Sử đụng dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa l mg vinblastin sulfat) của công ty Cipla Pharma.
2.2.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin
d. Phương pháp hóa học
Chuẩn bị mẫu: Hút I ml thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1 mg vinblastin sulfat), pha loãng với zước cất vừa đủ 10 ml,
Sau khi chuẩn bị mẫu như trên, tiễn hành định tính alkaloid bằng phương pháp hóa học với các thuốc thử chung alkaloid.
b. Sắc ký lớp
móng Chuân bị
mẫu:
+ Mẫu l: Thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1 mg vinblastin sulfat). + Mẫu 2: Hút chính xác | ml dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin cho vào bình định mức 20 ml, thêm zớc cất đến vạch. Acid hóa dịch nước với #C1 1M (TT) đến pH 1-2, sau do kiém hoa dung dich bang amoniac đậm dac (TT) dén pH 9-
10. Chiét vinblastin base trong dung dich bang chloroform. Cé thu hồi bớt dung môi.
Tiến hành khai triển sắc ký lớp móng và quan sát ở những điều kiện khác nhau.
2.2.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm
Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị như mẫu 2 mục (b) của phần 2.2.1.1.
2.2.1.3. Xác định khố lượng phân tử của alkaloid chiết được
Thực hiện đo khối phổ của mẫu dịch chiết alkaloid từ thuốc tiêm bằng hệ EST- MS/MS (Phuong phap 1on hóa phun điện).
Ghi nhận lại phổ để và xác định số khối của hoạt chất trong mẫu thử.
26
2.2.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/ 10 ml bang p wong p ap qung p é
Chuan bi mau:
+ Mẫu 3: Hut chinh xac | ml thuéc tiém Cytoblastin 10 mg/10 ml (cé chia 1
mg vinblastin sulfat) vào binh dinh mire 100 ml, thém medc cat dén vach dé thu được dung dịch có nỗng độ 0,001 g/l (1 ppm)
+ Mẫu 4: Chuân bị như mẫu 2 mục (b) phần 2.2.1.1. Cô địch chloroform đến căn. Hòa tan cắn với methanol, cho vào bình định mức 100 ml, thém methanol đên vạch.
Tiến hành quét phố của 2 mẫu trên bằng máy quang phô Shimadzu UV 1800 dé khảo sát cực đại hâp thụ của các mâu này.
2.2.1.5. Xây dựng đường chuẩn của alkaloid sulfat trong nước
Chuân bị mẫu: Tiến hành chuân bị 6 dung dịch mẫu như sau đề thu được các dung dịch cú nồng độ (ứ/1) khỏc nhau.
Trộn 5 ống thuốc tiêm lại, lắc đều cho đồng nhất. Hút lượng thuốc tiêm như sau:
Dung dịch l: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm pha vào bình định mức 50 mÌ.
Dung dịch 2: Hút chính xác 18 mÌ dung dịch 1 pha vào bình định mức 20 ml. Dung dịch 3: Hút chính xác 14 ml dung dich | pha vao bình định mức 20 ml. Dung dịch 4: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm pha vào bình định mức 100 ml. Dung dịch 5: Hút chính xác 16 mÌ dung dịch 4 pha vào bình định mức 20 ml. Dung dịch 5: Hút chính xác 12 ml dung dich 4 pha vào bình định mức 20 ml. Thêm zước cất vừa đủ thê tích.
Bảng 2. 3. Nồng độ các dung dịch thu được
Dung dịch 1
Nông độ thu được (g/1) 0,002 0/0018. 0/0014 0,001 | 0,0008) 0,0006
27
Tiến hành đo độ hấp thụ của các mau bang may quang phé Shimadzu UV 1800 va
vẽ đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của vinblastin sulfat.
2.2.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dược liệu Dừa cạn
2.2.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật
Soi bột: Quan sát bột bằng cảm quan (màu sắc, mùi vị) trước khi soi trên kính hiển
VI.
