Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây dừa cạn ( catharanthus roseus (l ) g don apocynaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH TỐI ƢU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID TRONG CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON APOCYNACEAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC TP Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH TỐI ƢU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID TRONG CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON APOCYNACEAE) Chuyên ngành: Sản xuất phát triển thuốc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Hƣớng dẫn khoa học: Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc TP Hồ Chí Minh - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Chữ ký SV DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH LỜI CẢM ƠN Khơng có thành cơng mà khơng có bàn tay dìu dắt giúp đỡ Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành tạo hội điều kiện để em thực đề tài Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Cô PGS TS Võ Thị Bạch Huệ Cô Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc dìu dắt dẫn em suốt q trình nghiên cứu giúp em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn Thầy, Cơ hội đồng đồng ý phản biện cho đề tài em Em xin gởi lời cảm ơn tới anh chị kỹ thuật viên môn giúp đỡ vào tạo điều kiện sở vật chất dụng cụ suốt thời gian em thực đề tài Em xin gởi lời cảm ơn đến Thầy, Cô môn khoa Dƣợc – trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành cho em mƣợn thiết bị, dụng cụ hóa chất nhằm phục vụ cho mục đích nghiên cứu Em xin trân trọng cảm ơn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT 1.1.1 Catharanthus 1.1.2 Catharanthus roseus (L.) G Don 1.1.3 Các hợp chất alkaloid Catharanthus roseus (L.) G Don 1.1.4 Các Vinca alkaloid 10 1.2 Phƣơng pháp chiết xuất, định tính định lƣợng alkaloid 14 1.2.1 Chiết xuất 14 1.2.2 Định tính 18 1.2.3 Định lƣợng .20 1.3 Tối ƣu hóa phần mềm .22 1.3.1 Giới thiệu chung .22 1.3.2 Phƣơng pháp tối ƣu hóa .22 1.3.3 Phần mềm tối ƣu hóa Modde 5.0 23 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.1 Nguyên liệu .24 2.1.2 Dung mơi, hóa chất .24 2.1.3 Trang thiết bị 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Chọn alkaloid để định hƣớng chiết .26 2.2.2 Khảo sát hợp chất alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn 28 i 2.2.3 Tối ƣu hóa quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1 Chọn alkaloid để định hƣớng chiết 32 3.1.1 Định tính alkaloid thuốc tiêm Cytoblastin .32 3.1.2 Chiết alkaloid thuốc tiêm .34 3.1.3 Xác định khối lƣợng phân tử chất chiết đƣợc từ thuốc tiêm phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (MS ) 34 3.1.4 Khảo sát cực đại hấp thụ alkaloid thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/ 10ml phƣơng pháp quang phổ 35 3.1.5 Xây dựng đƣờng chuẩn alkaloid sulfat nƣớc .36 3.2 Khảo sát hợp chất alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn .38 3.2.1 Sơ khảo sát thực vật .38 3.2.2 Định tính alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn 40 3.2.3 Xây dựng quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn 43 3.3 Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn 49 3.3.1 Xây dựng thí nghiệm tối ƣu hóa .49 3.3.2 Kết tối ƣu hóa 51 3.3.3 Phân tích tƣơng tác ảnh hƣởng yếu tố 54 3.3.4 Kết dự đoán 56 3.4 Bàn luận .57 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 4.1 Kết luận .58 4.2 Kiến nghị .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT C ữ v ết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh VB Vinblastin VC Vincristine SKLM UV-Vis HPLC ESI-MS DĐVN ngtiếng Việt Sắc ký lớp mỏng Ultra violet–visible High-performance liquid chromatography Tử ngoại – khả kiến Sắc ký lỏng hiệu cao Electrospray Ionization - Phƣơng pháp khối phổ với Mass Spectrometer ion hóa phun điện Dƣợc điển Việt Nam iii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Công thức cấu tạo Vinblastin .10 Hình Công thức cấu tạo Vincristin .12 Hình Sơ đồ chiết xuất alkaloid dung môi hữu mơi trƣờng kiềm 15 Hình Sơ đồ chiết xuất alkaloid nƣớc acid 16 Hình Sơ đồ tổng quát chiết xuất alkaloid từ dƣợc liệu 29 Hình Sắc ký