa cạn có chứa hơn 70 loại alkaloid (indol alklaloids) khác nhau và mang đến hiệu quả trong điều trị các loại ung thư như ung thư vú, ung thư phổi, ung thư tử cung, u ác tính, u lympho Hodgkin và không Hodgkin [25] Catharanthus alkaloids ngin chan sw phat trién của tế bào ung thư bang cach lién két véi cac tubulin trong qua trinh phan bao Catharanthus alkaloids cũng gây nên apoptosis (trình tự hủy diệt của tế bảo theo chương trình có sẵn trong gen) Chúng cũng ức chế sự lây lan của nhiều loại ung thư khác nhau [10, 11] Chiết xuat từ cây Dừa cạn cho các tác dụng hiệu quả lên các vi khuan va vi nam khác nhau Theo một vài nghiên cứu, các hợp chât trong cây Dừa cạn có tác động kháng khuẩn trên một số các vi khuân chọn lọc [12, 18]

Các nhà khoa học hiện đại đã tiễn hành nghiên cứu và chứng minh được khả năng điều trị tiêu đường của các alkaloid trong loài cây này [17, 28]

Không những vậy, một vài nghiên cứu khác đã chứng minh được tác dụng hạ huyết

áp và lipid huyết của chiết xuất từ lá Dừa cạn Các chiết xuất từ lá Dừa cạn có thể được dùng làm thuốc hoặc bố sung vào chế độ ăn đối với những người có nguy cơ mắc bệnh cao huyết áp [9]

Bên cạnh đó, chiết xuất từ cây Dừa cạn còn có các tác đụng khác như làm lành vết thương nhanh chóng [21], điều trị tiêu chảy [16]

1.1.3 Cac hop chat alkaloid trong cay Catharanthus roseus (L.) G Don

1.1.3.1 Alkaloid

a Khai niém

Đã từ lâu các nhà khoa học tìm thấy trong cây các hợp chất tự nhiên, những hợp chất tự nhiên, những hợp chất này thường là những acid hoặc những chất trung tính Nhưng đến năm 1819, được sĩ Wilhelm Meissner mới đề nghị xếp các chất có tính kiềm lây từ thực vật ra thành một nhóm riêng và gọi là alkaloid, do đó người ta ghí nhận MelIssner là người đầu tiên đưa ra khái niệm về alkaloid: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và lấy từ thực vật ra”

Sau này, Polonopski đã định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân đị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid”

Tuy nhiên, cũng có một số chất được xếp vào alkaloid nhưng nitơ không ở dị vòng

mà ở mạch nhánh như: ephedrin trong Ma hoàng, capsalcrn trong ớt, hordenin trong mam mach nha, colchicin trong hạt cây tỏi độc [5]

b Phân loại

Alkaloid la những base bac 1, bậc 2 hay bậc 3, đôi khi các alkaloid có mtơ bậc 4 Hâu hết các alkaloid có nitơ tham gia vào nhân dị vòng nhưng cũng có alkaloid mà

tơ ở ngoài vòng

Ngày nay, người ta thường chia các alkaloid ra thành các loại:

Alkaloid thật: Những alkaloid được tạo nên từ acid amin va nito năm trong đị vòng

là và gọi là những chất tạo ra từ acid amin

Protoalkaloid: Nitơ nằm ở mạch thang

Pseudoalkaloid: là những chất được tạo ra do sự ngưng tụ amoniac với các hợp chất không có nitơ

Ngoài ra, người ta cũng phân loại alkaloid dựa theo cấu trúc của nhân:

Alkaloid không có nhân dị vòng: Những alkaloid thuộc nhóm nảy có nitơ nằm ở mạch thắng, còn gọi là “protoalkaloid”

