khảo sát đặc điểm phân tử trên gen pcsk9 trong mối liên quan đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình ở người bệnh việt nam

Khao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien q

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

PHẠM HOÀNG NĂNG

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ TRÊN GEN PCSK9

TRONG MỐI LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH

CAO CHOLESTEROL CÓ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH Ở NGƯỜI BỆNH VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

129Wednesday, June 12, 20246:04:55 PM6:04:55 PM129Wednesday, June 12, 20246:04:55 PM6:04:55 PM129Wednesday, June 12, 20246:04:55 PM6:04:55 PM

Khao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet Nam

Khao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet Nam

129Khao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamWednesday, June 12, 2024

Trang 2

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Phạm Hoàng Năng

Ngày sinh: 01/02/1995 Nơi sinh: thành phố Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã học viên: 1884202010013

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Trang 3

Khao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet NamKhao sat dac diem phan tu tren gen PCSK9 trong moi lien quan den benh cao Cholesterol co tinh chat gia dinh o nguoi benh Viet Nam129Wednesday, June 12, 20246:04:53 PM6:04:53 PM129Wednesday, June 12, 20246:04:53 PM6:04:53 PM129Wednesday, June 12, 20246:04:53 PM6:04:53 PM

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Khảo sát đặc điểm phân tử trên gen PCSK9 trong

mối liên quan đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình ở người bệnh Việt Nam” là bài nghiên cứu của chính tôi

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam đoan rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố hoặc được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác

Không có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn này mà không được trích dẫn theo đúng quy định

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác

TP Hồ Chí Minh, Năm 2020

………

Phạm Hoàng Năng

Trang 5

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Huyền Ái Thúy đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cần thiết và hết lòng hướng dẫn, hỗ trợ em trong suốt quá trình học tập chương trình cao học và thực hiện Luận Văn Thạc Sĩ

Em xin cảm ơn TS Trương Kim Phượng và TS Lao Đức Thuận đã hướng dẫn, hỗ trợ, chỉ bảo em không chỉ những kiến thức chuyên môn, tinh thần nghiên cứu nghiêm túc và làm việc hiệu quả mà còn chỉ dạy em nhiều kinh nghiệm sống trong suốt quá trình thực hiện Luận Văn Thạc Sĩ

Em xin cảm ơn các anh chị học viên, các bạn đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em có thể hoàn thành Luận Văn Thạc Sĩ một cách thuận lợi nhất

Em xin cảm ơn Quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học và Quý Thầy Cô khoa Đào Tạo Sau Đại Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua

Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em có cơ hội được học tập, thực hiện và hoàn thành Luận Văn Thạc Sĩ Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cha mẹ đã nuôi dưỡng, dạy bảo để con có được ngày hôm nay Xin cảm ơn anh chị em trong gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập và hoàn thành Luận Văn Thạc Sĩ

Xin Chân Thành Cảm Ơn!

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 6

TÓM TẮT

Bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình (Familial hypercholesterolemia - FH) là dạng bệnh lý rối loạn di truyền ở dạng trội, với biểu hiện đặc trưng là sự tăng cao bất thường nồng độ cholesterol trong máu, dẫn đến sự tích tụ cholesterol ở da, gân và trong mạch máu (Khachadurian, 1964; Goldstein, 1974) Bệnh nhân mắc FH có nguy cơ cao mắc các bệnh về tim mạch từ rất sớm, điển hình như bệnh mạch vành có thể xuất hiện ở độ tuổi 40 đến 50 và nếu không được điều trị sớm, ở tuổi 60, khoảng 85% bệnh nhân sẽ bị nhồi máu cơ tim (Polychronopoulos và Tziomalos, 2019)

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO), bệnh cao cholesterol (tăng cholesterol) trong máu làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và đột quỵ Bệnh cao cholesterol là nguyên nhân gây ra 2,6 triệu ca tử vong Trong năm 2008, WHO đã ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh cao cholesterol ở người trưởng thành khoảng 39% (WHO, 2008) Nguyên nhân dẫn đến bệnh cao cholesterol trong máu là hút thuốc, béo phì, có lối sống thụ động, chế độ dinh dưỡng nghèo nàn, mất cân đối (tiêu thụ nhiều chất béo),v.v…, và có liên quan mật thiết với các rối loạn di truyền trên các

gen liên quan đến quá trình chuyển hóa lipid trong máu như: gen Low - Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (ApoB), Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin - 9 (PCSK9), (Kopin và Lowenstein, 2017; Veljkovic et al., 2018; Mach et al., 2020)

Gen proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) mã hóa protein giữ vai trò

quan trọng trong quá trình chuyển hóa cholesterol Một số dạng đột biến điểm xuất

hiện trên exon gen PCSK9 là nguyên nhân gây nên sự tăng chức năng của protein

PCSK9 Hệ quả dẫn đến sự rối loạn quá trình chuyển hóa cholesterol, tăng lượng

LDL-C (LDL - Cholesterol) trong máu – một dạng bệnh lý FH (Veljkovic et al.,

2018)

Hướng nghiên cứu đặc điểm phân tử liên quan đến bệnh lý rối loạn chuyển hóa cholesterol đã và đang được triển khai ở nhiều quốc gia, tuy nhiên, vẫn chưa được phát triển tại Việt Nam Vì vậy, trong phạm vi luận văn thạc sỹ, nghiên cứu này được

tiến hành với mục tiêu: Xác định đặc điểm phân tử xuất hiện trên gen PCSK9 trong

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 7

mối liên quan đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình trên người bệnh Việt Nam

Nghiên cứu này thực hiện các phương pháp chính: Xác định tỷ lệ và sự phân bố của

các biến thể xuất hiện trên gen PCSK9 trên thế giới thông qua phân tích tổng hợp dựa

trên mô hình phân tích ảnh hưởng cố định/ngẫu nghiên, đồng thời, xác định một số

tính chất đột biến nổi trội trên gen PCSK9 ở bệnh nhân mắc bệnh rối loạn lipid máu

tại Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự Sanger

Kết quả nghiên cứu ghi nhận được: Từ 32 nghiên cứu khoa học liên quan đến bệnh

cao cholesterol có tính chất gia đình và tính chất đột biến trên gen PCSK9, chúng tôi ghi nhận tỷ lệ xuất hiện biến thể trên gen PCSK9 trên người bệnh FH vào khoảng

5,67% (95%CI = 3,68 – 8,05; p < 0,0001) Trong đó, tỷ lệ của các biến thể GOF là 3,57% (95%CI = 1,76 – 5,97; p < 0,0001) và LOF là 6,05% (95%CI = 3,35 – 9,47; p

< 0,0001) Tỷ lệ các biến thể xuất hiện trên gen PCSK9 cũng cao hơn ở các bệnh nhân

tại Châu Á và Châu Phi, thấp hơn ở Bắc Mỹ, Châu Âu và Châu Đại Dương Ngoài ra,

chúng tôi ghi nhận exon 1 và exon 2 thuộc gen PCSK9 có tỷ lệ xuất hiện các biến thể

GOF và LOF cao hơn so với các exon còn lại Từ đó, chúng tôi xác định được exon 1 và exon 2 là các vùng mã hóa tiềm năng cho khảo sát tính chất đột biến trên gen