đồ định tính alkaloid (vinblastine) thuốc tiêm Cytoblastin (1) dịch chiết từ thuốc tiêm (2) 33 Hình Phổ khối ESI-MS dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin 34 Hình 3 Phổ UV-Vis vinblastine sulfat nƣớc 35 Hình Phổ UV-Vis vinblastine base methanol 36 Hình Đƣờng chuẩn thể phụ thuộc độ hấp thụ vào nồng độ vinblastine sulfat 37 Hình Soi bột dƣợc liệu Dừa cạn 39 Hình Sắc ký đồ xác định vinblastine (C) dịch chiết (T) Dừa cạn 41 Hình Sơ đồ quy trình chiết xuất alkaloid chi tiết 43 Hình Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết bƣớc 44 Hình 10 Sắc ký đồ dịch dung mơi loại chlorophyll (dịch A) .46 Hình 11 Sắc ký đồ dịch alkaloid toàn phần (dịch B) 47 Hình 12 Sắc ký đồ so sánh dung môi chiết tách alkaloid base tồn phần (dịch B) 48 Hình 13 Sắc ký đồ dung dịch thí nghiệm 51 Hình 14 Kết thể mức ảnh hƣởng yếu tố tối ƣu hóa .53 Hình 15 Hệ số biến thiên yếu tố ảnh hƣởng 53 Hình 16 Đƣờng cong thể tƣơng tác yếu tố khảo sát 54 Hình 17 Đƣờng thẳng thể mối quan hệ kết dự đoán kết thực tế 56 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Dung mơi hóa chất cần dùng 24 Bảng 2 Các thiết bị sử dụng 25 Bảng Nồng độ dung dịch thu đƣợc 27 Bảng Các yếu tố ảnh hƣởng mức độ biến đổi 31 Bảng Kết định tính alkaloid thuốc tiêm Cytoblastin phƣơng pháp hóa học 32 Bảng Độ hấp thụ dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin 36 Bảng 3 Kết định tính alkaloid bột dƣợc liệu 40 Bảng Kết khảo sát dung môi chiết bƣớc (theo hình 2.1) 44 Bảng Kết khảo sát dung môi loại chlorophyll bƣớc 46 Bảng Kết khảo sát dung môi chiết tách alkaloid base bƣớc 48 Bảng Các thí nghiệm tối ƣu hóa xây dựng đƣợc 50 Bảng Kết thơng số đánh giá mơ hình thiết kế tối ƣu hóa 52 Bảng Điều kiện tối ƣu hóa dự đốn 56 Bảng 10 Kết thực lần điều kiện tối ƣu 57 v Khóa luận tốt nghiệp dƣợc s đại học - Năm ọc 2017 – 2018 Tố ƣu ó quy trìn c ết xuất alkaloid Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don Apocynaceace) Dƣơng P ƣơng Quỳnh Hƣớng dẫn khoa học: Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, ung thƣ trở thành bệnh nguy hiểm đe dọa đến tính mạng ngƣời Tuy nhiên, thuốc điều trị ung thƣ hạn chế Từ năm 60 kỉ trƣớc, nhà khoa học tìm đƣợc công dụng giúp điều trị ung thƣ hợp chất vinca alkaloid Dừa cạn Thế nhƣng, hàm lƣợng alkaloid khơng nhiều, vậy, nhằm xác định điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid Dừa cạn, đề tài “Tố ƣu ó quy trình chiết xuất alkaloid Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)” đƣợc thực ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Dƣợc liệu tồn Dừa cạn khơ mua hiệu thuốc đông y đƣờng Hải Thƣợng Lãn Ông, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh Chất đối chiếu vinblastin sulfat chiết từ dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin công ty Cipla Pharma Phương pháp nghiên cứu: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm; khảo sát hợp chất alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid Dừa cạn KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đề tài hoàn thành mục tiêu đƣa thu đƣợc kết nhƣ sau: - Xác định vinblastin từ thuốc tiêm bằng: phản ứng hóa học, SKLM, khối phổ MS Sử dụng vinblastin làm chất đối chiếu định tính alkaloid từ bột dƣợc liệu Khảo sát đƣợc cực đại hấp thụ xây dựng đƣờng chuẩn vinblastin phƣơng pháp quang phổ UV-Vis - Định tính sơ dƣợc liệu Dừa cạn phƣơng pháp soi bột định tính alkaloid bột Dừa cạn phƣơng pháp hóa học sắc ký lớp mỏng - Khảo sát dung mơi xây dựng đƣợc quy trình chiết xuất alkaloid tồn phần (định hƣớng vinblastin) với dung mơi chiết ban đầu ethanol 80 %, dung môi loại chlorophyll hexan dung môi chiết tách alkaloid base từ dịch acid chloroform - Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn phần mềm Modde 5.0 chọn đƣợc điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn: tỷ lệ dung môi/ dƣợc liệu 5:1 (tt/kl), thời gian ngâm lạnh 18 pH kiềm hóa KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Sau tháng, đề tài đã thực đƣợc mục tiêu đề ra: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm, khảo sát hợp chất alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid Dừa cạn Từ khóa: Dừa cạn, tối ƣu hóa, Catharanthus roseus, vinblastin, alkaloid