Alkaloid có nhân đị vòng: Các alkaloid loại này có thê có một vòng hay nhiều vòng Alkaloid có nhân sterol: Các alkaloid steroid có một khung cyclopentanoperhydrophenantren và có l hoặc 2 nmitơ trong mạch nhánh đã đóng vòng ở vị trí CL7 hoặc vị trí C3 Chúng là dẫn chất của dãy cholestan hoặc là dẫn chất của đấy pregnan

Alkaloid có cấu trúc terpen: Người ta mới thấy rất ít alkaloid có cầu tao monoterpen

và sesquIferpen, cầu tạo diterpen có nhiêu hơn nhóm mono và sesquIterpen Cũng có nhiều tác giả phân loại alkaloid theo họ thực vật [5]

1.1.3.2 Tính chất chung của alkaloid

a Ly tinh

Thế chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy, nghĩa là trong công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường Những alkaloid không có oxy thường ở thể lỏng (coniin, nicotin, spartein ), tuy nhiên cũng có vài chất trong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thế lỏng như

arecolin (CgH¡3NO2), pilocarpin (CioHi4N2O2) và có vải chất không có oxy ở thế

rắn như sempervirin (CioHiøN2), concessin (Ca4HzoNa) Các alkaloid ở thể rắn thường kết tính được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không

có điểm chảy vì bị phá hủy ở nhiệt độ trước khi chảy Những alkaloid ở thé long bay hơi được và thường vững bền, không bị phá hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lay ra khỏi dược liệu

Mui vi: Da so alkaloid không có mùi, có vị đăng và một sô ít có vị cay như capsaicin, piperin, chavicin

Mau sac: Hau hét cac alkaloid déu không màu trừ một số it alkaloid có mau vàng như berberin, palmatin, chelidonin

Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform Trái lại, muối alkaloid thì

dé tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực Năng suất quay cực: Phần lớn alkaloid có khả năng quay cực (vì trong cấu trúc có carbon không đối xứng), thường tả tuyền, một số nhỏ hữu tuyên [5]

b Hóa tính

Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base mạnh và có khả năng làm xanh giấy quỳ Có vải trường hợp ngoại lệ, những alkaloid không có phản ứng kiềm và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu Tác dụng với các acid, alkaloiđ cho các muối tương ứng

Alkaloid kết hợp với kim loại nang (Hg, Bi, Pt ) tạo ra các muối phức

Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid,

chia làm 2 loại:

Phản ứng tạo tủa: Có hai nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid:

o Nhóm thuốc thử I cho tủa rất ít tan trong nước Tủa này sinh ra hầu hết là do

sự kết hợp của một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thường là anion phức hợp của thuốc thử

LÌ Thuéc thir Valse - Mayer (K2HgI4— Kali tetraiodomercurat): Cho tua trang hay vang nhat

LÌ Thuốc thử Bouchardat (Iodo -lodid): Cho tủa nâu

LÌ Thuốc thử Dragendorff (KBil4- Kali tetraiodobismutat III): Cho tủa vàng cam đên đỏ

LÌ Thuéc thtr Bertrand (Acid silicotungstic): Cho tủa trang hay trắng nga

o Nhom thuốc thử thứ hai cho những kết tủa ở dạng tỉnh thé

LÌ Dung dich vang clorid, acid picrolonic, acid styphnic

L] Dung dich platin clorid

L] Dung dịch nước bão hòa acid picric

Phản ứng tạo màu: Có một số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau, do đó người ta cùng đùng phản ứng tạo màu đề xác định alkaloid Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết c6 alkaloid nao trong đó [5]

1.1.3.3 Alkaloid trong Catharanthus roseus (L.)

Dừa cạn là một nguồn dược liệu có gia tri điều chế các indol alkaloid monoterpenoid Có khoảng 90 alkaloid khác nhau được tổng hợp từ loài cây này, trong số đó các alkaloid thì G.H Svohada và cộng sự (1991) đã phân loại thành nhiều nhóm hóa học:

a Alkaloid dwoi dang monomer

Alkaloid thuộc nhân indol: alstonin (vỏ rễ), amorosin (rễ), catharantin (lá, rễ) Alkaloid thuộc nhóm 2-acyl indol: perividin (14), perivin (lá, rễ), perosin (lá, rễ), reserpin, ajmalicin (rễ), tetrahydroalstonin, serpentin (rễ), akuammin