PCSK9 Đối với 26 mẫu DNA từ người bệnh cao cholesterol tại Việt Nam, chúng tôi ghi nhận có sự xuất hiện của các biến thể trên gen PCSK9 ở 14 trên tổng số 26 bệnh

nhân tham gia vào nghiên cứu này

Trang 8

ABSTRACT

Familial hypercholesterolemia is a common dominant disorder of cholesterol metabolism characterized by elevated level of serum cholesterol and the presence of tendon xanthomata (Khachadurian, 1964; Goldstein, 1974) Patients with FH are at high risk of early-onset atherosclerotic cardiovascular disease Coronary heart disease presents during the 4th to 5th decade of life Without treatment at the age of 60 years, approximately 85% percent of FH patients will have suffered a myocardial infarction(Polychronopoulos và Tziomalos, 2019)

According to the World Health Organization (WHO), raised cholesterol levels increase the risks of heart disease and stroke Overall, raised cholesterol is estimated to cause 2.6 million deaths In 2008, the global prevalence of raised total cholesterol among adults was 39% (WHO, 2008) Raised cholesterol typically associated with behavioral risk factors such as smoking, sedentary lifestyle, and poor dietary habits, and it’s also strongly related to genetic burdens on genes which are take part in the

cholesterol metabolism such as Low - Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (ApoB), Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin - 9 (PCSK9), (Kopin và Lowenstein, 2017; Veljkovic et al., 2018; Mach et al., 2020)

The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) gene encodes for the

protein which plays an important role in the LDL metabolism Many gain of function

mutations in PCSK9 have been reported These mutations increases LDLR

degradation activity of the PCSK9 protein, which leads to considerably elevated

LDL-C levels and the development of FH (Veljkovic et al., 2018)

Researchs on molecular characteristics related to cholesterol metabolism disorders has been deployed in many countries, however, has not yet been developed in Vietnam Therefore, this study aims to presents the molecular characteristics of

PCSK9 gene related to familial hypercholesterolemia on the Vietnamese patients

Through meta-analysis, based on fixed/random effect model, we determined the

propotion and distribution of PCSK9 variants on FH patients all over the world We

Trang 9

also identified molecular characteristics ofPCSK9 gene in patients with dyslipidemia

in Vietnam by Sanger sequencing method

Total of 32 cohort studies were enrolled into current study The analysis results

indicated that, based on the random-effect model, the weighted prevalence of PCSK9 mutation was 5.67% (95%CI = 3.68 – 8.05, p < 0.0001) The prevalence of PCSK9 GOF mutations was 3.57% (95%CI = 1.76 – 5.97, p < 0.0001) and PCSK9 LOF

mutations was 6.05% (95%CI = 3.35 – 9.47, p < 0.0001) Additionally, the first and

the second exon were identified as the hot spot of mutation occurred in PCSK9 Both

GOF and LOF mutations have a higher proportion in Asia and Africa to compare

with other regions We also detected PCSK9 variants on 14 of 26 dyslipidemia

Trang 10

Danh mục từ viết tắt xiii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Cơ sở hình thành luận văn 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3 Giả thuyết nghiên cứu 3

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.5 Phương pháp nghiên cứu 5

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5

CHƯƠNG 2: CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 6

2.1 Cholesterol 6

2.2 Lipoprotein 6

2.3 Chu trình chuyển hóa LDL-C 6

2.4 Bệnh rối loạn lipid máu (Dyslipidemia) 7

Trang 11

2.5.3 Nguyên nhân 9

2.5.4 Chẩn đoán 9

2.5.5 Bệnh FH tại Việt Nam 12

2.6 Proprotein Convertase Serine/Kexin 9 (PCSK9) 13

2.6.1 Định vị 13

2.6.2 Cấu trúc protein PCSK9 13

2.6.3 Chức năng 14

2.6.4 Tính chất đột biến trên gen PCSK9 15

2.6.5 Một số công trình nghiên cứu về đột biến trên gen PCSK9 16

2.6.6 Thuốc ức chế protein PCSK9 16

2.7 Một số phương pháp phát hiện đột biến trên gen PCSK9 17

2.8 Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) 18

3.2.3.1 Thu thập trình tự gen PCSK9 26

3.2.3.2 Khảo sát các bộ mồi nhằm phát hiện đột biến trên gen PCSK9 26

3.2.3.3 Phân tích chức năng đột biến 26

Trang 12

3.2.4.1 Tách chiết DNA bộ gen 28

3.2.4.2 Đánh giá chất lượng tách chiết DNA bằng phương pháp đo mật độ quang (Optical density – OD) 29

3.2.4.3 Phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự mục tiêu trên gen PCSK9 29

3.2.4.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 31

3.2.4.5 Giải trình tự và phân tích trình tự sản phẩm PCR 31

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 33

4.1 Khai thác dữ liệu 33

4.2 Phân tích tổng hợp 38

4.2.1 Đặc điểm đột biến trên gen PCSK9 38

4.2.2 Ảnh hưởng của yếu tố địa lý đến tính chất đột biến trên gen PCSK9 42

4.2.3 Đặc điểm phân bố biến thể trên gen PCSK9 42

4.3 Khảo sát in silico 45

4.3.1 Thu thập trình tự gen PCSK9 45

4.3.2 Một số trình tự mồi thu thập được nhằm phát hiện đột biến trên gen PCSK9 45

4.4 Kết quả thực nghiệm 48

4.4.1 Đặc điểm bộ mẫu 48

4.4.2 Kết quả tách chiết DNA 48

4.4.3 Kết quả thực hiện PCR-giải trình tự 49

4.4.4 Phân tích kết quả giải trình tự sản phẩm PCR 51

Trang 13

Phụ lục 1: Cấu trúc gen PCSK9 77

Phụ lục 2: Đặc điểm 55 biến thể trên gen PCSK9 được thu thập từ các công bố khoa học 77

Phụ lục 3 Đặc điểm bộ mẫu bệnh nhân cao cholesterol tại Việt Nam 84

Phụ lục 4 Các biến thể đã được ghi nhận trên cơ sở dữ liệu Clinvar, LOVD được tìm thấy trên bệnh nhân cao cholesterol tại Việt Nam 86

Phụ lục 5 Kết quả giải trình tự mẫu M8 với mồi FO-E1F 88

Phụ lục 6 Kết quả giải trình tự mẫu M8 với mồi FO-E1R 89

Phụ lục 7 Kết quả giải trình tự mẫu M8 với mồi FO-E2F 90

Phụ lục 8 Kết quả giải trình tự mẫu M8 với mồi FO-E2R 91

Trang 14

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 2.1 Định vị gen PCSK9 trên nhiễm sắc thể số 1 13

Hình 2.2 Cấu trúc protein PCSK9 14

Hình 2.3 Cơ chế và vai trò của PCSK9 trong chuyển hóa LDL-C 15

Hình 3.1 Mẫu phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu 22

Hình 3.2 Sơ đồ mô tả quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu trong phân tích tổng hợp 24

Hình 3.3 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR 30

Hình 4.1 Các bước thực hiện sàng lọc công trình nghiên cứu khoa học 34

Hình 4.2 (A) Đồ thị “Forest plot” phản ánh tỷ lệ đột biến gen PCSK9 và (B) Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị của tỷ lệ đột biến gen PCSK9 trong bộ dữ liệu 32 công trình nghiên cứu khoa học 39

Hình 4.3 Vị trí bắt cặp của cặp mồi FO-E1 trên exon 1 47

Hình 4.4 Vị trí bắt cặp của cặp mồi FO-E2 trên exon 2 47

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR gradient nhiệt độ khuếch đại (A) Exon 1 và (B) Exon 2 thuộc gen PCSK9 trên mẫu bệnh phẩm M1 50

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại (A) Exon 1 và (B) Exon 2 thuộc gen PCSK9 51