2.2.2.2. Din tin Ik lo d trong duoc liệu dừa cạn a.
Phương pháp hóa học
Chuan bi mau: Lay 3 ứ bột dược liệu cho vào một bỡnh nún nỳt mài, làm õm bột dược liệu bằng ứmowiae đậm đặc (T7) trong 30 phỳt. Thờm 30 ml chloroform (TT), lắc kỹ trong 30 phút, lọc vào bình lắng gạn. Chiết 3 lần bằng dung dich acid hydroclorie 2 % (TT), mỗi lần với 5 ml, thu được dịch chiết acid.
Tiến hành thử với các thuốc thử chung alkaloid để xác định sự có mặt của alkaloid.
b. Sắc kJ lớp mỏng
Chuan bi mẫu:
+ Mau chuan: Chuan bi nhu mau 2 mục (b) phan 2.2.1.1.
+ Mẫu thử: Chuyến dung dịch acid đã chiết ở phần phản ứng hóa học còn lại vào bỡnh gạn, kiềm húa bằng ứmoziae đậm đặc (T7) tới pH 9-10, lắc với chloroform 2 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp dịch chiết cj/oroƒform. cô trên cách thủy đến còn khoảng 5 ml.
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định sự có mặt của alkaloid.
28
2.2.2.3. Xây dựng quy trình chiết Iklo d(địn — ướng vinblasdin) từ Dừa cạn Quy trình chiết alkaloid cơ bản:
[or oc ter
- Ngâm lạnh với dung môi chiết I
Bước 1 - Cô thu hồi bớt dung môi, lọc
ơ..*,
| Dicirtoc
- Lắc phân bố với dung môi 2 đề loại
chlorophyll.
Bước 2 ao .
- Loại bỏ dịch dung môi
my ¥ a
| Địch nước còn lại |
Bước 3 Hình 2. 1. So dé téng quat chiét xuat alkaloid từ dược liệu Dict rẻ H Ý - Chiết với dung môi 3 1 ro Tiến hành khảo sát các dung môi thích hợp cần dùng đề thu được quy trình ôn định
và phù hợp nhằm chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn. Các bước tiễn hành khảo sát được tiễn hành như sau:
a. Khao sat dung moi chiết ở bước 1 (theo hình 2.1)
Tiến hành khảo sát dung môi chiết bước 1 theo quy trình chiết với các đung môi: + Ethanol 50 %
+ Ethanol 80 %
+ Ethanol 96 %
Cac dung môi dùng ở bước 2 và 3 tùy chọn. Ghi nhận lại khối lượng cao alkaloid toàn phần (mạ) và tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid toàn phần thu được.
29
b. Khảo sát dung môi loại chlorophpH ở bước 2 (theo hinh 2.1)
Sau khi đã khảo sát xong dung môi chiết bước 1, chiét alkaloid trong Dừa cạn bằng dung môi đã chọn, sau đó tiễn hành khảo sát dung môi 2 loại chlorophyll theo quy trình chiết cơ bản (hình 2.1) với các dung môi sau:
+ Hexan
+ Toluen
+ Ethyl acetat
+ Dicloromethan
Dùng dung môi tùy ý để chiết ở bước 3. Ghi nhận lại khối lượng tủa (mi) sau khi
loại chlorophyll và khối lượng cao alkaloid toàn phan (m2).
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid toàn phần thu được.
c. Khảo sát dung môi chiết tach alkaloid base ở bước 3 (theo hình 2. I)
Dùng các dung môi đã khảo sát được ở mục (a), (b) và tiến hành khảo sát tiếp dung môi để chiết tách alkaloid base ở bước 3 theo quy trình chiết cơ bản (hình 2.1) như trên. Khảo sát dung môi chiết alkaloid base với các dung môi sau:
+ Chloroform
+ Ethyl acetat
+ Dicloromethan
Ghi nhận lại khối lượng cao alkaloid toàn phần (mạ) thu được.
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid toàn phần thu được.