Alkaloid thuộc nhóm oxindol: mitraphylin (lá, rễ)

Alkaloid thuộc nhóm ơ-methylen indolin: akuammicin (rễ), lochneriein (1a), Cac alkaloid khac: amocalin (rễ), pericalin (rễ), perimivin (lá), virosin (rễ) [5]

b Alkaloid dioi dang dimer

Alkaloid thuộc nhóm nho dimer idol — indolin: desacetyl — vincaleucoblastin (1a), isoleurosin (14), leurocristin (lá, rễ), leurosidin (lá, rễ), leurosin (lá, rễ), leurosivin (rễ), neuleurocristin (1á), rovidin (lá), neoleurosidin (1á), vinaleueoblastin (lá, rễ) Alkaloid thuộc nhóm nhỏ dimer khác: carosidin (lá, rễ), vincamicin (lá), vindolidin (lá), vincarodin (14), vindolicin (1a), vinosidin (rễ), vinsedicin (hat) [3]

1.1.4, Cac Vinea alkaloid chinh

Trong Dừa cạn có chứa khá nhiều alkaloid, tuy nhiên các vinca alkaloid lại đóng vai trò quan trọng giúp hình thành giá trị điều trị bệnh và giá trị thị trường của cây nay Vinea alkaloid la tap hợp cac alkaloid co kha nang khang mitotic va khang microtubule Ching có tác động ngăn chặn liên kết beta-tubulin trong quá trình phân chia tế bào ung thư Từ đó có vai trò quan trọng trong điều trị ung thư Hai vinca alkaloid chu yéu hay duoc sir dung do 1a vinblastin và vincristin Ngoài ra còn một số các vinca alkaloid khác như vindesine, vinorelbine, vinecaminol, vineridine

và vinburnine cũng đang được nghiên cứu và đưa vào liệu trình điều trị

1.1.4.1 Vinblastin (VB)

Công thức phân tir: Ca4gHsgN4Oo

Vinblasin là methyl (3a#485S, 5aR,10bR,13aR)-4-(acetyloxy)-3a-ethyl-9 -

[32]indol-9-yl ]-5-hydroxy-8-methoxy-6-methyl-3a,4,5,5a,6, 11,12,13a-octahydro-I Z7-

a Dac điểm

La tinh thé hinh kim, két tinh tt methanol

Trọng lượng phân tử: 810,989 g/mol

Vinblastin là vinca alkaloid đầu tiên được phân lập vào năm 1958 bởi Robert Noble

và Charles Thomas Beer tại đại học Western Ontario từ Dừa cạn [22]

Trong số các tác dụng được lý được nghiên cứu của VB thì hoạt tính chống ung thư được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng nhiều nhất Mặc dù cơ chế tác dụng của hợp chất này còn chưa thật sáng tỏ, nhưng có lẽ vinblastin thế hiện tác dụng độc tế bảo bằng cách ức chế sự tạo thành các vi ống trên thoi gián phân, dẫn đến ngừng phân chia tế bào ở pha giữa (pha M) Ở nồng độ cao, vinblastin còn thê hiện nhiều tác dụng phức tạp trên tổng hợp acid nucleic và protein VB có tác dụng chống ung thư còn do tác động đối với chuyên hóa của glutamat và aspartat [2]

Vinblastin được sử dụng trong điều trị nhiều loại ung thư như: Ung thư vú [29], ung thư phối [15] ung thư bàng quang [26], ung thư tính hoàn [14], ung thư các dòng tế bào máu (bệnh máu ác tính), ung thư cô và ung thư đạng nắm da [3]