Hình 4.7 Biến thể p.(Pro71Leu) (c.212C>T) xuất hiện trên mẫu M7 59

Hình 4.8 Biến thể p.(Leu23_Gly24insLeu) (c.69_70insCTG) xuất hiện trên mẫu M4 60

Hình 4.9 Biến thể p.(Leu23_Gly24insLeu) (c.69_70insCTG) xuất hiện trên mẫu M6 61

Hình 4.10 Biến thể p.(Ala53Vval) (c.158C>T) xuất hiện trên mẫu M4 62

Hình 4.11 Biến thể p.(Ala53Val) (c.158C>T) xuất hiện trên mẫu M6 62

Hình 4.12 Biến thể p.(Arg105Gln) (c.314G>A) xuất hiện trên mẫu M5 63

Trang 15

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Tiêu chí về nồng độ cholesterol trong máu trong chẩn đoán bệnh lý

rối loạn mỡ máu 8

Bảng 2.2 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH theo Simon Broome 10

Bảng 2.3 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH theo Dutch Lipid Clinic Network 11

Bảng 3.1 Trình tự các bộ mồi khuếch đại vùng trình tự mục tiêu gen PCSK9 30

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 30

Bảng 4.1 Đặc điểm của bộ dữ liệu 32 công bố khoa học và tỷ lệ đột biến trên gen PCSK9 35

Bảng 4.2 Tỷ lệ xuất hiện của các biến thể PCSK9 ở bệnh nhân Châu Á 40

Bảng 4.3 Tỷ lệ xuất hiện biến thể PCSK9 ở các châu lục 43

Bảng 4.4 Tỷ lệ xuất hiện biến thể PCSK9 trên 12 exon 44

Bảng 4.5 Cơ sở dữ liệu gen PCSK9 được thu thập từ NCBI 45

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát thông số vật lý của các bộ mồi khuếch đại vùng exon 1 và exon 2 thuộc gen PCSK9 45

Bảng 4.7 Vị trí bắt cặp của bộ mồi khuếch đại vùng exon 1 và exon 2 thuộc gen PCSK9 46

Bảng 4.8 Kết quả đo mật độ quang của các mẫu DNA bộ gen người 48

Bảng 4.9 Đặc điểm các biến thể được ghi nhận trên mẫu bệnh phẩm tại Việt Nam 52

Trang 16

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ACGS Association for Clinical Genetic Science

ACMG American College of Medical Genetics and Genomics AHA American Heart Association

AMP Association for Molecular Pathology

ApoB Apolipoprotein B

ApoC1 Apolipoprotein C1 ApoC-II Apoliprotein C-II ApoE Apolipoprotein E

BLAST Basic Local Alignment Search Tool CETP Cholesterylester-transfer protein CI Confidence intervals

DNA Deoxyribonucleic acid

EAS European Atherosclerosis Society

EGF-A Epidermal growth factor precursor homology domain A FH Familial hypercholesterolemia

GOF Gain of function

HDL High - Density Lipoprotein

HDL-C High - Density Lipoprotein – Cholesterol HeFH Heterozygous Familial Hypercholesterolemia HGVS Human Genome Variation Society

HMG-CoA 3-hydroxy-3-metylglutaryl coenzyme A HoFH Homozygous Familial Hypercholesterolemia HRM High Resolution Melting

IDL Intermediate Density Lipoprotein LDL Low - Density Lipoprotein

LDL-C Low - Density Lipoprotein – Cholesterol LDLR Low - Density Lipoprotein Receptor LOF Loss of function

Trang 17

LOVD Leiden Open Variation Database LPL Lipoprotein lipase

miRNA Micro ribonucleic acid

MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification mRNA Messenger ribonucleic acid

NARC-1 Neural apoptosis regulated convertase 1

NCBI National Center for Biotechnology Information NCEP ATP III National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III

NGS Next genration sequencing OD Optical density

PCR Polymerase chain reaction

PCSK9 Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin 9 Pro Prodomain

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic acid

Trang 18

Trang 19

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Cơ sở hình thành luận văn

Bệnh rối loạn lipid máu (Dyslipidemia) là dạng bệnh lý rối loạn chuyển hóa lipid đặc trưng bởi sự tăng bất thường nồng độ LDL, cholesterol tổng số và triglyceride, hoặc nồng độ HDL giảm bất thường trong máu Đây là nguyên nhân dẫn đến các bệnh về tim mạch như bệnh mạch vành và đột quỵ (Kopin và Lowenstein, 2017)

Bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình (Familial hypercholesterolemia - FH) là một bệnh rối loạn chuyển hóa lipid; gây ra bởi các rối loạn di truyền đơn gen, dạng trội Biểu hiện đặc trưng của bệnh là sự tăng cao bất thường nồng độ cholesterol trong máu, dẫn đến sự tích tụ cholesterol ở da, gân và trong mạch máu (Khachadurian,

1964; Goldstein, 1974, Mach et al., 2020)

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO), bệnh tim mạch là một nhóm các bệnh về tim và mạch máu bao gồm: bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh động mạch ngoại vi, bệnh tim bẩm sinh và huyết khối tĩnh mạch sâu gây thuyên tắc phổi Bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới với ước tính khoảng 17,9 triệu người tử vong trong năm 2016 Riêng tại các nước đang phát triển, bệnh tim mạch chiếm hơn 30% trên tổng số ca tử vong (WHO, 2017)

Bệnh mạch vành là một trong những bệnh tim mạch thường gặp (Veljkovic et al.,

2018) Ngoài các yếu tố về lối sống và chế độ dinh dưỡng, bệnh mạch vành liên quan

mật thiết với các yếu tố di truyền (Veljkovic et al., 2018) Một số nghiên cứu quần thể

cho thấy, các yếu tố di truyền làm tăng nguy cơ mắc bệnh mạch vành từ 40 đến 60%, trong đó, có bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình (Familial

hypercholesterolemia – FH; Veljkovic et al., 2018)

Tần suất mắc bệnh FH theo công bố của Dutch Lipid Clinic Network trên toàn cầu lần

lượt là 1:250 đối với HeFH và 1:160.000 – 1:300.000 đối với HoFH (Cuchel et al., 2014; Akioyamen et al., 2017) Nguyên nhân chính dẫn đến bệnh FH là do các đột

biến điểm trên một số gen chịu trách nhiệm, có chức năng trong con đường chuyển

hóa cholesterol: LDLR, ApoB, PCSK9, … (Khachadurian, 1964; Goldstein, 1974)

Đối với bệnh nhân mắc FH, bệnh tim mạch vành có thể xuất hiện ở độ tuổi 40 đến 50

Trang 20

và nếu không được điều trị sớm, ở tuổi 60, khoảng 85% bệnh nhân sẽ bị nhồi máu cơ tim (Polychronopoulos và Tziomalos, 2019)

Nếu được chẩn đoán sớm và trị liệu thích hợp để giảm lượng cholesterol trong máu

của bệnh nhân FH, nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch sẽ giảm (Lye et al., 2013; Mach et al., 2020) Hiện nay, tại Việt Nam, bệnh vẫn chưa được chẩn đoán và các

phương thức điều trị bệnh vẫn còn hạn chế Người bệnh chỉ được thông báo về sự bất thường trong các chỉ số về cholesterol trong máu (cholesterol tổng số, HDL-C, LDL-C, Triglyceride) khi khám và điều trị các bệnh lý khác tại các cơ sở y tế và sẽ

