tiểu luận phương pháp phân tích trong cnsh chủ đề aflatoxin

II.2 Nguồn thực phẩm chứ aflatoxin6II.3 Các phương pháp định lượng aflatoxin6III.1 Chuẩn bị dung dịch aflatoxin tiêu chuẩn 7III.2 Chuẩn bị mẫu thực vật 7III.3 Lây nhiễm mẫu với aflatoxi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

-

-TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

TRONG CNSH

Chủ đề AFLATOXIN :

Giảng viên hướng dẫn

MỤC LỤC

I.1 Định nghĩa Aflatoxin 3

I.2 Công thức 3

I.3 Đặc điểm 4

I.4 Tác hại 4

II.1 Phát hiện aflatoxin 5

II.2 Nguồn thực phẩm chứ aflatoxin6

II.3 Các phương pháp định lượng aflatoxin 6

III.1 Chuẩn bị dung dịch aflatoxin tiêu chuẩn 7

III.2 Chuẩn bị mẫu thực vật 7

III.3 Lây nhiễm mẫu với aflatoxin 7

III.4 Chiết mẫu 7

III.5 Làm sạch mẫu 7

IV.1 Cột sắc ký 8

IV.2 Nhiệt độ, thể tích bơm mẫu và tốc độ dòng 8 IV.3 Detector 8

IV.4 Dung môi pha động 8

V.1 Đường hiệu chuẩn 8

V.2 Độ thu hồi 8

V.3 Độ chính xác 8

V.4 Độ chụm 9

2

I Đặc điểm chất phân tích

I.1 Định nghĩa Aflatoxin

Aflatoxin là viết tắt của Aspergillus flavus toxins

Aflatoxin là chất độc được sản sinh ra như một chất chuyển hoá trong quá trình trao đổi chất của nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trong thực phẩm và thức ăn gia súc Aflatoxin là độc tố tích luỹ trong cơ thể người và gia súc, các aflatoxin có thể được gan chuyển hóa thành dạng trung gian epoxit hoạt hóa hoặc được thuỷ phân và trở thành M1 ít độc hơn

I.2 Công thức

3

B1 (C17 H12 O6), B2 (C17 H14 O6), G1 (C17 H12 O7), G2 (C17 H14 O ),…7

I.3 Đặc điểm

Aflatoxin là tinh thể màu trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu

ở nhiệt độ thông thường (ở 1200 độ C phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với men tiêu hóa Tuy nhiên nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp bao gồm 6 loại (B1, B2,

4

G1, G2, M1 và M3) Aflatoxin B1 là loại cực độc, một lượng khoảng 0,03 ppm từ aflatoxin B1 từ khô lạc có thể gây ra u gan

Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus, các chủng nấm này phát triển mạnh ở các loài thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia cầm như ngô, lạc, đậu,… trong các điều kiện thuận lợi nóng

ẩm, nhất là điều kiện thời tiết ở Việt Nam Tác hại của độc tố vi nấm này đối với động vật đã được biết đến từ lâu và đã được chứng minh có thể gây ung thư gan

trên thực nghiệm

Hình ảnh: Nấm Aspergillus.

I.4 Tác hại

Đối với thức ăn chăn nuôi nếu điều kiện chế biến bảo quản không tốt gây ra những thiệt hại cho ngành chăn nuôi, theo Fao có khoảng 25% lượng ngũ cốc cung cấp thế giới có chứa độc tố từ nấm, ở châu Á, tỷ lệ này còn cao hơn do các yếu tố

về khí hậu và phương thức thu hoạch, chế biến, bảo quản kém

Thông thường trong những điều kiện phù hợp Aspergillus sẽ sinh ra Aflatoxin song không đủ lượng để gây ngộ độc nặng, nó làm giảm khả năng hấp thu dinh dưỡng, vật nuôi tăng trưởng chậm, còi cọc làm tăng tiêu tốn thức ăn, khả năng miễn dịch giảm, vật nuôi dễ mắc bệnh Độc tốc gây hư hại tế bào gan, thận, gây ung thư làm tăng tỷ lệ chết ở thú non, giảm năng suất và sản lượng Nếu con người ăn thịt chứa aflatoxin thì có thể bị ung thư gan

Độc tính trên động vật thí nghiệm: nhiễm độc các aflatoxin gây ra một loạt các triệu chứng cấp tính và mãn tính Nhiễm độc thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các triệu chứng thường gặp là hủy hoại tử mô gan

5

chảy máu ở gan và viêm thận cấp nhiễm độc mãn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô Loại mãn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với ba kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến

Đối với cơ thể: aflatoxin được xem như là một trong các tác nhân gây ung thư gan ở người và gây ra dị tật thai ở phụ nữ mang thai Tác động bệnh lý của aflatoxin có tính cộng hưởng với những tác nhân khác: HBV, hoặc những độc tố di truyền bên cạnh gan, các cơ quan khác như: phổi, thận, mạc treo, túi mật cũng bị tổ thương ít nhiều

Khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn:

Tác động qua lại với ADN ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổng hợp ADN và ARN

Ngừng tổng hợp ADN

Giảm tổng hợp ADN và ức chế tổng hợp ARN truyền tin

Biến đổi hình thái tế bào

Giảm tổng hợp protein

Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư biểu mô tế bào gan Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mãn tính ở các loài động vật và con người Độc tính nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan nguyên phát

II Nguồn gốc

II.1 Phát hiện Aflatoxin

Độc tố nấm đã từ lâu được các nhà khoa học quan tâm, trong những năm

1920 – 1930 ở Anh và Liên Xô đã phát hiện nhiều trường hợp ngộ độc Alcalloit ở người và ở gà mà chất này tìm thấy trong lúa mạch và lúa mì Năm 1960 một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại một quần đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương tây tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra độc tối Anatoxin, độc tố tiết ra từ nấm Aspergillus flavus, parasiticus và fumigatus Năm

1961 ở Anh, người ta đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống cho ăn thức ăn đã nhiễm nấm mốc trong đó có 20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan Nghiên cứu của Shank mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50-60% có Aflatoxin, tại các gia đình cũng có 30-50% số mẫu có độc tố aflatoxin

II.2 Nguồn thực phẩm chứa Aflatoxin

6

Ở Việt Nam, theo Viện VSDT nghiên cứu trên 29.381 mẫu lương thực thực phẩm thấy có khoảng 30 loại men mốc khác nhau, trong đó Aspergillus chiếm tỷ lệ cao nhất (5,2 – 80,39%) bao gồm 12 chủng Aspergillus khác nhau, trong đó có 11 chủng sinh độc tố Các sản phẩm thực phẩm có thể nhiễm Aflatoxin: các loại hạt ngũ cốc, ngô, thóc, gạo, lúa mì, bo bo…; các loại hạt có dầu như lạc, dừa, đậu tương, hướng dương…; củ sắn, khoai tây; sữa tươi, phomat; sản phẩm lên men như bia, nước giải khát, rượu vang,

Thực phẩm nhiễm aflatoxin

II.3 Các phương pháp định lượng Aflatoxin

Điều kiện tiến hành phân tích: ở phòng mát, tránh ánh nắng

Có nhiều phương pháp phát hiện aflatoxin, các phương pháp lý hóa học chủ yếu dựa trên tính chất phát huỳnh quang của bước sóng tử ngoại của aflatoxin Aflatoxin có thể được phát hiện và định lượng bằng phương pháp sắc ký trên giấy với các hệ dung môi butanol – nước – acetic (20:1:19) hay chloroform – methanol – (95:5) và sắc ký bản mỏng trên alumin, bột kieselguhl, bột cellulose với hệ dung môi chloroform – methanol (99:1 hay 93:7) hoặc chloroform – aceton (90:10 hay 85:15),… cũng có thể định lượng aflatoxin bằng sắc ký trên cột nhôm oxyd, cột silicagel với các dung dịch rửa là cloroform và hỗn hợp 5% methanol – cloroform Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất cho phát hiện định lượng aflatoxin với độ nhạy cao là sử dụng HPLC

Trong bài báo cáo này, em xin trình bày phương pháp định lượng aflatoxin có trong loài Maytenus ilicifolia bằng HPLC sử dụng đầu dò

7

Fluorescence, phương pháp được phát triển bởi Sayonara Lia Fook Meira Braga và cộng sự (2005).

III Chuẩn bị mẫu

III.1 Chuẩn bị dung dịch aflatoxin tiêu chuẩn

Dung dịch aflatoxin ban đầu được pha loãng với methanol để thu được dung dịch gốc với hàm lượng 10.0μg/mL và được bảo quản lạnh ở -20 C Dung dịch gốco sau đó được pha loãng bằng methanol để thu được dung dịch tiêu chuẩn với hàm lượng 1.0μg/mL Nồng độ aflatoxin trong dung dịch chuẩn được kiểm tra bằng phương pháp quang phổ UV, tuân theo công thức

c = A × CF × MW × 1000/ε Với A là độ hấp thụ ở bước sóng 362nm, CF là chỉ số tuyến tính của thiết bị, MW

là khối lượng phân tử của aflatoxin và ε bằng 21800, 24000, 17000 và 19300 với lần lượt aflatoxin B , B , G , G1 2 1 2.