Từ năm 1970, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công việc điều trị bệnh Letterer-Siwe (bệnh hệ lưới lan tỏa nhiều phủ tạng) bằng VB [23]

Vinblastin có mặt trong liệu trình điều trị hội chứng mô bào (là hội chứng rối loạn hiếm gặp gây ra bởi sự phát triển bất thường của một loại tế bào máu trắng gọi là

mô bào) ở trẻ em Không chỉ ở trẻ em, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng vinblastin đê điều trị hội chứng này ở người lớn và nghiên cứu cho kết quả khả quan

[27]

H

Vinblastin cũng có mặt trong danh sách các thuốc được dùng để trị bệnh Hodgkin (một loại ung thư hạch, bệnh ung thư máu bắt đầu trong hệ bạch huyết) ở giai đoạn III và IV Thay vì dùng riêng lẻ, người ta hay phối hợp sử dụng đồng thời 4 thuốc là mechloretamin, vinblastin, procabazine và prenisone đề điều trị căn bệnh này [13] Vinblastin con duoc ding dé diéu tri bénh leukemia cap, u lympho không Hodgkin, lympho m6 bao (u lympho mé bao), u sti dang nam, sarcom co van, u nguyén bao than kinh va u Wilm

Vao nam 2016, các nhà khoa học Canada đã nghiên cửu được rằng, vinblastin mang đến hiệu quả điều trị cũng như thể hiện ít độc tính trên các trẻ em bị u thần kinh đệm cấp thấp [19]

1.1.4.2 Vincristin (VC)

Công thức phân tir: Ca6Hs6N40 10

Vineristin 14 methyl (1R,9R,10S,11R,12R,19R)-11-(acetyloxy)-12-ethyl-4- [33]nonadeca-4(12),5,7,9-tetraen-13-yl]-8-formyl]-10-hydroxy-5-methoxy-8, 16- diazapentacyclo[34]nonadeca-2(7),3,5,13-tetraene-10-carboxylate

Vineristin còn có tên gọi khác là leuroeristine

a Dac điểm

La tinh thế hình phiến

Điểm chảy: 218-220 °C

Trọng lượng phân tử: 824,972 g/mol

Bước sóng hấp thụ cực đại trong ethanol la 220 nm, 255 nm va 296 nm

Không tan trong nước, ether dầu hỏa, tan trong alcol aceton, ethyl acetat,

chloroform [3]

b Tác dụng dược lÿ và cơ chế tác dụng

Vincristin 14 mét alkaloid chéng ung thư có tác đụng kích ứng mạnh các mô Cơ chế tác dụng còn chưa được biết thật chỉ tiết nhưng vincristin là chất ức chế mạnh tế bào Thuốc liên kết đặc hiệu với tubulin là protein ống vi thê, phong bế sự tạo thành các thoi phân bào cần thiết cho sự phân chia tế bào Do đó vincristin có tính đặc hiệu cao trên chu kì tế bào, và ức chế sự phân chia tế bào ở kì giữa Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp, làm ngừng phân chia tế bào Do thuốc có tính đặc hiệu với kì giữa của sự phân chia tế bào nên độc lực của tế bảo thay đổi theo thời gian tiếp xúc với thuốc, nhờ có nửa đời thải trừ dài và độ lưu giữ thuốc cao trong tế bào nên không cần phải truyền kéo dài

Cũng như VB, VC phối hợp với các chất khác trong điều trị bệnh leukemia cấp, bệnh Hodgkin, u lympho khéng Hodgkin, sarcom co van, u nguyén bao than kinh

va u Wilm Vincristin cũng tỏ ra có ích trong diéu tri bénh leukemia man, sarcom Ewing, u sui dang nam, sarcom Kaposi, cac sarcom mô mém, sarcom xuong, u melanin, da u tủy, ung thư lá nuôi, ung thư trực tràng, não, vú, cô tử cung, ung thư tuyến giáp và ung thư phôi [2]