được chỉ định điều trị bằng một số thuốc hạ cholesterol máu thông thường (Truong et al., 2018) Theo ghi nhận của Mahdieh et al (2020), từ năm 1970 đến nay, 160 bài báo khoa học thực hiện nghiên cứu về trên các gen LDLR, ApoB và PCSK9 liên quan

đến bệnh FH trên quần thể người Châu Á được công bố từ 20 quốc gia và khoảng 42% các quốc gia Châu Á không có bất kỳ thông tin nào về FH Cập nhật đến năm 2019, các công trình nghiên cứu về đặc điểm phân tử của những gen liên quan (nguyên nhân chính) đến bệnh FH trên người Việt Nam vẫn còn hạn chế Điển hình là

công bố của Truong et al (2018), Truong et al (2019)

Tính chất đột biến xuất hiện trên gen PCSK9 gồm hai dạng: mất chức năng và tăng chức năng (Veljkovic et al., 2018; Polychronopoulos và Tziomalos, 2019) Đột biến

tăng chức năng (Ser127Arg, Asp374Tyr, Arg496Trp, …) khiến LDLR bị phân hủy dẫn đến tăng lượng LDL trong máu và tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, ngược lại, đột biến mất chức năng (Thr77Ile, Tyr142*, Trp428*, …) lại làm giảm lượng

LDL trong máu (Abifadel et al., 2009a; Veljkovic et al., 2018) Theo ghi nhận của Sharifi et al (2017), biến thể p.(Asp374Tyr) gây tăng chức năng protein PCSK9, là biến thể gây bệnh FH thường gặp trên gen PCSK9, tuy nhiên chỉ xuất hiện trên

khoảng 2% số bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh FH Đối với biến thể p.(Arg46Leu), được xác nhận gây mất chức năng protein PCSK9, làm giảm lượng LDL và đồng thời làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch lại có tần suất xấp xỉ 3% ở quần thể người Châu Âu

Trang 21

Dựa vào các đặc điểm phân tử trên của gen PCSK9, hiện nay, hướng điều trị tăng

cholesterol máu được triển khai dựa vào việc tác động lên protein PCSK9 thông qua các chất ức chế hoặc kháng thể nhằm hạn chế sự hoạt động của protein PCSK9 dẫn

đến làm giảm lượng LDL-C trong máu (Abifadel et al., 2009a) Từ đó cho thấy việc tìm hiểu các đột biến liên quan đến PCSK9 không những có ý nghĩa về chẩn đoán

phân tử mà còn cung cấp thêm thông tin cho việc điều trị bệnh FH

Trên cơ sở khoa học nêu trên, cùng với hướng tiếp cận công nghệ sinh học trong hỗ trợ chẩn đoán bệnh lý ở người, tập trung vào bệnh cao cholesterol trong máu, luận văn

cao học này được thực hiện nhằm: “Khảo sát đặc điểm phân tử trên gen PCSK9

trong mối liên quan đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình ở người bệnh Việt Nam”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định đặc điểm phân tử xuất hiện trên gen PCSK9 trong mối liên quan đến bệnh

cao cholesterol có tính chất gia đình trên người bệnh Việt Nam

1.3 Giả thuyết nghiên cứu

− Có hay không sự khác nhau về mức độ đột biến (đánh giá thông qua giá trị

Proportion), các kiểu đột biến xuất hiện trên trình tự gen PCSK9 ở các mẫu máu của

bệnh nhân FH từ các công bố khoa học trên thế giới

Proportion), các kiểu đột biến xuất hiện trên trình tự gen PCSK9 ở các bệnh nhân FH

tại các khu vực khác nhau trên thế giới

Proportion), các kiểu đột biến xuất hiện trên các exon thuộc gen PCSK9 ở các bệnh

nhân FH

− Có hay không sự xuất hiện đột biến trên trình tự gen PCSK9 ở mẫu máu của người

Việt Nam có sự biểu hiện bất thường cholesterol trong máu

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu:

Trang 22

− Đối với phần phân tích tổng hợp, đối tượng nghiên cứu là dữ liệu được trích xuất từ các công bố khoa học trên thế giới, đạt yêu cầu phân tích

− Đối với phần thực nghiệm, đối tượng nghiên cứu là người Việt Nam, có sự biểu hiện bất thường cholesterol trong máu

Phạm vi:

Đối với nội dung phân tích tổng hợp: Khai thác dữ liệu trên hệ thống cơ sở dự liệu NCBI, Google Scholar về các nghiên cứu ca chứng, nghiên cứu đoàn hệ, thuộc hướng

phân tích đặc điểm phân tử trên gen PCSK9

Đối với nội dung thực nghiệm: Đặc điểm phân tử trên gen PCSK9 được tập trung

phân tích vùng exon 1 và exon 2 có tỷ lệ cao xuất hiện các biến thể ảnh hưởng đến chức năng protein PCSK9 Bộ mẫu bệnh phẩm là máu toàn phần được thu nhận kèm thông tin về chỉ số sinh hóa máu: Cholesterol toàn phần, LDL-C, HDL-C, Triglyceride theo hướng dẫn của Hiệp hội tim mạch Hoa Kỳ (American Heart Association - AHA), Hiệp hội tim mạch Châu Âu (European Atherosclerosis Society - EAS) và Chương trình Giáo dục Cholesterol Quốc gia Hoa Kỳ về điều trị cao cholesterol ở người lớn (National Cholesterol Education Program Adult Treatment

Panel III - NCEP ATP III) (Kopin và Lowenstein, 2017; Mach et al., 2020)

Cỡ mẫu:

− Đối với nội dung phân tích tổng hợp, dữ liệu khoa học phải có ít nhất 10 công bố khoa học, để đưa vào tổng quan hệ thống, trích xuất dữ liệu (Haidich, 2011;

Higgins et al., 2013; Ryan, 2014)

− Đối với nội dung thực nghiệm, theo kết quả phân tích tổng hợp từ 32 công trình nghiên cứu khoa học về tính chất đột biến trên bệnh nhân FH, tần số đột biến có

trọng số gây bệnh FH xuất hiện trên gen PCSK9 trên bộ mẫu bệnh nhân FH là 3,57% Vì vậy, cỡ mẫu được xác định theo công thức của Kumar et al (2014) như

Trang 23

Chú thích: độ tin cậy 95%, Z1-𝑎2 = 1,96; sai số, d = 0,1

Nếu tần số đột biến có trọng số gây bệnh FH xuất hiện trên gen PCSK9 là 3,57%, cỡ

mẫu dự kiến là: 13 mẫu Tuy nhiên, lượng mẫu sử dụng trong nghiên cứu thực nghiệm sẽ dựa trên tình hình và tỷ lệ đột biến thực tế ghi nhận trong nghiên cứu

1.5 Phương pháp nghiên cứu

Khai thác dữ liệu - Phân tích tổng hợp: Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp:

thu thập, khai thác dữ liệu khoa học trên thế giới về đặc điểm phân tử bất thường (biến

thể/tính chất đột biến) trên gen PCSK9 và phân tích chỉ số Proportion để đánh giá mức độ đột biến trên gen PCSK9 liên quan đến sự biểu hiện rối loạn – tăng cao

cholesterol trong máu (bệnh FH)

Khảo sát trên máy tính: Ứng dụng một số công cụ tin – sinh học và khai thác dữ liệu từ NCBI, Clinvar, LOVD nhằm: (1) Phân tích chức năng đột biến trên trình tự gen

mục tiêu (PCSK9) (2) Thu thập thông tin trình tự gen mục tiêu, bộ mồi phù hợp với

phương pháp PCR-giải trình tự (giải trình tự Sanger) nhằm phân tích đặc điểm phân

tử trên trình tự gen mục tiêu (PCSK9)