III.2 Chuẩn bị mẫu thực vật

Mẫu M.ilicifolia được thu thập từ các cửa hàng y tế và hiệu thuốc địa phương Chọn 10 túi mẫu ngẫu nhiên, trộn lại và lấy 500g từ hỗn hợp đem đi phân tích Mẫu sau đó được trộn, nghiền thành bột và mang đi lọc qua lưới dây Sau khi lọc đem chia nhỏ và bảo quản ở -20 C o

III.3 Lây nhiễm mẫu với aflatoxin

5g mẫu sạch được chuẩn bị như trên được cho vào cốc đựng và 1mL aflatoxin được thêm vào để thu được mẫu chứa nồng độ aflatoxin trong khoảng 4-20ng/g

III.4 Chiết mẫu

Lấy 5g mẫu cho vào cốc đựng, thêm vào 70mL hỗn hợp methanol:nước (tỉ lệ 7:3) và 1g kali chloride Hỗn hợp sau đó được siêu âm trong 60 phút và được lọc qua giấy lọc 16 mL dịch lọc sau đó được pha loãng với 32 mL dung dịch đệm phosphate pH 7.3 và lại được tiếp tục lọc Sau khi lọc xong lấy 25 mL dịch lọc mang đi rửa cột ái lực

III.5 Làm sạch mẫu

Dung dịch chiết thu được được đưa qua cột ái lực miễn dịch Sau khi rửa với

15 mL nước, aflatoxin được rửa giải trong ba bước liên tiếp với 1 mL metanol,với khoảng thời gian 30 giây sau mỗi bước, trong điều kiện giảm áp suất bằng cách sử

8

dụng một ống góp chân không Dung dịch thu được được pha loãng với 3 mL metanol và một phần dịch được chuyển vào lọ thủy tinh lấy mẫu tự động 2 mL và được sử dụng trực tiếp để tiêm vào HPLC

IV Điều kiện chạy sắc ký

IV.1 Cột sắc ký

Quá trình phân tách sắc ký được thực hiện trên cột Shim-pack CLC-ODS (5

μm, 250 x 4.6 mm

IV.2 Nhiệt độ, thể tích bơm mẫu và tốc độ dòng

Nhiệt độ chạy sắc ký của cột được duy trì ở nhiệt độ 35 C, thể tích bơm là 20o

μL một lượt bơm và tốc độ dòng là 0,8 mL/phút

IV.3 Detector

Detector 10Axl fluorescence có bước sóng kích thích là 360 nm và bước sóng phát xạ là 440nm

IV.4 Dung môi pha động

Dung môi pha động là hỗn hợp gồm nước:methanol:acetonitrile (56:29:17)

V Kết quả

V.1 Đường hiệu chuẩn

Đường hiệu chuẩn đã được xây dựng bằng cách lây nhiễm mẫu với aflatoxin

ở mức nồng độ 4-20ng/g Dữ liệu được thu ở bảng, cho thấy dư lượng aflatoxin tuyến tính trong phạm vi nồng độ thử nghiệm

V.2 Độ thu hồi

Độ thu hồi của phương pháp được xác định bằng nồng độ aflatoxin trong mẫu đã được lây nhiễm với dung dịch aflatoxin tiêu chuẩn ở nồng độ 7-10ng/g Kết quả cho thấy ở nồng độ 7ng/g độ thu hồi trung bình dao động từ 55,4-61,4% Ở

9

nồng độ 10ng/g, độ thu hồi trung bình dao động từ 61,7-91,6% Mặc dù độ thu hồi khá thấp nhưng nó nằm trong giới hạn quy định bởi European Community directive (European Community, 1998) với việc xác định aflatoxin ở nồng độ thấp hơn 1μg/mL

V.3 Độ chính xác

Độ chính xác được kiểm tra trong cùng một ngày và trong một tuần Để kiểm tra độ chính xác, mẫu đầu tiên được lây nhiễm với aflatoxin ở nồng độ 7,15 và 20 ng/g, sau đó được đem đi chiết Nồng độ aflatoxin trong mẫu lây nhiễm sau đó được định lượng và so sánh với nồng độ trước khi lây nhiễm, cũng như tính toán độ lệch với từng nồng độ lây nhiễm Kết quả cho thấy thử nghiệm trong ngày và liên ngày đều tốt với giá trị độ lệch đều nhỏ hơn 20%, cũng như thử nghiệm liên ngày

có độ chính xác cao hơn

10

V.4 Độ chụm

Độ chụm được thể hiện bởi giá trị RSD và mọi giá trị RSD đều nhỏ hơn 20% Giới hạn phát hiện nhỏ nhất (LOD) được tính toán là 4ng/g với aflatoxin B , 1

B2 và G và 7ng/g với aflatoxin G2 1

VI Tài liệu tham khảo

Giáo trình nấm học – Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Bá, Nguyễn Văn Thành Độc tố học và an toàn thực phẩm – Lê Ngọc Tú

www.aspergillus.ogr.uk/ntlam

Tạp chí nông nghiệp viễn thông

Development and Validation of a Method for the Quantitative Determination

of Aflatoxin Contaminants in Maytenus ilicifolia by HPLC with Fluorescence

Detection - Sayonara Lia Fook Meira Braga, Francinalva Dantas de Medeiros,

Eduardo de Jesus Oliveira and Rui Oliveira Macedo (2005) DOI:

10.1002.pca.837

11