Vineristin cũng gây độc thân kinh, tuy nhiên không mạnh như vinblastin

13

1.2.P wong p ape ết xuất, din tín và địạn lượng alkaloid

1.2.1 Chiết xuất

Việc chiết xuất alkaloid dựa vào tính chất chung như sau:

Alkaloid nói chung là những base yếu, thường tổn tại trong cây đưới dạng muỗi của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi có dạng kết hợp với tanin nên phải tán nhỏ được liệu để đễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó băng những kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh

Hầu hết các alkaloid base không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung môi hữu

cơ ít phân cực Trái lại, các muối alkaloid thường tan trong nước, cồn và không tan trong các dung môi ít phân cực Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid như loại bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phương pháp chiết thích hợp

Thông thường, người ta sử dụng một trong 4 phương pháp sau đây đề chiết tách alkaloid từ dược liệu [5]

1.2.1.1 Chiết bằng dung môi hữu cơ trong mô trường kiềm

Dược liệu được tán nhỏ rồi tâm bột được liệu với dung dịch kiềm trong nước Chiết bột dược liệu đã kiềm hóa như trên bằng dung môi hữu cơ không phân cực thích hợp, dung môi này dùng đề hòa tan các alkaloid base vừa được giải phóng Cất thu hồi dung môi hữu cơ dưới áp lực giảm rồi lắc địch chiết cô đặc với dung dịch acid loãng Các alkaloid được chuyền sang dạng muỗi tan trong nước, còn mỡ, sắc tố và sterol ở lại dung môi hữu cơ

Gộp các dịch chiết muối alkaloid lại rồi kiềm hóa để chuyển alkaloid sang dạng base, lắc với dụng môi hữu cơ thích hợp nhiều lan dé lay kiét alkaloid base Sau khi lấy riêng lớp đung môi hữu cơ chứa alkaloid base, người ta thường loại nước bằng muối trung tính khan nước (NazSOa khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi sẽ thu được alkaloid thô [5]

14

Bột dược liệu (2-5 g)

- Kiềm hóa vừa đủ âm

- Chiết băng 20-30 ml dung môi hữu cơ ở nhiệt độ

kh6 Can alkaloid base

Hinh 1 3 So dé chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi

trường kiểm

1.2.1.2 Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước (P ương pháp STAS-OTTO)

Thấm âm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất

Chiết bột dược liệu băng dung môi chiết xuất Các alkaloid trong được liệu sẽ chuyên sang dạng muôi và tan trong dung môi trên

15

Cat thu hồi đung môi hoặc bốc hơi dung môi đưới áp suất giảm, dùng cther rửa dịch chiết đậm đặc còn lại Trong môi trường acid, ether thường hòa tan I số hợp chất chứ không hòa tan alkaloid

Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung địch nước rồi lấy alkaloid base được giải phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp Cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu được cắn alkaloid thô [5]

Ÿ - Acid hóa bằng acid loãng (5 ml x 2 lần)

| Dịch chiết nước acid

16

Bột dược liệu (2-5 g)

- Trung hòa đến pH 5-6

- Bay hơi cồn trên bếp cách thủy đến cắn

- Hòa tan cắn trong nước nóng (10 ml x 2 lần), lọc

Hình I 5 Sơ đỗ chiết xuất alkaloid bằng cồn acid

1.2.1.4 Chiết bằng cất kéo ơ nước

Đây là phương pháp ding để chiết tách những alkaloid bay hơi được như coniin, nicotin, spartein Sau khi say khô dược liệu, tán nhỏ, cho kiềm vào đề đây alkaloid dạng muối ra dạng base rồi lấy alkaloid ra khỏi được liệu theo phương pháp cất kéo bằng hơi nước [5]

17

Bột dược liệu (10 g)