Khảo sát thực nghiệm: Ứng dụng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự nhằm phân tích

đặc điểm phân tử (tính chất đột biến) xuất hiện trên trình tự mục tiêu thuộc gen

PCSK9 trên một số mẫu máu ở Việt Nam

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này mô tả bức tranh tổng thể về đặc điểm phân tử (đột biến điểm) xuất

hiện trên gen PCSK9 trong mối liên quan đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình trên thế giới và khái quát một số tính chất đột biến nổi trội trên gen PCSK9 ở một

số bệnh nhân cao cholesterol ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu góp phần tạo nên dữ liệu di truyền về bệnh FH ở Việt Nam, hướng đến ứng dụng trong hỗ trợ chẩn đoán, tiên đoán, và hỗ trợ định hướng điều trị bệnh cao cholesterol có tính di truyền, đồng thời, sàng lọc và quản lý người bệnh FH tại Việt Nam nhằm hạn chế nguy cơ mắc bệnh lý tim mạch ở Việt Nam

Trang 24

CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

Trang 25

CHƯƠNG 2: CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Cholesterol

Cholesterol là một chất béo steroid, giữ vai trò thiết yếu trong cấu trúc màng tế bào động vật, vi sinh vật và một số loài nấm Cholesterol còn là tiền chất của vitamin D (được tổng hợp ở tế bào da) và các hormone steroid (tổng hợp ở tuyến thượng thận, tuyến sinh dục và acid mật) (Yeagle, 1985)

2.2 Lipoprotein

Lipoprotein là phức hợp gồm protein và lipid có chức năng vận chuyển lipid trong máu Lipoprotein được tổng hợp ở gan từ lipid trong tế bào và lipid ngoại sinh Các loại lipoprotein gồm: lipoprotein tỷ trọng rất thấp (Very Low Density Lipoprotein – VLDL), lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein – LDL), lipoprotein tỷ trọng trung bình (Intermediate Density Lipoprotein – IDL) và lipoprotein tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein – HDL) (Eisenberg và Levy, 1975)

2.3 Chu trình chuyển hóa LDL-C

Chu trình chuyển hóa cholesterol bắt đầu khi VLDL chưa trưởng thành được tổng hợp ở gan và giải phóng vào máu Thành phần của VLDL chưa trưởng thành gồm: apolipoprotein-B100 (apoB-100), apolipoprotein E (apoE), apolipoprotein C1 (apoC1), cholesterol ester, cholesterol và triglyceride Khi tuần hoàn trong mạch máu, VLDL chưa trưởng thành nhận apoliprotein C-II (apoC-II) từ HDL và trở thành VLDL trưởng thành VLDL trưởng thành tương tác với lipoprotein lipase (LPL) trong các mao mạch của mô mỡ, cơ tim và tế bào mô cơ xương nhằm loại bỏ Triglyceride ra khỏi phức hợp VLDL Triglycerides được lưu trữ hoặc sử dụng để sản sinh năng lượng trong các mô này Một lần nữa, VLDL trưởng thành tương tác với HDL nhằm hoàn trả lại apoC-II cùng với phospholipid và triglyceride để nhận lấy cholesteryl ester từ cholesterylester-transfer protein (CETP) Quá trình trên giúp chuyển hóa VLDL thành IDL Một nửa số IDL tuần hoàn trong máu được nhận diện và hấp thụ bởi tế bào gan thông qua apoB-100 và apoE Lượng IDL còn lại mất đi apoE và chuyển hóa thành LDL Các phân tử LDL mang apoB-100 có ái lực mạnh với LDLR Khi LDL liên kết với LDLR thông qua apoB-100, phức hợp LDL/LDLR

Trang 26

sẽ được nhập bào bởi các endosome pH thấp bên trong endosome làm giảm ái lực giữa LDL và LDLR khiến phức hợp LDL/LDLR tan rã LDL được hấp thụ bởi tế bào

và LDLR được vận chuyển trở lại bề mặt tế bào để tái sử dụng (Chaudhary et al.,

Theo báo cáo của Tổ Chức Y Tế Thế Giới (World Health Organization-WHO), bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới với ước tính khoảng 17,9 triệu người tử vong trong năm 2016 Riêng tại các quốc gia đang phát triển, bệnh tim mạch chiếm hơn 30% trên tổng số ca tử vong (WHO, 2017)

2.4.2 Nguyên nhân

Nguyên nhân dẫn đến bệnh rối loạn lipid máu là hút thuốc; béo phì; có lối sống thụ động; chế độ dinh dưỡng nghèo nàn, mất cân đối (tiêu thụ nhiều chất béo),… và có liên quan mật thiết với các rối loạn di truyền trên các gen liên quan đến quá trình

chuyển hóa lipid trong máu như: gen Low - Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (ApoB), Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin – 9 (PCSK9), … (Kopin và Lowenstein, 2017; Veljkovic et al., 2018)

2.4.3 Dấu hiệu và triệu chứng

Rối loạn mỡ máu thường không có các dấu hiệu và triệu chứng đặc trưng Tuy nhiên, rối loạn mỡ máu thường dẫn đến các bệnh khác như xơ vữa động mạch và các bệnh tim mạch vành (Kopin và Lowenstein, 2017)

2.4.4 Chẩn đoán

Hiện nay, phương pháp chẩn đoán bệnh rối loạn mỡ máu phổ biến nhất là xác định nồng độ cholesterol trong máu dựa theo hướng dẫn của Hiệp hội tim mạch Hoa Kỳ (American Heart Association - AHA), Hiệp hội tim mạch Châu Âu (European

Trang 27

Atherosclerosis Society - EAS) và Chương trình Giáo dục Cholesterol Quốc gia Hoa Kỳ về điều trị cao cholesterol ở người lớn (National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III - NCEP ATP III):

Bảng 2.1 Tiêu chí về nồng độ cholesterol trong máu trong chẩn đoán bệnh lý

rối loạn mỡ máu (Kopin và Lowenstein, 2017; Mach et al., 2020)

(mmol/L) Cholesterol toàn phần > 6,20

trong mạch máu (Khachadurian, 1964; Goldstein, 1974; Mach et al., 2020) Nguyên

nhân chính dẫn đến bệnh FH là do tính chất bất thường dạng trội, xảy ra trên đơn gen, cụ thể là tính chất đột biến điểm trên một trong số các gen chịu trách nhiệm, có chức

năng trong con đường chuyển hóa cholesterol: LDLR, ApoB, PCSK9, …

(Khachadurian, 1964; Goldstein, 1974)

2.5.2 Các thể bệnh FH

Các công bố khoa học của Khachadurian (1964); Goldstein (1974) và Cuchel et al

(2014) đã công bố bệnh FH có hai thể: đồng hợp (Homozygous Familial Hypercholesterolemia - HoFH) và dị hợp (Heterozygous Familial Hypercholesterolemia - HeFH) Tần suất mắc bệnh FH theo công bố của Dutch Lipid Clinic Network trên toàn cầu lần lượt là 1:250 đối với HeFH và 1:160.000 -

1:300.000 đối với HoFH (Cuchel et al., 2014; Akioyamen et al., 2017)