- Kiểm hóa sau đó cât kéo theo hơi nước

- Hứng vảo bình có sẵn dung dịch acid loãng

® Tiêu bản |: Ngay sau khi mới cắt, nhỏ một giọt thuốc thử Bouchardat, đợi một lúc rồi soi kính hiển vi sẽ thây kết tủa màu nâu

® Tiêu bản 2: Đem ngâm tiêu bản vào côn tartric, sau đó rửa sạch cồn tartric, đặt lên phiến kính rồi nhỏ một giọt thuốc thử Bouchardat, để một lúc rồi đem soi kinh

Nếu tế bào có chứa alkaloid thì alkaloid đã hòa tan trong cồn và trên vi phẫu 2 không quan sát thấy tủa nâu Còn nếu vẫn thấy tủa thì phải nghĩ ngay tới tủa của protid [5]

18

1.2.2.2 Din tín trong dược liệu và trong các chế phẩm a

Định tính bằng thuốc thử chung

Đề phát hiện alkaloid trong được liệu bằng các thuốc thử chung, thường người ta chiết alkaloid ra khỏi cơ quan thực vật bằng phương pháp chiết thích hợp rồi dùng các thuốc thử đê phát hiện và đánh giá sơ bộ sự có mặt của chúng trong dược liệu Tủy theo phản ứng mà sử dụng dịch chiết thích hợp Các phản ứng với thuốc thử chung thường được thực hiện với muối alkaloid trong môi trường nước aeid Các thuốc thử chung cho với các alkaloid một tủa vô định hình có màu sắc không đặc trưng thay đôi tùy theo thuốc thử Với một số thuốc thử, tia nay co thé tan lại trong một lượng thuốc thử thừa

Các thuốc thử thường dùng là Bouchardat, Valse-Mayer, Dragendorff, Hager và acid tannic [5]

b Định tính bằng sắc kí lớp mong (SKLM)

SKLM được sử dụng như một phương pháp phát hiện sự có mặt, đồng thời đánh giá

sơ bộ thành phần alkaloid của dược liệu khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp Tiến hành sắc ký song song với | alkaloid chuân còn cho phép nhận định sự có mặt của một alkaloid nào đó trong dược liệu SKLM còn hữu dụng trong việc xác định | dược liệu khi sắc ký so sánh với được liệu chuẩn

Pha tnh: Trong định tính alkaloid bằng SKLM, ta thwong dung silica gel G, F254, GF 254

.Các pha tĩnh khác như nhôm oxyd, silica gel pha đảo đôi khi cũng được dùng Dung môi khai triển: Dung môi khai triển sắc ký alkaloid thường là hỗn hợp 2 hay 3 dung môi hữu cơ, từ phân cực yếu tới phân cực trung bình Đôi khi, các dung môi phân cực mạnh hơn như butanol, ethanol, methanol, nước, các acid như acid acetic, acid formic cũng được dùng đối với alkaloid phân cực mạnh Mẫu thử thường là alkaloid base hay hỗn hợp alkaloid base toàn phần được hòa tan trong các dung môi

ít phân cực và dễ bay hơi Các hệ dung môi khai triển sắc ký thường dùng cho alkaloid la:

19

se CHCls— MeOH — NH4OH (50:9: 1)

* n-butanol -CH3COOH — NH4OH (4:1:5)

¢ Cyclohexane — CHCI]s— dietylamine (5:4:1)

¢ CHCl3— MeOH (4:1)