Trang 28

Theo công bố của Cuchel et al (2014) và Veljkovic et al (2018), người bệnh HoFH

có biểu hiện tăng cao bất thường nồng độ LDL-C ngay từ giai đoạn sơ sinh và có nguy cơ cao mắc các dạng bệnh lý tim mạch và có thể có nguy cơ tử vong sớm Song song, diễn tiến bệnh lý ở người bệnh HeFH có thể tương đối ít nghiêm trọng hơn nhưng vẫn có nguy cơ cao mắc bệnh mạch vành sớm Bệnh tim mạch vành có thể xuất hiện ở độ tuổi 40 đến 50 và nếu không được điều trị sớm, ở tuổi 60, khoảng 85%

bệnh nhân sẽ bị nhồi máu cơ tim (Truong et al., 2018; Polychronopoulos và

Tziomalos, 2019)

2.5.3 Nguyên nhân

Nguyên nhân chính dẫn đến bệnh FH là do các đột biến trên gen LDLR làm thay đổi sự biểu hiện cũng như chức năng của protein LDLR, các đột biến trên gen ApoB làm

ảnh hưởng đến vùng liên kết với thụ thể LDLR của apolipoprotein B hoặc các đột

biến làm tăng chức năng protein PCSK9 trên gen PCSK9 (Goldstein, 1974; Veljkovic et al., 2018)

Trong đó, 85% đến 90% trường hợp mắc FH đều mang đột biến trên gen LDLR, các biến đổi bất thường gây bệnh ở các gen ApoB, PCSK9 hiếm gặp hơn và chiếm tỷ lệ

lần lượt là 1-12% và 2-4% (Polychronopoulos và Tziomalos, 2019)

2.5.4 Chẩn đoán

Đến nay, một số chỉ tiêu chẩn đoán bệnh FH dựa vào chỉ số cholesterol tổng số và các loại lipoprotein trong máu đã được công bố Điển hình là tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của: Simon Broome ở Vương Quốc Anh (Bảng 2.2) và Dutch Lipid Clinic Network (Bảng 2.3)

Trang 29

Bảng 2.2 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH theo Simon Broome (Marks et al., 2003)

FH Khi thõa mãn tiêu chí (a) và (d) hay (a) và (e)

Trang 30

Bảng 2.3 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH theo Dutch Lipid Clinic Network

(Marks et al., 2003)

Tiền sử gia đình

Thế hệ thứ nhất có người mắc bệnh về tim mạch sớm (nam: <55 tuổi, nữ: <60) hay thế hệ thứ nhất có nồng độ LDL-C ở phân vị trên 95%

1

Thế hệ thứ nhất có xuất hiện các xanthoma trong da, gân hay rìa giác mạc hay trẻ em dưới 18 tuổi có nồng độ LDL-C ở phân vị trên 95%

Đột biến trên gen LDLR (ApoB/PCSK9) làm

ảnh hưởng chức năng của protein LDLR (ApoB/PCSK9)

Trang 31

Tuy nhiên, các chỉ số cholesterol trong máu của người bệnh FH Việt Nam được ghi nhận có xu hướng thấp hơn so với các tiêu chí về chẩn đoán FH của các quốc gia phương Tây như: tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của Dutch Lipid Clinic Network và tiêu

chí chẩn đoán bệnh FH của Simon Broome (Truong et al., 2018) Vì vậy, trong nghiên cứu của Truong et al (2018), nhóm tác giả đã đề xuất ngưỡng LDL-C chẩn

đoán FH dành cho người Việt Nam:

Người trưởng thành Trẻ em (<16 tuổi)

> 4.1 mmol/L > 3.0 mmol/L

Ngoài ra, theo hướng dẫn của Goldberg et al (2011) và Harada-Shiba et al (2018),

các bệnh nhân mắc FH thường có nồng độ triglycerides cao bất thường trong máu Vì vậy, sự hiện hiện của sự tăng bất thường nồng độ triglycerides trong máu có thể là

một dấu chứng cho chẩn đoán bệnh FH (Goldberg et al., 2011; Harada-Shiba et al.,

2018)

2.5.5 Bệnh FH tại Việt Nam

Theo Truong et al (2018), bệnh FH là một vấn đề sức khỏe cộng đồng cần được chú

ý tại Việt Nam.Tuy nhiên, bệnh FH vẫn còn rất mới mẻ đối với các chuyên gia sức khỏe lẫn người dân Việt Nam, bệnh vẫn chưa được chẩn đoán và các phương thức điều trị bệnh vẫn còn hạn chế Người bệnh chỉ được thông báo về sự bất thường trong các chỉ số về cholesterol trong máu (cholesterol tổng số, HDL-C, LDL-C, Triglyceride) khi khám và điều trị các bệnh lý khác tại các cơ sở y tế và sẽ được chỉ

định điều trị bằng một số thuốc hạ cholesterol máu thông thường (Truong et al., 2018) Theo ước tính của Truong et al (2018), Việt Nam có khoảng 300.000 bệnh

nhân mắc FH, cùng với việc người bệnh Việt Nam có nồng độ LDL-C trong máu thấp hơn so với phương Tây nên sẽ rất khó khăn cho việc chẩn đoán bệnh FH thông qua các chỉ số cholesterol trong máu, dẫn đến nguy cơ rất cao xuất hiện các bệnh nhân HoFH trong cộng đồng

Theo ghi nhận của Mahdieh et al (2020), từ năm 1970 đến nay, 160 bài báo khoa học thực hiện nghiên cứu về trên các gen LDLR, ApoB và PCSK9 liên quan đến bệnh FH

trên quần thể người Châu Á được công bố từ 20 quốc gia và khoảng 42% các quốc gia

Trang 32

Châu Á không có bất kỳ thông tin nào về FH Cập nhật đến năm 2019, các công trình nghiên cứu về đặc điểm phân tử của những gen liên quan (nguyên nhân chính) đến bệnh FH trên người Việt Nam vẫn còn hạn chế, chỉ một vài công bố gần đây như công

bố của Truong et al (2018), Truong et al (2019) Vì vậy mà các công trình nghiên

cứu về bệnh FH trên quần thể người Việt Nam là rất cần thiết được tiến hành, tạo cơ sở dữ liệu phục vụ công tác sàng lọc và quản lý bệnh FH tại Việt Nam

2.6 Gen PCSK9 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9)

2.6.1 Định vị

Gen PCSK9 đinh vị trên nhiễm sắc thể số 1 (1p32), gồm 12 exon (Phụ lục 1) PCSK9

mã hóa cho protein tham gia vào sự phân hủy protein LDLR Protein PCSK9 có kích

thước 692 amino acid, thuộc họ subtilisinlike proconvertases (Abifadel et al., 2009a; Veljkovic et al., 2018)

Hình 2.1 Định vị gen PCSK9 trên nhiễm sắc thể số 1

(https://www.genecards.org)

2.6.2 Cấu trúc protein PCSK9

Protein PCSK9 (NP_777596.2) có kích thước 692 amino acid, gồm: vùng tín hiệu ( amino acid 1-30), prodomain (amino acid 31-152), vùng xúc tác (amino acid 153-449) và vùng C-Terminal giàu cysteine và histidine có kích thước 242 amino acid (Cunningham et al., 2007; Abifadel et al., 2009a)

Dọc theo chiều dài chuỗi amino acid PCSK9 là các vùng chức năng có vai trò quan trọng đối với hoạt động điều hòa chuyển hóa cholesterol Đầu tiên là vị trí Gln152 và Ser153, đây là vị trí xúc tác cho enzyme cắt tiền protein PCSK9 (~74-kDa) trở thành hai đoạn có kích thước 60-kDa và 14-kDa Quá trình này giúp chuỗi amino acid có thể đi qua lưới nội chất Trước khi được giải phóng vào máu, hai đoạn amino acid đã được gấp cuộn sẽ liên kết với nhau, trở thành protein PCSK9 hoàn chỉnh và có đầy đủ chức năng Ngoài ra, protein PCSK9 còn một dạng bị bất hoạt có kích thước 53-kDa, tồn tại và tuần hoàn song song với protein PCSK9 hoàn chỉnh trong mạch máu Dạng

Trang 33

bất hoạt này có chuỗi amino acid bị cắt ở vị trí Arg218 và Gln219 (Abifadel et al., 2009a)

Tiếp theo, vị trí amino acid thứ 159-163 và 331-360 là hai vùng trung tâm hoạt động, chứa phân tử canxi Trung tâm hoạt động cùng với các vị trí Asp186, His226 và Ser386 là các vùng có vai trò trọng yếu trong hoạt động xúc tác của PCSK9 Cuối cùng là vùng phosphoryl hóa (Ser47 và Ser688), đây là những vùng được cho là có chức năng bảo vệ tiền protein PCSK9 khỏi quá trình phân giải protein (Cunningham

et al., 2007)

Hình 2.2 Cấu trúc protein PCSK9 (Trình tự tham khảo: NP_777596.2)

Ghi chú: SP, Signal peptide: vùng tín hiệu; Pro, Prodomain

2.6.3 Chức năng

Protein PCSK9 còn có tên gọi khác là NARC-1 có vai trò chính như một chaperone kiểm soát lượng LDLR trên bề mặt tế bào Ở điều kiện bình thường, phức hợp LDL/LDLR được nhập bào bởi endosomes Tại đây, LDL tách khỏi LDLR và được chuyển vào bên trong tế bào, trong khi, LDLR được tái tuần hoàn trở lại bề mặt tế bào PCSK9 gắn với LDLR và ức chế chu trình này, khiến LDLR không thể quay trở

lại bề mặt tế bào và bị phân hủy bởi Lysosome (Hình 2.3; Chaudhary et al., 2017)

Trang 34

Hình 2.3 Cơ chế và vai trò của PCSK9 trong chuyển hóa LDL-C

(Chaudhary et al., 2017)

2.6.4 Tính chất đột biến trên gen PCSK9

Các biến thể xuất hiện trên gen PCSK9 ảnh hưởng đến chức năng của protein PCSK9

theo hai dạng: mất chức năng (Loss of function – LOF) và tăng chức năng (gain of

function – GOF) (Veljkovic et al., 2018; Polychronopoulos và Tziomalos, 2019) Đột

biến tăng chức năng (Ser127Arg, Asp374Tyr, Arg496Trp, …) khiến LDLR bị phân hủy dẫn đến tăng lượng LDL trong máu và tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, ngược lại, đột biến mất chức năng (Thr77Ile, Tyr142*, Trp428*, …) lại làm giảm

lượng LDL trong máu (Abifadel et al., 2009a; Veljkovic et al., 2018) Tuy các đột biến gây bệnh FH trên gen PCSK9 khá hiếm gặp (2-4%), các biến thể xuất hiện trên gen PCSK9 lại có tác động lớn đến một số quần thể người vì các biến thể này có số

lượng, tần số và mức ảnh hưởng lớn đối với quá trình điều hòa chuyển hóa cholesterol

(Abifadel et al., 2009a; Polychronopoulos và Tziomalos, 2019) Ví dụ, một số đột

biến gây mất chức năng protein PCSK9, làm giảm nồng độ cholesterol trong máu như p.(Leu253Phe) và p.(Ala443Thr) có xu hướng thường gặp hơn ở nhóm người gốc Phi

(Abifadel et al., 2009a) Do đó, những nghiên cứu chuyên sâu nhằm đánh giá tác động của các biến thể, sự tương tác giữa chúng và các đặc điểm di truyền trên gen

Trang 35

PCSK9 đến các biểu hiện lâm sàng có tầm quan trọng lớn trong chẩn đoán, tiên lượng

và tìm ra phác đồ điều trị hiệu quả cho các bệnh rối loạn chuyển hóa cholesterol

(Veljkovic et al., 2018)

2.6.5 Một số công trình nghiên cứu về đột biến PCSK9

Sánchez-Hernánde et al (2019) sử dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (Next genration sequencing-NGS) đã xác định được 1 biến thể thuộc gen PCSK9 có liên

quan đến bệnh FH từ bộ mẫu 70 người bệnh FH tại Tây Ban Nha

Hori et al (2019) sử dụng phượng pháp giải trình tự Sanger đã xác định 4 biến thể thuộc gen PCSK9 có liên quan đến bệnh FH từ bộ mẫu 650 người bệnh FH tại Nhật

Bản

Raal et al (2018) sử dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (Next genration sequencing-NGS) đã xác định được 2 biến thể thuộc gen PCSK9 có liên quan đến

bệnh FH từ bộ mẫu 141 người bệnh FH tại Nam Phi

2.6.6 Thuốc ức chế protein PCSK9

Một số nghiên cứu trên bệnh nhân FH được điều trị bằng Statin ghi nhận tình trạng giảm hiệu lực của thuốc sau một khoảng thời gian điều trị, đồng thời, nồng độ PCSK9 tuần hoàn trong máu của các bệnh nhân này tăng cao Statin ức chế 3-hydroxy-3-metylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp cholesterol nội bào Tế bào bị thiếu hụt cholesterol sẽ tăng cường tổng hợp LDLR nhằm tận dụng nguồn cholesterol ngoại bào dẫn đến làm giảm lượng LDL-C trong máu Tuy nhiên, quá trình trên lại hoạt hóa cho quá trình điều hòa ngược, tăng cường biểu hiện protein PCSK9 nhằm làm giảm số lượng LDLR đã và đang tăng bất thường trên bề mặt tế bào, làm giảm hiệu quả của thuốc Statin

(Chaudhary et al., 2017) Do đó, việc ức chế protein PCSK9 sẽ giúp tăng biểu hiện

của các LDLR trên bề mặt tế bào, hỗ trợ điều trị bệnh tăng cholesterol cũng như điều

trị hiệu quả các bệnh nhân FH mang đột biến GOF trên gen PCSK9

Trang 36

ngăn chặn PCSK9 liên kết với LDLR bằng các kháng thể đơn dòng, yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF-A), adnectin; và (3) ức chế các vùng xúc tác của PCSK9 Cho đến nay, hai kháng thể đơn dòng ức chế biểu hiện PCSK9 đã được thương mại hóa: alirocumab và evolocumab Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy hiệu quả của alirocumab và evolocumab khi được điều trị bổ trợ cho các phác đồ điều trị bệnh FH thông thường là rất tốt Đặc biệt, hai kháng thể đơn dòng trên rất hữu hiệu trong các phác đồ điều trị bệnh nhân HoFH, làm giảm rõ rệt số liệu trình lọc máu ở các bệnh nhân này Những phát hiện này chứng minh được rằng các thuốc ức chế PCSK9 là phương pháp điều trị tiềm năng đối với bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình (Polychronopoulos và Tziomalos, 2019)

2.7 Một số phương pháp sinh học phân tử xác định đột biến trên gen PCSK9

Hiện nay, các công trình khoa học trên thế giới đã sử dụng rất đa dạng các kỹ thuật

sinh học phân tử nhằm xác định đột biến trên gen PCSK9 liên quan đến bệnh FH Tuy

nhiên, để xác định được đồng thời nhiều loại đột biến khác nhau, lẫn các đột biến mới, các kỹ thuật giải trình tự sau được sử dụng rất phổ biến trong các nghiên cứu gần đây về bệnh FH:

❖ Giải trình tự Sanger (Sanger sequencing)