Phát hiện vết: Đề phát hiện vết alkaloid trên bản sắc ký, người ta thường phun hoặc nhúng với thuốc thử Dragendorff Các alkaloid sẽ cho các vết màu đỏ cam trên nền vàng cam Cách phát hiện thông thường như soi đèn UV (254 nm và 365 nm) hoặc

hơ trong hơi iod cũng được dùng như là phương pháp bổ sung nhưng không đặc hiệu

Ghi nhận kết quả: Ghi nhận số lượng các vết quan sát được trên sắc ký đồ về màu sắc với các phương pháp phát hiện, Rf và tỉ lệ tương đối của các vết alkaloid trong hỗn hợp [5]

sự chuyên màu rõ rệt của chỉ thị

Thực hiện: Khi định lượng, người ta phải chiết được alkaloid tính khiết bằng một

dung môi thích hợp, đem bốc hơi dung môi, sây căn đến khối lượng không đôi rồi dem can [5]

20

1.2.3.2.P ương p áp trung ò (( ừa trừ)

Phạm vi sử đụng: Thường dùng nhiều với những alkaloid họ Cà, áp dụng với các alkaloid chiết ra ở dạng base

Thực hiện: Sau khi đã có dịch chiết alkaloid base, có thê tiến hành định lượng bằng cách lắc alkaloid trong dung môi hữu cơ với lượng chính xác acid chuẩn độ dư, sau

đó định lượng acid thừa bằng kiềm tương ứng, hoặc làm bốc hơi dung môi hữu cơ, cắn alkaloid còn lại được định lượng trực tiếp hay gián tiếp băng acid chuẩn độ Chỉ thị thường dùng trong phương pháp chuân độ thừa trừ này là metyl đa cam hoặc metyl đỏ [5]

1.2.3.3 P wong p áp chuẩn độ trong mô trường khan

Phạm vi sử dụng: Áp dụng với các alkaloid có tính base rất yếu

Thực hiện: Hòa tan alkaloid vào dung môi không phải nước, thường dùng acid acetic khan (gọi là môi trường khan) Sau đó dùng acid percloric để định lượng và

- Đối với các alkaloid có màu tự nhiên, có thé do trực tiếp màu dung dịch

- Với những alkaloid không thể tạo thành dung dịch có màu để định lượng trực tiếp, người ta cho alkaloid tac dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp đề thu được dung dịch có màu để định lượng

- Một số alkaloid có thể biến đôi để tạo thành một dẫn chất có màu hoặc dùng phản ứng giáng phân alkaloid thành những phần nhỏ, lấy riêng phần cần thiết rồi cho tác đụng với thuốc thử tạo ra dung địch có màu đề định lượng [5]

21

1.2.3.5 P ương p áp sắc ký lỏng hiệu năng c o (HPLC)

Phạm vi sử dụng: Áp dụng cho nhiều alkaloid khác nhau

Thực hiện: Đề tến hành định lượng alkaloid bằng phương pháp HPLC cần:

- Có alkaloid tính khiết làm chất chuẩn

- Xây dựng phương pháp chiết kiệt alkaloid trong dược liệu đáp ứng đủ nhu cầu định lượng

- Xây dựng được chương trình sắc ký trên máy HPLC (pha tĩnh, pha động, detector, tốc độ dòng, thể tích tiêm, nhiệt độ phân tích) [5]

1.3 Tốưu ó bằng phần mềm

1.3.1 Giới thiệu chung

Trong điều kiện chiết, ngoài bản chất của mẫu chiết thì kết quả của quá trình chiết còn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tô bên ngoài Vì vậy, cần tối ưu hóa các điều kiện này để đạt được kết quả tốt nhất Tối ưu hóa có thể được định nghĩa là quá trình tìm kiếm các yếu tố ảnh hưởng để hạm mục tiêu đạt lớn nhất hoặc nhỏ nhất theo mong muôn, trong khi van đáp ứng đủ các điều kiện ban dau

1.3.2 P ương p áp tố ưu ó

Thông thường, có 2 phương pháp đề tối ưu hóa một mô hình :

- Phương pháp cô điển (phương pháp thực nghiệm một biến số): ta thay đổi lần lượt từng yếu tô (biến độc lập) đề thu được kết quả (biến phụ thuộc), thực hiện lần lượt với từng yếu tô Phương pháp này tương đối đơn giản nên chỉ áp dụng cho mô hình có từ một đến hai biến độc lập Phương pháp không có hiệu quả trong các mô hình nhiều yếu tố

- Phương pháp tôi ưu hóa bằng phần mềm chuyên dụng: phương pháp này cho phép xây dựng được các mô hình có nhiều yếu tố ảnh hưởng Đánh giá được sự ảnh hưởng nhiều hay ít giữa các yếu tố, từ đó xác định được kết quả dự đoán bằng các phép tính toán trong phần mềm Có nhiều phần mềm chuyên dụng cho việc tôi ưu hóa như MODDE, JMP, Design — Expert [8]

22

1.3.3 Phần mềm tốuu 6 ~Modde 5.0

Modde 5.0 là phần mềm tối ưu hóa được phát triển bởi Umetrics AB Đây là phần mềm được xây dựng đê thiết kế và đánh giá các thử nghiệm với nhiều biến số khác nhau Phần mềm này giúp người sử dụng định hướng cải thiện và tối ưu hóa được các sản phẩm cũng như quy trình với lượng thứ nghiệm tối thiểu, do đó giảm được công sức và tiết kiệm được thời gian hơn so với dùng các phương pháp đất tiền khác

Phần mềm Modde có những công dụng như sau:

- Thiết kế thử nghiệm

- Phân tích đữ liệu và đánh giá kết quả

- Dự đoán và tôi ưu hóa quy trình [20]

23

CHUONG 2 ĐỎI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Đồ tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Được liéu (loan cay Dira can)

Dược liệu được thu mua tại hiệu thuốc đơng y trên đường Hải Thượng Lan Ơng, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh Mẫu dược liệu sau khi sơ chế được sây khơ Dược liệu khơ được xay nhỏ đến đạng bột thơ Bảo quản trong bao nylon kín Alkaloid định hướng chiết từ thuốc tiêm:

Vinblastin sulfat chiết từ dung địch thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (cĩ chứa I

mg vinblastin sulfat) của cơng ty Cipla Pharma

Thành phần của đung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/10ml:

Vinhlastin suffAl, ca Img

Nati C1OVIG ceceeccsscctssssssstsssssssssssssssssusessseeeeee 9 mg

Benzyl

đÌCO HỌ, ST 2 HS se, 0,924 v4

Nước cất pha tiÊm cà: vừa đủ thể tích

2.1.2 Dung mơi, hĩa chất

Bảng 2 1 Dung mơi và hĩa chất cần dùng Tên dung mơi, hĩa chat Xuât xứ

Trung Nam Trung

24

Stt Tén thiét bi Model Hang san xuat

1 | Bép cach thay WNB l4 Memmert (Đức)

2 Cân phân tích 0,1mg Entris 2241-18 Sartorius (Duc)

3 Đèn UV 254 nm & 365 nm UVPI0 Spectroline (My)

4 | May do quang UV UV 1800 Shimadzu (Nhat)

2.2,P wong p apng êncứu

2.2.1.Chọn Iklodđếdđịn ướng chiết

Sử đụng dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa l mg vinblastin sulfat) của công ty Cipla Pharma

2.2.1.1 Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin

10 Chiét vinblastin base trong dung dich bang chloroform Cé thu hồi bớt dung môi

Tiến hành khai triển sắc ký lớp móng và quan sát ở những điều kiện khác nhau

2.2.1.2 Chiết alkaloid trong thuốc tiêm

Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị như mẫu 2 mục (b) của phần 2.2.1.1

2.2.1.3 Xác định khố lượng phân tử của alkaloid chiết được

Thực hiện đo khối phổ của mẫu dịch chiết alkaloid từ thuốc tiêm bằng hệ EST- MS/MS (Phuong phap 1on hóa phun điện)

Ghi nhận lại phổ để và xác định số khối của hoạt chất trong mẫu thử

26