Giải trình tự Sanger được thiết lập đầu tiên bởi Sanger et al (1977) Nguyên lý chính

của giải trình tự Sanger dựa trên phản ứng PCR tổng hợp dừng thông qua bổ sung các dideoxy nucleotide vào thành phần phản ứng, tạo thành sản phẩm là các đoạn DNA

ngắn có kích thước khác nhau (Sanger et al., 1977) Sản phẩm phản ứng PCR được điện di, sắp xếp và phân tích để cho ra trình tự gen cần khảo sát (Sanger et al., 1977)

❖ Giải trình tự thế hệ mới (Next genration sequencing-NGS)

Giải trình tự thế hệ mới (Next genration sequencing-NGS) được thiết lập đầu tiên bởi

Ansorge et al (1991) Nguyên lý chính của NGS dựa trên phản ứng PCR khuếch đại

các đoạn DNA đã được cố định bởi các mẫu dò được gắn trên chip, hình thành những cụm sản phẩm PCR, sau đó những cụm này được phân tích trình tự thông qua sự phát

tín hiệu huỳnh quang của các nucleotide phát huỳnh quang (Ansorge et al.,1991)

Trang 37

NGS là phương pháp giải trình tự có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể được sử dụng

để phân tích trình tự có kích thước lớn (Ansorge et al.,1991)

Giải trình tự Sanger và NGS đều có khả năng xác định được đồng thời nhiều loại đột biến khác nhau, tuy nhiên, NGS có độ nhạy, độ đặc hiệu vượt trội cùng khả năng xác

định đột biến trong một phạm vi lớn và trên đa gen (Ihle et al., 2014) Vì vậy, trong

những năm gần đây, NGS được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu các đặc điểm

phân tử về bệnh FH, điển hình là các nghiên cứu của Sánchez-Hernández et al (2019), Raal et al (2018), Truong et al (2018) Nhược điểm duy nhất của NGS là sự

phức tạp và giá thành cao, do đó, giải trình tự Sanger vẫn được sử sụng vì tính đơn

giản và chi phí phù hợp (Ihle et al., 2014)

2.8 Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) 2.8.1 Định nghĩa

Phân tích tổng hợp là phân tích thống kê của một tập hợp lớn các kết quả phân tích từ nghiên cứu cá nhân để đánh giá một cách hệ thống các kết quả nghiên cứu trước đó để được các kết luận về bản chất của nghiên cứu (Haidich, 2011) Phân tích tổng hợp được sử dụng với mục đích: giải quyết các vấn đề đang tranh cãi hoặc mâu thuẫn về kết quả của các nghiên cứu, hoặc chưa có câu trả lời dứt khoát; xác định giả thuyết mới cho các vấn đề đã và đang được nghiên cứu rộng rãi, hoặc chưa đủ/thiếu bằng chứng/minh chứng thích hợp (Field và Gillett, 2010)

Theo Field và Gillett (2010), phân tích tổng hợp gồm các bước chính: - Xác định mục tiêu phân tích tổng hợp

- Xây dựng các câu hỏi/vấn đề cần giải quyết và xây dựng hệ thống tiêu chuẩn để chọn lọc dữ liệu (nhận và và loại ra dữ liệu khoa học)

- Thu thập bộ dữ liệu (bộ dữ liệu gốc)

- Phân loại, lựa chọn nghiên cứu và đánh giá chất lượng nghiên cứu - Trích xuất dữ liệu (chọn lọc và mã hóa dữ liệu)

- Ước tính các trọng số

- Phân tính ảnh hưởng cố định và ảnh hưởng ngẫu nhiên

- Đánh giá “publication bias” (yếu tố thiên vị) và phân tích độ nhạy

Trang 38

- Xác định kết quả, giải thích kết quả và viết báo cáo (bàn luận kết quả)

Theo Field và Gillett (2010), phân tích tổng hợp có thể giúp thu nhận một số dạng kết quả như sau:

- Xác định được giá trị trung bình và độ biến thiên của các kết quả thu được từ các nghiên cứu riêng lẻ

- Phản ánh và lý giải sự khác biệt/mâu thuẫn/tranh cãi trong các nghiên cứu

- Xác định các biến số ảnh hưởng hay còn gọi là biến điều tiết (moderator variables) Phân tích tổng hợp là công cụ thống kê đắc lực trong nghiên cứu khoa học thuộc một số lĩnh vực: y học thực chứng, công nghệ sinh học, … nhằm xác định ý nghĩa thống kê của các dữ liệu/vấn đề nghiên cứu hoặc mức độ ảnh hưởng của một số yếu tố (yếu tố nguy cơ, …) đối với một số dạng bệnh lý, … hoặc phản ánh tiềm năng ứng dụng của một số quy trình thực nghiệm trong khoa học thực tiễn (quy trình chẩn đoán bệnh có thể được ứng dụng trong đời sống/công tác tiên lượng, chẩn đoán bệnh trên một quần thể người nhất định nào đó, …) (Haidich, 2011)

2.8.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích tổng hợp 2.8.2.1 Sai lệch hệ thống (Bias)

Việc thu thập được tất cả các nghiên cứu liên quan rất quan trọng vì khi thiếu sót một số các nghiên cứu có thể dẫn đến sai lệch hệ thống trong nghiên cứu phân tích tổng hợp Đối với trường hợp trên, cần tìm càng nhiều các nghiên cứu liên quan càng tốt nhằm giảm thiểu sai lệch và tăng độ tin cậy (Haidich, 2011)

Một nguồn quan trọng khác có khả năng dẫn đến sai lệch hệ thống là sự thất lạc các kết quả thử nghiệm và đối tượng thí nghiệm Lý tưởng nhất là khi tất cả các đối tượng ngẫu nhiên trong tất cả các nghiên cứu đáp ứng được tất cả các tiêu chí lựa chọn thử nghiệm, tuân thủ tất cả các quy trình thử nghiệm, và cung cấp dữ liệu hoàn chỉnh Khi đó, nghiên cứu trên trực tiếp trở thành “phân tích theo chủ ý”, đó là phân tích thống kê chỉ dựa trên những đối tượng đáp ứng được tất cả kỳ vọng của thử nghiệm và được cho là đối tượng lý tưởng (Haidich, 2011)

Trang 39

Có thể nói, mục đích cuối cùng của việc phân tích tổng hợp là tìm ra nguồn gốc của sự bất đồng nhất nếu nó có hiện diện trong những nghiên cứu Nếu xuất hiện tính bất đồng nhất, các bước sàng lọc cần được cẩn thận dò xét lại Khi xuất hiện tính bất đồng nhất, ta phải đặt câu hỏi rằng liệu và làm thế nào có thể khái quát hóa được kết quả thống kê Hiểu rõ được nguồn gốc của sự bất đồng nhất giúp phòng ngừa và khắc phục tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu, đồng thời, là kết quả cho những đề tài nghiên cứu mới noi theo Một phần công việc của tiến trình phân tích tổng hợp đó là xác định các yếu tố then chốt trong phân tích quần thể hay một biến số tương thích để khảo sát trong tất cả các nghiên cứu (Haidich, 2011)

Thống kê Cochran’s Q là phép thử chi bình phương (χ2) của tính bất đồng nhất với độ

tự do k-1 thường được dùng để đánh giá sự thay đổi giữa các phép thử k, nhưng ít hiệu

quả trong việc phát hiện tính bất đồng nhất trong những mẫu cỡ nhỏ Do đó, thông thường mức α xấp xỉ 0,10 được sử dụng để kiểm tra các giả thuyết (Haidich, 2011)

Trang 40

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU